FI79716B - Daeggdjur-pgrf. - Google Patents

Description

1 79716

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen nisäkkään PGRF:n valmistamiseksi, sekä menetelmässä käytetty välituote 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti

käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-10 Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-

Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-R^-R

jossa R on OH tai NH2 ja R41 on Arg, Arg-Ala, Arg-Ala-Arg, Arg-Ala-Arg-Leu tai des-R^, 15 tai niiden biologisesti aktiivisten fragmenttien valmista miseksi. Peptidi vaikuttaa ihmisen ja muiden nisäkkäiden aivolisäkkeen toimintaan edistämällä aivolisäkkeen kasvuhormonin vapauttamista. Keksintö koskee myös menetelmässä käytettyä peptidivälituotetta.

20 1950-luvun alkupuolelta saakka fysiologit ja kliini kot ovat tienneet, että aivojen hypothalamus säätelee kaikkia aivolisäkkeen etulohkon erityistoimintoja. Tämä säätely on neurohumoraalista hypothalamuksen erikoistuneiden neu-rosekreettisten hermosolujen tuottaessa erityisiä polypep-25 tidejä, joista jokaisen vaikutuksena ja tehtävänä on kunkin aivolisäkkeen hormonin erityksen laukaiseminen lyhytaikaisesti ja pitkäaikaisesti. Tähän mennessä hypothalamuksen vapautustekijä on tunnistettu aivolisäkehormoneille tyro-tropiini ja prolaktiini (tripeptidi TRF), aivolisäkkeen 30 gonadotropiineja luteinisoivalle hormonille ja follikkelia stimuloivalle hormonille (dekapeptidi LRF, LH-RH, Gn-RH tai Gn-RF) ja aivolisäkehormoneille /5-endorfiini ja edrenokor-tikotropiini (41 aminohappoa sisältävä polypeptidi CRF). Lisäksi on tunnistettu inhibitiotekijä: hypothalamuksen 35 somatostatiini estää aivolisäkkeessä kasvuhormonin vapautusta. Jokainen näistä hypothalamuksen vapautustekijöistä sekä somatostatiini on tuotettu kokonaissynteesillä ja monia luonnossa esiintyvien rakenteiden analogeja on synteti- 2 Γ7 λ» n « s /7/1 6 soitu; joillakin niistä on paljon suurempi aktiivisuus kuin luonnon yhdisteillä.

Tähän mennessä vastaavaa hypothalamuksen vapautus-tekijää aivolisäkkeen kasvuhormonille tai somatotropiinil-5 le ei ole tunnistettu, vaikka laaja fysiologinen ja kliininen todistusaineisto sen olemassaolosta onkin ollut. Yksi pääongelmista hypothalamuksen kasvuhormonia vapauttavan tekijän (tästä eteenpäin GRF) eristämisessä ja tunnistamisessa on se, että vaikuttava peptidi näyttää esiintyvän 10 jokaisessa hypothalamusfragmentissa äärimmäisen pieninä määrinä, joiden otaksutaan olevan 50 - 150 femtomoolin suuruusluokkaa. Tämä määrä on paljon pienempi kuin mitä koskaan on laskettu muille hypothalamuksen vapautusteki-jöille. Tämän toteamuksen kanssa sopusoinnussa on väittä-15 mä, että hypothalamuksen GRF on erittäin tehokas.

Toinen suuri ongelma hypothalamuksen GRF:n eristämisessä on ollut erittäin suurien somatostatiinimäärien esiintyminen hypothalamusuutteissa, jotka somatostatiini-määrät luonnollisesti estävät jokaisen biologisen määri-20 tyksen yrityksen tai antaisivat harhaanjohtavia tuloksia sellaisessa. Muutamien viime vuosien aikana useat laboratoriot ovat väittäneet eristäneensä ja tunnistaneensa hypothalamuksen GRF:n; kaikki nämä väitteet koskivat keinotekoisia tuotteita, kuten ovat myöhemmin todenneet 25 Schally A.V.S. et ai., J. Biol. Chem. 246 (1971) 6647 ja Veber D.F. et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (1971) 235. Sellaiset virheelliset väitteet voidaan selittää osaksi kasvuhormonin vapautumisen arviointiin liittyvien biologisten määritysten vaikeudella.

30 44 aminohappotähdettä sisältävä polypeptidi, joka edistää aivolisäkkeen kasvuhormonin (GH) vapauttamista, on eristetty ihmisen saarekesolukasvaimesta, puhdistettu, tunnistettu, syntetisoitu ja testattu. Tämän peptidin aminohappojärjestys on: H-Tyr - Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-35 Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH^. Sen uskotaan olevan ja siitä käytetään tästä eteenpäin nimitystä PGRF (ih- ο π o n 1 s

J / / / IU

misen haiman GRF), ja sitä kutsutaan myös somatokriniinik-si. Yhdessä sen kanssa eristettiin myös kaksi muuta erittäin puhdasta peptidiä, joilla on GH:a vapauttava vaikutus ja jotka ovat vapaa happo PGRF(1-37) ja vapaa happo 5 PGRF(1-40). Näitä peptidejä voidaan käyttää tasalämpöisten eläinten ja vedessä elävien vaihtolämpöisten eläinten kasvun edistämiseen.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja peptidejä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää kliini-10 sessä lääketieteessä sekä ihmisten että eläinten ollessa kysymyksessä, lyhytaikaisessa tai pitkäaikaisessa anto-muodossa diagnostisiin tai terapeuttisiin tarkoituksiin.

Peptidien nimeämiseen käytetään nimistöä, jonka ovat tarkkaan määritelleet Schroder & Lubke, "The Pep-15 tides", Academic Press, 1965, ja jossa tavanomaisen esityksen mukaisesti N-terminaalinen aminoryhmä on vasemmalla ja C-terminaalinen karboksyyliryhmä oikealla. Silloin kun aminohappotähteellä on keskenään isomeerisia muotoja, esitetty muoto on L-muoto, ellei toisin ole 20 nimenomaan mainittu.

