FI101884B - Luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin (LHRH) antagonistipeptidej ä - Google Patents

Description

101884

Lutein!soivaa hormonia vapauttavan hormonin (LHRH) an-tagonistipeptidejä

Jakamalla erotettu FI-patenttihakemuksesta 883 388 5 Tämä keksintö koskee uusia peptidejä, jotka estävät nisäkkäillä gonadotropiinien vapauttamista aivolisä-kerauhasesta aiheuttamatta kuitenkaan turvotusvastavaiku-tuksia. Erityisesti tämä keksintö koskee seuraavan raken-10 teen omaavan luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin (LHRH): p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 15 analogeja sekä niiden suoloja.

Yli 15 vuoden ajan ovat tutkijat etsineet selektiivisesti tehokkaita LHRH-dekapeptidin antagonisteja [M. Karten ja J.E. Rivier, Endocrine Reviews, 7, 44 - 66 (1986)]. Suuri kiinnostus sellaisia antagonisteja kohtaan 20 perustuu niiden hyödyllisyyteen endokrinologian, gyneko logian, raskauden ehkäisyn ja syövän alalla. On valmistettu suuri määrä yhdisteitä potentiaalisina LHRH:n antagonisteina. Kiinnostavimpia tähän mennessä löydettyjä antagonisteja ovat ne yhdisteet, joiden rakenne edustaa 25 LHRH-rakenteen muunnelmaa.

Ensimmäinen sarja tehokkaita antagonisteja saatiin sijoittamalla aromaattisia aminohappojäännöksiä asemiin 1, 2, 3 ja 6 tai 2, 3 ja 6. Yhdisteet kuvataan LHRH:na, jossa alkuperäisten aminohappojäännösten korvaaminen 30 muilla on ilmaistu korkealle asetettujen numeroiden avulla. Tunnettuja antagonisteja ovat: [Ac-D-Phe(4-C1Ϋ'2,D-Trp3'6]LHRH (D.H. Coy et ai., julkaisussa: Gross, E. ja Meienhofer, J. (toimittajat), Peptides, Proceedings of the 6th American Peptid Symposium, 35 s. 775 - 779, Pierce Chem. Co., Rockville, 11., 1979); 101884 2 /Äc-Pro1, D-Phe(4-Cl)2, D-Nal(2)3'67LHRH (US-pa-tentti no. 4 419 347) ja IAc-A3-Pro1, D-Phe (4-Cl) 2 , D-Trp3 'f 7LHRH (J.L. Pi-5 neda et ai., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 420, 1983).

Antagonistien vesiliukoisuuden lisäämiseksi sijoitettiin myöhemmin emäksisiä aminohappoja, kuten esimerkik-si D-Arg, 6-asemaan. Esimerkiksi /Ac-D-Phe(4—Cl) ' , D-Trp3, D-Arg6, D-Ala187LHRH (ORG-30276) (D.H. Coy et ai., 2Q Endocrinology, 100, 1 445, 1982); ja /Äc-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg67LHRH (ORF 18260) (J.E. Rivier et ai., julkaisussa: Vickery B.H., Nestor, Jr. J.J., Hafez, E.S.E. (toimittajat), LHRH and Its Analogs, s. 11 - 22, MTP Press, Lancaster, UK, 15 1984)*

Analogit eivät osoittaneet ainoastaan odotettua parantunutta vesiliukoisuutta, vaan niillä ilmeni myös parantunut antagonistinen vaikutus. Nämä erittäin tehokkaat, hydrofiiliset analogit, joissa on D-Arg ja muita emäksi-20 si^ sivuketjuja 6-asemassa, aiheuttivat kuitenkin ohimenevän turvotuksen muodostumista kasvoihin ja raajoihin, kun niitä annettiin rotille annoksina 1,25 tai 1,5 mg/kg ihon alle (F. Schmidt et ai., Contraception, 29, 283, 1984; J.E. Morgan et ai., Int. Archs. Allergy Appi. Immun. 80, 2g 70, (1986) . Koska turvotusta aiheuttavien vaikutusten esiintyminen rotilla näiden antagonistien antamisen jälkeen synnytti epäilyksiä niiden turvallisuudesta ihmisten käytössä ja siten jarrutti näiden lääkkeiden ottamista kliiniseen käyttöön, on toivottavaa kehittää antagonistiko siä peptidejä, joilla ei ole näitä sivuvaikutuksia.

Tämä keksintö koskee LHRH:n antagonisteja, joilla ilmenee emäksisten peptidien parantunut vesiliukoisuus ja suuri antagonistinen tehokkuus ja joilla ei ole turvotusta synnyttäviä vaikutuksia. Nämä yhdisteet estävät erit-2^ täin tehokkaasti gonadotropiinien vapauttamista aivolisä- kerauhasesta nisäkkäillä, mukaan luettuna ihmiset.

3 101884 Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä esittää kaava I: 1 2 3 6 10

X-R -R -R -Ser-Tyr-R -Leu-Arg-Pro-R -NH2 I

5 X on asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 hiiliatomia sisältävien tai alisyklisten karboksyylihappojen suorista tai haarautuneista ketjuista, tai karbamoyyliryhmä, 1 3 R on D- tai L-Pro, D- tai L-Δ -Pro, D-Phe, 10 D-Phe(4-H1), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) tai D-Nal(2), R3 on D-Phe tai D-Phe(4-H1), R3 on D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) tai D-Nal(2), R6 on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hic(Q), R10 on Gly tai D-Ala, jolloin Hl on fluori, kloori 15 tai bromi ja Q on C^^-alkyyli, ja näiden fysiologisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat,

Kaavan I mukaiset yhdisteet syntetisoidaan tunnettujen menetelmien avulla, kuten esimerkiksi pelkän kiin-2q teäfaasitekniikan, osittaisen kiinteäfaasitekniikan tai klassisten liuoskytkemisten avulla. Mieluimmin kaavan I mukaiset yhdisteet valmistetaan tunnetun kiinteäfaasitekniikan avulla. Sellainen menetelmä tuottaa välipeptidejä tai välipeptidihartseja, joilla on kaava II: 25

" w 4 1« M Λ g ^ O

X -R -R -R -Ser(X )-Tyr(X )-R (X )-Leu-Arg(X )-R10-NH-X10 1 35 joSSa . on asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 hiiliatomia sisältävien alifaattisten tai alisyklisten karboksyylihappojen suorista ja haarautuneista ketjuista (erityisesti asetyyli), t-Boc, vety tai karbamoyyli, 4 101884 4 X on Ser-hydroksiryhmän suojaryhmä (esimerkiksi bentsyyli, 2,6-diklooribentsyyli), X5 on Tyr-fenolihydroksyyliryhmän suojaryhmä (esimerkiksi bentsyyli, 2,6-diklooribentsyyli, 2-kloori(2-5 bromi)-bentsyloksikarbonyyli; bentsyloksikarbonyyli), X6 on Lys- tai Orn-sivuketjuaminoryhmän suojaryhmä (bentsyloksikarbonyyli, 2-klooribentsyloksikarbonyyli), g X on Arg-guanidinoryhmän suojaryhmä (NO-, Tos), 10 1 X on bentshydryyli- tai metyylibentshydryyliryh- ^ miä sisältävä kantajahartsi, 1 . 3 R on D- tai L-Pro, D- tai L-Δ -Pro, D-Phe, D-Phe(4-H1), d-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) tai D-Nal(2), R2 on D-Phe tai D-Phe(4-Hl), R3 on D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) tai D-Nal(2), 15 *6 , R on D-Lys tai D-Orn, D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q) ja R10 on Gly tai D-Ala, jolloin Hl on fluori, kloori tai bromi.

Erään menettelytavan mukaan esimerkiksi muutetaan 20 *6 kaavan II mukainen peptidi, jossa R on D-Lys tai D-Orn ja X8 on vety, syanaatin tai yhdisteen, joka tuottaa syanaatin (syanaattilähde), avulla kaavan III mukaiseksi peptidiksi : 25 1 2 3 4 5 **6 X -R -R -R -Ser(X )-Tyr(X )-R -

III

Leu-Arg(X8)-Pro-R10-NH-X10 jossa symboleilla X., R3, R2, R3, X^, X3, X8, R38 ja X*8 30 1 **6 on ilmoitetut merkitykset ja R on Cit, Hei, Cit(Q) tai

Hci(Q). Tämä reaktio suoritetaan mieluimmin, kun X^ on asyyli ja kaikki muut jäännökset X on vety.

Sopivia syanaatteja tai syanaatin tuottavia yhdisteitä ovat: alkalisyanaatit (esimerkiksi kaliumsyanaatti), N-alempialkyyli-isosyanaatti (N-etyyli-isosyanaatti).

