FI91075B - Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi - Google Patents

Description

91075

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien peptidien 5 valmistamiseksi, jotka estävät nisäkkäillä gonadotropii-nien vapauttamista aivolisäkerauhasesta aiheuttamatta kuitenkaan turvotusvastavaikutuksia. Erityisesti tämä keksintö koskee menetelmää luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin (LHRH), jolla on kaava 10 p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, analogien ja niiden suolojen valmistamiseksi.

Yli 15 vuoden ajan ovat tutkijat etsineet selek-15 tiivisesti tehokkaita LHRH-dekapeptidin antagonisteja [M. Karten ja J.E. Rivier, Endocrine Reviews, 7, 44 - 66 (1986)]. Suuri kiinnostus sellaisia antagonisteja kohtaan perustuu niiden höydyllisyyteen endokrinologian, gynekologian, raskauden ehkäisyn ja syövän alalla. On valmis-20 tettu suuri määrä yhdisteitä potentiaalisina LHRH:n antagonisteina. Kiinnostavimpia tähän mennessä löydettyjä antagonisteja ovat ne yhdisteet, joiden rakenne edustaa LHRH-rakenteen muunnelmaa.

Ensimmäinen sarja tehokkaita antagonisteja saatiin 25 sijoittamalla aromaattisia aminohappojäännöksiä asemiin 1, 2, 3 ja 6 tai 2, 3 ja 6. Yhdisteet kuvataan LHRH:na, jossa alkuperäisten aminohappojäännösten korvaaminen muilla on ilmaistu yläindeksien avulla. Tunnettuja antagonisteja ovat: . . 30 [Ac-D-Phe(4-C1 )1,2,D-Trp3,6]LHRH (D.H. Coy et ai., julkaisussa: Gross, E. ja Meienhofer, J. (toimittajat). Peptides, Proceedings of the 6th American Peptid Sympo- • · sium, s. 775 - 779, Pierce Chem. Co., Rockville, 11., 1979); 35 [Ac-Pro1, D-Phe(4-Cl)2, D-Nal( 2 )3·6] LHRH (US-pa- ____: tentti no. 4 419 347) ja [Ac-AS-Pro1, D-Phe(4-Cl)2, D-Trp3·6]LHRH (J.L. Pineda et ai., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 420, 1983).

2

Antagonistien vesiliukoisuuden lisäämiseksi sijoitettiin myöhemmin emäksisiä aminohappoja, kuten esimerkiksi D-Arg, 6-asemaan. Esimerkiksi [Ac-D-Phe(4-Cl)1,2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10]LHRH (ORG-30276) (D.H. Coy et ai., 5 Endocrinology, 100, 1 445, 1982); ja [Ac-D-Nal(2J1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6]LHRH (ORF 18260) (J.E. Rivier et ai., julkaisussa: Vickery B.H., Nestor, Jr. J.J., Hafez, E.S.E. (toimittajat), LHRH and Its Analogs, s. 11 - 22, MTP Press, Lancaster, UK, 10 1984).

Analogit eivät osoittaneet ainoastaan odotettua parantunutta vesiliukoisuutta, vaan niillä ilmeni myös parantunut antagonistinen vaikutus. Nämä erittäin tehokkaat, hydrofiiliset analogit, joissa on D-Arg ja muita 15 emäksisiä sivuketjuja 6-asemassa, aiheuttivat kuitenkin ohimenevän turvotuksen muodostumista kasvoihin ja raajoihin, kun niitä annettiin rotille annoksina 1,25 tai 1,5 mg/kg ihon alle (F. Schmidt et ai., Contraception, 29, 283, 1984; J.E. Morgan et ai., Int. Archs. Allergy Appi. 20 Immun. 80, 70, (1986). Koska turvotusta aiheuttavien vai kutusten esiintyminen rotilla näiden antagonistien antamisen jälkeen synnytti epäilyksiä niiden turvallisuudesta ihmisten käytössä ja siten jarrutti näiden lääkkeiden ottamista kliiniseen käyttöön, on toivottavaa kehittää an-25 tagonistisia peptidejä, joilla ei ole näitä sivuvaikutuksia.

Keksinnön mukaisesti valmistetut peptidit ovat LHRH:n antagonisteja, joilla on emäksisten peptidien parantunut vesiliukoisuus ja suuri antagonistinen tehok-30 kuus, mutta joilla ei ole turvotusta synnyttäviä vaikutuksia. Nämä yhdisteet estävät erittäin tehokkaasti gona-dotropiinien vapauttamista aivolisäkerauhasesta nisäkkäillä mukaan luettuna ihmiset.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää yhdiste!-35 den valmistamiseksi, joilla on kaava X-R1-R2-R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2 (I) 91075 3 jossa X on asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 hiiliatomia sisältävien, alifaattisten tai alisyklisten karboksyyli-happojen suorista tai haarautuneista ketjuista, tai kar-5 bamoyyliryhmä, R1 on D- tai L-Pro, D- tai L-A3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-Hl), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) tai D-Nal(2), R2 on D-Phe tai D-Phe(4-Hl), R3 on D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) tai 10 D-Nal(2), R6 on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q) ja R10 on Gly tai D-Ala, jolloin Hl on fluori, kloori tai bromi ja Q on C1.3-alkyy-li, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditio-15 suolojen valmistamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnus omaista, että peptidikemiassa tavallisen fragmenttikondensaation avulla kondensoidaan vastaavat peptidifragmentit tai peptidi rakennetaan asteittain lähtöaminohapoista 20 peptidikemiassa tavallisen faramgnettikondensaation avul la tai kaavan I mukaisessa peptidissä, jossa R6 on D-Orn tai D-Lys, D-Orn:n tai D-Lys:n vapaa aminoryhmä muutetaan saattamalla reagoimaan alkalisyanatin kanssa tai yhdisteen kanssa, joka tuottaa syanaatin, tai C^-alkyyli-iso-25 syanaatin kanssa ureidoryhmäksi ja saadut peptidit mahdollisesti asyloidaan ja/tai muutetaan amideiksi ja mahdollisesti muutetaan fysiologisesti vaarattomiksi happosuoloiksi.

30 Keksinnön mukaisessa menetelmässä syntyy välipep- tidejä tai välipeptidihartseja, joilla on kaava

XJ-R1-R2-R3-Ser (X4) -Tyr( X5 )-R*6( X6) -Leu-Arg( X®) -R10-NH-X10 II

35 jossa

Xt on asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 hiiliatomia sisältävien alifaattisten tai alisyklisten karboksyyli- 4 happojen suorista ja haarautuneista ketjuista (erityisesti asetyyli), t-Boc, vety tai karbamoyyli, X4 on Ser-hydroksiryhmän suojaryhmä (esimerkiksi bentsyyli, 2,6-diklooribentsyyli), 5 X5 on Tyr-fenolihydroksyyliryhmän suojaryhmä (esi merkiksi bentsyyli, 2,6-diklooribentsyyli, 2-kloori(2-bromi)-bentsyyliloksikarbonyyli; bentsyyliloksikar-bonyyli), X6 on Lys- tai Orn-sivuketjuaminoryhmän suojaryh-10 mä (bentsyylioksikarbonyyli, 2-klooribentsyylioksikarbo-nyyli), X8 on Arg-guanidinoryhmän suojaryhmä (N02, Tos), X10 on bentshydryyli- tai metyylibentshydryyliryh-miä sisältävä kantajahartsi, 15 R1 on D- tai L-Pro, D- tai L-A3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-H1), d-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) tai D-Nal(2), R2 on D-Phe tai D-Phe(4-Hl), R3 on D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) tai D-Nal(2), 20 R*6 on D-Lys tai D-Orn, D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q) ja R10 on Gly tai D-Ala, jolloin Hl on fluori, kloori tai bromi.

Erään menettelytavan mukaan esimerkiksi muutetaan 25 kaavan II mukainen peptidi, jossa R*6 on D-Lys tai D-Orn ja X6 on vety, syanaatin tai yhdisteen, joka tuottaa syanaatin (syanaattilähde), avulla kaavan III mukaiseksi peptidiksi: X1-R1-R2-R3-Ser (X4) -Tyr( X5 )-R**6-

30 Leu-Arq( Xs)-Pro-R10-NH-X10 III

jossa symboleilla Xlr R1, R2, R3, X4, X5, X8, R10 ja X10 on ilmoitetut merkitykset ja R**6 on Cit, Hei, Cit(Q) tai Hci(Q). Tämä reaktio suoritetaan mieluimmin, kun on 35 asyyli ja kaikki muut jäännökset X on vety.

Sopivia syanaatteja tai syanaatin tuottavia yhdisteitä ovat: alkalisyanaatit (esimerkiksi kaliumsyanaat- I! 91075 5 ti), N-alempialkyyli-isosyanaatti (N-etyyli-isosyanaat-ti). Kaavan II mukaiset peptidit syntetisoidaan mieluimmin tunnetun kiinteäfaasitekniikan avulla. Muuttaminen syanaateilla tai syanaatin tuottavilla yhdisteillä suori-5 tetaan liuottimissa, mieluimmin aproottisissa liuottimis-sa kuten esimerkiksi vesipitoisessa DMF:ssa, lämpötiloissa väliltä 0 - 50 °C, mieluimmin 0 - 25 °C.

Tämän reaktion edistymistä, toisin sanoen Orn/ Lys-peptidien muuttumista vastaaviksi Cit/Hci-peptideik-10 si, voidaan helposti seurata HPLC:n avulla MeCN-vesipi- toisissa TFA-systeemeissä, johtuen Cit/Hci- ja esimerkiksi Cit(etyyli)/Hei(etyyli)peptideille tunnusomaisesta re-tentioajan pidentyneisyydestä 2,6 ± 0,3 minuutilla verrattuna vastaaviin Orn/Lys-peptideihin.

15 Kaavan I mukaisia peptidejä, joissa X on asyyli- ryhmä, saadaan suoraan suorittamalla lohkaiseminen ja suojauksen poistaminen kaavan II mukaisille välipeptidi-hartseille, joissa Xx on asyyliryhmä ja R*6 on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q), ja kaavan I mukaisia pepti-20 dejä, joissa X on karbamoyyliryhmä, saadaan kaavan II mukaisista peptidihartseista, joissa Xj on vety tai Boc, nimittäin lohkaisemalla ja poistamalla suojaus ja sen jälkeen karbamoyloimalla.

Gonadotropiinia vastaan vaikuttava farmaseuttinen 25 valmiste aikaansaadaan sekoittamalla kaavan I mukaista yhdistettä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa, mukaan luettuna mikropalloset hidastettua vapauttamista varten.