Peptidit syntetisoidaan soveltuvalla menetelmällä, kuten esimerkiksi yksinomaisella kiinteäfaasitekniikalla, osittaisella kiinteäfaasitekniikalla, fragmenttikondensaa-tiolla, klassisin liuoksessa tapahtuvin liittämisreaktioin 25 tai käyttämällä viime aikoina kehitettyä yhdistelmä-DNA- tekniikkaa. Esimerkiksi yksinomaan kiinteäfaasisynteesiin perustuva tekniikka esitetään oppikirjassa "Solid-Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco, 1969 ja siitä on esimerkkejä US-patenttijulkai-30 sussa 4 105 603 (8. elokuuta 1978, Vale et al.). Esimerkkejä fragmenttikondensaatiosta synteesimenetelmänä esitetään US-patenttijulkaisussa 3 972 859 (3. elokuuta 1976). Muista käytettävissä olevista synteeseistä esitetään esimerkkejä f * 79716 US-patenttijulkaisuissa 3 842 067 (15. lokakuuta 1974) ja 3 862 925 (28. tammikuuta 1975). Synteettisten peptidien tuottamista yhdistelmä-DNA-tekniikalla tullaan todennäköisesti käyttämään suurten kaupallisten tarpeiden tyydyttämi-5 seen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että

a) muodostetaan peptidivälituote, joka sisältää vähintään yhden suojaryhraän ja jolla on kaava II

10 X1-Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)- of 7 5

Tyr(XZ)-Arg(X°)-Lys(X )-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X )-Ala-

Arg(X6)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gin-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X5)-

Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Ser(X5)-Asn-Gln-Glu(X3)- 15 Arg(X6)-Gly-Ala-Arg(X6)-Ala-Arg(X6)-Leu-X8 jossa X^" on vety tai 66-aminoryhmää suojaava ryhmä; 2 X on vety tai Tyr:n fenolihydroksyyliryhmää suojaava ryhmä; 20 XJ on vety tai Asp:n tai Glu:n karboksyyliryhmää suojaa va ryhmä; X4 on vety tai Thr:n alkoholihydroksyyliryhmää suojaava ryhmä; X^ on vety tai Ser:n alkoholihydroksyyliryhmää suojaava 25 ryhmä; X8 on vety tai Arg:n guanidoryhmää suojaava ryhmä; 7 X on vety tai Lys:n sivuketjuaminoryhmää suojaava ryhmä;

O

ja X on -O-Cf^-polystyreenihartsikantaja tai -NH-bentsyy-lihydryyliamiinihartsikantaja; tai tarkoituksenmukaisesti C-päätteestä lyhennetty muunnos siitä, liittämällä järjestyksessä suojatut aminohapot suhteessa noin yksi millimooli suojattua aminohappoa yhtä grammaa sopivassa liuottimessa, edullisesti metyleeniklo-ridissa tai dimetyyliformamidissa tai niiden seoksessa ole-33 vaa hartsia kohti, ja 5 79716 b) lohkaistaan suojaryhmät ja erotetaan peptidi hartsikantajasta käyttämällä TFA:ta sopivassa liuottimessa, joka edullisesti on minkä jälkeen käytetään HF yh dessä huuhteluaineen kanssa, joka edullisesti on anisoli 5 tai metyylietyylisulfidi tai niiden seos, alhaisessa lämpötilassa, edullisesti noin 0°C ja -20°C:n välillä, ja sitten peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen, edullisesti etikka-happoon, ja puhdistetaan käyttäen tunnettuja menetelmiä.

Yhteistä synteeseille, joissa käytetään liittämis-10 reaktioita (coupling), on eri aminohappo-osien labiilien sivuketjuryhmien suojaaminen soveltuvilla suojaryhmillä, jotka estävät kyseisessä kohdassa tapahtuvan kemiallisen reaktion siihen asti, kun ryhmä lopulta poistetaan. Tavallisesti yhteistä on myös aminohapon tai fragmentin Ä-ami-15 noryhmän suojaaminen siksi ajaksi, kun sen karboksyyliryh-mä reagoi, jonka jälkeen Ot-aminoryhmää suojaava ryhmä poistetaan selektiivisesti, jotta tämän jälkeen voi tapahtua reaktio kyseisessä asemassa. Niinpä on tavallista, että synteesin yhtenä vaiheena syntyy välituoteyhdiste, 20 jossa jokainen aminohappotähde sijaitsee halutulla paikallaan peptidiketjussa sivuketjusuojaryhmien ollessa liittyneinä asianmukaisiin tähteisiin.

Tämän keksinnön piiriin katsotaan kuuluvan myös välituotteet, joilla on kaava: 25 X1_Tyr(X2)-Ala-Asp(X3)-Ala-Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg (X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-Gin-Asp (X3) -Ile-Met-Ser (X5)-Arg(X6) -Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Ser(X5)-Asn-Gln-Glu(X3)-Arg(X6)-Gly-Ala-Arg(X6)-Ala-Arg(X6)-Leu-X8 30 jossa xl on joko vety tai Ot-aminoryhmää suojaava ryhmä. χ!:η tarkoittamat Ot-aminoryhmää suojaavat ryhmät ovat ryhmiä, joiden tiedetään olevan käyttökelpoisia polypep-tidien asteittaisissa synteeseissä. Ryhmiä, jotka sisäl-X3:llä tarkoitettuja Ä-aminoryhmää suojaavia ryhmiä, 6 79716 ovat (1) asyylityyppiset suojaryhmät, kuten formyyli, trifluoriasetyyli, ftalyyli, tolueenisulfonyyli (Tos), bentseenisulfonyyli, nitrofenyylisulfenyyli, trityyli-sulfenyyli, o-nitrofenoksiasetyyli, klooriasetyyli, 5 asetyyli ja "f"-klooributyryyli; (2) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät, kuten bentsyylioksi-karbonyyli (Z) ja substituoitu Z, esimerkiksi p-kloori-bentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyylioksi-10 karbonyyli; (3) alifaattiset uretaanisuojaryhmät, kuten t-butyylioksikarbonyyli (BOC), di-isopropyylimetyyli-oksikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikarbo-nyyli ja allyylioksikarbonyyli; (4) sykloalkyyliuretaani- tyyppiset suojaryhmät, kuten syklopentyylioksikarbonyyli, 15 adamantyylioksikarbonyyli ja sykloheksyylioksikarbonyyli? (5) tiouretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fenyylitio-karbonyyli; (6) alkyylityyppiset suojaryhmät, kuten tri-fenyylimetyyli(trityyli) ja bentsyyli; ja (7) trialkyyli-silaaniryhmät, kuten trimetyylisilaani. Edullinen Ot-ami- 20 noryhmää suojaava ryhmä on BOC.

2 X on Tyr:n fenolihydroksyyliryhmää suojaava ryhmä ja se voi olla tetrahydropyranyyli, t-butyyli, trityyli, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ tai 2,6-diklooribentsyyli.

2

Edullinen suojaryhmä on 2,6-diklooribentsyyli. X voi 25 olla vety, mikä merkitsee sitä, että hydroksyyliryhmä ei ole suojattu.

3 X on vety tai Asp:n tai Glu:n karboksyyliryhmää suojaava esterin muodostava ryhmä, joka voi olla Bzl, 2,6-diklooribentsyyli, metyyli tai etyyli.

4 5 30 X 3a X ovat Thr:n ja Ser:n hydroksyyliryhmää suojaavia ryhmiä, ja ne valitaan ryhmästä, jonka muodostavat asetyyli, bentsoyyli, t-butyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-diklooribentsyyli ja CBZ. Edul- 4 5 linen suojaryhmä on Bzl. X ja/tai X voi olla vety, mikä 35 merkitsee sitä, että hydroksyyliryhmä ei ole suojattu.