35 5 101884

Kaavan II mukaiset peptidit syntetisoidaan mieluimmin tunnetun kiinteäfaasitekniikan avulla. Muuttaminen syanaateilla tai syanaatin tuottavilla yhdisteillä suoritetaan liuottimissa, mieluimmin aproottisissa liuottimissa kuten esimerkiksi vesipitoisessa DMF:ssa, lämpötiloissa 5 väliltä 0 - 50 °C, mieluimmin 0 - 25 °C.

Tämän reaktion edistymistä, toisin sanoen Orn/ Lys-peptidien muuttumista vastaaviksi Cit/Hci-peptideik-si, voidaan helposti seurata HPLCsn avulla MeCN-Vesipi-toisissa TFA-systeemeissä, johtuen Cit/Hci- ja esimerkik-10 si Cit(etyyli)/Hei(etyyli)peptideille tunnusomaisesta re-tentioajan pidentyneisyydestä 2,6 + 0,3 minuutilla verrattuna vastaaviin Orn/Lys-peptideihin.

Kaavan I mukaisia peptidejä, joissa X on asyyliryh-mä, saadaan suoraan suorittamalla lohkaiseminen ja suo-15 jauksen poistaminen kaavan II mukaisille välipeptidihart-seille, joissa Xj on asyyliryhmä ja R ® on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q), ja kaavan I mukaisia peptidejä, joissa X on karbamoyyliryhmä, saadaan kaavan II mukaisista peptidihartseista, joissa X^ on vety tai Boc, nimittäin 20 lohkaisemalla ja poistamalla suojaus ja sen jälkeen karba-moyloimalla.

Gonadotopiinia vastaan vaikuttava valmiste aikaansaadaan sekoittamalla kaavan I mukaista yhdistettä fysiologisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa, mukaan 25 luettuna mikropalloset hidastettua vapauttamista varten.

Peptidien määrittelyyn käytetty nimistö on yhtäpitävä biokemian nimistöä käsitelleen IUPAC-IUB-komitean esittämän nimistön kanssa (European J. Biochem., 1984, 138, 9 - 37), jolloin yhdenmukaisesti totunnaisen esi- 30 . .

tystavan kanssa N-päässä olevan aminoryhmät esiintyvät vasemmalla ja C-pään karboksyyliryhmä oikealla. Ilmausta luonnolliset aminohapot käytetään yleisesti luonnollisesti esiintyvistä aminohapoista, joita on proteiineissa ja jotka käsittävät aminohapot Gly, Ala, Vai, Leu,

Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, 35 6 101884

Phe, Tyr, Pro, Trp ja His. Yksittäisistä aminohappojäännöksistä käytetyt lyhennykset perustuvat aminohappojen triviaalinimiin ja ovat Ala, alaniini; Arg, arginiini;

Cit, sitrulliini; Gly, glysiini; Hei, homositrulliini; 5 Leu, leusiini; Lys, lysiini; Pal(3), 3-(3-pyridyyli)ala-niini; Nal(2), 3-(2-naftyyli)alaniini; Nal(l), 3-(l-naf-tyyli)alaniini, Orn, ornitiini; Phe, fenyylialaniini; Phe(4-Cl), 4-kloorifenyylialaniini; Phe(4-F), 4-fluori-fenyylialaniini; Pro, proliini; Ser, seriini; Trp, tryp-10 tofaani ja tyr, tyrosiini. Kaikki tässä kuvatut aminohapot kuuluvat L-sarjaan, ellei toisin ole mainittu, esimerkiksi D-Trp tarkoittaa D-tryptofaania ja D-Nal(2) tarkoittaa 3-(2-naftyyli)-D-alaniinia. D-Cit(Q) tai D-Hci(Q) tarkoittaa, että sitrulliinin (homositrulliinin) ureido-15 osan aminoryhmän H-atomi on korvattu alkyyli-ryhmällä Q. Muita käytettyjä lyhennyksiä ovat;

AcOH etikkahappo

AcOEt etyyliasetaatti AC2O etikkahapon anhydridi 20 Boc- tert. butyloksikarbonyyli- DIC di-isopropyylikarbodi-imidi DIEA N,N-di-isopropyylietyyliamiini DMF dimetyyliformamidi

HoBt 1-hydroksibentseenitriatsolihydraatti 25 HPLC korkeapainenestekromatografia ' MeOH metyylialkoholi TEA trietyyliamiini DCC disykloheksyylikarbodi-imidi

MeCN asetonitriili 30 IpOH isopropanoli Z (2—Cl) 2-klooribentsyloksikarbonyyli * DCB 2,6-diklooribentsyyli

Tos p-tolueenisulfonyyli TFA trifluorietikkahappo 35 Z bentsyloksikarbonyyli 7 101884

Erityisen hyvinä pidetään kaavan I mukaisia LHRH-analogeja, joissa; X on asetyyli tai karbanoyyli/ R1 on D-Phe(4-Cl), D-Nal(2), Pro tai D-Phe, 5 R2 on D-Phe(4-Cl) tai D-Phe(4-F), R3 on D-Trp tai D-Pal(3), R^ on D-Cit, D-Hci, D-Cit(etyyli), D-Hci(etyyli) ja R3^ on D-Ala.

Keksinnön mukaisten peptidien valmistus tapahtuu 10 siten, että ne valmistetaan peptidikemiassa yleisesti käytetyn kappalekondensaation avulla vastaavista peptidin-palasista tai peptidikemiassa tavallisen asteittaisen rakentamisen avulla, tai siten että kaavan I mukaisessa peptidissä, jossa R^ on D-Orn tai D-Lys, D-Orn:n tai D-Lys:n 15 vapaa aminoryhmä muutetaan antamalla reagoida alkalisya-naatin tai yhdisteen, joka tuottaa syanaatin, tai alkyyli-isosyanaatin kanssa ureidoryhmäksi, ja saadut peptidit mahdollisesti asyloidaan ja/tai muutetaan amideiksi ja mahdollisesti muutetaan fysiologisesti vaarattomiksi 20 happosuoloiksi.

Asteittainen rakentaminen tapahtuu esimerkiksi siten, että ensin sidotaan karboksyylipään aminohappo gly-siini tai D-alaniini tai niiden amidien, joissa pysyvä <x-aminoryhmä on suojattu, tähän tarkoitukseen yleisesti 25 käytettyyn synteettiseen kantajaan kovalenttisesti, a-ami-non suojaryhmä lohkaistaan pois, näin saatuun vapaaseen aminoryhmään sidotaan lähinnä seuraava suojattu aminohappo sen karboksyyliryhmän kautta, sitten taas lohkaistaan tämän toisen aminohapon ct-aminon suojaryhmä pois, tähän 30 sidotaan seuraava aminohappo ja tällä tavoin askel askeleelta liitetään syntetisoitavan peptidin muut aminoha-pot oikeassa järjestyksessä ja kun kaikki aminohapot on liitetty, patenttivaatimuksen 1 mukainen valmis peptidi lohkaistaan pois kantajasta ja mahdollisesti muut läsnä 35 olevat sivufunktioiden suojaryhmät lohkaistaan pois.

101884 8

Kappalekytkemisessä käytetään mieluimmin ilman ra-semoitumista tapahtuvaa atsidikytkemistä tai disyklohek-syylikarbodi-imidi/l-hydroksibentsotriatsoli- tai DCC/3-hydroksi-4-okso-3,4-dihydro-l,2,3-bentsotriatsiini-mene-5 telmää. Voidaan myös käyttää hyväksi palasten aktivoituja estereitä (DCC = disykloheksyylikarbodi-imidi).

Aminohappojen asteittaiseen kondensaatioon sopivat erityisen hyvin bentsyloksikarbonyyli-aminohappojen aktivoidut esterit, kuten esimerkiksi N-hydroksisuksiini-imi-10 diesteri tai 2,4,5-trikloorifenyyliesteri ja 4-nitrofe-nyyliesteri. Kahden jälkimmäisen aktiiviesterin aminolyy-siä voidaan erittäin hyvin katalysoida N-hydroksiyhdis-teiden avulla, joiden happamuus on suurin piirtein etikka-hapon luokkaa, kuten esimerkiksi 1-hydroksibentsotriatso-15 Iin avulla.

Väliaminonsuojaryhmiksi soveltuvat poishydrattavat ryhmät, kuten esimerkiksi bentsyloksikarbonyylijäännös (= Z-jäännös) tai heikon happamuuden avulla pois lohkaistavat ryhmät, kuten esimerkiksi 2-(p-difenyyli)isopropy-20 loksikarbonyyli- tai 2-(3,5-dimetoksifenyyli)isopropylok-sikarbonyylijäännös.