Peptidien määrittelyyn käytetty nimistö on yhtäpi-30 tävä biokemian nimistöä käsitelleen IUPAC-IUB-komitean esittämän nimistön kanssa (European J. Biochem., 1984, 138, 9 - 37), jolloin yhdenmukaisesti totunnaisen esitystavan kanssa N-päässä olevan aminoryhmät esiintyvät vasemmalla ja C-pään karboksyyliryhmä oikealla. Ilmausta 35 luonnolliset aminohapot käytetään yleisesti luonnollisesti esiintyvistä aminohapoista, joita on proteiineissa ja jotka käsittävät aminohapot Gly, Ala, Vai, Leu, Ile, Ser, 6

Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Yksittäisistä aminohappojäännöksistä käytetyt lyhennykset perustuvat aminohappojen triviaali-nimiin ja ovat Ala, alaniini; Arg, arginiini; Cit, sit-5 rulliini; Gly, glysiini; Hei, homositrulliini; Leu, leu-siini; Lys, lysiini; Pal(3), 3-(3-pyridyyli)alaniini; Nal(2), 3-(2-naftyyli)alaniini; Nal(l), 3-(1-naftyyli)-alaniini, Orn, ornitiini; Phe, fenyylialaniini;

Phe(4-Cl), 4-kloorifenyylialaniini; Phe(4-F), 4-fluori-10 fenyylialaniini; Pro, proliini; Ser, seriini; Trp, tryp-tofaani ja tyr, tyrosiini. Kaikki tässä kuvatut aminohapot kuuluvat L-sarjaan, ellei toisin ole mainittu, esimerkiksi D-Trp tarkoittaa D-tryptofaania ja D-Nal(2) tarkoittaa 3-(2-naftyyli)-D-alaniinia. D-Cit(Q) tai D-Hci(Q) 15 tarkoittaa, että sitrulliinin (homositrulliinin) ureido-osan aminoryhmän H-atomi on korvattu alkyyli-ryhmällä Q. Muita käytettyjä lyhennyksiä ovat AcOH etikkahappo

AcOEt etyyliasetaatti 20 Ac20 etikkahapon anhydridi

Boc- tert. butyylioksikarbonyyli- DIC di-isopropyylikarbodi-imidi DIEA N,N-di-isopropyylietyyliamiini DMF dimetyyliformamidi 25 HoBt 1-hydroksibentseenitriatsolihydraatti HPLC korkeapainenestekromatografia

MeOH metyylialkoholi TEA trietyyliamiini DCC disykloheksyylikarbodi-imidi 30 MeCN asetonitriili

IpOH isopropanoli Z(2-C1) 2-klooribentsyylioksikarbonyyli DCB 2,6-diklooribentsyyli

Tos p-tolueenisulfonyyli 35 TFA trifluorietikkahappo Z bentsyylioksikarbonyyli li 91075 7

Erityisen hyvinä pidetään kaavan I mukaisia LHRH-analogeja, joissa; X on asetyyli tai karbamoyyli, R1 on D-Phe(4-C1), D-Nal(2), Pro tai D-Phe, 5 R2 on D-Phe(4-C1) tai D-Phe(4-F), R2 on D-Trp tai D-Pal(3), R^ on D-Cit, D-Hci, D-Cit(etyyli), D-Hci(etyyli) ja R10 on D-Ala.

Kuten edellä on mainittu, keksinnön mukainen peptidien 10 valmistus tapahtuu siten, että ne valmistetaan peptidikemias-sa yleisesti käytetyn fragmenttikondensaation avulla vastaavista peptidifragmenteissa tai peptidikemiassa tavallisen asteittaisen rakentamisen avulla, tai siten että kaavan I mukaisessa peptidissä, jossa R6 on D-Orn tai D-Lys, D-Orn:n tai 15 D-Lys : n vapaa aminoryhmä muutetaan antamalla reagoida alka-lisyanaatin tai yhdisteen, joka tuottaa syanaatin, tai Cj^-alkyyli-isosyanaatin kanssa ureidoryhmäksi, ja saadut peptidit mahdollisesti asyloidaan ja/tai muutetaan amideiksi ja mahdollisesti muutetaan fysiologisesti vaarattomiksi 20 happosuoloiksi.

Asteittainen rakentaminen tapahtuu esimerkiksi siten, että ensin sidotaan karboksyylipään aminohappo gly-siini tai D-alaniini tai niiden amidien, joissa pysyvä tx-aminoryhmä on suojattu, tähän tarkoitukseen yleisesti 25 käytettyyn synteettiseen kantajaan kovalenttisesti, a-ami-non suojaryhmä lohkaistaan pois, näin saatuun vapaaseen aminoryhmään sidotaan lähinnä seuraava suojattu aminohappo sen karboksyyliryhmän kautta, sitten taas lohkaistaan tämän toisen aminohapon OL-aminon suojaryhmä pois, tähän 30 sidotaan seuraava aminohappo ja tällä tavoin askel askeleelta liitetään syntetisoitavan peptidin muut aminohapot oikeassa järjestyksessä ja kun kaikki aminohapot on liitetty, patenttivaatimuksen 1 mukainen valmis peptidi lohkaistaan pois kantajasta ja mahdollisesti muut läsnä 35 olevat sivufunktioiden suojaryhmät lohkaistaan pois.

8

Fragmenttikytkemisessä käytetään mieluimmin ilman ra-semoitumista tapahtuvaa atsidikytkemistä tai disyklohek-syylikarbodi-imidi/l-hydroksibentsotriatsoli- tai DCC/3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydro-l,2,3-bentsotriatsiini-mene-5 telmää. Voidaan myös käyttää hyväksi fragmenttien aktivoituja estereitä (DCC = disykloheksyylikarbodi-imidi).

Aminohappojen asteittaiseen kondensaatioon sopivat erityisen hyvin bentsyylioksikarbonyyli-aminohappojen aktivoidut esterit, kuten esimerkiksi N-hydroksisukkinimi-10 diesteri tai 2,4,5-trikloorifenyyliesteri ja 4-nitrofe-nyyliesteri. Kahden jälkimmäisen aktiiviesterin aminolyy-siä voidaan erittäin hyvin katalysoida N-hydroksiyhdis-teiden avulla, joiden happamuus on suurin piirtein etikka-hapon luokkaa, kuten esimerkiksi 1-hydroksibentsotriatso-15 Iin avulla.

Väliaminonsuojaryhmiksi soveltuvat poishydrattavat ryhmät, kuten esimerkiksi bentsyylioksikarbonyylijäännös (= Z-jäännös) tai heikon happamuuden avulla pois lohkaistavat ryhmät, kuten esimerkiksi 2-(p-difenyyli)isopropyyli-20 oksikarbonyyli- tai 2-(3,5-dimetoksifenyyli)isopropyyli-'oksikarbonyylijäännös.

Asteittainen kondensaatio tapahtuu suorittamalla synteesi vastaavista, mahdollisesti tavalliseen tapaan suojatuista aminohapoista totunnaiseen tapaan. Samoin on 25 mahdollista käyttää automaattista peptidinsyntetisoijaa, esimerkiksi Beckman Model 990 -peptidinsyntetisoijaa, mahdollisesti käyttäen yleiseen tapaan kaupallisesti saatavissa olevia suojattuja aminohappoja.

Tämä synteesi tapahtuu esimerkiksi tätä tarkoitus-30 ta varten yleisellä tavalla vastaavista suojatuista aminohapoista siten, että ensin sidotaan syntetisoitavan peptidin karboksyyliterminaalinen aminohappo, jonka pysyvä Ä-aminoryhmä on suojattu, tähän tarkoitukseen yleisesti käytettyyn synteettiseen kantaja-aineeseen kovalenttises-35 ti, tt-aminon suojaryhmä lohkaistaan pois, näin saatuun vapaaseen aminoryhmään sidotaan lähinnä seuraava suojattu li 91075 9 aminohappo sen karboksyyliryhmän kautta, sitten jälleen tämän toisen aminohapon Ä-aminon suojaryhmä lohkaistaan pois, tähän sidotaan seuraava aminohappo ja tällä tavoin asekeleelta liitetään syntetisoitavan peptidin muut ami-5 nohapot oikeassa järjestyksessä ja kun kaikki aminohapot on liitetty, lohkaistaan valmis peptidi kantajasta pois ja mahdollisesti lisäksi läsnä olevat sivufunktioiden suo-jaryhmät lohkaistaan pois.

Aminohappojen liittämisreaktio tapahtuu lämpötila-10 alueella 10 - 40 °C, mieluimmin 20 - 30 °C, mahdollisesti tähän tarkoitukseen yleisesti käytetyssä inertissä liuot-timessa tai suspension väliaineessa (esimerkiksi dikloori-metaanissa), jolloin voidaan mahdollisesti liukoisuuden parantamiseksi lisätä 20 %:iin saakka dimetyyliformamidia.

15 Synteettisenä kantajamateriaalina tulevat kysymyk seen synteettiset polymeerit, esimerkiksi turpoava poly-styreenihartsi, joka on helmien muodossa (esimerkiksi, kloorimetyloitu kopolymeraatti, joka on muodostunut poly-styreenistä ja 1 %:sta divinyylibentseeniä). Pysyvien 20 (t-aminoryhmien suojaryhminä tulevat kysymykseen esimerkiksi: tertiaarinen butyylioksikarbonyyliryhmä, karbobent-soksiryhmä tai karbobentstioryhmä (joissa mahdollisesti on kulloinkin p-bromi tai p-nitrobentsyylijäännös), tri-fluoriasetyyliryhmä, ftalyylijäännös, o-nitrofenoksiase-25 tyyliryhmä, trityyliryhmä, p-tolueenisulfonyyliryhmä, bentsyyliryhmä, bentseeniytimessä substituoidut bentsyy-lijäännökset (p-bromi- tai p-nitrobentsyylijäännös), Ä-fenyylietyylijäännös. Tämän lisäksi viitataan myös Jesse P. Greensteinin ja Milton Winitzin kirjaan Chemistry 30 of Amino Acids, New York 1961, John Wiley and Sons, Inc., osa 2, esimerkiksi sivuille 883 ja sitä seuraavat sivut, sekä teokseen The Peptids, osa 2, toim. E. Gross ja J. Meienhofer, Academic, New York, taulukoihin III ja IV.

Nämä suojaryhmät sopivat periaatteessa myös kysymykseen 35 tulevien aminohappojen muiden funktionaalisten sivuryhmien (OH-ryhmät, Nl^-ryhmät) suojaamiseen.

10 Läsnä olevat hydroksiryhmät (seriini, treoniini) suojataan mieluimmin bentsyyliryhmien ja vastaavien ryhmien avulla. Muut aminoryhmät kuin pysyvät Ot-aminoryhmät (esimerkiksi ω-asemassa olevat aminoryhmät; arginiinin 5 guanidinoryhmä) suojataan mieluimmin nitroryhmillä.

Yksittäisten aminohappojen liittäminen toisiinsa tapahtuu tähän tarkoitukseen yleisesti käytetyillä menetelmillä. Erityisesti tulevat kysymykseen: symmetristen anhydridien menetelmä 10 (disykloheksyylikarbodi-imidin läsnä ollessa) karbodi-imidi-menetelmä, karbodi-imidi-hydroksibentsotriatsoli-menetelmä (katso The Peptids, osa 2, toim. E. Gross ja J. Meien-hofer).

15 Arginiinin liittämiseen käytetään mieluimmin kar- bodi-imidi-menetelmää, asparagiinin sekä glutamiinin liittämiseen käytetään mieluimmin karbodi-imidi-hydroksi-bentsotriatsoli-menetelmää (katso The Peptids, osa 2, toim.

E. Gross ja J. Meienhofer). Muita aminohappoja varten käy-20 tetään yleensä symmetristen tai seka-anhydridien menetelmää.

Kaavan 1 mukaisten peptidien, joissa kuitenkin ·’, on D-Orn tai D-Lys (lähtöaineita syanaatin avulla muutta- mistä varten), valmistus voi tapahtua esimerkiksi maini-

• I

.*·.·, 25 tun asteittaisen peptidinrakentamisen tai fragmenttikonden- •v säätiön avulla.

Kun valmistetaan keksinnön mukaisesti peptidejä, joissa R° on Cit(Q) tai Hci(Q), käytetään peptidin synteesissä yleensä vastaavaa päässä olevaa ureidoryhmässä 30 alkyyliryhmällä Q substituoitua Cit:a tai Hci:a.

Peptidien I muuttaminen niiden happoadditiosuoloik-si voidaan suorittaa antamalla niiden reagoida happojen kanssa sinänsä tunnetulla tavalla. Päinvastoin voidaan vapaiden peptidien vapauttaminen suorittaa antamalla niiden 35 happoadditiosuolojen reagoida emästen kanssa.

Il 91075 11

Valmistusmenetelmässä on siis kysymys esimerkiksi yksinomaisesta kiinteäfaasitekniikasta, osittaisesta kiin-teäfaasitekniikasta, fragmenttikondensaatiosta tai klassisesta liuosfaasisynteesistä. (Katso M. Bodanszky, "Prin-5 ciples of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984).

Esimerkiksi yksinomaisen kiinteäfaasisynteesin menetelmiä on kuvattu oppikirjassa "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart ja J.D. Young, Pierce Chem.

Company, Rockford, III., 1984 (2. painos), G. Barany ja 10 R.B. Merrifield, "The Peptides", kappale 1, s. 1 - 285, 1979, Academic Press, Inc.

Klassinen liuossynteesi on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl). Synthese von Peptiden", E. Wunsch (toimit-15 taja) (1974) , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Saksan Liittotasavalta.