7 79716 on Arg:n guanidoryhmää suojaava ryhmä, joka voi olla nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli tai BOC tai vety.

7 X on Lys:n sivuketjuna olevaa aminosubstituenttia 5 suojaava ryhmä. Esimerkkejä soveltuvista sivuketjuamino- ryhmää suojaavista ryhmistä ovat 2-klooribentsyylioksi-karbonyyli (2-C1-Z), Tos, CBZ, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.

Sivuketjuaminoryhmää suojaavan ryhmän valinta ei 10 ole ratkaisevaa lukuun ottamatta sitä, että ryhmän täytyy olla sellainen, joka ei irtoa Ot-aminoryhmien suojausta poistettaessa synteesin aikana. Tästä syystä Ot-amino-ryhmää suojaava ryhmä ja sivuketjuaminoryhmää suojaava ryhmä eivät voi olla samoja.

g 15 X valitaan ryhmästä, jonka muodostavat -O-CI^- polystyyrenihartsikantaja ja -NH-bentsyylihydryyliamiini-hartsikantaja.

Välituotteen kaavassa vähintään yksi ryhmistä x\ X2, X^, X^, X5, X^, X7 ja X^ on suojaryhmä.

20 Valittaessa peptidisynteesissä käytettävää määrättyä sivuketjua suojaavaa ryhmää noudatetaan seuraavia sääntöjä: (a) suojaryhmän tulisi olla stabiili kussakin synteesi-vaiheessa reagenssia vastaan sekä niissä olosuhteissa, joita käytetään poistettaessa Of-aminoryhmää suojaava ryhmä, 25 (b) suojaryhmän tulisi säilyttää suojaominaisuutensa eikä se saisi irrota liittämisreaktion olosuhteissa ja (c) sivuketjua suojaavan ryhmän tulisi olla poistettavissa synteesin, jonka tuloksena on haluttu aminohappojärjestys, mentyä loppuun sellaisissa reaktio-olosuhteissa, jotka ei-30 vät muuta peptidiketjua.

Peptidit valmistetaan edullisesti käyttäen kiinteä-faasisynteesiä, esimerkiksi sellaista, jonka on esittänyt Merridield, J. Am. Chem. Soc., 85 (1063) 2149; vaikka muitakin vastaavia alalla tunnettuja kemiallisia synteesejä 35 voidaan käyttää, kuten edellä on mainittu. Kiinteäfaasisyn- teesi aloitetaan peptidin C-terminaalisesta päästä liittämällä suojattu Ofc-aminohappo soveltuvaan hartsiin. Sellainen lähtöaine voidaan valmistaa liittämällä Leu tai Ala, jonka 8 79716 0(-aminoryhmä on suojattu, esterisidoksella kloorimetyloi-tuun hartsiin tai hydroksimetyylihartsiin tai amidisidok-sella BHA- tai MBHA-hartsiin. Hydroksimetyylihartsin valmistusta kuvaavat Bodansky et ai., Chem. Ind. (London) 5 38 (1966) 1597-98. Kloorimetyloituja hartseja myyvät Bio

Rad Laboratories, Richmond, California ja Lab. Systems,

Inc. Sellaisten hartsien valmistusta kuvaavat Stewart et ai., "Solid-Phase Peptide Synthesis", Freeman & Co.,

San Francisco, 1969, luku 1, s. 1-6. BHA- ja MBHA-hartsi-10 kantajia on kaupallisesti saatavana ja niitä käytetään yleensä vain silloin, kun haluttu syntetisoitava polypep-tidi sisältää C-terminaalisen Ot-karboksamidin.

B0C:llä suojattu Ala liitetään kloorimetyloituun hartsiin Monahanin ja Gilonin (Biopolymer 12 (1973) 2513-15 19) esittämän menettelytavan mukaisesti esimerkiksi halut taessa valmistaa 40 aminohappoa sisältävä peptidi. Sen jälkeen kun BOC-Ala on liitetty hartsikantajaan, Ä-aminoryh-mää suojaava ryhmä poistetaan esimerkiksi käyttäen tri-fluorietikkahappoa (TFA) metyleenikloridissa, TFA:a yksi-20 nään tai HCl:a dioksaanissa. Suojauksen poistaminen tehdään 0°C:n ja huoneen lämpötilan välillä olevassa lämpötilassa. Muita tavanomaisia lohkaisureagensseja ja olosuhteita määrättyjen öC-aminoryhmää suojäävien ryhmien poistamiseksi voidaan käyttää, kuten Schroder ja Lubke ("The Peptides", 25 Academic Press, 1965, luku 1, s. 72-75) esittävät.

Ala:n Ofc-aminoryhmää suojaavan ryhmän poistamisen jälkeen loput aminohapot, joiden 0£-aminoryhmät ja sivu-ketjut on suojattu, liitetään haluttuun järjestykseen, jolloin saadaan edellä määritelty välituoteyhdiste tai vaihto-30 ehtona jokaisen aminohapon liittämiselle erikseen syntee sillä jotkut niistä voidaan liittää toisiinsa ennen lisäämistä kiinteäfaasireaktoriin. Asianmukaisten liittämisrea-genssien valitseminen on alalla tunnettua. Erityisen edullinen liittämisreagenssi on N,N'-disykioheksyylikarbodi-35 imidi (DCCI).

9 79716

Peptidien kiinteäfaasisynteesissä käytettävät akti-vointireagenssit ovat peptidialalla tunnettuja. Esimerkkejä soveltuvista aktivointireagensseista ovat: (1) karbodi-imi-dit, kuten N,N1-di-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N'-5 (3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi; (2) syanamidit, kuten N,N1-dibentsyylisyanamidi; (3) keteimiinit; (4) isoksat-soliumsuolat, kuten N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsolium-3'-sulfonaatti; (5) monosykliset typpeä sisältävät luonteeltaan aromaattiset heterosykliset amidit, jotka sisältävät 10 renkaassaan 1-4 typpiatornia, kuten imidatsolidit, pyratso- lidit ja 1,2,4-triatsolidit; yksittäisiä käyttökelpoisia heterosyklisiä amideja ovat N,N'-karbonyylidi-imidatsoli ja N ,N'-karbonyylidi-1,2,4-triatsoli; (6) alkoksyloitu asetyleeni, kuten etoksiasetyleeni; (7) reagenssit, jotka 15 muodostavat seka-anhydridin aminohapon karboksyyliosan kanssa, kuten etyyliklooriformaatti ja isobutyylikloori-formaatti; ja (8) reagenssit, jotka muodostavat aktiivisen esterin aminohapon karboksyyliosan kanssa, kuten typpeä sisältävät heterosykliset yhdisteet, joissa yhteen renkaan 20 typpiatomiin on liittynyt hydroksyyliryhmä, esimerkiksi N-hydroksiftalimidi, N-hydroksisukkinimidi ja 1-hydroksi-bentsotriatsoli (HOBT). Muita aktivointireagensseja ja niiden käyttämistä peptidisynteesissä kuvaavat Schroder ja Lubke, supra, luku III ja Kapoor, J. Pharm. Sei. 59 (1970) 25 1-27.