Asteittainen kondensaatio tapahtuu suorittamalla synteesi vastaavista, mahdollisesti tavalliseen tapaan suojatuista aminohapoista totunnaiseen tapaan. Samoin on 25 mahdollista käyttää automaattista peptidinsyntetisoijaa, esimerkiksi Beckman Model 990 -peptidinsyntetisoijaa, mahdollisesti käyttäen yleiseen tapaan kaupallisesti saatavissa olevia suojattuja aminohappoja.

Tämä synteesi tapahtuu esimerkiksi tätä tarkoitus-30 ta varten yleisellä tavalla vastaavista suojatuista aminohapoista siten että ensin sidotaan syntetisoitavan peptidin karboksyyliterminaalinen aminohappo, jonka pysyvä Qf-aminoryhmä on suojattu, tähän tarkoitukseen yleisesti käytettyyn synteettiseen kantaja-aineeseen kovalenttises-35 ti, α-aminon suojaryhmä lohkaistaan pois, näin saatuun vapaaseen aminoryhmään sidotaan lähinnä seuraava suojattu 9 101884 aminohappo sen karboksyyliryhmän kautta, sitten jälleen tämän toisen aminohapon Ä-aminon suojaryhmä lohkaistaan pois, tähän sidotaan seuraava aminohappo ja tällä tavoin asekeleelta liitetään syntetisoitavan peptidin muut ami-5 nohapot oikeassa järjestyksessä ja kun kaikki aminohapot on liitetty, lohkaistaan valmis peptidi kantajasta pois ja mahdollisesti lisäksi läsnä olevat sivufunktioiden suo-jaryhmät lohkaistaan pois.

Aminohappojen liittämisreaktio tapahtuu lämpötila-10 alueella 10 - 40 °C, mieluimmin 20 - 30 °C, mahdollisesti tähän tarkoitukseen yleisesti käytetyssä inertissä liuot-timessa tai suspension väliaineessa (esimerkiksi dikloori-metaanissa), jolloin voidaan mahdollisesti liukoisuuden parantamiseksi lisätä 20 %:iin saakka dimetyyliformamidia.

15 Synteettisenä kantajamateriaalina tulevat kysymyk seen synteettiset polymeerit, esimerkiksi turpoava poly-styreenihartsi, joka on helmien muodossa (esimerkiksi, kloorimetyloitu kopolymeraatti,.joka on.muodostunut poly-styreenistä ja 1 %:sta divinyylibentseeniä). Pysyvien 20 (i-aminoryhmien suojaryhminä tulevat kysymykseen esimerkiksi: tertiaarinen butyloksikarbonyyliryhmä, karbobent-soksiryhmä tai karbobentstioryhmä (joissa mahdollisesti on kulloinkin p-bromi tai p-nitrobentsyylijäännös), tri-fluoriasetyyliryhmä, ftalyylijäännös, o-nitrofenoksiase-25 tyyliryhmä, trityyliryhmä, p-tolueenisulfonyyliryhmä, ' bentsyyliryhmä, bentseeniytimessä substituoidut bentsyy- lijäännökset (p-bromi- tai p-nitrobentsyylijäännös), Ä-fenyylietyylijäännös. Tämän lisäksi viitataan myös Jesse P. Greensteinin ja Milton Winitzin kirjaan Chemistry 30 of Amino Acids, New York 1961, John Wiley and Sons, Inc., osa 2, esimerkiksi sivuille 883 ja sitä seuraavat sivut, sekä teokseen The Peptids, osa 2, toim. E. Gross ja J. Meienhofer, Academic, New York, taulukoihin III ja IV.

Nämä suojaryhmät sopivat periaatteessa myös kysymykseen 35 tulevien aminohappojen muiden funktionaalisten sivuryhmien (OH-ryhmät, Ni^-ryhmät) suojaamiseen.

101884 10 Läsnä olevat hydroksiryhmät (seriini, treoniini) suojataan mieluimmin bentsyyliryhmien ja vastaavien ryhmien avulla. Muut aminoryhmät kuin pysyvät a-aminoryhmät (esimerkiksi D-asemassa olevat aminoryhmät; arginiinin 5 guanidinoryhmä) suojataan mieluimmin nitroryhmillä.

Yksittäisten aminohappojen liittäminen toisiinsa tapahtuu tähän tarkoitukseen yleisesti käytetyillä menetelmillä. Erityisesti tulevat kysymykseen: symmetristen anhydridien menetelmä 10 (disykloheksyylikarbodi-imidin läsnä ollessa),. kar- bodi-imidi-menetelmä, karbodi-imidi-hydroksibentsotriatsoli-menetelmä (katso The Peptids, osa 2, toim. E. Gross ja J. Meien-hofer).

15 Arginiinin liittämiseen käytetään mieluimmin kar- bodi-imidi-menetelmää, asparagiinin sekä glutamiinin lititämiseen käytetään mieluimmin karbodi-imidi-hydroksi-bentsotriatsoli-menetelmää (katso The Peptids, osa 2, toim.

E. Gross ja J. Meienhofer). Muita aminohappoja varten käy-20 tetään yleensä symmetristen tai seka-anhydridien menetelmää .

Patenttivaatimuksen 1 mukaisten peptidien, joissa kuitenkin R° on D-Orn tai D-Lys (lähtöaineita syanaatin avulla muuttamista varten), valmistus voi tapahtua esi-25 merkiksi mainitun asteittaisen peptidinrakentamisen tai kappalekondensaation avulla.

Kun valmistetaan keksinnön mukaisia peptidejä, joissa R6 on Cit(Q) tai Hci(Q), käytetään peptidin synteesissä yleensä vastaavaa päässä olevaa ureidoryhmässä 30 alkyyliryhmällä Q substituoitua Cit:a tai Hei:a.

Peptidien I muuttaminen niiden happoadditiosuoloik-si voidaan suorittaa antamalla niiden reagoida happojen kanssa sinänsä tunnetulla tavalla. Päinvastoin voidaan vapaiden peptidien vapauttaminen suorittaa antamalla niiden 35 happoadditiosuolojen reagoida emästen kanssa.

101884 11

Valmistusmenetelmässä on siis kysymys esimerkiksi yksinomaisesta kiinteäfaasitekniikasta, osittaisesta kiin-teäfaasitekniikasta, kappalekondensaatiosta tai klassisesta liuosfaasisynteesistä. (Katso M. Bodanszky, "Prin-5 ciples of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984).

Esimerkiksi yksinomaisen kiinteäfaasisynteesin menetelmiä on kuvattu oppikirjassa "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M. Stewart ja J.D. Young, Pierce Chem.

Company, Rockford, III., 1984 (2. painos), G. Barany ja 10 R.B. Merrifield, "The Peptides", kappale 1, s. 1 - 285, 1979, Academic Press, Inc.

Klassinen liuossynteesi on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl). Synthese von Peptiden", E. Wunsch (toimit-15 taja) (1974) , Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Saksan Liittotasavalta.

Sellaisissa synteeseissä on tavallista, että eri aminohappojäännösten reaktiiviset sivuketjun funktionaaliset ryhmät suojataan sopivien suojaryhmien avulla, jol-20 lainen estää kemiallisen reaktion tässä kohdassa, kunnes ryhmä lopuksi otetaan pois. Yleensä niissä on myös tavallista aminohapon tai fragmentin Ot.-aminoryhmän suojaaminen siksi aikaa kun tämä kokonaisuus reagoi karboksyyliryhmän avulla, minkä jälkeen seuraa α-aminon suojaryhmän selek-25 tiivinen poistaminen, jotta seuraava reaktio voisi tapahtua tässä kohdassa. Sen mukaisesti niissä on samoin tavallista valmistaa synteesin yhtenä vaiheena välituote, joka käsittää jokaisen aminohappojäännöksistä ja se on halutun järjestyksen mukaisesti liitetty peptidiketjuun, jolloin 30 sivuketjusuojaryhmät liitetään sopiviin jäännöksiin.

Tämän keksinnön mukaiset menetelmät voidaan suorit-taa lukuisia tukifaaseja käyttämällä. Nämä tukifaasit voivat olla esimerkiksi hartseja, kuten bentshydryyliamiini-hartseja (sopivasti 2 % verkkokytkentää), p-metyylibents-35 hydryyliamiinihartseja (sopivasti 2 % verkkokytkentää), tai vastaavia.

101884 12

Kaavassa II: 1 2 . 3 ovat R , R ja R edelleen yllä lähemmin kuvatun mukaisia, X1 on vety tai asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 5 hiiliatomia sisältävien alifaattisten tai alisyklisten karboksyylihappojen suorista tai haarautuneista ketjuista, tai α-aminon suojaryhmä. Χ^:η tarkoittamat a-aminon suojaryhmät ovat sellaisia, jotka alan kehitystason mukaan ovat tunnettuja käytettäviksi asteittaisessa synteesissä 10 polypeptidejä varten. <X-aminon suojaryhmäluokista, joita voidaan käyttää X^:nä, voidaan mainita fluorenyylimetoksi-karbonyyli (Fmoc) tai t-butoksikarbonyyli (Boc).