Sellaisissa synteeseissä on tavallista, että eri aminohappojäännösten reaktiiviset sivuketjun funktionaaliset ryhmät suojataan sopivien suojaryhmien avulla, jol-20 lainen estää kemiallisen reaktion tässä kohdassa, kunnes ryhmä lopuksi otetaan pois. Yleensä niissä on myös tavallista aminohapon tai fragmentin α-aminoryhmän suojaaminen siksi aikaa kun tämä kokonaisuus reagoi karboksyyliryhmän avulla, minkä jälkeen seuraa Oi-aminon suojaryhmän selek-25 tiivinen poistaminen, jotta seuraava reaktio voisi tapahtua tässä kohdassa. Sen mukaisesti niissä on samoin tavallista valmistaa synteesin yhtenä vaiheena välituote, joka käsittää jokaisen aminohappojäännöksistä ja se on halutun järjestyksen mukaisesti liitetty peptidiketjuun, jolloin 30 sivuketjusuojaryhmät liitetään sopiviin jäännöksiin.

Tämän keksinnön mukaiset menetelmät voidaan suorittaa lukuisia tukifaaseja käyttämällä. Nämä tukifaasit voivat olla esimerkiksi hartseja, kuten bentshydryyliamiini-hartseja (sopivasti 2 % verkkokytkentää), p-metyylibents-35 hydryyliamiinihartseja (sopivasti 2 % verkkokytkentää), tai vastaavia.

12

Kaavassa II: R*, R2 ja R^ ovat edelleen yllä lähemmin kuvatun mukaisia.

on vety tai asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 5 hiiliatomia sisältävien alifaattisten tai alisyklisten karboksyylihappojen suorista tai haarautuneista ketjuista, taia-aminon suojaryhmä. X^:n tarkoittamat a-aminon suojaryhmät ovat sellaisia, jotka alan kehitystason mukaan ovat tunnettuja käytettäviksi asteittaisessa synteesissä 10 polypeptidejä varten. a-aminon suojaryhmäluokista, joita voidaan käyttää X1:nä, voidaan mainita fluorenyylimetoksi-karbonyyli (Fmoc) tai t-butoksikarbonyyli (Boc).

4 X voi olla sopiva Ser:n hydroksyyliryhmän suoja-ryhmä, kuten esimerkiksi bentsyyli (Bzl) ja 2,6-dikloori-15 bentsyyli (DCB). Parhaana pidetty suojaryhmä on Bzl.

X^ voi olla sopiva Tyr:n fenyylihydroksyyliryhmän suojaryhmä, kuten esimerkiksi Bzl, 2-Br-Z ja 2,6-dikloori-bentsyyli (DCB). Parhaana pidetty suojaryhmä on DCB.

X^ on Lys:n tai Orn:n sivuketjuaminoryhmän sopiva 20 suojaryhmä. Esimerkkejä sopivista sivuketjuaminon suoja-ryhmistä ovat bentsyylioksikarbonyyli (Z) ja 2-klooribent-syylioksikarbonyyli /Z-(2-Cl)].

g X on sopiva suojaryhmä Arg:n guanidinoryhmälle, kuten esimerkiksi nitro, Tos, metyyli-(t-butyylibents)-25 sulfonyyli, 4-metoksi-2,3,6-trimetyylibentssulfonyyli; parhaana pidetty ryhmä on Tos.

X10 on amidiryhmää suojaava bentshydryyli- tai metyylibentshydryyliryhmä, joka on kiinnittynyt tähän tarkoitukseen yleisesti käytettyyn kantajahartsiin (esi-30 merkiksi 98 % styreeni - 2 % dinyylibentseenikopolyme-raatti, joka sisältää bentshydryyliamiini- tai metyyli-bentshydryyliamiiniryhmiä).

Sivuketjuaminon suojaryhmän valinta ei ole kriittinen, mutta yleensä valitaan sellainen, joka ei poistu, 35 kun α-aminon suojaryhmiä poistetaan synteesin aikana. 1 91075 13

Kaavan I mukaiset peptidit valmistetaan kaavan II mukaisista välipeptidihartseista alan nykytason perusteella tunnettujen menetelmien mukaan.

Kaavan II mukaisten välipeptidihartsien kiinteäfaa-5 sisynteesi suoritetaan oleellisesti siten kuin Merrifield, J. on kuvannut julkaisussa J. Am. Chem. Soc., 85, s. 2 149 (1963) . Kiinteäfaasisynteesi aloitetaan peptidin C-termi-naalisesta päästä kytkemällä suojattu «-aminohappo sopivaan hartsiin. Tällainen lähtöaine voidaan valmistaa sito-10 maila α-aminosuojattu Gly tai D-Ala amidisidoksella bents-hydryyliamiinihartsiin. Sellaisia kantajahartseja on yleisesti saatavissa kaupallisesti ja niitä käytetään yleensä, kun toivotussa syntetisoitavassa polypeptidissä on C-pääs-sä Ct-karboksiamidi.

15 Eräässä synteesin suoritusmuodossa suojataan Gly:n tai D-Ala:n primaarinen aminoryhmä t-butoksikarbonyloival-la vaikuttaja-aineella ja kytkeminen suoritetaan käyttämällä jotakin tunnetuista dialkyylikarbodi-imidi-kytken-tämenetelmistä.

20 Sopivan kytkentäreagenssin valinta on asiantunti jalle tuttua. Erityisen sopiva kytkentäreagenssi on N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi (DIC).

Aktivoivia reagensseja ja niiden käyttöä peptidi-kytkennässä on kuvattu teoksessa M. Bodanszky, "Prin-25 ciples of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984.

Jokainen suojattu aminohappo tai aminohappojakso lisätään kiinteäfaasireaktoriin käyttäen sen suurin piirtein kaksinkertaista ylimäärää ja kytkeminen voidaan suorittaa väliaineessa DMF^I^C^ (1:1) tai pelkässä 30 Ci^C^issa. Sellaisissa tapauksissa, joissa esiintyy epätäydellistä kytkeytymistä, kytkentämenetelmä toistetaan, ennen kuin poistetaan <t-aminon suojaryhmä ennen seuraavan aminohapon kanssa kytkemistä. Kytkentäreaktion tulosta tutkitaan kussakin synteesin vaiheessa mieluimmin ninhyd-35 riinireaktion avulla kuten on kuvanneet E. Kaiser et ai., Anal. Biochem., 34, 595 (1970).

14

Sen jälkeen kun kaavan II mukaisten peptidihart-sien haluttu aminohapposekvenssi on saatu valmiiksi, poistetaan päässä oleva Boc-ryhmä ja haluttaessa suoritetaan N-terminaalinen asylointi käyttämällä sopivaa asyylihyd-5 ridiä tai happokloridia 50-kertaisena ylimääränä haloge-noidussa hiilivetyliuottimessa; sopivasti etikkahapon an-hydridiä metyleenikloridissa 30 minuutin ajan. Välipepti-di voidaan poistaa kantajahartsista käsittelemällä sitä sellaisella reagenssilla kuin esimerkiksi nestemäisellä 10 fluorivedyllä, joka ei ainoastaan lohkaise peptidiä irti hartsista, vaan lohkaisee myös pois kaikki muut sivuket-jusuojaryhmät X^, X^, X®, X*^ ja X^, mikäli se on läsnä.

Mikäli lohkaisemiseen käytetään fluorivetyä, silloin ovat reaktioputkessa läsnä anisoli tai m-kresoli tai 15 haluttaessa metyylietyylisulfidi huuhteluaineena.

*6 6

Peptidien II, joissa R on D-Lys tai D-Orn ja X

on vety, muuttaminen peptideiksi I syanaatin avulla on kuvattu edellisillä sivuilla.

Jos asylointi jätetään pois, johtaa kaavan II mu-20 kaisten peptidihartsien käsitteleminen fluorivedyllä sellaisten dekapeptidien muodostumiseen, joissa on vapaita omega-amino- ja/tai α-aminoryhmiä ja jotka vastaavat kaavaa II, jossa X., X^, X5, X®, X^ ja, mikäli se on läsnä, g ^ X ovat vety. Nämä vapaat peptidit muutetaan kaavan I mu-25 kaisiksi peptideiksi, joissa X on karbamoyyliryhmä, nimittäin käsittelemällä syanaatilla, sopivasti alkalimetalli-syanaatilla, mieluimmin kaliumsyanaatilla. Viimeksi mainittua reaktiota, toisin sanoen I^Nin muuttamista I^N-CO-NH:ksi peptidien aminopäässä ja Orn/Lys-jäännösten 30 muuttamista Cit/Hci-jäännöksiksi, voidaan helposti tarkkailla HPLC:n avulla käyttäen MeCN-vesipitoisia TFA-sys-teemejä, johtuen karbamoyloiduille peptideille tunnusomaisesta retentioajan pidentyneisyydestä 2-3 minuutin verran, toisin sanoen HjN-CO-NH-ryhmän omaaville yhdis-35 teille, I^N-ryhmän omaaviin yhdisteisiin verrattuna tunnusomaisesta.

Il 91075 15

Vaihtoehtoisesti ja mieluummin saadaan peptidit I, joissa X = asyyli tai karbamoyyli, suoraan kaavan II mukaisista välipeptidi-hartseista, joissa X1 on asyyli tai kar-*6 1 bamoyyli ja R on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q), 5 lohkaisemalla ja poistamalla lohkaisemalla suojaryhmät.

Vaikka tässä kuvataan myös kaavan I mukaisten yhdisteiden yksinomainen kiinteäfaasisynteesi ja osittainen kiinteäfaasisynteesi, voitaisiin yhdisteet valmistaa klassisten liuosfaasimenetelmienkin avulla.

10 Esimerkeissä kuvatulla tavalla valmistettuja, syn teettisiä peptidejä verrattiin kahteen tehokkaimmasta viime aikoina kuvatuista LHRH:n antagonisteista, nimittäin yhdisteisiin /Äc-D-Phe(4-C1)^'2, D-Trp3, D-Arg^, D-Ala^7-LHRH (ORG-30276) (Coy et ai., Endocrinology, 100, 1 445,

15 1982) ja /Äc-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg®7LHRH

(ORF 18260) (Rivier et ai., teoksessa: Vickery, B.H., Nestor, Jr., J.J., Hafez, E.S.E. (toimittajat), "LHRH and Its Analogs", s. 11 - 22, MTP Press, Lancaster, UK, 1984), ja todettiin, että ne osoittivat yhtä voimakkaita estäviä 20 vaikutuksia sekä in vitro että in vivo, tosin sillä poikkeuksella, että päinvastoin kuin kontrollipeptideillä niillä ei ilmennyt in vivo turvotusvaikutuksia.

Hormonaalisia vaikutuksia in vitro verrattiin rottien aivolisäkerauhasen superfundamentoituihin solusys-25 teemeihin (S. Vigh ja A.V. Schally, Peptides, 5 suppl.

1: 241 - 247, 1984), joissa LHRH:n (ja muiden vapauttavien hormonien) vaikutus voidaan todeta tarkkaan, koska LH:n (tai muiden aivolisäkerauhashormonien) määrä, joka erittyy poisvirtaavaan väliaineeseen, ei ainoastaan ole 30 verrannollinen käytetyn peptidin hormoninvapautustehoon, vaan on myös helposti mitattavissa hyvin kuvatun radioim-munoanalyysin avulla.

LHRH:n antagonistin tehokkuuden määrittämiseksi käytetään superfundamentointiin seoksia, jotka sisältävät 35 LHRH:a samana pysyvän konsentraation (tavallisesti 1 nM) ja antagonistia vaihtelevia konsentraatioita, jotta saa- 16 täisiin määritettyä se molekyylinen antagonistin suhde LHRH:n, jossa LHRH:n vaikutus on täysin estynyt. Nämä suhteet ovat suunnilleen 5 kummankin kaavan I mukaisen peptidin ja vertailupeptidin kohdalla, kun rotan aivo-5 lisäkerauhasen solusysteemiä esi-inkuboidaan etukäteen antagonistien kanssa 9 minuutin ajan.