Kutakin aminohappoa tai aminohappoketjua laitetaan kiinteäfaasireaktoriin noin kaksinkertainen tai sitä suurempi ylimäärä ja liittämisreaktio voidaan tehdä käyttäen väliaineena dimetyyliformamidin (DMF) ja Ci^C^in seosta 30 suhteessa 1:1 tai DMF:aa tai Cl^C^ja yksinään. Epätäydellisen liittymisen tapahtuessa liittämisreaktio toistetaan ennen seuraavan aminohapon liittämistä edeltävää amino-ryhmää suojaavan ryhmän poistamista. Liittämisreaktion onnistumista kussakin synteesin vaiheessa seurataan ninhyd-35 riinireaktiolla, kuten ovat kuvanneet E. Kaiser et ai.,

Anal. Biochem. 34 (1970) 595.

10 7971 6

Sen jälkeen, kun haluttu aminohappoketju on saatu valmiiksi, välituotepeptidi poistetaan hartsikantajalta käsittelemällä reagenssilla, kuten esimerkiksi nestemäisellä fluorivedyllä, joka ei pelkästään irrota peptidiä hartsil-5 ta, vaan lohkaisee myös jäljellä olevat sivuketjujen suo-jaryhmät X^, x\ X^, X^, X^, Y? ja X® sekä Ot-aminoryhmää suojaavan ryhmän X^, jolloin saadaan kyseinen peptidi.

Vaihtoehtoisesti välituotepeptidi voidaan erottaa hartsikantajalta alkoholyysillä, jonka jälkeen talteensaatu 10 C-terminaalinen alkyyliesteri muutetaan hydrolysoimalla hapoksi. Mahdolliset sivuketjuja suojaavat ryhmät voidaan sitten lohkaista, kuten edellä on kuvattu tai muilla tunnetuilla menetelmillä, kuten esimerkiksi katalyyttisesti pelkistämällä (esim. Pd BaSO^-kantoaineella). Käytettäessä 15 lohkaisuun fluorivetyä reaktioastiaan lisätään anisolia ja metyylietyylisulfidia lohkaisutuotteiden erottamiseksi.

Seuraavassa esimerkissä esitetään edullinen menetelmä PGRFm syntetisoimiseksi kiinteäfaasitekniikalla. On luonnollisesti ymmärrettävä, että vastaavan lyhyemmän pep-20 tidifragmentin synteesi tehdään samalla tavalla jättämällä vain pois vaadittu määrä aminohappoja ketjun päästä. Nykyään ollaan sitä mieltä, että biologisesti aktiivisten fragmenttien tulisi sisältää ilmoitettu järjestys ketjun vapaan aminoryhmän sisältävässä päässä.

25 Esimerkki I

Vapaan hapon PGRF(l-44), jolla on kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-OH 30 synteesi tehdään asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide

Synthesizer:a ja kloorimetyloitua hartsia, esimerkiksi sellaista, jota myy Lab Systems Inc. ja joka sisältää 0,9 milliekvivalenttia Cl/g. B0C-Leu:n liittäminen hartsiin suoritetaan käyttäen yleistä menettelytapaa, jonka ovat 35 esittäneet Monahan et ai., Biopolymers 12 (1973) 2513-19 ja se johtaa substituutioon, jonka tuloksena grammaa kohden hartsia on liittynyt 0,22 mmol Leu:a. Kaikista käytettävistä liuottimista poistetaan kaasut huolellisesti hajottamalla ne pisaroiksi inertin kaasun, edullisesti heliumin, 11 7971 6 ollessa mukana hapettomuuden varmistamiseksi, koska happi saattaisi hapettaa Met-tähteen rikin, mikä ei ole toivottavaa.

Suojauksen poiston ja neutraloinnin jälkeen peptidi-ketju rakennetaan hartsikantajalta vaihe vaiheelta. Suojauk-5 sen poisto, neutralointi ja kunkin aminohapon lisääminen tehdään yleensä käyttäen menettelytapaa, jota ovat yksityiskohtaisesti kuvanneet Guillemin et ai. US-patenttijulkaisussa 3 904 594. Liittämisreaktioiden yksityiskohtainen toteutus esitetään seuraavassa suunnitelmassa.

20 Suunnitelma

Vaihe Reagenssit ja toimenpiteet Sekoitus- aika (min) 1 CH^Cl^-pesu (kahdesti) 0,5 2 50 % trifluorietikkahappo (TFA) + 5 % 1,2- 15 etaaniditioli CH2Cl2:ssa (1 kerta) 0,5 3 50 % trifluorietikkahappo (TFA) + 5 % 1,2- etaaniditioli CH2Cl2:ssa (1 kerta) 20,0 4 CHCl2-pesu (kolmesti) 0,5 5 CH^OH-pesu (kahdesti) 0,5 20 6 neutralointi 10 % trietyyliamiinilla (Et^N) CH2Cl2:ssa (kahdesti) 0,5 7 CH^OH-pesu (kahdesti) 0,5 8 neutralointi 10 % trietyyliamiinilla (Et^N) CH2Cl2:ssa (kahdesti) 0,5 25 9 CH^OH-pesu (kahdesti) 0,5 10 CH2Cl2-pesu (kahdesti) 0,5 11 *BOC-aminohappo (1 mmol/g hartsia) + ekvivalenttinen määrä disykloheksyyli-karbodi-imidiä (DCCI) CH2Cl2:ssa 120 30 12 CH2Cl2-pesu (kerran) 0,5 13 pesu 50 % dimetyyliformamidin CH2Cl2-liuok- sella (kahdesti) 0,5 14 pesu 10 % trietyyliamiinin (Et^N) CH2C12- liuoksella (kerran) 0,5 35 15 CH^OH-pesu (kahdesti) 0,5 16 CH2Cl2"pesu (kahdesti) 0,5 17 25 % etikkahappoanhydridiä CH2Cl2:ssa (2 ml/g hartsia) 20,0 18 CH2Cl2-pesu (kahdesti) 0,5 19 CH^OH-pesu (kahdesti) 0,5 i2 7971 6 *Asn:n ja Gln;n liittämiseksi tässä vaiheessa käytettiin 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBT) 1,136 moolia ylimäärin.