4 X voi olla sopiva Ser:n hydroksyyliryhmän suoja-ryhmä, kuten esimerkiksi bentsyyli (Bzl) ja 2,6-dikloori-15 bentsyyli (DCB). Parhaana pidetty suojaryhmä on Bzl.

5 X voi olla sopiva Tyr:n fenyylihydroksyyliryhmän suojaryhmä, kuten esimerkiksi Bzl, 2-Br-Z ja 2,6-dikloori-bentsyyli (DCB). Parhaana pidetty suojaryhmä on DCB.

X^ on Lys:n tai Orn:n sivuketjuaminoryhmän sopiva 20 suojaryhmä. Esimerkkejä sopivista sivuketjuaminon suoja-ryhmistä ovat bentsyloksikarbonyyli (Z) ja 2-klooribent- syloksikarbonyyli /Z-(2-Cl)_7.

8 — — X on sopiva suojaryhmä Arg:n guanidinoryhmälle, kuten esimerkiksi nitro, Tos, metyyli-(t-butyylibents)-25 sulfonyyli, 4-metoksi-2,3,6-trimetyylibentssulfonyyli; parhaana pidetty ryhmä on Tos.

on amidiryhmää suojaava bentshydryyli- tai metyylibentshydryyliryhmä, joka on kiinnittynyt tähän tarkoitukseen yleisesti käytettyyn kantajahartsiin (esi-30 merkiksi 98 % styreeni - 2 % dinyylibentseenikopolyme-raatti, joka sisältää bentshydryyliamiini- tai metyyli-.. bentshydryyliamiiniryhmiä) .

Sivuketjuaminon suojaryhmän valinta ei ole kriittinen, mutta yleensä valitaan sellainen, joka ei poistu 35 kun α-aminon suojaryhmiä poistetaan synteesin aikana.

101884 13

Kaavan I mukaiset peptidit valmistetaan kaavan II mukaisista välipeptidihartseista alan nykytason perusteella tunnettujen menetelmien mukaan.

Kaavan II mukaisten välipeptidihartsien kiinteäfaa-5 sisynteesi suoritetaan oleellisesti siten kuin Merrifield, J. on kuvannut julkaisussa J. Am. Chem. Soc., 85, s. 2 149 (1963). Kiinteäfaasisynteesi aloitetaan peptidin C-termi-naalisesta päästä kytkemällä suojattu «-aminohappo sopivaan hartsiin. Tällainen lähtöaine voidaan valmistaa sito-10 maila α-aminosuojattu Gly tai D-Ala amidisidoksella bents-hydryyliamiinihartsiin. Sellaisia kantajahartseja on yleisesti saatavissa kaupallisesti ja niitä käytetään yleensä, kun toivotussa syntetisoitavassa polypeptidissä on C-pääs-sä a-karboksiamidi.

15 Eräässä synteesin suoritusmuodossa suojataan Gly:n tai D-Ala:n primaarinen aminoryhmä t-butoksikarbonyloivalla vaikuttaja-aineella ja kytkeminen suoritetaan käyttämällä jotakin tunnetuista dialkyylikarbodi-imidi-kytken-tämenetelmistä.

20 Sopivan kytkentäreagenssin valinta on asiantunti jalle tuttua. Erityisen sopiva kytkentäreagenssi on N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi (DIC).

Aktivoivia reagensseja ja niiden käyttöä peptidi-kytkennässä on kuvattu teoksessa M. Bodanszky, "Prin-25 ciples of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, 1984.

Jokainen suojattu aminohappo tai aminohappojakso lisätään kiinteäfaasireaktoriin käyttäen sen suurin piirtein kaksinkertaista ylimäärää ja kytkeminen voidaan suorittaa väliaineessa DMF:CH2Cl2 (1:1) tai pelkässä 30 CH2Cl2:ssa. Sellaisissa tapauksissa, joissa esiintyy epätäydellistä kytkeytymistä, kytkentämenetelmä toistetaan, . ennen kuin poistetaan α-aminon suojaryhmä ennen seuraavan aminohapon kanssa kytkemistä. Kytkentäreaktion tulosta tutkitaan kussakin synteesin vaiheessa mieluimmin ninhyd-35 riinireaktion avulla kuten on kuvanneet E. Kaiser et ai., Anal. Biochem., 34, 595 (1970).

101884 14

Sen jälkeen kun kaavan II mukaisten peptidihart-sien haluttu aminohapposekvenssi on saatu valmiiksi, poistetaan päässä oleva Boc-ryhmä ja haluttaessa suoritetaan N-terminaalinen asylointi käyttämällä sopivaa asyylihyd-5 ridiä tai happokloridia 50-kertaisena ylimääränä haloge-noidussa hiilivetyliuottimessa; sopivasti etikkahapon an-hydridiä metyleenikloridissa 30 minuutin ajan. Välipepti-di voidaan poistaa kantajahartsista käsittelemällä sitä sellaisella reagenssilla kuin esimerkiksi nestemäisellä 10 fluorivedyllä, joka ei ainoastaan lohkaise peptidiä irti hartsista, vaan lohkaisee myös pois kaikki muut sivuket-jusuojaryhmät X , X^, X®, X*® ja X6, mikäli se on läsnä.

Mikäli lohkaisemiseen käytetänä fluorivetyä, silloin ovat reaktioputkessa läsnä anisoli tai m-kresoli tai 15 haluttaessa metyylietyylisulfidi huuhteluaineena.

*6 6

Peptidien II, joissa R on D-Lys tai D-Orn ja X

on vety, muuttaminen peptideiksi I syanaatin avulla on kuvattu edellisillä sivuilla.

Jos asylointi jätetään pois, johtaa kaavan II mu-20 kaisten peptidihartsien käsitteleminen fluorivedyllä sellaisten dekapeptidien muodostumiseen, joissa on vapaita omega-amino- ja/tai α-aminoryhmiä ja jotka vastaavat kaavaa II, jossa X-, X^, X5, X8, X1® ja, mikäli se on läsnä, β X ovat vety. Nämä vapaat peptidit muutetaan kaavan I mu-25 kaisiksi peptideiksi, joissa X on karbamoyyliryhmä, nimittäin käsittelemällä syanaatilla, sopivasti alkalimetalli-syanaatilla, mieluimmin kaliumsyanaatilla. Viimeksi mainittua reaktiota, toisin sanoen I^^n muuttamista ^N-C0-NH:ksi peptidien aminopäässä ja Orn/Lys-jäännösten 30 muuttamista Cit/Hci-jäännöksiksi voidaan helposti tarkkailla HPLC:n avulla käyttäen MeCN-vesipitoisia TFA-sys-, teemejä, johtuen karbamoyloiduille peptideille tunnus omaisesta retentioajan pidentyneisyydestä 2-3 minuutin verran, toisin sanoen f^N-CO-NH-ryhmän omaaville yhdis-35 teille, I^N-ryhmän omaaviin yhdisteisiin verrattuna tunnusomaisesta .

101884 15

Vaihtoehtoisesti ja mieluummin saadaan peptidit I, joissa X = asyyli tai karbamoyyli, suoraan kaavan II mukaisista välipeptidi-hartseista, joissa X. on asyyli tai kar-*6 1 bamoyyli ja R on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q), 5 lohkaisemalla ja poistamalla lohkaisemalla suojaryhmät.

Vaikka tässä kuvataan myös kaavan I mukaisten yhdisteiden yksinomainen kiinteäfaasisynteesi ja osittainen kiinteäfaasisynteesi, voidaan yhdisteet valmistaa klassisten liuosfaasimenetelmienkin avulla.

10 Esimerkeissä kuvatulla tavalla valmistettuja, syn teettisiä peptidejä verrattiin kahteen tehokkaimmasta viime aikoina kuvatuista LHRH:n antagonisteista, nimittäin — 12 o r i n _ yhdisteisiin /Ac-D-Phe(4-C1) ' , D-Trp , D-Arg , D-Ala _/- LHRH (ORG-30276) (Coy et ai., Endocrinology, 100, 1 445,

15 1982) ja /Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg®7LHRH

(ORF 18260) (Rivier et ai., teoksessa: Vickery, B.H., Nestor, Jr., J.J., Hafez, E.S.E. (toimittajat), "LHRH and Its Analogs", s. 11 - 22, MTP Press, Lancaster, UK, 1984), ja todettiin, että ne osoittivat yhtä voimakkaita estäviä 20 vaikutuksia sekä in vitro että in vivo, tosin sillä poikkeuksella, että päinvastoin kuin kontrollipeptideillä niillä ei ilmennyt in vivo turvotusvaikutuksia.