In vivo -ovulaationestokokeessa (A. Corbin ja C.W. Beattie; Endocr. Res. Commun. 2, 1 - 23, 1975; D.H. Coy et ai., Endocrinology, 100, 1 445, 1982) todettiin kaa-10 van I mukaisten peptidien kohdalla samoin, että ne ovat suurin piirtein yhtä tehokkaita kuin kontrolliantagonis-ti, nimittäin kullakin peptidillä voitiin havaita ovulaation 87,5 - 100 % estyminen ihon alle annetun annoksen ollessa 1-3 pg/rotta.

15 Schmidtin et ai. (Contraception, 29, 283 - 289, 1984) turvotuskokeessa voitiin kuitenkin todeta selvä ero kontrollipeptidien ja kaavan I mukaisten peptidien välillä. Kontrollipeptidit aiheuttivat turvotusta kasvoissa ja raajoissa, kun niitä annettiin rotille ihon alle an-20 noksina 1,25 ja 1,5 mg/kg. Kaavan I mukaisilla peptideillä ei voitu havaita sellaista vastavaikutusta, kun niitä annettiin ihon alle annoksena 1,5 mg/kg.

Suoritetuissa kokeissa jaettiin rotat kolmeen ryhmään, siten että kulloinkin oli viisi rottaa ryhmää koh-25 den ja tutkittua yhdistettä kohden. Suoritettiin vertailu tunnetun, alan kehitystason mukaisen yhdisteen kanssa, jolla on nimitys ORG 30276 (N-Ac-D-p-Cl-Phe*'^, D-Trp^, D-Arg^, D-Ala^) .

Ryhmille annettiin kerran päivässä kahtena peräk-30 käisenä päivänä ruiskeena ihon alle LHRH:n antagonisteja annostuksena 1,5 mg/kg. Kontrolliryhmälle annettiin ruiskeena ainoastaan laimennusainetta. Rottia tarkkailtiin 5 tunnin ajan päivää kohden. Rottien reaktiot luokiteltiin seuraavasti: NR ei näkyvää vastavaikutusta, PR osit-35 täinen vastavaikutus: turvotusta nenän alueella ja nenän-vierusalueella, FR täydellinen vastavaikutus: turvotusta kasvoissa ja turvonneet raajat.

Il 91075 17

Alla olevassa taulukossa 1 on yhteenveto tuloksista .

Taulukko 1 5 LHRH:n 1. päivä 2. päivä

antagonisti_NR_PR_FR__NR_PR_FR

ORG 30276 3 7 0 0 0 10 kontrolli 900 900 esimerkki I 800 9 0* 0 10 esimerkki III 800 800 esimerkki IV 9 0 0 9 0 0 esimerkki V 900 81*0 esimerkki XX 900 81*0 esimerkki XXI 900 900 15 esimerkki XXVI 8 0 0 8 0 0 esimerkki XXVII 900 900 * hyvin vähäistä kasvoturvotusta 20 Kaikki valmistetut peptidit ovat täysin tehokkai ta LHRH-vapautuksen estämisessä jossakin määrin järkevinä konsentraatioina in vitro, vaikka useimmat ovat hiukan vähemmän tehokkaita kuin kysymyksessä olevat in vitro-standardit; tosin nämä peptidit ovat in vivo paljon te-25 hokkaampia.

Tämä osoitettiin kokeessa, joka koski histamiinin vapauttamista in vitro vatsakalvon syöttösoluista, joka koe suoritettiin yhdenmukaisesti Morganin et ai. (Int.

Archs. Allergy appi. Immun. 80, 70, 1986) menetelmän kans-30 sa.

Histamiinin vapauttaminen in vitro

Tässä kokeessa rottia nukutettiin eetterin avulla ja vatsaontelotulehdusnestesoluja otettiin talteen pesemällä niitä 12 ml:11a syöttösoluväliainetta (MCM) (150 mM 35 NaCl; 3 mM KC1; 3,0 mM Na2HP04; 3,5 mM KH2PC>4; 0,98 mM

CaCl2; 5,6 mM dekstroosi; 0,1 % vasikan seerumin albumii- 18 ni; 0,1 % gelatiini ja 10 E/ml hepariinia) [9]. Koottiin soluja 4:Itä tai 5:Itä rotalta, ne sentrifugoitiin nopeudella 120 G, uudelleensuspendoitiin MCM:een konsentraa-tioksi 0,5 x 106 ml ja 1 ml annostettiin 12 x 75 mm:n po-5 lyetyleeniputkiin. Putkien annettiin tasoittua 15 minuutin ajan 37 °C:een ja niitä inkuboitiin 60 minuutin ajan yksin (histamiinin taustavapauttaminen), 48/80:n kanssa (positiivinen kontrolli) (Sigma Chemicals, St. Louis,

Mo.) tai sopivien konsentraatioiden kanssa (1 ng -10 10 pg/ml) LHRH:n antagonisteja. Reaktio lopetettiin jääh dyttämällä putket 4 °C:een. Putket sentrifugoitiin; su-pernatantit poistettiin ja niitä säilytettiin -20 °C:ssa, kunnes niistä tutkittiin histamiini. Kokeet suoritettiin kulloinkin kahdesti. Solujen kokonaishistamiini osoitet-15 tiin keittämällä 10 minuutin ajan. Vastavaikutuksena antagonisteille vapautettu histamiini ilmoitettiin prosenttimääränä koko vapautumista. Nämä konsentraatiot, joissa vapautui suurin piirtein 50 % koko syöttösolujen histamiinista (HRDS0 pg/ml), määritettiin jokaiselle antago-20 nistille. Tuloksista on esitetty yhteenveto kuviossa 1.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettua LHRH-analogia, jossa 6-asemassa on D-sitrulliini, verrattiin rakenteeltaan läheiseen, julkaisusta Z. Natur-forschung. 42b (1987) 101 - 106 tunnettuun peptidiin, 25 jossa 6-asemassa on D,L-sitrulliini.

50 päivää vanhoja Spraque-Dawley-naarasrottia (paino 200 - 230 g) käsiteltiin dimetyylibentsantrasee-nillä (DMBA; 20 mg/eläin) suun kautta. Noin 20 päivän kuluttua voitiin todeta ensimmäiset rintakasvaimet. Kasvai-30 men paino määritettiin Druckreyn menetelmällä [Druckrey, H., Steinhoff, D., Nakayama, M., Preussmann, R., Anger, K.: Experimentelle Beiträge zum Dosis-Problem in der Krebs-Chemotherapie und zur Wirkungsweise von Endoxan., Dtsch. Med. Wschr. 88 (1963) 651] vertaamalla kunkin kas-35 vaimen tilavuutta etukäteen muodostettujen plastiliini-

II

91075 19 mallien tilavuuteen. Kasvaimen paino määritettiin kertomalla mallin paino tekijällä, joka muistutti plastiliinin ja kasvainkudosten ominaispainoja. Tämän menetelmän vali-dointi suoritettiin korreloimalla 99 palpoidun kasvaimen 5 painot painoihin, jotka saatiin punnitsemalla suoraan irtileikattu kasvain. Korrelaatiokerroin oli 0,98. Kun ko-konaiskasvainmassa oli noin 1 g, eläimet jaettiin sattumanvaraisesti käsittelyryhmiin ja kontrolliryhmiin, joissa kussakin oli 7 eläintä, ja hoito aloitettiin välittö-10 mästi.

Testattavat yhdisteet olivat Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (D-muoto; D-20761), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-L-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (L-muoto, D-21378) ja Ac-15 D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D,L-Cit-Leu-Arg-

Pro-D-Ala-NH2 (DL-muoto, D-21385). Yhdisteet injektoitiin ihon alle yhtenä annoksena; annoksen suuruus oli 3,16 mg/kg. Koe päätettiin 21 päivän kuluttua ja kasvaimen paino määritettiin. Tulokset esitetään seuraavassa 20 taulukossa 2.

Taulukko 2 D-20761 D-21385 D-21378 kontrolli (D-muoto) (DL-muoto) (L-muoto) 25

Keskimääräinen 0,45 8,6 9,4 9,45 kasvaimen paino g:ina 21 päivän kuluttua koeyh-30 disteen injek tiosta

Kun rottia, joilla oli DMBArlla indusoituja kas-35 vaimia, hoidettiin yhdellä suurella annoksella (3,16 mg/kg) valmisteita D-20761 (D-muoto), D-21378 (L-muoto) ja D-21385 (DL-muoto), havaittiin, että L-muoto oli täysin tehoton estämään kasvaimen kasvua. Myös DL-muoto oli lähes tehoton; saatiin vain 9 %:n inhibitio kontrolliin 20 verrattuna. Sitä vastoin D-muoto esti kasvaimen kasvua hyvin voimakkaasti eli 95 % kontrolliin verrattuna.

Nämä koetulokset osoittavat, että D-muoto toimii hyvin spesifisesti sekä DL- että L-muotoon verrattuna.

5 Kaikilla peptideillä todettiin ovulaatio estävä vaikutus naarasnisäkkäillä hyvin alhaisina annoksina. Kaavan I mukaiset peptidit annettiin usein farmaseuttisesti hyväksyttävien, ei myrkyllisten suolojen, kuten esimerkiksi happoadditiosuolojen, muodossa. Esimerkkejä 10 sellaisista happoadditiosuoloista ovat hydrokloridi, hyd-robromidi, sulfaatti, fosfaatti, fumaraatti, glukonaatti, tannaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsonaatti, sukkinaatti, alginaatti, pamoaatti, malaatti, askorbaat-ti, tartraatti ja vastaavat. Kun vaikuttava aine annetaan 15 tablettimuodossa, voi tabletti sisältää farmaseuttisesti hyväksyttävää laimennusainetta, jossa on sideainetta, kuten esimerkiksi traganttia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; hajotusainetta, kuten algiinihappoa ja liukuai-netta, kuten magnesiumstearaattia.

20 Kun antaminen halutaan suorittaa nestemäisessä muodossa, voidaan käyttää makeutusainetta ja/tai makuainetta farmaseuttisesti hyväksyttävän laimennusaineen osana, ja antamisen tapahtuessa laskimoon se suoritetaan isotoonisessa suolaliuoksessa, fosfaattipuskuriliuoksis-25 sa tai vastaavassa.

Farmaseuttiset valmisteet sisältävät tavallisesti peptidin yhdessä tavanomaisen, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa. Annos on yleensä suurin piirtein 1 - 100 mikrogrammaa peptidiä kilogrammaa kohden 30 saajan ruumiinpainoa antamisen tapahtuessa laskimoon; suun kautta annettavat annokset ovat suurempia. Yleensä tapahtuu koehenkilöiden hoito näillä peptideillä samalla tavoin kuin kliininen hoito muilla LHRH:n antagonisteilla· '35 Näitä peptidejä voidaan antaa nisäkkäille laski moon, ihon alle, lihaksen sisään, suun kautta, nenän si-

II

91075 21 sään tai emättimen sisään, sikiävyyden ehkäisyn ja/tai kontrollin aikaansaamiseksi ja samoin käyttötapauksissa, joissa tarvitaan ohimenevää sukurauhasaktiivisuuden vaimenemista, kuten esimerkiksi hoidettaessa ennenaikaista 5 puberteettia tai sädehoidon tai kemoterapian aikana.

Tepsivät annokset vaihtelevat kulloinkin antamismuodon ja kulloisenkin hoidettavan nisäkäslajin mukaan. Esimerkki tyypillisestä annostusmuodosta on fysiologinen suolaliuos, jossa on peptidiä, ja tätä annetaan annoksena suu-10 rin piirtein 0,1 - 2,5 mg/kg ruumiinpainoa. Peptidin antaminen suun kautta voi tapahtua joko kiinteänä tai nestemäisenä muotona.

Vaikka keksintö on kuvattu huomioiden parhaana pidetty suoritusmuoto, tulisi olla itsestään selvää, että 15 voidaan tehdä vaihdoksia ja muutoksia, jotka ovat asiantuntijalle ilmeisen selviä, ilman että poiketaan oheisten patenttivaatimusten rajoittamalta keksinnön alueelta. Keksinnössä voidaan samoin käyttää alan kehitystason mukaisia korvaamisia, jotka eivät oleellisesti poikkea suo-20 rituksesta.