Lyhyesti sanoen liittämisreaktiossa käytetään 1 mmol BOC-suojattua aminohappoa metyleenikloridissa yhtä grammaa 5 kohden hartsia plus yksi ekvivalentti 0,5 molaarista DCCI:ä metyleenikloridissa tai 30 % DMF:ä metyleenikloridissa sekä kahden tunnin reaktioaikaa. Arg:a liitettäessä käytetään seosta, jossa on 10 % DMF:a ja metyleenikloridia. Bzl:ä käytetään Ser:n ja Thr:n hydroksyylisivuketjua suojaavana ryh-10 mänä. 2-klooribentsyylioksikarbonyyliä2C1-Z) käytetään

Lys:n sivuketjua suojaavana ryhmänä. Tosia käytetään Argin guanidoryhmän suojaamiseen ja Gluin tai Aspin karboksyy-liryhmä suojataan Bzl-esterinä. Tyrin fenolihydroksyyliryh- mä suojataan 2,6-diklooribentsyylillä. Synteesin lopussa 12 3 15 saadaan seuraava koostumusι X -Tyr(X )-Ala-Asp(X )-Ala-

Ile-Phe-Thr(X4)-Asn-Ser(X5)-Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Vai- 5 6 7

Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X )-Ala-Arg(X )-Lys(X )-Leu-Leu-Gln-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X5)-Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Ser(X5)-

Asn-Gln-Glu(X3)-Arg(X6)-Gly-Ala-Arg(X6)-Ala-Arg(X6)-Leu-X®, 12 3 20 jossa X on BOC, X on 2,6-diklooribentsyyli, X on bentsyy- liesteri, X4 on Bzl, X3 on Bzl, X3 on Tos, X7 on 2C1-Z ja g X on -O-Cl^-bentseeni-polystyreenihartsikanta ja .

Sen jälkeen kun viimeinen Tyr-lähde on liitetty hartsiin, BOC-ryhmä poistetaan TFAin 45 % C^C^-liuoksel-25 la. Jäljelle jäävän peptidi-hartsi-yhdistelmän hajottamiseksi ja suojausten poistamiseksi sitä käsitellään 1,5 mlilla anisolia, 0,25 mlilla metyylietyylisulfidia ja 10 mlilla fluorivetyä (HF) grammaa kohden peptidi-hartsi-yhdistelmää puoli tuntia -20°Cissa ja puoli tuntia 0°C:ssa. Sen jälkeen 30 kun HF on poistettu suuressa alipaineessa, hartsi-peptidi-jäännös pestään vuorotellen vedettömällä dietyylieetteril-lä ja kloroformilla ja peptidi uutetaan sitten kaasunpois-tokäsitellyllä etikkahapon 2N vesiliuoksella. Etikkahappo-uuttoliuoksen kylmäkuivaus antaa tulokseksi valkoisen höy-35 tälemäisen aineen.

Peptidi, joka on irrotettu hartsista ja josta suojaukset on poistettu, liuotetaan sitten 30 % etikkahappoon ja suodatetaan käyttäen Sephadej^3-50-hienogeeliä.

i3 79716

Peptidi puhdistetaan sitten perusteellisemmin CM-32-karboksimetyyliselluloosa(Whatman)kationinvaihtokromatogra-fialla (1/8 x 18 cm, νΐςβΓΓ03 = 50 ml) käyttäen koveraa gra-dienttia, joka kehitetään tiputtamalla 1 litra 0,4M NH^OAc:a, 5 jonka pH on 6,5, sekoituspulloon, joka sisältää 400 ml 0,01M NH40Ac:a, jonka pH on 4,5. Lopullinen puhdistus suoritetaan partitiokromatografiällä käyttäen Sephadex^-50 -hienogeeliä (Pharmacia) ja eluoimalla nBuOH-EtOH-pyridii-ni-HOAc(0,2 N) -liuotinsysteemillä (4:1:1:7). Puhdistuksen 10 yksityiskohdat esitetään yleisluontoisesti julkaisussa

Ling et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 95 (1980) 945. Kromatografiajakeet tutkitaan huolellisesti TLC:llä ja vain suurin piirtein puhtaat jakeet yhdistettiin.

Aminohappoanalyysi suoritetaan suljetuissa putkissa 15 tehdyn hydrolyysin jälkeen käyttäen metodiikkaa, jota kuvataan julkaisussa Anal. Biochem. 126 (1982) 144-156, ja käyttäen liquimat III -aminohappoanalysaattoria sen tarkistamiseksi, että saatu aminohappojärjestys on oikea ja analyysi antoi seuraavat tulokset: Asx(3,62), Thr(0,75), 20 Ser (3,5) , Glx(6,83), Gly(2,87), Ala(5,10), Val(0,9),

Met (1 ,23) , Ile (1 ,84) , Leu(5,045), Tyr(2,09), Phe(0,91), Lys(2,31) ja Arg(6,61). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen .

Esimerkki II

25 PGRF(1-40):n, jolla on kaava H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-

Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-OH, synteesi tehdään asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja kloorimetyloi-30 tua hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan suurin piirtein puhtaaksi TLC:ä ja HPLC:ä käyttäen.

Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatiin oikea aminohappojärjestys ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(3,89), Thr(0,88), 35 Ser (3,66) , Glx(7,04), Gly(3,07), Ala(4,02), Val(0,96),

Met(1,01), Ile (1,86), Leu(4,28), Tyr(2,0), Phe(0,86), i4 7971 6

Lys(2,24) ja Arg(4,15). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen.

Esimerkki IIA

PGRF(1-34):n, jolla on kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-5 Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-

Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-OH, synteesi tehdään asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja kloorimetyloitua hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan suurin piir-10 tein puhtaaksi TLC:ä ja HPLC:ä käyttäen.

Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatu aminohappojärjestys on oikea ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(2,87), Thr(0,78),

Ser(3,78) , Glx(5,11), Gly(1,93), Ala(3,03), Val(0,88), 15 Met(0,96), Ile (1 ,88) , Leu(4,14), Tyr(2,05), Phe(1,07),

Lys(2,29) ja Arg(3,22). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen .

Esimerkki IIB

Vapaan hapon PGRF1-31), jolla on kaava: H-Tyr-Ala-20 Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-OH, synteesi suoritetaan asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja kloorimetyloitua hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan suurin piir-25 tein puhtaaksi TLC:ä ja HPLCsä käyttäen.

Suoritetaan aminohappoanalyysi hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatiin oikea aminohappojärjestys ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(2,73), Thr(0,75),

Ser (2,77) , Glx(3,95), Gly(0,98), Ala(3,06), Vai (0,80), 30 Met (0,98) , Ile(1,77), Leu(4,28), Tyr(2,23), Phe(1,14), Lys(2,34) ja Arg(3,22). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen .

Esimerkki IIC

Vapaan hapon PGRF(1-28), jolla on kaava: H-Tyr-Ala-35 Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-OH, 15 7 9 71 £

« ' « · V

synteesi suoritetaan asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja kloorimetyloitua hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan suurin piirtein puhtaaksi käyttäen TLC:ä ja HPLCrä.

5 Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatiin oikea aminohappojärjestys, ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(2,66), Thr(0,73), Ser(2,66), Glx(1,98), Gly(0,81), Ala(2,89), Val(0,90),

Met (1 ,15) , Ile (1,72) , Leu(4,14), Tyr(2,43), Phe(1,58), 10 Lys(2,15) ja Arg(2,19). Analyysi vahvisti oikean järjestyk sen.