Hormonaalisia vaikutuksia in vitro verrattiin rottien aivolisäkerauhasen superfundamentoituihin solusys-25 teemeihin (s. Vigh ja A.V. Schally, Peptides, 5 suppl.

1: 241 - 247, 1984), joissa LHRH:n (ja muiden vapauttavien hormonien) vaikutus voidaan todeta tarkkaan, koska LH:n (tai muiden aivolisäkerauhashormonien) määrä, joka erittyy poisvirtaavaan väliaineeseen, ei ainoastaan ole 30 verrannollinen käytetyn peptidin hormoninvapautustehoon, vaan on myös helposti mitattavissa hyvin kuvatun radioim-i munoanalyysin avulla.

LHRH:n antagonistin tehokkuuden määrittämiseksi käytetään superfundamentointiin seoksia, jotka sisältävät 35 LHRH:a samana pysyvän konsentraation (tavallisesti 1 nM) ja antagonistia vaihtelevia konsentraatioita, jotta saa- 16 101884 täisiin määritettyä se molekyylinen antagonistin suhde LHRH:n, jossa LHRH:n vaikutus on täysin estynyt. Nämä suhteet ovat suunnilleen 5 kummankin tämän keksinnön mukaisen peptidin ja vertailupeptidin kohdalla, kun rotan 5 aivolisäkerauhasen solusysteemiä esi-inkuboidaan etukäteen antagonistien kanssa 9 minuutin ajan.

In vivo -ovulaationestokokeessa (A. Corbin ja C.W. Beattie; Endocr. Res. Commun. 2, 1 - 23, 1975; D.H. Coy et ai.. Endocrinology, 100, 1 445, 1982) todettiin kek-10 sinnön mukaisten peptidien kohdalla samoin, että ne ovat suurin piirtein yhtä tehokkaita kuin kontrolliantagonis-ti, nimittäin kullakin peptidillä voitiin havaita ovulaation 87,5 - 100 % estyminen ihon alle annetun annoksen ollessa 1-3 pg/rotta.

15 Schmidtin et ai. (Contraception, 29, 283 - 289, 1984) turvotuskokeessa voitiin kuitenkin todeta selvä ero kontrollipeptidien ja keksinnön mukaisten peptidien välillä. Kontrollipeptidit aiheuttivat turvotusta kasvoissa ja raajoissa,.kun niitä annettiin rotille ihon alle an-20 noksina 1,25 ja 1,5 mg/kg. Keksinnön mukaisilla peptideillä ei voitu havaita sellaista vastavaikutusta, kun niitä annettiin ihon alle annoksena 1,5 mg/kg.

Suoritetuissa kokeissa jaettiin rotat kolmeen ryhmään, siten että kulloinkin oli viisi rottaa ryhmää koh-25 den ja tutkittua yhdistettä kohden. Suoritettiin vertailu tunnetun, alan kehitystason mukaisen yhdisteen kanssa, 12 1 jolla on nimitys ORG 30276 (N-Ac-D-p-Cl-Phe ' , D-Trp , D-Arg6, D-Ala10).

Ryhmille annettiin kerran päivässä kahtena peräk-30 käisenä päivänä ruiskeena ihon alle LHRH:n antagonisteja annostuksena 1,5 mg/kg. Kontrolliryhmälle annettiin ruiskeena ainoastaan laimennusainetta. Rottia tarkkailtiin 5 tunnin ajan päivää kohden. Rottien reaktiot luokiteltiin seuraavasti: NR ei näkyvää vastavaikutusta, PR osit-35 täinen vastavaikutus: turvotusta nenän alueella ja nenän-vierusalueella, FR täydellinen vastavaikutus: turvotusta kasvoissa ja turvonneet raajat.

101884 17

Alla olevassa taulukossa 1 on yhteenveto tuloksista.

Taulukko 1 5 LHRH:n 1.-päivä 2. päivä

antagonisti_NR_PR_FR_NR__PR_FR

ORG 30276 3 7 0 0 0 10 kontrolli 900 900 esimerkki I 800 9 0* 0 10 esimerkki III 8 0 0 8 0 0 esimerkki IV 9 0 0 9 0 0 esimerkki V 9 0 0 8 1* 0 esimerkki XX 9 0 0 8 1* 0 esimerkki XXI 900 900 15 esimerkki XXVI 800 800 esimerkki XXVII 900 900 * hyvin vähäistä kasvoturvotusta 20 Kaikki valmistetut peptidit ovat täysin tehokkai ta LHRH-vapautuksen estämisessä jossakin määrin järkevinä konsentraatioina in vitro, vaikka useimmat ovat hiukan vähemmän tehokkaita kuin kysymyksessä olevat in vitro-standardit; tosin nämä peptidit ovat in vivo paljon te- 25 hokkaampia.

: Tämä osoitettiin kokeessa, joka koski histamiinin vapauttamista in vitro vatsakalvon syöttösoluista, joka koe suoritettiin yhdenmukaisesti Morganin et ai. (Int. Archs. Allergy appi. Immun. 80, 70, 1986) menetelmän kans-30 sa.

Histamiinin vapauttaminen in vitro ‘ Tässä kokeessa rottia nukutettiin eetterin avulla

ja vatsaontelotulehdusnestesoluja otettiin talteen pesemällä niitä 12 ml:11a syöttösoluväliainetta (MCM) (150 mM 35 NaCl; 3 mM KC1; 3,0 mM Na2HPC>4; 3,5 mM KH2P04? 0,98 mM

CaCl2; 5,6 mM desktroosi; 0,1 % vasikan seerumin albumii- 1. 101884 ni; 0,1 % gelatiini ja 10 E/ml hepariinia) /*9_7. Koottiin soluja 4:Itä tai 5:Itä rotalta, ne sentrifugoitiin nopeudella 120 G, uudelleensuspendoitiin MCM:een konsentraa-tioksi 0,5 x 106 ml ja 1 ml annostettiin 12 x 75 mm:n po-5 lyetyleeniputkiin. Putkien annettiin tasoittua 15 minuutin ajan 37 °C:een ja niitä inkuboitiin 60 minuutin ajan yksin (histamiinin taustavapauttaminen), 48/80:n kanssa (positiivinen kontrolli) (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.) tai sopivien konsentraatioiden kanssa (1 ng - 10 jig/ml) 10 LHRHrn antagonisteja. Reaktio lopetettiin jäähdyttämällä putket 4 °C:een. Putket sentrifugoitiin; supernatantit poistettiin ja niitä säilytettiin -20 °C:ssa, kunnes niistä tutkittiin histamiini. Kokeet suoritettiin kulloinkin kahtena. Solujen kokonaishistamiini osoitettiin keittämäl-15 lä 10 minuutin ajan. Vastavaikutuksena antagonisteille vapautettu histamiini ilmoitettiin prosenttimääränä koko vapautumista. Nämä konsentraatiot, joissa vapautui suurin piirtein 50 % koko syöttösolujen histamiinista (HRD^q pg/ml), määritettiin jokaiselle antagonistille. Tuloksis-20 ta on esitetty yhteenveto kuviossa 1.

Kaikilla peptideillä todettiin ovulaatio estävä vaikutus naarasnisäkkäillähyvin alhaisina annoksina. Tämän keksinnön mukaiset peptidit annettiin usein fysiologisesti hyväksyttävien, ei myrkyllisten suolojen, kuten 25 esimerkiksi happoadditiosuolojen, muodossa. Esimerkkejä sellaisista happoadditiosuoloista ovat hydrokloridi, hyd-robromidi, sulfaatti, fosfaatti, fumaraatti, glukonaatti, tannaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsonaatti, sukkinaatti, alginaatti, pamoaatti, malaatti, askorbaat-30 ti, tartraatti ja vastaavat. Kun vaikuttava aine annetaan tablettimuodossa, voi tabletti sisältää fysiologisesti hyväksyttävää laimennusainetta, jossa on sideainetta, kuten esimerkiksi traganttia, maissitärkkelystä tai gelatiinia; hajotusainetta, kuten algiinihappoa ja liukuai-35 netta, kuten magnesiumstearaattia.

101884 19 Näitä peptidejä voidaan antaa nisäkkäille laskimoon, ihon alle, lihaksen sisään, suun kautta, nenän sisään tai emättimen sisään, sikiävyyden ehkäisyn ja/tai kontrollin aikaansaamiseksi. Tepsivät annokset vaihtele-5 vat kulloinkin antamismuodon ja kulloisenkin nisäkäslajin mukaan. Esimerkki tyypillisestä annostusmuodosta on fysiologinen suolaliuos, jossa on peptidiä, ja tätä annetaan annoksena suurin piirtein 0,1 - 2,5 mg/kg ruumiinpainoa. Peptidin antaminen suun kautta voi tapahtua joko 10 kiinteänä tai nestemäisenä muotona.