SB-030, SB-075 ja SB-088 ovat, kuten jäljempänä on kuvattu tarkemmin, dekapeptidejä, joilla on erityisen edullisia vaikutuksia:

Ac—D—Nai (2) -D-Phe( 4C1) -R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 25 SB-030, R3 = D-Trp, R6 * D-Cit; SB-075, R3 - D-Pal, R6 « D-Cit? SB-088, R3 - D-Pal, R6 « D-Hci.

Rakenneosiin sisältyvistä aminohapoista eivät D-Pal, D-Cit ja D-Hci ole kaupallisesti saatavissa. D-Pal 30 vaatii täydellisen synteesin, joka alkaa dietyyliasetami-domalonaatista ja 3-pikolyylikloridistä ja suoritetaan tunnetulla tavalla. D-Cit ja D-Hci voidaan helposti valmistaa kaupallisesti saatavista diaminohapoista, kuten esimerkiksi aminohaposta D-Om tai D-Lys.

22

Jokaisella peptidillä ilmenee voimakas LHRH:a estävä vaikutus, kuten alla on osoitettu, eikä ollenkaan turvotusta aiheuttavia sivuvaikutuksia.

Taulukko 3 5 SB-030:n, SB-075:n ja SB-088:n LHRH:a estävä vai kutus

Peptidi LHRH:n (3 nM) % esty- Ovulaationesto- minen ekvimolaarisella koe 10 määrällä peptidiä ajan kohtana 0 min. 2 tunnin kulut- annos (pg) % esto _tua_ SB-030 83 58 1,5 50 15 3,0 100 SB-088 86 60 1,5 66 2.0 83 3.0 100 SB-075 89 54 1,5 75 20 1,0 100

Lyhennykset: Aminohapot ja suojaryhmät on lyhennetty kuten IUPAC IUB JCBN on suositellut [Eur. J.

25 Biochem. 138, 9-37 (1984)]. Muita lyhennyksiä ovat:

Boc20, di-t-butyylidikarbonaatti; DCM, di-kloorimetaani; TLC/TLE, ohutkerroskromatografia/elektroforeesi silika-geelilevyllä.

SB-030:11a on SB-075:een ja SB-088:aan verrattuna 30 se etu, että se sisältää vain yhden epätavallisen aminohapon, nimittäin aminohapon D-Cit. Toisaalta osoittavat sekä SB-075 että SB-088 suurempaa tehokkuutta ja parempaa vesiliukoisuutta kuin SB-030.

Havainnot ja kokeet, jotka tehtiin SB-030:n, 35 SB-075:n ja SB-088:n synteesin aikana, voidaan esittää ’·“· lyhyesti seuraavasti:

II

91075 23

Kuvataan SB-030:n, SB-075:n ja SB-088:n kiinteä-faasisynteesi bentshydryyliamiinihartsin yhteydessä käyttäen Boc-toimintaohjetta. Tämä menettely on täysin riittävä tämän peptidin kokoamista varten, koska se sisältää 5 asteittaisen ketjunpidentämisen karboksyylipään kautta, jotta vältettäisiin merkittävä rasemoituminen amidisidok-sen muodostamisen aikana, ja samoin siihen sisältyy välituotteiden helppo eristäminen, jotka välituotteet voivat osoittautua erikoisen vaikeiksi syntetisoitaessa luon-10 teeltaan hydrofiilisia fragmentteja (toisin sanoen fragmentteja 9-10-5-10).

Tavanomainen asteittainen synteesi liuoksessa on luonnollisesti myös sopiva näiden peptidien valmistusmenetelmä, mutta se menetelmä vaatii kuitenkin varmasti 15 enemmän työtä ja aikaa.

Lähtöaineet

Kiinteä kantaja Käytettiin bentshydryyliamiinihartsia, joka sisälsi 1,1 mekv. NH2/g (Advanced ChemTech, Louisville, KY).

20 Voidaan myös käyttää pienemmän NH2-pitoisuuden, esim.

0,4 - 0,6 mekv./g, omaavia hartseja, mutta niiden käyttö on luonnollisesti epätaloudellisempaa.

Aminojohdannaiset

Alla mainitut Boc-aminohapot hankittiin toimini-25 meitä Bachem ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta:

Boc-D-Ala, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu.H20,

Boc-D-Nal, Boc-D-Phe(4Cl), Boc-Pro,

Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Trp ja Boc-Tyr(DCB).

Boc-D-Cit, Boc-D-Hci ja Boc-D-Pal, joita ei ole 30 kaupallisesti saatavissa, valmistettiin kirjallisuuden mukaan (1 - 4), vähäisin muutoksin.

Boc-D-Cit

Vaihe 1, D-Cit D-Orn (Sigma, 98 %) muutettiin D-Cit:ksi kuten on 35 kuvattu (1), sillä poikkeuksella, että reaktioseosta, 24 jossa oli (D-Orn)2Cu ja KOCN, sekoitettiin 2-3 tunnin ajan, jotta esitettäisiin (D-Cit, D-Orn)Cu:n muodostaman karstan kerrostuminen astian seinämiin.

D-Cit:n puhtaus tutkittiin TLE:n (ohutkerroselek-5 troforeesi) avulla käyttäen pH-arvon 6,5 omaava pyridii-ni-etikkahappo-vesi (100:4:900) -puskuriliuosta ja 30 V/cm, 45 minuutin aikana.

Vaihe 2, Boc-D-Cit 6,6 g (30 mmoolia) Boc20, joka oli 15 ml:ssa ase-10 tonitriiliä, lisättiin liuokseen, jossa oli 4,4 g (25 mmoolia) D-Cit 25 ml:ssa vettä ja 12,6 ml:ssa (90 mmoolia) trietyyliamiinia. Seosta sekoitettiin 2-3 tunnin ajan. Sen jälkeen seokselle suoritettiin TLC (ohutkerroskromatografia) käyttäen liuotinsysteemiä etyy-15 liasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi (60:10:3:6): yhdisteillä Boc-D-Cit, D-Cit ja Boc-D-Orn (Boc), joka muodostui D-Orn-epäpuhtaudesta, ilmenevät vastaavasti Rf-arvot 0,4, 0,0 ja 0,9. Seosta laimennettiin 25 ml:11a vettä ja uutettiin dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja etyyliase-20 taatilla (2 x 20 ml), jotta poistettaisiin ylimäärä di- karbonaattia ja Boc-D-0rn(Boc)-epäpuhtaus. Vesifaasi tehtiin happamaksi käyttäen 1 M KHS04 ja sen jälkeen kun oli lisätty suunnilleen 10 g Na2S04 uutettiin faasia etyyliasetaatilla (3 x 30 ml). Yhdistetyt etyyliasetaattiliuok-25 set (jotka oli huolellisesti erotettu vesikerroksesta) haihdutettiin tyhjössä. Jäännös laimennettiin kuivalla dioksaanilla ja haihdutettiin tyhjössä kolme kertaa. Tämän seurauksena muodostunut kevyt öljy laimennettiin 25 ml:11a DMF ja käytettiin kytkemiseen pitoisuutena 30 mmooli/ml tätä Boc-D-Cit-perusliuosta.

Boc-Cit:n synteesi käyttäen Boc-atsidia asylointi-aineena ja kiteisen disykloheksyyliamiinisuolan valmistus on kuvattu (2).

Il 91075 25

Boc-D-Hci Vaihe 1, D-Hci D-Hci valmistettiin yhdisteestä D-Lys.HCl (Sigma) vastaavasti kuin D-Cit (katso yllä ja viittaus 1).

5 Vaihe 2, Boc-D-Hci 6,6 g di-tert-butyylikarbonaattia laimennettuna 15 ml:11a asetonitriiliä lisättiin liuokseen, jossa oli 25 mmoolia (4,73 g) D-Hci 25 ml:ssa vettä ja 12,6 ml:ssa (90 mmoolia) trietyyliamiinia, ja reaktioseosta sekoitet-10 tiin 2-3 tunnin ajan. Reaktion täydellisyys tutkittiin TLC:n avulla kuten Boc-D-Cit:n tapauksessa; Boc-D-Hci:n, D-Lys:n ja Boc-D-Lys(Boc):n Rf-arvot olivat vastaavasti 0,3, 0,0 ja 0,8. Reaktioseosta uutettiin eetterillä. Vesi faasi tehtiin happamaksi käyttäen 1 M KHS04 ja sen jäl-15 keen kun oli lisätty 10 g Na2S04, sitä uutettiin etyyliasetaatin ja n-butanolin 1:1-seoksella (4 x 30 ml). Yhdistetyt orgaaniset liuokset kuivattiin Na2S04:n avulla ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännöstä hierrettiin dietyy-lieetterin kanssa, suodatettiin, pestiin eetterillä, sit-20 ten suspendoitiln etyyliasetaattiin ja sekoitettiin 2 tunnin ajan 20 °C:ssa ja lisäksi 0 °C:ssa vielä 2 tunnin ajan. Näin saatu kiteinen materiaali suodatettiin erilleen, pestiin kylmällä etyyliasetaatilla ja kuivattiin, jolloin saatiin suunnilleen 3,9 g Boc-D-Hci:a, jonka su-25 lamispiste oli 141 - 142 °C (hajoaa).

Boc-D-Pal(3)

Vaihe 1, dietyyliasetamido(3-pyridyylimetyyli) ma-lonaatti (3)

Saatiin 113,0 g (60,3 %) dietyyliasetamido(3-pyri-30 dyylimetyyli)malonaattia 132,0 g:sta dietyyliasetamidoma-lonaattia J.E. Rivierin et ai. (3) menetelmän avulla.

Raaka materiaali suli 95 eC:ssa. Pieni näyte 104 -106 °C:ssa sulaneesta (kirjallisuuden mukaan 95 °C) uudelleenkiteytettiin vedestä.

35 Vaihe 2, N-asetyyli-3-(3-pyridyyli)-DL-alaniinin etyyliesteri (4) 26 61,6 g (200 mmoolia) dietyyliasetamido(3-pyridyy-limetyyli)malonaattia laimennettiin tulpalla varustetussa pullossa 210 ml:11a NaOH:n etanoliliuosta ja seisotettiin yön ajan ympäristön lämpötilassa. Seuraavana päivänä seos 5 saatettiin palautusjäähdytysolosuhteisiin ja sitä pidettiin jäähdytyspalautuslämpötilassa 30 minuutin ajan. Seos jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan ja suodatettiin liukenemattomien kiinteiden aineiden poistamiseksi. Liukenemattomia aineita pestiin erilaisilla pienillä määril-10 lä etanolia ja heitettiin sitten pois. Yhdistetyt suodok-set haihdutettiin kuiviin ja kuiva jäännös kiteytettiin vedestä käyttäen 3 - 5 ml H20:tä grammaa kohden kiinteää ainetta. Materiaalin saanto 38,0 (160 mmoolia, 80 %). Sulamispiste 124 - 126 °C (kirjallisuuden mukaan 118 -15 121 °C).

Vaihe 3, N-asetyyli-3-(3-pyridyyli)-D-alaniinin etyyliesteri (3) 45,0 g (190 mmoolia) yllä kuvattua DL-seosta laimennettiin 225 ml:11a kuumaa 4,5 % HC1. Tämä liuos jääh-20 dytettiin sitten nopeasti 25 °C:een hienojen kiteiden suspension muodostamiseksi. pH-arvo säädettiin 7,2:ksi käyttämällä 2 N KOH:a ja sitten lisättiin 150 mg alfaky-motrypsiiniä ja pH-arvo pidettiin sitten välillä 6,8 - 7,2 lisäämällä tipoittain 2 N K0H:a. Sen jälkeen kun pH-25 arvossa ei ollut tapahtunut muutosta 15 minuutin aikana, lisättiin vielä 50 mg alfa-kymotrypsiiniä, jotta varmistettaisiin, että hydrolyysi oli tapahtunut täydellisesti. pH-arvossa ei ilmennyt enää muutosta tämän uuden entsyy-milisäyksen jälkeen ja lopullinen pH-arvo oli 7,2. Tätä 30 liuosta uutettiin 4 x 200 ml:11a etyyliasetaattia. Etyy-liasetaattiuutteet yhdistettiin, kuivattiin Na2S04:n avulla, kuivausaine suodatettiin pois ja liuotin poistettiin tyhjössä. Jäännös uudelleenkiteytettiin tolueenista (13 15 ml/g), jolloin saatiin saannoksi 13,0 g (55 mmoo-35 lia, 57 %), tuotetta, jonka sulamispiste oli 79 - 81 °C (kirjallisuuden mukaan 122 °C).