Esimerkki III

PGRF(1-44)-amidin, jolla on kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-15 Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2, synteesi suoritetaan asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja MBHA-hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Tämä peptidi todetaan suurin piirtein puh-20 taaksi käyttäen TLC:ä ja HPLC:ä-.

Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatiin oikea aminohappojärjestys ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(3,75), Thr(0,80), Ser (3,60) , Glx(6,98), Gly(3,16), Ala(5,04), Val(0,77), 25 Met(1,02), Ile(1,79), Leu(5,41), Tyr(2,03), Phe(0,84),

Lys(2,39) ja Arg(6,43). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen .

Esimerkki IV

PGRF(1-40)-amidin, jolla on kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-5 Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NH2, synteesi suoritetaan asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja MBHA-hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan suurin piirtein puhtaaksi käyttäen TLC:ä ja HPLC:ä.

16 7971 6

Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatiin oikea aminohappojärjestys ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(3,76), Thr(0,88),

Ser(3,68), Glx(6,89), Gly(3,12), Ala(4,08), Val(0,88),

Met(1,36), Ile(1,76), Leu(4,24), Tyr(2,00), Phe(0,80), Lys(2,32) ja Arg(4,16). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen .

Esimerkki V

Vapaan hapon PGRF(l-37), jolla on kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-OH, synteesi suoritetaan asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja kloori-metyloitua hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan suurin piirtein puhtaaksi käyttäen TLC:ä ja HPLC:ä.

Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatiin oikea aminohappojärjestys ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(3,92), Thr(0,79),

Ser(3,62), Glx(7,05), Gly(l,97), Ala(3,17), Val(l,03),

Met(1,0), Ile (1,91), Leu(4,37), Tyr(l,86), Phe(0,76), Lys(2,15) ja Arg(3,40). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen .

Esimerkki VA

PGRF(1-37)-amidin, jolla on kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NH2, synteesi suoritetaan asteittain käyttäen Beckman 990 Peptide Synthesizer:a ja MBHA-hartsia esimerkissä I kuvatulla tavalla. Peptidi todetaan suurin piirtein puhtaaksi käyttäen TLC:ä ja HPLC:ä.

Aminohappoanalyysi suoritetaan hydrolyysin jälkeen sen tarkistamiseksi, että saatiin oikea aminohappojärjestys ja se antoi seuraavat tulokset: Asx(4,02), Thr(0,80),

Ser(3,49), Glx(6,90), Gly(l,92), Ala(3,08), Val(l,05),

Met(1,01), Ile(1,77), Leu(4,05), Tyr(2,02), Phe(l,14), Lys(2,50) ja Arg(3,27). Analyysi vahvisti oikean järjestyksen.

7971 6

Esimerkki VI

Sen määrittämiseksi, kuinka tehokkaita peptidit ovat kasvuhormonin vapautumisen edistämisessä, suoritetaan in vitro määritykset käyttäen esimerkin II synteetti-5 siä PGRF(1-40):ä rinnakkaisvertailussa yhtä suuriin pitoisuuksiin (mmol/ml) uutettua ja puhdistettua, luonnossa esiintyvää PGRF(1-40):ä ja GRF-vertailustandardia, jolla on tunnettu tehokkuus aivolisäkesoluista tapahtuvan kasvuhormonin vapautumisen edistämisessä. GRF-vertailustandardi 10 kuvataan ja määritellään julkaisussa Brazeau et ai.,

Endocrinology 110 (1982) A538 ja se on sellainen määrä rotan hypothalamuksesta peräisin olevaa preparaattia, joka saa aikaan biologisessa yksisolukerrosmäärityksessä vasteen, joka on puolet maksimista, ilmoitettuna GH:n vapautumisena 15 aivolisäkesolussa. Käytetään viljelmiä, jotka sisältävät rotilta noin 4-5 päivää aikaisemmin poistettujen aivolisäkkeiden soluja. Sekä viljelmiä, joita on kasvatettu tarkkaan määritellyllä standardialustalla sekä viljelmiä, joita pidetään optimaalisina kasvuhormonin erittymisen kannalta, 20 käytetään vertailevassa kokeessa, jota on kuvattu yleis luontoisesti julkaisussa Brazeau et ai., Regulatory Peptides 1. (1981 ) 255. Inkubointi tutkittavan aineen kanssa kestää 3-4 tuntia ja. yhtä suuret määrät elatusainetta poistetaan ja käsitellään niiden immuunireaktiivisen GH:n 25 (ir-GH) pitoisuuden määrittämiseksi hyvin tunnetulla radio immunologisella määrityksellä (RIA). Tämän vertailevan kokeen tulokset osoittavat, että yhtä suurina moolimäärinä synteettisellä PGRF(1-40):llä on täysimääräinen luonnossa esiintyvän peptidin biologinen aktiivisuus, kuten taulu-30 kossa I on esitetty. Synteettisen peptidin ED,-q on noin : 113 pikogrammaa ja se on paljon tehokkaampi kuin mikään muu molekyyli, josta tähän mennessä on esitetty vaatimuksia GH:a vapauttavana tekijänä.

ie 7971 6

Taulukko I

GRF-vertailustandardi GH:n eritys in vitro % vertailunäytteistä 0,63 yksikköä 173 + 0,4 5 1,25 yksikköä 230 + 5 2,50 yksikköä 347 + 13 5,00 yksikköä 474 + 3 10,00 yksikköä 674 + 6

Luonnossa esiintyvä PGRF(1-40) 10 12,5 femtomoolia 234 + 17 25 f mol 351 4. 7 50 fmol 528 + 16 100 fmol 720 + 32 200 fmol 748 + 7 15 Synteettinen PGRF(1-40) 10 fmol 269 + 20 100 fmol 701 + 6 1000 fmol 990 + 42

Kasvuhormonin eritystä koskevien in vitro -kokeiden 20 lisäksi tehtiin myös in vivo -kokeita antamalla synteettis-; tä peptidiä ruiskeena tavallisille urosrotille, joiden pai- ; no oli noin 200 g ja jotka oli nukutettu pentobarbitaalilla.

Taulukossa II esitetyt tulokset osoittavat, että synteettinen PGRF-peptidi on voimakas aivolisäkkeen kasvuhormonin 25 erityksen stimuloija.

Taulukko II

Synteettisen PGRF(1-40):n in vivo -vaikutukset aivolisäkkeen kasvuhormonin vapautumiseen yhden ainoan laski-monsisäisen ruiskeen jälkeen normaaleilla rotilla (4 eläin-30 tä käsittelyannosta kohden).