Vaikka keksintö on kuvattu huomioiden parhaana pidetty suoritusmuoto, tulisi olla itsestään selvää, että voidaan tehdä vaihdoksia ja muutoksia, jotka ovat asiantuntijalle ilmeisen selviä, ilman että poiketaan oheis-ten patenttivaatimusten rajoittamalta keksinnön alueelta. Keksinnössä voidaan samoin käyttää alan kehitystason mukaisia korvaamisia, jotka eivät oleellisesti poikkea suorituksesta .

SB-030, SB-075 ja SB-088 ovat, kuten jäljempänä on 20 kuvattu tarkemmin, dekapeptidejä, joilla on erityisen ' edullisia vaikutuksia:

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-R3-Ser-Tyr-R^-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH 3 fi 2 SB-030, R = D-Trp, R = D-Cit; SB-075, R3 = D-Pal, R6 = D-Cit; ' 25 SB-088, R3 = D-Pal, R6 = D-Hci.

Rakenneosiin sisältyvistä aminohapoista eivät D-Pal, D-Cit ja D-Hci ole kaupallisesti saatavissa. D-Pal vaatii täydellisen synteesin, joka alkaa dietyyliasetamidomalo- naatista ja 3-pikolyylikloridista ja suoritetaan tunnetul-30 la tavalla. D-Cit ja D-Hci voidaan helposti valmistaa kaupallisesti saatavista diaminohapoista, kuten esimerkiksi aminohaposta D-Orn tai D-Lys.

Jokaisella peptidillä ilmenee voimakas LHRH:a estävä vaikutus, kuten alla on osoitettu, eikä ollenkaan 35 turvotusta aiheuttavia sivuvaikutuksia.

101884 20

Taulukko 2 SB—030:n, SB—075:n ja SB—088:n LHRH:a estävä vaikutus 5 . .

Peptidi LHRH:n (3 nM) % estyminen Ovulaationesto- ekvimolaarisella määrällä koe peptidiä ajankohtana 0 min. 2 tunnin kuluttua annos (pg) % esto 10 SB-030 83 58 1,5 50 3.0 100 SB-088 86 60 1,5 66 2.0 83 15 3.0 100 SB-075 89 54 1,5 75 1.0 100 20 --—'--

Lyhennykset: Aminohapot ja suojaryhmät on lyhennetty kuten IUPAC IUB JCBN on suositellut /Eur. J. Biochem.

138, 9 - 37 (1984]_7. Muita lyhennyksiä ovat: Βοο20, di-t- 25 butyylidikarbonaatti; DCM, di-kloorimetaani; TLC/TLE, ohutkerroskromatografia/elektroforeesi silikageelilevyllä.

SB-030:11a on SB-075:een ja SB-088:aan verrattuna se etu, että se sisältää vain yhden epätavallisen aminohapon, nimittäin aminohapon D-Cit. Toisaalta osoittavat 2q sekä SB-075 että SB-088 suurempaa tehokkuutta ja parempaa vesiliukoisuutta kuin SB-030.

Havainnot ja kokeet, jotka tehtiin SB-030:n, SB-075:n ja SB-088:n synteesin aikana, voidaan esittää lyhyesti seuraavasti: 35 101884 21

Kuvataan SB-030:n, SB-075:n ja SB-088:n kiinteäfaa-sisynteesi bentshydryyliamiinihartsin yhteydessä käyttäen Boc-toimintaohjetta. Tämä menettely on täysin riittävä tämän peptidin kokoamista varten, koska se sisältää as-5 teittaisen ketjunpidentämisen karboksyylipään kautta, jotta vältettäisiin merkittävä rasemoituminen amidisidok-sen muodostamisen aikana, ja samoin siihen sisältyy välituotteiden helppo eristäminen, jotka välituotteet voivat osoittautua erikoisen vaikeiksi syntetisoitaessa luon-10 teeltaan hydrofiilisia fragmentteja (toisin sanoen fragmentteja 9 - 10 - 5 - 10) .

Tavanomainen asteittainen synteesi liuoksessa on luonnollisesti myös sopiva näiden peptidien valmistusmenetelmä, mutta se menetelmä vaatii kuitenkin varmasti 15 enemmän työtä ja aikaa.

Lähtöaineet

Kiinteä kantaja Käytettiin bentshydryyliamiinihartsia, joka sisälsi 1,1 mekv. NH2/g (Advanced ChemTech, Louisville, KY).

20 Voidaan myös käyttää pienemmän Nl^-pitoisuuden, esim.

0,4 - 0,6 mekv./g, omaavia hartseja, mutta niiden käyttö on luonnollisesti epätaloudellisempaa.

Aminojohdannaiset

Alla mainitut Boc-aminohapot hankittiin toimini-

L· O

meitä Bachem ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta:

Boc-D-Ala, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu.HjO,

Boc-D-Nal, Boc-D-Phe(4C1), Boc-Pro,

Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Trp ja Boc-Tyr(DCB).

Boc-D-Cit, Boc-D-Hci ja Boc-D-Pal, joita ei ole O u kaupallisesti saatavissa, valmistettiin kirjallisuuden mukaan (1 - 4), vähäisin muutoksin.

22 101884

Boc-D-Cit

Vaihe 1, D-Cit D-Orn (Sigma, 98 %) muutettiin D-Cit:ksi kuten on kuvattu (1), sillä poikkeuksella, että reaktioseosta, jossa oli (D-Orn)2Cu ja KOCN, sekoitettiin 2-3 tunnin ajan, jotta esitettäisiin (D-Cit, D-Orn)Cu:n muodostaman karstan kerrostuminen astian seinämiin.

D-Cit:n puhtaus tutkittiin TLE:n (ohutkerroselek-troforeesi) avulla käyttäen pH-arvon 6,5 omaava pyridii-jq ni-etikkahappo-vesi (100:4:900) -puskuriliuosta ja 30 V/cm, 45 minuutin aikana.

Vaihe 2, Boc-D-Cit 6,6 g (30 mmoolia) BoCjO, joka oli 15 ml:ssa ase-tonitriiliä, lisättiin liuokseen, jossa oli 4,4 g (25 mmoolia) D-Cit 25 ml:ssa vettä ja 12,6 ml:ssa (90 mmoolia) trietyyliamiinia. Seosta sekoitettiin 2-3 tunnin ajan. Sen jälkeen seokselle suoritettiin TLC (ohutker-roskromatografia) käyttäen liuotinsysteemiä etyyliase-taatti-pyridiini-etikkahappo-vesi (60:10:3:6): yhdisteil-2Q lä Boc-D-Cit, D-Cit ja Boc-D-Orn (Boc), joka muodostui D-Orn-epäpuhtaudesta, ilmenevät vastaavasti Rf-arvot 0,4, 0,0 ja 0,9. Seosta laimennettiin 25 ml :11a vettä ja uutettiin dietyylieetterillä (2 x 20 ml) ja etyyliasetaatilla (2 x 20 ml), jotta poistettaisiin ylimäärä dikarbo-2^ naattia ja Boc-D-Orn(Boc)-epäpuhtaus. Vesifaasi tehtiin happamaksi käyttäen 1 M KHSC>4 ja sen jälkeen kun oli lisätty suunnilleen 10 g Na2S04 uutettiin faasia etyyliasetaatilla (3 x 30 ml). Yhdistetyt etyyliasetaattiliuok-set (jotka oli huolellisesti erotettu vesikerroksesta) 30 haihdutettiin tyhjössä. Jäännös laimennettiin kuivalla dioksaanilla ja haihdutettiin tyhjössä kolme kertaa. Tämän seurauksena muodostunut kevyt öljy laimennettiin 25 ml:11a DMF ja käytettiin kytkemiseen pitoisuutena mmooli/ ml tätä Boc-D-Cit-perusliuosta.

101884 23

Boc-Cit:n synteesi käyttäen Boc-atsidia asylointi-aineena ja kiteisen disykloheksyyliamiinisuolan valmistus on kuvattu (2).

Boc-D-Hci 5 Vaihe 1, D-Hci D-Hci valmistettiin yhdisteestä D-Lys.HCl (Sigma) vastaavasti kuin D-Cit (katso yllä ja viittaus 1)..