Il 91075 27

Vaihe 4, 3-(3-pyridyyli)-D-alaniini, D-Pal(3) (4) 13.0 g (55 mmoolia) N-asetyyli-3-(3-pyridyyli)-D-alaniinin etyyliesteriä kuumennettiin yön ajan 100 ml:n kanssa 6 N HCl:a palautusjäähdyttäen. Liuotin poistettiin 5 tyhjössä. Lisättiin 15 mg etanolia ja tämä poistettiin tyhjössä. Tämä etanolikäsittely toistettiin vielä kaksi kertaa. Jäännös uudelleenkiteytettiin 90 % etanolista, jolloin saatiin 13,0 g (54 mmoolia, 98 %) amiinihydroklo-ridia. Sulamispiste 237 - 239 °C (hajoaa) (kirjallisuuden 10 mukaan 253 - 256 °C).

Vaihe 5, N-Boc-3-(3-pyridyyli)-D-alaniini,

Boc-D-Pal(3) (3) 13.0 g (54 mmoolia) yllä kuvattua D-Pal(3):a laimennettiin 50 ml:11a H20:tä. Lisättiin 50 ml tetrahydro- 15 furaania ja 30 ml (214 mmoolia) trietyyliamiinia. Tähän

seokseen lisättiin sekoittamisen aikana tunnin väliajoin 4 x 5 g:n osia Boc20 ( 90,7 mmoolia). Sen jälkeen kun oli sekoitettu kaikkiaan 6 tunnin ajan, poistettiin tetrahyd-rofuraani tyhjössä. Ylimäärä dikarbonaattia poistettiin 20 heksaanin avulla. Vesikerroksen pH-arvo säädettiin 6 N

HCl:n avulla 4:ksi ja sitä uutettiin sitten 4 x 100 ml:n osilla etyyliasetaattia. Etyyliasetaattiuutteet yhdistettiin ja takaisinuutettiin 2 x 5 ml:n osilla kyllästettyä suolaliuosta. Kuivattiin Na2S04:n avulla, suodatettiin ja 25 liuotin poistettiin tyhjössä. Jäännös uudelleenkiteytettiin tolueenista, jolloin saatiin 8,4 g (31 mmoolia, 57 %) Boc-D-Pal(3):a, jonka sulamispiste oli 141 - 142 °C (hajoaa) (kirjallisuuden mukaan 135 - 136 °C).

Peptldihartsien valmistus 30 Manuaaliseen synteesiin tarkoitettuun reaktioas- tiaan, jonka vetävyys oli suunnilleen 60 ml; pantiin 1 g (1,1 mmoolia) bentshydryyliamiini HCl-hartsia. Annettiin paisua 2 tunnin ajan 20 ml:ssa DCM:a ja suodatettiin sitten. Sen jälkeen lisättiin hartsin joukkoon 15 ml 10 % 35 DIEA/DCM:a, ravistettiin 2 minuutin ajan ja suodatettiin.

28

Viimeksi mainittu käsittely toistettiin vielä kaksi kertaa. Boc-aminohapot liitettiin etukäteen muodostettuina HOBt-estereinä tähän hartsiin vähitelleen kuten on esitetty taulukossa 3. Vaiheet 1-12 muodostavat yhden ami-5 nohappojäännöksen kytkentäsyklin. Kymmenen peräkkäisen syklin avulla saatiin vapaan D-Nal(2)-jäännöksen päättämä dekapeptidiamidihartsi. Tämä peptidihartsi asetyloitiin kuten on kuvattu vaiheissa 2e ja 2f, poistettiin sitten reaktioastiasta, pestiin DCM:lla ja n-heksaanilla ja kui- 10 vattiin tyhjössä, jolloin saatiin 2,9 - 3,0 g haluttua seuraavien rakenteiden mukaista asetyylidekapeptidiamidi-hartsia2: 1. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(DCB)-D-Cit-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARTSI SB-030:n tapauk- 15 sessa; 2. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)-

Tyr(DCB)-D-Cit-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARTSI SB-075:n tapauksessa; 3. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)- 20 Tyr(DCB)-D-Hci-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARTSI SB-088;n tapauksessa.

2SB-088:a syntetisoitiin pienempi määrä (0,1866 mmoolia), peptidihartsia no. 3 ja saadun vapaan dekapep-tidin raakaa HF-suolaa oli vastaavasti 410 mg ja 200 mg.

Il 91075 29

Taulukko 4. Synteesiohjelma

Vaihe Reagenssi ja menetelmä Sekoitusaika 5 minuutteina 1 etukäteen valmistettu HOBt-esteri^, kytkentä 90 4 2 ninhydriinikoe (5) , kun palloset ovat 10 keskinkertaisen tai voimakkaan sinisiä, toistetaan vaiheet 1+2, heikosti sinisen värin tapauksessa jatketaan vaiheilla 2a - 2f 2a MeOH (10 ml), pesu 1 15 2b 10 % DIEA/DCM (10 ml), neutralointi 2 2c MeOH (10 ml), pesu 1 2d DCM (10 ml), (kolme kertaa) pesu 2 4 2e asetyyli-imidatsoli , asetylointi 30 2f ninhydriinikoe, jos se on positiivi- 20 nen, toistetaan vaiheet 2d - 2f 3 MeOH (10 ml), (kaksi kertaa) pesu 1 4 DCM (10 ml), (kolme kertaa) pesu 2 5 50 % TFA/DM (10 ml), suojaryhmän poisto 1 25 6 50 % TFA/DM (10 ml), suojaryhmän poisto 30 7 IpOH (10 ml), pesu 1 8 10 % DIEA/DCM (10 ml), neutralointi 3 9 MeOH (10 ml), pesu 1 30 10 10 % DIEA/DCM (10 ml), neutralointi 3 11 MeOH (10 ml), pesu 1 12 DCM (10 ml), pesu 2 35 ^Lukuunottamatta yhdistettä Boc-D-Cit valmistet tiin Boc-aminohappojen HOBt-esterit seuraavasti: 30 3 mmol Boc-aminohappoa /toisin sanoen (mg:na) D-Ala: 568, D-Pro: 646, Arg(Tos): 1 286, Leu: 748, Tyr(DCB): 1 321, Ser(Bzl): 886, D-Hci: 865, D-Trp: 913 tai D-Pal(3): 799, D-Phe(4Cl): 899, D-Nal(2): 946? ja 460 mg 5 (3 mmol) HOBT.I^Orta liuotettiin 1 ml:an DMF:a, laimen nettiin 2 ml:11a DCM:a, jäähdytettiin 0 °C:een ja annettiin reagoida 0,6 ml:n (3,8 mmol) kanssa DIC:a 0 °C:ssa 10 minuutin ajan; sen jälkeen lisättiin hartsiin huuhdellen 4x1 ml:11a DCM:a. Boc-D-Cit:n tapauksessa liuotet-10 tiin HOBt.^O 3 ml:an Boc-D-Cit-perusliuosta, annettiin reagoida DIC:n kanssa kuten yllä, sitten sekoitettiin hartsin joukkoon käyttäen 1 x 1 ml DMF:a ja 3 x 1 ml:n DCM-huuhtelua.

4

Cit:a sisältävien peptidihartsien tapauksessa on 15 kokeen tulos negatiivinen, kun palloset ovat valkeita (tai heikosti keltaisia) ja liuos on värjäytynyt sinipunerta-vaksi. Boc-Arg(Tos):n täydellinen kiinnittyminen Pro-jään-nökseen, joka on liittyneenä hartsiin, voidaan tarkistaa käyttämällä isatiinireagenssia (2,5 g isatiinia, 20 g fe-20 nolia, 30 g bentsyylialkoholia ja 2,5 g Boc-Phe:a); kokeen tulos on negatiivinen, kun palloset ovat valkeita (tai heikosti keltaisia, mutta eivät sinisiä) sen jälkeen kun on pesty 3-4 kertaa asetonilla.

4 0,34 g:n imidatsolia liuotettuna 2 ml:an DCM:a 25 annettiin reagoida 0,5 ml:n kanssa etikkahapon anhydridiä 0 °C:ssa 2 minuutin ajan ja lisättiin sitten hartsin joukkoon käyttäen 3 x 2 ml:n DCM-huuhtelua.

Vapaiden dekapeptidiamidien valmistus

Lohkaisu ja suojauksen poisto 30 Kutakin peptidihartsia käsiteltiin 3 ml:11a m- kresolia ja suunnilleen 30 ml:11a fluorivetyä (HF) 0 °C:ssa 45 minuutin ajan. Sen jälkeen kun HF oli poistettu suurtyhjössä, hierrettiin jäljellä olevaa peptidihartsia kuivan dietyylieetterin kanssa, suodatettiin, pes-35 tiin dietyylieetterillä ja peptidi uutettiin sitten seuraavasti:

II

91075 31 1. 50 % etikkahappo ja DMF (2 - 2 x 20 ml) SB-030 :n tapauksessa; 2. 50 % etikkahappo (3 x 15 ml) SB-075:n ja SB-088 :n tapauksessa; 5 ja erotettiin hartsista suodattamalla. Peptidi- liuos haihdutettiin tyhjössä ja jäännöstä hierrettiin di-etyylieetterin kanssa, suodatettiin, pestiin dietyylieet-terillä ja kuivattiin, jolloin saatiin 1,2 - 1,3 g HF-suolaa raakojen dekapeptidien kanssa , puhtauden ollessa 10 70 - 85 %.

Puhdistus

Raaka peptidi puhdistettiin käyttämällä Beckman Prep-350 -preparatiivista HPLC-systeemiä. Erottumiset saatiin tapahtumaan 41,5 x 250 mm:n Dynamax-pylväässä, 15 jossa oli pakattuna pallomaista C^-silikageeliä (huokoskoko 300 A, osasten suuruus 12 jam) (RAININ Inc. Co.

Woburn, MA).

Raaka SB-030 lisättiin pylvääseen 30 % muurahais-happoliuoksessa, kun sen sijaan raaka SB-075 ja SB-088 20 liuotettiin 30 % etikkahappoon. Käytettiin painegradient-tieluutiota. Liuotin A oli 0,1 % TFA:n vesiliuos ja liuotin B oli 0,1 % TFA 70 % asetonitriilin vesiliuoksessa. Painevirtausnopeus oli 35 ml/min. Pylvään eluointia valvottiin vaihdeltavissa olevan aallonpituuden UV-detekto-25 rin avulla (Beckman tyyppi 163) 220 nm:n aallonpituudella .

Puhtaiden dekapeptidiamidien määrä ja yleensä saadut saannot olivat seuraavat: 1. 600 mg (34 %) SB-030:a, 30 2. 960 mg (52 %) SB-075:tä ja 3. 140 mg (45 %) SB-088:a (katso alaviite 2), jolloin puhtaus oli >95 %.

Analyyttinen HPLC

HPLC-analyysi suoritettiin Hewlett-Packard malli 35 1090 -nestekromatografian avulla. Peptidinäytteet kroma- tografoitiin 4,6 x 250 mm:n W-Porex 5 um - C^g-pylväässä 32 (Phenomex, Rancho Palos Verdes, CA) läpivirtausnopeudel-la 1,2 ml/min käyttäen painegradienttieluutiota liuottimilla A ja B (raakanäytteiden kromatogrammeja on liitetty mukaan).