Annokset Vasteet seerumin ir-GH:n (nanogrammaa/ml) ilmoitettuina ajankohtina ennen ruisketta ja sen jälkeen -1 min +5 min +10 min +15 min +30 min +60 min 0 /Ug 173+ 47 251+ 81 339+139 396+121 749+440 316+ 76 35 0,01 /ug 173+ 23 284+ 20 238+ 51 201+ 47 261+ 50 299+ 25 0,1 ^ug 276+126 694+246 582+290 758+562 280+ 70 424+129 1/0 ^ug 142+ 24 4551+1825 1748+564 730+158 234+ 53 267+129 10,0 ^ug 234+ 76 7077+1943 4676+585 2464+378 616+112 223+ 26 i9 7971 6

Lisäkokeet osoittavat, että esimerkkien V ja VA synteettisillä jakeillakin on hyvin huomattava biologinen tehokkuus. Lisäksi esimerkin IV PGRF(1-40)-peptidin, joka sisältää C-terminaalisen -karboksamidin, biologinen tehok-5 kuus on suurin piirtein kaksinkertainen esimerkissä VI

testattuun synteettiseen peptidiin verrattuna.

Esimerkki VII

Esimerkissä VI kuvatut in vitro -määritykset toistetaan käyttäen luonnossa esiintyvää PGRF(1-40):ä ja luon-10 nossa esiintyvää PGRF(1-44):ä ja tulokset osoittavat, että luonnossa esiintyvällä PGRF(1-44):llä on yli kaksinkertainen biologinen tehokkuus.

Lisäkokeet osoittavat, että esimerkin I mukaisesti syntetisoitu vapaa happo PGRF(1-44) on jonkin verran tehot-15 tomampi kuin luonnossa esiintyvä PGRF(1-44) ja että synteettinen PGRF(1-44)-amidi on suunnilleen yhtä tehokas kuin luonnossa esiintyvä PGRF(1-44). Synteettisellä PGRF(1-44)-amidilla on, annettaessa sitä ruiskeena koe-eläimille (rotille) , samantyyppinen GH:a vapauttava vaikutus kuin 20 PGRF(1-40):llä esimerkin VI taulukossa II, mutta noin 2,5 - 3,0 kertaa voimakkaampi vaikutus kuin vapaalla hapolla PGRF(1-40) painon mukaan laskettuna.

Yhdysvalloissa syntyneistä lapsista suunnilleen yhden 7 000 - 15 000:sta tiedetään kärsivän aivolisäkkeen 25 kasvuhormonin puutteesta eli olevan "aivolisäkekääpiöitä", so. he ovat kääpiökasvuisia siksi, että heillä ei ole normaaleja aivolisäkkeen GH:n pitoisuuksia veressään. On olemassa kliinisiä syitä väittää, että useimmilla näistä potilaista on normaali aivolisäke ja että syynä heidän ongel-30 maansa on joko hypothalamuksen GH:a vapauttavan tekijän synteesin tai erityksen puuttuminen. Synteettisen PGRF:n odotetaan olevan ihanteellinen hoito näihin tapauksiin, joita on tähän saakka hoidettu antamalla ruiskeina ihmisen aivolisäkkeen GH:a, joka on erittäin kallista ja jota saa-35 daan yksinomaan ihmisen aivolisäkkeistä ruumiinavauksissa.

2o 7971 6

Yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettua ihmisen GH:a; vaikka siitä onkin kerrottu kirjallisuudessa, ei tällä hetkellä ole saatavissa rutiinikäyttöön. Synteettinen PGRF on paljon yksinkertaisempi molekyyli ja sillä pitäisi olla merkittä-5 viä etuja maailmanlaajuista käyttöä silmälläpitäen, sillä maailmassa tällaisten aivolisäkekääpiöiden määrän arvioidaan olevan useita satoja tuhansia.

Koska synteettinen PGRF on ensimmäinen tunnettu molekyyli, jonka avulla voidaan spesifisesti arvioida aivoli-10 säkkeen toimintaa GH:n erityksen suhteen, se edustaa ensimmäistä rutiinikoetta GH-erityksen tutkimiseksi kaikissa tapauksissa, joissa lääkäri epäilee aivolisäkkeen toiminnan spesifistä vajausta. Synteettisen PGRF:n pitäisi siksi korvata tällä hetkellä käytettävät vaivalloiset menetelmät 15 (arginiinitiputukset, hypoglysemia, L-DOPA-ruiskeet, jne.) GH:n erityskyvyn mittaamiseksi diagnostisesti.

Synteettisen PGRF:n pitäisi olla kiinnostava kaikissa tapauksissa kliinisessä lääketieteessä, joissa lääkäri toivoo parantunutta typpitasapainoa ja anaboliaa, kuten 20 haavojen parantamisessa, laajojen palovammojen hoidossa, laajojen leikkauksien jälkihoidossa ja muissa lääketieteellisissä heikkoustiloissa monet käytännön gerontologiassa ja keskosten, hoidossa esiintyvät monet oireyhtymät mukaan luettuina. Potilaiden GH-erityksen stimuloiminen kiinteiden 25 kasvainten laajan sädehoidon aikana ja sen jälkeen on kiinnostavaa, toisaalta anabolian edistämiseksi ja myös hyödyn saamiseksi siitä, että GH stimuloi verenmuodostussysteemin kantasoluja. Ihmisille annettavien synteettisten PGRF-pep-tidien puhtausasteen tulisi olla vähintään noin 93 % ja 30 edullisesti vähintään 98 %. Tämä puhtausaste tarkoittaa sitä, että haluttua peptidiä on mainittu painoprosentti-osuus kaikista läsnäolevista samankaltaisista peptideistä ja peptidifragmenteista.

Useimmilla biologisesti aktiivisilla peptideillä on 35 havaittu olevan myös muita biologisia vaikutuksia kuin ne, jotka niillä ensin on havaittu. Tällaisten ennakkotapausten 2i 79716 valossa on todennäköistä, että PGRF:llä havaitaan olevan sellaisia vaikutuksia aivolisäkkeen ulkopuolella, jotka saattavat olla käytännön kannalta mielenkiintoisia. Vaikka PGRF uutettiin ja eristettiin ihmisen haimakasvaimesta, 5 uskotaan kaiken kokemuksen ja tutkimuksen perusteella, että PGRF(1-44)-amidin aminohappojärjestys on sama kuin ihmisen hypothalamuksen kasvuhormonia vapauttavalla tekijällä.

Synteettisten PGRF-peptidien pitkäaikaisen antamisen kotieläimille tai muille tasalämpöisille eläimille uskotaan 10 edistävän anaboliaa ja siten lisäävän ruumiinpainoa lihasmassan muodossa. Suunnitellaan myös käyttöä vesieläinten kasvatuksessa kalojen ja muiden vaihtolämpöisten merieläimien kasvun kiihdyttämiseksi. Annettaessa eläimille jopa niin pieni puhtausaste kuin 5 % saattaa olla hyväksyttävä.