Vaihe 2, Boc-D-Hci 6,6 g di-tert-butyylikarbonaattia laimennettuna 10 15 ml:11a asetonitriiliä lisättiin liuokseen, jossa oli 25 mmoolia (4,73 g) D-Hci 25 mlsssa vettä ja 12,6 ml:ssa (90 mmoolia) trietyyliamiinia, ja reaktioseosta sekoitettiin 2-3 tunnin ajan. Reaktion täydellisyys tutkittiin TLC:n avulla kuten Boc-D-Cit:n tapauksessa; Boc-D-Hci:n, 15 D-Lys:n ja Boc-D-Lys(Boc):n Rf-arvot olivat vastaavasti 0,3, 0,0 ja 0,8. Reaktioseosta uutettiin eetterillä. Vesi-faasi tehtiin happamaksi käyttäen 1 M KHSO^ ja sen jälkeen kun oli lisätty 10 g Na2SO^, sitä uutettiin etyyliasetaatin ja n-butanolin 1:1-seoksella (4 x 30 ml). Yhdistetyt 20 orgaaniset liuokset kuivattiin Na2SO^:n avulla ja haihdutettiin tyhjössä. Jäännöstä hierrettiin dietyylieetterin kanssa, suodatettiin, pestiin eetterillä, sitten suspen-doitiin etyyliasetaattiin ja sekoitettiin 2 tunnin ajan 20 °C:ssa ja lisäksi 0 °C:ssa vielä 2 tunnin ajan. Näin 25 saatu kiteinen materiaali suodatettiin erilleen, pestiin kylmällä etyyliasetaatilla ja kuivattiin, jolloin saatiin suunnilleen 3,9 g Boc-D-Hci:a, jonka sulamispiste oli 141 - 142 °C (hajoaa).

Boc-D-Pal(3)

Vaihe 1, dietyyliasetamido(3-pyridyylimetyyli)- malonaatti (3)

Saatiin 113,0 g (60,3 %) dietyyliasetamido(3-pyridyylimetyyli) raalonaattia 132,0 g:sta dietyyliasetamidomalo- naattia J.E. Rivierin et ai. (3) menetelmän avulla. Raaka 35 101884 24 materiaali suli 95 °C:ssa. Pieni näyte 104 - 106 °C:ssa sulaneesta (kirjallisuuden mukaan 95 °C) uudelleenkitey-tettiin vedestä.

Vaihe 2, N-asetyyli-3-(3-pyridyyli)-DL-alaniinin 5 etyyliesteri (4) 61,6 g (200 mmoolia) dietyyliasetamido(3-pyridyyli-metyyli)malonaattia laimennettiin tulpalla varustetussa pullossa 210 ml:11a NaOHrn etanoliliuosta ja seisotettiin yön ajan ympäristön lämpötilassa. Seuraavana päivänä seos saatettiin palautusjäähdytysolosuhteisiin ja sitä pidettiin jäähdytyspalautuslämpötilassa 30 minuutin ajan. Seos jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan ja suodatettiin liukenemattomien kiinteiden aineiden poistamiseksi. Liukenemattomia aineita pestiin erilaisilla pienillä määrillä lä etanolia ja heitettiin sitten pois. Yhdistetyt suodok-set haihdutettiin kuiviin ja kuiva jäännös kiteytettiin vedestä käyttäen 3 - 5 ml 1^0:tä grammaa kohden kiinteää ainetta. Materiaalin saanto 38,0 (160 mmoolia, 80 %). Sulamispiste 124 - 126 °C (kirjallisuuden mukaan 118 -20 121 °C).

Vaihe 3, N-asetyyli-3-(3-pyridyyli)-D-alaniinin etyyliesteri (3) 45,0 g (190 mmoolia) yllä kuvattua DL-seosta laimennettiin 225 ml:11a kuumaa 4,5 % HC1. Tämä liuos jääh-

OC ( t Q

dytettnn sitten nopeasti 25 C:een hienojen kiteiden suspension muodostamiseksi. pH-arvo säädettiin 7,2:ksi käyttämällä 2 N KOH:a ja sitten lisättiin 150 mg alfa- kymotrypsiiniä ja pH-arvo pidettiin sitten välillä 6,8 - 7,2 lisäämällä tipoittain 2 N KOH:a. Sen jälkeen kun pH-30 arvossa ei ollut tapahtunut muutosta 15 minuutin aikana, lisättiin vielä 50 mg alfa-kymotrypsiiniä, jotta varmistettaisiin, että hydrolyysi oli tapahtunut täydellisesti. pH-arvossa ei ilmennyt enää muutosta tämän uuden entsyymi- lisäyksen jälkeen ja lopullinen pH-arvo oli 7,2. Tätä 35 101884 25 liuosta uutettiin 4 x 200 ml:lla etyyliasetaattia. Etyy-liasetaattiuutteet yhdistettiin, kuivattiin Na2SO^:n avulla, kuivausaine suodatettiin pois ja liuotin poistettiin tyhjössä. Jäännös uudelleenkiteytettiin tolueenista (13 - 15 ml/g), jolloin saatiin saannoksi 13,0 g (55 mmoolia, 5 o 57 %), tuotetta, jonka sulamispiste oli 79-81 C (kirjallisuuden mukaan 122 °C).

Vaihe 4, 3-(3-pyridyyli)-D-alaniini, D-Pal(3) (4) 13.0 g (55 mmoolia) N-asetyyli-3-(3-pyridyyli)-D-alaniinin etyyliesteriä kuumennettiin yön ajan 100 ml:n 10 kanssa 6 N HClta palautusjäähdyttäen. Liuotin poistettiin tyhjössä. Lisättiin 15 mg etanolia ja tämä poistettiin tyhjössä. Tämä etanolikäsittely toistettiin vielä kaksi kertaa. Jäännös uudelleenkiteytettiin 90 % etanolista, jolloin saatiin 13,0 g (54 mmoolia, 98 %) amiinihydro-15 λ kloridia. Sulamispiste 237 - 239 C (hajoaa) (kirjallisuuden mukaan 253 - 256 °C).

Vaihe 5, N-Boc-3-(3-pyridyyli)-D-alaniini,

Boc-D-Pal(3) (3) 13.0 g (54 mmoolia) yllä kuvattua D-Pal(3):a lai- 20 mennettiin 50 ml :11a I^O:tä. Lisättiin 50 ml tetrahydro- furaania ja 30 ml (214 mmoolia) trietyyliamiinia. Tähän seokseen lisättiin sekoittamisen aikana tunnin väliajoin 4x5 g:n osia B0C2O (90,7 mmoolia). Sen jälkeen kun oli sekoitettu kaikkiaan 6 tunnin ajan, poistettiin tet-2 5 rahydrofuraani tyhjössä. Ylimäärä dikarbonaattia poistettiin heksaanin avulla. Vesikerroksen pH-arvo säädettiin 6 N HCl:n avulla 4:ksi ja sitä..uutettiin sitten 4 x 100 ml:n osilla etyyliasetaattia. Etyyliasetaattiuutteet yh-distettiin ja takaisinuutettiin 2 x 5 ml:n osilla kyllästettyä suolaliuosta. Kuivattiin Na2SO^:n avulla, suodatettiin ja liuotin poistettiin tyhjössä. Jäännös uudelleenkiteytettiin tolueenista, jolloin saatiin 8,4 g (31 mmoolia, 57 %) Boc-D-Pal(3):a, jonka sulamispiste oli f 141 - 142 °C (hajoaa) (kirjallisuuden mukaan 135 - 136 35 o °C) .

101884 26

Peptidihartsien valmistus

Manuaaliseen synteesiin tarkoitettuun reaktioas-tiaan, jonka vetävyys oli suunnilleen 60 ml; pantiin 1 g (1,1 mmoolia) bentshydryyliamiini HCl-hartsia. Annettiin 5 paisua 2 tunnin ajan 20 ml:ssa DCM:a ja suodatettiin sitten. Sen jälkeen lisättiin hartsin joukkoon 15 ml 10 % DIEA/DCM:a, ravistettiin 2 minuutin ajan ja suodatettiin. Viimeksi mainittu käsittely toistettiin vielä kaksi kertaa. Boc-aminohapot liitettiin etukäteen muodostettuina 10 HOBt-estereinä tähän hartsiin vähitelleen kuten on esitetty taulukossa 3. Vaiheet 1-12 muodostavat yhden aminohappo jäännöksen kytkentäsyklin. Kymmenen peräkkäisen syklin avulla saatiin vapaan D-Nal(2)-jäännöksen päättämä dekapeptidiamidihartsi. Tämä peptidihartsi asetyloitiin 15 kuten on kuvattu vaiheissa 2e ja 2f, poistettiin sitten reaktioastiasta, pestiin DCM:lla ja n-heksaanilla ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 2,9 - 3,0 g haluttua seuraavien rakenteiden mukaista asetyylidekapeptidiamidi-hartsia^: 20 1. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(DCB)- D-Cit-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARTSI SB-030:n tapauksessa; 2. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bz1)-

Tyr(DCB)-D-Cit-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARTSI SB-075:n 25 tapauksessa; 3. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4C1)-D-Pal(3)-Ser(Bz1)-

Tyr(DCB)-D-Hci-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-HARTSI SB-088:n tapauksessa.