5 Aminohappoanalyysi

Peptidinäytteitä hydrolysoitiin 110 °C:ssa 20 tunnin ajan tyhjennetyissä, suljetuissa putkissa käyttäen 4 M metaanisulfonihappoa, jossa oli 0,2 % 3-(2-aminoetyyli)-indolia, ja hydrolysaatin aminohappokoostumus määritet- 10 tiin Beckman 6300 -aminohappoanalysaattorissa.

Oheisessa taulukossa on osoitettu LHRH-analogien affiniteetti aivolisäkerauhasta kohtaan tai ihmisen nisä-syöpämembraanin reseptoreita kohtaan, määritettynä käyttäen radioaktiivisuudella merkittyä LHRH:a tai radioak- 15 tiivisuudella merkittyä D-Trp^-LHRH:a.

Radioaktiivisuudella merkittyä LHRH:a käyttäen suoritetut mittaukset (A) osoittavat, että SB-075:llä ilmenee suurin affiniteetti aivolisäkerauhasen reseptoreita kohtaan, toisin sanoen sillä on suurin kyky syrjäyttää 20 LHRH, mikä on LHRH:n antagonistien päätuntomerkki. Toisaalta näyttää SB-088 osoittavan erityisen suurta affiniteettia ihmisen nisäsyöpämembraanin reseptoreita kohtaan kummassakin kokeissa (A + B).

Kirjallisuusviitteet: 25 1. J.P. Greenstein ja M. Winitz: Chemistry of the

Amino Acids, John Wiley + Sons, New York, NY, 1961. (Cit: 2 491 - 2 494).

2. K. Eisele: Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 356, 845 - 854 (1975) .

30 3. J.E. Rivier, J. Porter, C.L. Rivier, M. Perrin, A. Corriogan, W.A. Hook, R.P. Siraganiean ja W.W. Vale: J. Med. Chem. 29, 1 846 - 1 851 (1986).

4. C. Hoes, J. Raap, W. Bloemhoff ja K.E.T.

Kerling: Reel. Trav. Chim. Pay-Bas 99, 99 - 104 (1980).

35 5. J.M. Stewart ja J.D. Young: Solid Phase Peptide

Synthesis, toinen painos. Pierce Chemical Company, Rockford Illionois, 1984^.

11 33 91075

Esimerkki 1

Kaavan Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4 —C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 mukainen peptidi

Synteesi tapahtuu välipeptidistä Ac-D-Nal(2)-Pro-5 D-Phe(4—Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2.

Tämä välipeptidi rakennettiin asteittain n. 0,6 mekv.

NH2/g sisältävään bentshydryyliamiinihartsiin kiinnittyneenä Beckman 990 -syntetisaattorissa aloittaen Boc-D-Ala:lla alla kuvatun menetelmän mukaan.

10 Kytkeminen suoritetaan ohjeen A mukaan seuraavasti:

Ohje A

Reagenssi Sekoitusaika _(minuutteja) 15 1. Boc-aminohappo 60 - 90 (2-3 mmoolia/g hartsia) + ekviv. määrä DIC:ä 2. MeOH (kaksi kertaa) 1 3. CH2C12 (kaksi kertaa) 1 20

Suojaryhmien poisto suoritetaan ohjeen B mukaan seuraavasti:

Ohje B

25 Reagenssi Sekoitusaika _(minuutteja) 4. 50 % TFA/1 % etaaniditioli CH2Cl2:ssa (kaksi kertaa) 15 + 15 5. IpOH/1 % etaaniditioli 1 30 6. 10 % TEA CH2Cl2:ssa 2 7. MeOH 1 8. 10 % TEA CH2Cl2:ssa 2 9. MeOH (kaksi kertaa) 1+1 10. CH2C12 (kaksi kertaa) 1+1 35 34

Lyhyesti sanottuna käytetään Boc: ä α,-aminoryhmien suojaamiseen. Tos:ä käytetään suojaamaan Arg:n guanidi-noryhmää. DCB:ä käytetään Tyr:n fenolisen hydroksyyli-ryhmän suojaryhmänä ja Ser:n OH-ryhmä suojataan BzL:n 5 avulla. Käytetään suojattujen aminohappojen kaksin- - kolminkertaista ylimäärää perustuen bentshydryyliamiinihartsin NH2~pitoisuuteen plus yhteen ekvivalenttiin DIC:ä CH2C12 CH2Cl2:ssa tai 10 - 50 % DMF/CH2C12:ssa, kulloinkin Boc-aminohapon liukoisuuden mukaan, kahden tunnin ajan.

10 N-terminaalinen asetylointi suoritetaan käyttäen etikkahapon anhydridin 50-kertaista ylimäärää CH2Cl2:ssa 0,5 tunnin aikana. Näin saadulla suojatulla välipeptidil-lä on seuraava kokoonpano:

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser(X4)-Tyr-(X5)-D-15 Lys(X8)-Leu-Arg(X®)-Pro-D-Ala-NH-X^, missä X4 on Bzl ja X^ on DCB, X8 on Z(2-C1), X8 on Tos ja X^8 on hartsiin kuuluva bentshydryyliryhmä.

Suojatun peptidihartsin pilkkomiseksi ja suojauksen poistamiseksi siitä sitä käsitellään 1,4 ml:lla m-20 kresolia ja 15 ml:11a fluorivetyä grammaa kohden peptidi-hartsia 0,5 tunnin ajan 0 °C:ssa ja 0,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun fluorivety on poistettu suurtyhjössä peptidihartsi pestään dietyylieetterillä ja peptidi uutetaan sitten DMF:lla ja erotetaan hartsista 25 suodattamalla. DMF-liuos konsentroidaan sitten suurtyhjössä pieneen tilavuuteen ja sitä hierretään sitten dietyyli-eetterin kanssa. Näin saatu raakatuote puhdistetaan yllä kuvatulla tavalla valmistavan HPLC:n avulla. Näin saadaan yllä annetun kaavan mukainen puhdas vapaa välipeptidi, 30 jossa X4, X5, X6, X8 ja X10 merkitsevät vetyä.

Vapaan, D-Lys(X8):n sisältävän välipeptidin annetaan sitten reagoida huoneen lämpötilassa kaliumsyanaatin kanssa 80 % DMF:n vesiliuoksessa (81 mg KCNO/ml; aika: 24 tuntia). Sen jälkeen kun liuotin on poistettu suurtyh-35 jössä seuraa reaktiotuotteen puhdistus preparatiivisen HPLC:n avulla; näin saadaan haluttu D-Hci:n sisältävä peptidi.

li 91075 35 Näin saatu D-Hci:n sisältävä peptidi on oleellisesti puhdas (95 %:iin saakka). HPLC-analyysi suoritetaan Hewlett-Packard 1090A -gradienttinestekromatografiasys-teemissä PHENOMENEX (W-Porex 5C18) -pylväässä ja eluoidaan 5 liuottimilla, joista A on: 0,1 % TFA, B: 0,1 % TFA 70 % CH^CNjssa, käyttäen gradienttia 30 - 60 % 30 minuutissa. Halutulla peptidillä ilmenee HPLC-retentioaika (retention time) 28,2 minuuttia.

Peptidien puhdistaminen suoritetaan Beckman Prep-10 350-gradienttinestekromatografissa käyttäen 41,4 x 250 mm:n kolonnia, jossa on preparatiivinen, käänteinen DYNEMAX C18 -faasi (300 A, 12 um), ja liuottimia, joista A on: 0,1 % TFA ja B: 0,1 % TFA 70 % CH^CNsssa, ja käyttäen painegradienttia 45 - 60 % 30 minuutissa. Puhdas peptidi, 15 joka on saatu TFA-suolan muodossa, voidaan haluttaessa muuttaa asetaattimuotoon, nimittäin saattaen asetaatti-muotoon johtamalla AG3X (Bio-Rad) -pylvään lävitse ja sen jälkeen lyofilisoiden.

Esimerkki II

20 Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyy li) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-N^

Valmistaminen tapahtuu vastaavasta välipeptidis-tä, joka sisältää 6-asemassa D-Hci(etyyli):n asemesta aminohapon D-Lys, vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 25 I antamalla reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa (0,1 mg 10 ml:ssa 1 g:a kohden välipeptidiä) DMF:ssa 0-10 °C:ssa 10 tunnin aikana. Retentioaika (retention time) on 30,8 minuuttia.

Esimerkki III

30 Peptidin Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr- D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi suoritetaan esimerkissä I kuvatulla tavalla. Lähtöpeptidi sisältää 6-asemassa Boc-D-Orn(Z) :n Boc-D-Lys/Z (2-Cl]_7:n asemesta, jota käytetään esimerkissä I. Tämä lähtöpeptidi valmiste-35 taan vastaavasti kuin esimerkissä I. Retentioaika 27,8 minuuttia. Lähtöpeptidin retentioaika 25,5 minuuttia.

36

Esimerkki IV

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(etyyli) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Tämä peptidi valmistetaan Ac-D-Nal(2)-Phe(4-C1)-5 D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2:sta ja N-etyyli-isosyanaatista DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden välipeptidiä) 0-10 °C:ssa esimerkin III mukaisesti. Reaktioaika 10 tuntia. HPLC-retentioaika 30,4 minuuttia.

Esimerkki V

10 Peptidin Ac-D-Phe(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr- D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi suoritetaan esimerkissä I kuvatulla tavalla, sillä poikkeuksella, että läh-töpeptidin 1-asemaan sijoitetaan Boc-D-Phe(4-C1) Boc-D-Nal(2):n asemesta, jolloin saadaan välittömänä lähtöpep-15 tidinä Ac-D-Phe(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2- Retentioaika 26,6 minuuttia; lähtöpep-tidin, jossa on Ac 1-asemassa, retentioaika; 24,0 minuuttia .

Esimerkki VI

20 Ac-D-Phe(4—Cl)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci- (etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NI^ Lähtöpeptidi on Ac-D-Phe(4-C1)-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki V), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa 25 (0,1 mg 10 mltssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C;ssa DMFtssa. Reaktioaika 10 tuntia. HPLC-retentioaika: 29,2 minuuttia.

Esimerkki VII

Peptidin Ac-D-Phe(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-30 D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi suoritetaan kuten on kuvattu esimerkissä I, sillä poikkeuksella, että Boc-D-Phe(4-Cl) sijoitetaan Boc-D-Nal(2):n asemesta 1-asemaan ja Boc-D-Orn(Z) Boc-D-Lys/Z(2-C1W:n asemesta 6-ase-maan, niin että välittömänä lähtöpeptidinä saadaan Ac-35 D-Phe(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 24,0 minuuttia), jonka annetaan I! 91075 37 sitten reagoida esimerkin I mukaisesti KCNO:n kanssa. HPLC-retentioaika 26,3 minuuttia.

Esimerkki Vili

Ac-D-Phe(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-5 (etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NI^ Lähtöpeptidi on Ac-D-Phe(4 —Cl)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-N^ (katso esimerkki VII), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 10 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 28,6 mi nuuttia .

Esimerkki IX

Peptidin Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 synteesi suoritetaan esimerkin 15 I mukaisesti. Saadulla peptidillä ilmenee HPLC-retentioaika 27,4 minuuttia.

Esimerkki X

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4 —Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyyli) -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 20 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Nal(2)-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-

Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ (katso esimerkki IX), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 30,0 minuuttia.

25 Esimerkki XI

Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 16,8 minuuttia), 30 jonka annetaan reagoida esimerkin I mukaisesti kaliumsya-naatin kanssa. Lähtöpeptidi saadaan vastaavasti kuin esimerkissä I, sillä poikkeuksella, että Boc-Pro sijoitetaan Boc-D-Nal(2):n asemesta 1-asemaan. HPLC-retentioaika 19,3 minuuttia.

38

Esimerkki XII

Ac-Pro-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Pro-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-5 D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki XI), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 22 minuuttia.

Esimerkki XIII

10 Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro- D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 16,85 minuuttia), jonka annetaan esimerkin I mukaisesti reagoida kaliumsya-15 naatin kanssa. Lähtöpeptidi saadaan myös vastaavasti kuin esimerkissä I, sillä erotuksella, että Boc-Pro sijoitetaan Boc-D-Nal(2):n asemesta 1-asemaan ja Boc-D-Orn(Z) Boc-D-Lys/Z (2-Cl)_7:n asemesta 6-asemaan. HPLC-retentioaika 18,8 minuuttia.