15 Synteettistä PGRF:a tai sen myrkyttömiä suoloja, yh distettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen farmaseuttiseksi koostumukseksi, voidaan antaa nisäkkäille ihmiset mukaan luettuina joko laskimonsisäisesti, ihon alle, lihakseen tai suun kautta. Lääkäri voi antaa valmis-20 tetta kasvuhormonin vapautumisen stimuloimiseksi silloin, kun potilas tarvitsee sellaista hoitoa. Tarvittava annos vaihtelee hoidettavan tilan mukaan, tilan vakavuuden sekä halutun hoidon pituuden mukaan.

Tällaisia peptidejä annetaan usein farmaseuttisesti 25 hyväksyttävien myrkyttömien suolojen muodossa, kuten happo-additiosuoloina tai metallikomplekseinä, esimerkiksi sinkin, raudan tai vastaavien komplekseina (joita pidetään suoloina tässä yhteydessä). Esimerkkejä tällaisista happoadditio-suoloista ovat hydrokloridi, hydrobromidi, sulfaatti, fos-30 faatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsoaatti, suk-kinaatti, malaatti, askorbaatti, tartraatti ja vastaavat. Aktiivinen aineosa voidaan antaa myös tablettimuodossa, tabletti voi sisältää sideainetta, kuten trakanttikumia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; hajotusainetta, kuten al-35 giinihappoa; sekä liukastetta, kuten magnesiumstearaattia. Jos lääke halutaan antaa liuosmuodossa, voidaan käyttää makeutus- ja/tai makuaineita ja laskimonsisäisesti aine voidaan antaa liuotettuna isotoniseen suolaliuokseen, fos-faattipuskuriliuokseen tai vastaavaan.

22 7971 6

Peptidit tulisi antaa lääkärin valvonnassa ja farmaseuttiset koostumukset sisältävät yleensä peptidiä yhdistettynä tavanomaiseen, farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen. Annostus on tavallisesti noin 20 - noin 5 2 000 ng peptidiä/potilaan painokilo.

Vaikka keksintöä on kuvattu käsitellen sen edullisia toteutusmuotoja, jotka ovat paras keksijöiden tällä hetkellä tuntema ilmaisumuoto, tulisi käsittää, että monenlaisia muutoksia ja muunnelmia, jotka ovat todennäköisesti 10 selviä tavalliselle tämän alan asiantuntijalle, voidaan tehdä. Esimerkiksi muutoksia 44-aminohappoisessa ketjussa, erityisesti poistamista peptidin karboksyyliryhmän sisältävästä päästä alkaen, voidaan tehdä tätä aikaisemmin tunnettujen kokeellisten menetelmien mukaisesti sellaisten frag-15 menttien aikaansaamiseksi, jotka sisältävät vähemmän kuin 40 happotähdettä, kuten esimerkiksi PGRF(l-27), ja joiden karboksyylipäässä on joko NH2 tai OH ja joilla säilyy peptidin koko tehokkuus tai hyvin huomattava osa siitä ja sellaiset peptidit katsotaan keksinnön piiriin kuuluviksi. Sitä 20 paitsi voidaan tehdä lisäyksiä jompaankumpaan päähän tai molempiin päihin ja/tai yleensä ekvivalentit happotähteet voidaan korvata luonnossa esiintyvillä happotähteillä, joka on yleisesti peptidikemiassa tunnettu tapa sellaisten analogien tuottamiseksi, joilla on ainakin pääosa luonnossa esiin-25 tyvän polypeptidin tehokkuudesta.

Claims (9)

23 7971 6

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I 5 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser- Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-R^-R 10 jossa R on OH tai NH2 ja R^ on Arg, Arg-Ala, Arg-Ala-Arg, Arg-Ala-Arg-Leu tai des-R^, tai niiden biologisesti aktiivisten fragmenttien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) muodostetaan peptidivälituote, joka sisältää vä-15 hintään yhden suojaryhmän ja jolla on kaava II X3-Tyr (X2) -Ala-Asp (X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Asn-Ser (X5) -Tyr(X2)-Arg(X6)-Lys(X7)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X5)-Ala-Arg(X^)-Lys(X7)-Leu-Leu-Gin-Asp(X3)-Ile-Met-Ser(X^)-20 Arg(X6)-Gln-Gln-Gly-Glu(X3)-Ser(X5)-Asn-Gln-Glu(X3)- Arg(X^)-Gly-Ala-Arg(X^)-Ala-Arg(X^)-Leu-X^ jossa X3 on vety tai Ct-aminoryhmää suojaava ryhmä; 2 X on vety tai Tyr:n fenolihydroksyyliryhmää suojaava 25 ryhmä; 3 X on vety tai Asp:n tai Glu:n karboksyyliryhmää suojaava ryhmä; 4 X on vety tai Thr:n alkoholihydroksyyliryhmää suojaava ryhmä;

30 X^ on vety tai Ser:n alkoholihydroksyyliryhmää suojaava ryhmä; X^ on vety tai Arg:n guanidoryhmää suojaava ryhmä; X on vety tai Lys:n sivuketjuaminoryhmää suojaava ryhmä; O ja X on -0-CH2-polystyreenihartsikantaja tai -NH-bentsyy-35 lihydryyliamiinihartsikantaja; tai tarkoituksenmukaisesti C-päätteestä lyhennetty muunnos siitä, liittämällä järjestyksessä suojatut aminohapot suhteessa noin yksi millimooli suojattua aminohappoa yhtä 24 7971 6 grammaa sopivassa liuottimessa, edullisesti metyleeniklo-ridissa tai dimetyyliformamidissa tai niiden seoksessa olevaa hartsia kohti, ja b) lohkaistaan suojaryhmät ja erotetaan peptidi 5 hartsikantajasta käyttämällä TFA:ta sopivassa liuottimessa, joka edullisesti on minkä jälkeen käytetään HF yh dessä huuhteluaineen kanssa, joka edullisesti on anisoli tai metyylietyylisulfidi tai niiden seos, alhaisessa lämpötilassa, edullisesti noin 0°C ja -20°C:n välillä, ja sitten 10 peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen, edullisesti etikka-happoon, ja puhdistetaan käyttäen tunnettuja menetelmiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että on Arg-Ala-Arg-Leu.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetel- 15 mä, tunnettu siitä, että R on Nl·^.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R on OH.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan H-Tyr-Ala-Asp-

20 Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2.

6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen menetelmä, 1 2 tunnettu siitä, että X on BOC, X on 2,6-dikloo- 3 4 5 6. ribentsyyli, X on Bzl, X on Bzl, X on Bzl, X on Tos ja

25 X7 on 2-klooribentsyylioksikarbonyyli.

7. Peptidivälituote, jolla on kaava 25 7971 6 5 oksyyliryhmää suojaava ryhmä; X on vety tai Ser:n alko- g holihydroksyyliryhmää suojaava ryhmä; X on vety tai Arg:n 7 guamdoryhmää suojaava ryhmä; X on vety tai Lys:n si- y vuketjuaminoryhmää suojaava ryhmä; ja X on -0-CH2~poly-5 styreenihartsikantaja tai -NH-bentsyylihydryyliamiinihart- sikantaja. 26 7971 6