20 Esimerkki XIV

Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki XIII), jonka 25 annetaan esimerkin VI mukaisesti reagoida N-etyyli-isosya-naatin kanssa. HPLC-retentioaika 24,9 minuuttia.

Esimerkki XV

Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 30 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr- D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 20,8 minuuttia), jonka annetaan esimerkin I mukaisesti reagoida kaliumsya-naatin kanssa. Lähtöpeptidi saadaan vastaavasti kuin esimerkissä I, jolloin kuitenkin 1-asemaan sijoitetaan Boc-35 D-Nal(2):n asemesta aminohappojäännös Boc-D-Phe. HPLC-retentioaika 23,4 minuuttia.

Il 91075 39

Esimerkki XVI

Ac-D-Phe-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-5 Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki XV), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 26,0 minuuttia.

Esimerkki XVII

10 Ac-D-Phe-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-

Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 21,0 minuuttia) , jonka annetaan esimerkin I mukaisesti reagoida ka-15 liumsyanaatin kanssa. Lähtöpeptidin valmistus tapahtuu esimerkin I mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Nal(2):n asemesta sijoitetaan 1-asemaan Boc-D-Phe ja Boc-D-Lys/Z (2-Cl]_7:n asemesta 6-asemaan Boc-D-Orn (Z) . HPLC-retentioaika 23,1 minuuttia.

20 Esimerkki XVIII

Ac-D-Phe-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki XVII), 25 jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 25,4 minuuttia .

Esimerkki XIX

30 Esimerkki kaavan Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-

Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 mukaisen peptidin .·. · yleisestä valmistuksesta.

Tämä peptidi valmistetaan asteittain käyttäen bentshydryyliamiinihartsia, joka sisältää suunnilleen 35 1,0 moolia ekvivalenttisia aminoryhmiä grammaa kohden, käyttäen Beckman 990 -syntetisaattoria, jolloin aloite- 40 taan Boc-D-Alasta. Kytkeminen tapahtuu esimerkissä I annetun ohjeen A mukaan. D-suojaryhmän poistaminen suoritetaan esimerkissä I annetun ohjeen B mukaan. Muut olosuhteet ovat vastaavien esimerkissä I annettujen tietojen 5 mukaiset.

Näin saatu suojattu välipeptidi on kokoonpanoltaan seuraavanlainen:

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser(X4)-Tyr(X5)-D-

Hci-Leu-Arg(X8)-Pro-D-Ala-NHX10, jolloin X4 = Bzl ja X5 8 10 10 = Bzb, X = Tos ja X on bentshydryyliryhmä, joka kuuluu hartsiin.

Näin saadun suojatun peptidin lohkaisu tapahtuu esimerkin I mukaan käyttäen 1,4 ml m-kresolia ja 15 ml fluorivetyä grammaa kohden peptidihartsia (0,5 tuntia 15 0 °C:ssa ja 0,5 tuntia huoneen lämpötilassa). Kaikki muut toimenpiteet ovat esimerkissä I ilmoitetun mukaiset. Saatu raakatuote puhdistetaan preparatiivisen HPLC-kromato-grafian avulla. HPLC-analyysi suoritetaan esimerkin I mukaisesti Hewlett-Packard 1090A -gradienttinestekromato-20 grafiasysteemissä käyttäen Phenomenex-pylvästä ja eluoi-den seuraavilla liuottimilla:

Liuotin A: 0,1 % TFA, liuotin B: 0,1 % TFA 70 % CH^CNissa käyttäen gradienttia 35 - 75 % 30 minuutissa. Saadun peptidin, jossa on 6-asemassa D-Hci, HPLC-retentio-25 aika on 22,9 minuuttia. Lisäpuhdistus tapahtuu Beckmann-Prep-350-gradientti-nestekromatografissa esimerkin I mukaisesti .

Esimerkki XX

Peptidi H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-30 D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 saadaan esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Nal(2):n asemesta sijoitetaan 1-asemaan ^N-CO-D-Nal(2) ja N-terminaalista asylointia ei suoriteta. HPLC-retentioaika 24,0 minuuttia.

Esimerkki XXI

35 Peptidin Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-

Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi tapahtuu kuten on ku- 91075 41 vattu esimerkissä XIX sillä poikkeuksella, että Boc-D-Cit sijoitetaan asemaan 6 Boc-D-Hci:n asemesta. Halutulla peptidillä on HPLC-retentioaika 22,5 minuuttia.

Esimerkki XXII

5 Ac-D-Phe(4—Cl)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-

Arg-Pro-D-Ala-N^

Valmistus esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Phe(4-C1) sijoitetaan 1-asemaan Boc-D-Nal(2):n asemesta. HPLC-retentioaika 24,0 minuuttia.

10 Esimerkki XXIII

Ac-D-Phe(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NHj

Valmistus tapahtuu esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Phe(4-C1) sijoitetaan Boc-D- 15 Nal(2):n asemesta 1-asemaan ja Boc-D-Cit Boc-D-Hci:n asemesta 6-asemaan. Saadun peptidin retentioaika on 20,8 minuuttia.

Esimerkki XXIV

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu- 20 Arg-Pro-Gly-NH2

Valmistus tapahtuu esimerkin XIX mukaisesti, sillä erotuksella, että Boc-Gly sijoitetaan 10-asemaan Boc-D-Ala:n asemesta. Saadun peptidin HPLC-retentioaika on 22,4 minuuttia.

25 Esimerkki XXV

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Valmistus tapahtuu esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Pal(3) sijoitetaan Boc-D-Trp:n 30 asemesta 3-asemaan. Saadun peptidin HPLC-retentioaika on 13,6 minuuttia.

Esimerkki XXVI

Ac-D-Nal-D-Phe(4 —Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 35 Valmistus tapahtuu esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Cit sijoitetaan D-Hci:n asemesta 42 6-asemaan ja Boc-D-Pal(3) Boc-D-Trp:n asemesta 3-asemaan. Saadun peptidin HPLC-retentioaika on 13,3 minuuttia.

Esimerkki XXVII

Peptidin H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-5 Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi suoritetaan kuten on kuvattu esimerkissä XIX, sillä erotuksella, että Boc-D-Cit sijoitetaan Boc-D-Hci:n asemesta asemaan 6, Boc-D-Pal(3) sijoitetaan Boc-D-Trp:n asemesta asemaan 3 ja N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Näin saadaan 10 välipeptidi: H-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-

Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2. Näin saadun vapaan peptidin annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa 80 % DMF:n vesiliuoksessa (81 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kun on haihdutet-15 tu suurtyhjössä, reaktioseos puhdistetaan preparatiivisen HPLC:n avulla. Näin saadun peptidin HPLC-retentioaika on 14,4 minuuttia.

Esimerkki XXVIII

H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hci-20 Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 valmistetaan esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Pal(3) sijoitetaan Boc-D-Trp:n asemesta asemaan 3 ja että N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Näin saadaan välipeptidi H-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2. 25 Näin saadun vapaan peptidin annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa DMF:n vesiliuoksessa (81 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kun on haihdutettu suurtyhjössä, reaktioseos puhdistetaan preparatiivisen HPLC:n avulla. Näin saadun pep-30 tidin HPLC-retentioaika on 14,7 minuuttia.

Esimerkki XXIX

Peptidin H2N-C0-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2 synteesi alkaa välipepti-din H-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-35 Pro-D-Ala-NH2 valmistamisesta. Välipeptidin synteesi suoritetaan kuten on kuvattu esimerkissä XIX, sillä erotuk-

II

91075 43 sella, että Boc-D-Orn(Z) sijoitetaan asemaan 6 Boc-D-Hci:n asemesta ja että N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Vapaan, 6-asemassa D-Orn:n sisältävän peptidin annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa 80 % 5 DMF:n vesiliuoksessa (162 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen on haihdutettu suurtyhjössä, reaktioseos puhdistetaan preparatii-visen HPLC:n avulla. Näin saadun peptidin HPLC-retentio-aika on 23,6 minuuttia.

10 Esimerkki XXX

Peptidin H2N-C0-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NHj synteesi alkaa välipep-tidin H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 valmistamisella. Välipeptidin synteesi suo-15 ritetaan kuten on kuvattu esimerkissä XIX, sillä erotuksella, että Boc-D-Lys/Z(2-Cl7 sijoitetaan 6-asemaan Boc-D-Hci:n asemesta ja että N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Vapaan peptidin, joka sisältää 6-asemassa D-Lys:n, annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa 20 80 % DMF:n vesiliuoksessa (164 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kun on haihdutettu suurtyhjössä,reaktioseos puhdistetaan prepa-ratiivisen HPLC:n avulla. Näin saadun peptidin HPLC-re-tentioaika on 14,0 minuuttia.

Claims (7)

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen pep-5 tidin valmistamiseksi, jolla on kaava X-R1-R2-R3-Ser-Tyr-R6-Leu-Arg-Pro-R10-NH2 (I) jossa 10. on asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 hiiliatomia sisältävien, alifaattisten tai alisyklisten karboksyyli-happojen suorista tai haarautuneista ketjuista, tai kar-bamoyyliryhmä, R1 on D- tai L-Pro, D- tai L-A3-Pro, D-Phe,

15 D-Phe(4-Hl), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) tai D-Nal(2), R2 on D-Phe tai D-Phe(4-Hl), R3 on D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) tai D-Nal(2), R6 on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q) ja 20 R10 on Gly tai D-Ala, jolloin Hl on fluori, kloori tai bromi ja Q on C^-alkyy-li, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditio-suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että peptidikemiassa tavallisen fragmenttikondensaation 25 avulla kondensoidaan vastaavat peptidifragmentit tai peptidi rakennetaan asteittain lähtöaminohapoista peptidikemiassa tavallisen fragmenttikondensaation avulla tai kaavan I mukaisessa peptidissä, jossa R6 on D-Orn 30 tai D-Lys, D-Orn:n tai D-Lys:n vapaa aminoryhmä muutetaan saattamalla reagoimaan alkalisyanatin kanssa tai yhdisteen kanssa, joka tuottaa syanaatin, tai C^-alkyyli-iso-syanaatin kanssa ureidoryhmäksi ja saadut peptidit mahdollisesti asyloidaan ja/tai 35 muutetaan amideiksi ja II 91075 mahdollisesti muutetaan fysiologisesti vaarattomiksi happosuoloiksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suoritetaan asteittainen ra- 5 kentaminen, jolloin ensin sidotaan karboksyylipään aminohappo, glysiini tai D-alaniini, tai niiden amidi, joissa pysyvä α-aminoryhmä on suojattu, tätä tarkoitusta varten tavanomaiseen synteettiseen kantajaan kovalenttisesti, α-aminon suojaryhmä lohkaistaan pois, näin saatuun vapaa-10 seen aminoryhmään sidotaan lähinnä seuraava suojattu aminohappo sen karboksyyliryhmän kautta, sitten jälleen lohkaistaan tämän toisen aminohapon α-aminon suojaryhmä pois, tähän sidotaan seuraava aminohappo ja tällä tavoin askel askeleelta liitetään syntetisoitavan peptidin muut 15 aminohapot oikeassa järjestyksessä, ja kun kaikki aminohapot on liitetty valmis peptidi lohkaistaan pois kantajasta ja mahdollisesti lohkaistaan pois lisäksi läsnä olevat sivuryhmien suojaryhmät.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että X on asetyyli- tai karba-moyyliryhmä, R1 on D-Nal(2), D- tai L-Pro, D-Phe tai D-Phe(4-Cl), R2 on D-Phe(4-Cl) tai D-Phe(4-F) ja R3 on D-Trp tai D-Pal(3).

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen me-25 netelmä, tunnettu siitä, että X on asetyyli, R1 on D-Nal(2) tai D-Phe(4-Cl), R2 on D-Phe(4-Cl), R3 on D-Trp tai D-Pal(3) ja R10 on D-Ala.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on asetyyli.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että X on karbamoyyli.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R6 on D-Cit tai D-Hci.