2 SB-088:a syntetisoitiin pienempi määrä (0,1866 30 mmoolia), peptidihartsia no. 3 ja saadun vapaan dekapep-tidin raakaa HF-suolaa oli vastaavasti 410 mg ja 200 mg.

101884 27

Taulukko 3. Synteesiohjelma

Vaihe Reagenssi ja menetelmä Sekoitusaika 5 minuutteina 3 1 etukäteen valmistettu HOBt-esteri , kytkentä 90 4 2 ninhydriinikoe (5) , kun palloset ovat 10 keksinkertaisen tai voimakkaan sinisiä, toistetaan vaiheet 1+2, heikosti sinisen värin tapauksessa jatketaan vaiheilla 2a - 2f 2a MeOH (10 ml), pesu 1 15 2b 10 % DIEA/DCM (10 ml), neutralointi 2 2c MeOH (10 ml), pesu 1 2d DCM (10 ml), (kolme kertaa) pesu 2 4 2e asetyyli-imidatsoli , asetylointi 30 2f ninhydriinikoe, jos se on positiivi- 20 nen, toistetaan vaiheet 2d - 2f 3 MeOH (10 ml), (kaksi kertaa) pesu 1 4 DCM (10 ml), (kolme kertaa) pesu 2 5 50 % TFA/DM (10 ml), vapauttaminen esteestä 1 25 6 50 % TFA/DM (10 ml), vapauttaminen esteestä . 30 7 IpOH (10 ml), pesu 1 8 10 % DIEA/DCM (10 ml), neutralointi 3 9 MeOH (10 ml), pesu 1 30 10 10 % DIEA/DCM (10 ml), neutralointi 3 11 MeOH (10 ml), pesu 1 :· 12 DCM (10 ml), pesu 2 3 35 Lukuunottamatta yhdistettä Boc-D-Cit valmistet tiin Boc-aminohappojen HOBt-esterit seuraavasti: 101884 28 3 mmoolia Boc-aminohappoa /toisin sanoen (mg:na) D-Ala: 568, D-Pro: 646, Arg(Tos): 1 286, Leu: 748, f Tyr(DCB): 1 321, Ser(Bzl): 886, D-Hci: 865, D-Trp: 913 tai D-Pal(3): 799, D-Phe(4Cl): 899, D-Nal(2): 946? ja 460 mg 5 (3 mmoolia) HOBT.IVOsta liuotettiin 1 ml;an DMF:a, laimen nettiin 2 ml:lla DCM:a, jäähdytettiin 0 °C:een ja annettiin reagoida 0,6 ml:n (3,8 mmoolia) kanssa DIC:a 0 °C:ssa 10 minuutin ajan; sen jälkeen lisättiin hartsiin huuhdellen 4x1 ml:11a DCM:a. Boc-D-Cit:n tapauksessa liuotet-10 tiin HOBt.I^O 3 ml:an Boc-D-Cit-perusliuosta, annettiin reagoida DIC:n kanssa kuten yllä, sitten sekoitettiin hartsin joukkoon käyttäen 1 x 1 ml DMF:a ja 3 x 1 ml:n DCM-huuhtelua.

4 .

Cit:a sisältävien peptidihartsien tapauksessa on 15 kokeen tulos negatiivinen, kun palloset ovat valkeita (tai heikosti keltaisia) ja liuos on värjäytynyt sinipunerta-vaksi. Boc-Arg(Tos):n täydellinen kiinnittyminen Pro-jään-nökseen, joka on liittyneenä hartsiin, voidaan tarkistaa käyttämällä isatiinireagenssia (2,5 g isatiinia, 20 g fe-20 nolia, 30 g bentsyylialkoholia ja 2,5 g Boc-Phe:a); kokeen tulos on negatiivinen, kun palloset ovat valkeita (tai heikosti keltaisia, mutta eivät sinisiä) sen jälkeen kun on pesty 3-4 kertaa asetonilla.

4 0,34 g:n imidatsolia liuotettuna 2 ml:an DCM:a 25 annettiin reagoida 0,5 ml:n kanssa etikkahapon anhydridiä 0 °C:ssa 2 minuutin ajan ja lisättiin sitten hartsin joukkoon käyttäen 3 x 2 ml:n DCM-huuhtelua.

Vapaiden dekapeptidiamidien valmistus

Lohkaisu ja suojauksen poisto 30 Kutakin peptidihartsia käsiteltiin 3 ml:11a m- kresolia ja suunnilleen 30 ml:11a fluorivetyä (HF) 0 °C:ssa 45 minuutin ajan. Sen jälkeen kun HF oli poistettu suurtyhjössä, hierrettiin jäljellä olevaa peptidihartsia kuivan dietyylieetterin kanssa, suodatettiin, pes-35 tiin dietyylieetterillä ja peptidi uutettiin sitten seu-raavalla: 101884 29 1. 50 % etikkahappo ja DMF (2 - 2 x 20 ml) SB-030 :n tapauksessa; 2. 50 % etikkahappo (3 x 15 ml) SB-075:n ja SB-088 :n tapauksessa; 5 ja erotettiin hartsista suodattamalla. Peptidi- liuos haihdutettiin tyhjössä ja jäännöstä hierrettiin di- etyylieetterin kanssa, suodatettiin, pestiin dietyylieet- terillä ja kuivattiin, jolloin saatiin 1,2 - 1,3 g HF- 2 suolaa raakojen dekapeptidien kanssa , puhtauden ollessa 10 70 - 85 %.

Puhdistus

Raaka peptidi puhdistettiin käyttämällä Beckman Prep-350 -preparatiivista HPLC-systeemiä. Erottumiset saatiin tapahtumaan 41,5 x 250 mm:n Dynamax-pylväässä, 15 jossa oli pakattuna pallomaista C^g-silikageeliä (huokoskoko 300 A, osasten suuruus 12 jim) (RAININ Inc. Co.

Woburn, MA).

Raaka SB-030 lisättiin pylvääseen 30 % muurahais-happoliuoksessa, kun sen sijaan raaka SB-075 ja SB-088 20 liuotettiin 30 % etikkahappoon. Käytettiin painegradient-tieluutiota. Liuotin A oli 0,1 % TFA:n vesiliuos ja liuotin B oli 0,1 % TFA 70 % asetonitriilin vesiliuoksessa. Painevirtausnopeus oli 35 ml/min. Pylvään eluointia valvottiin vaihdeltavissa olevan aallonpituuden UV-detekto-25 rin avulla (Beckman tyyppi 163) 220 nm:n aallonpituudel-la.

Puhtaiden dekapeptidiamidien määrä ja yleensä saadut saannot olivat seuraavat: 1. 600 mg (34 %) SB-030:a, 30 2. 960 mg (52 %) SB-075:tä ja 3. 140 mg (45 %) SB-088:a (katso alaviite 2), jol- : loin puhtaus oli >95 %.

Analyyttinen HPLC

HPLC-analyysi suoritettiin Hewlett-Packard malli 35 1090 -nestekromatografiän avulla. Peptidinäytteet kroma- tografoitiin 4,6 x 250 mm:n W-Porex 5 um - C^g-pylväässä 101884 30 (Phenomex, Ranch Palos Verdes, CA) läpivirtausnopeudella I, 2 ml/min käyttäen painegradienttieluutiota liuottimilla A ja B (raakanäytteiden kromatogrammeja on liitetty mukaan) .

5 Aminohappoanalyys i

Peptidinäytteitä hydrolysoitiin 110 °C:ssa 20 tunnin ajan tyhjennetyissä, suljetuissa putkissa käyttäen 4 M metanaisulfonihappoa, jossa oli 0,2 % 3-(2-aminoetyy-li)indolia, ja hydrolysaatin aminohappokoostumus määri-10 tettiin Beckman 6300 -aminohappoanalysaattorissa.

Oheisessa taulukossa on osoitettu LHRH-analogien affiniteetti aivolisäkerauhasta kohtaan, määritettynä käyttäen radioaktiivisuudella merkittyä LHRH:a tai radioaktiivisuudella merkittyä D-Trp6-LHRH:a.

15 Radioaktiivisuudella merkittyä LHRH:a käyttäen suoritetut mittaukset (A) osoittavat, että SB-075:llä ilmenee suurin affiniteetti aivolisäkerauhasen reseptoreita kohtaan, toisin sanoen sillä on suurin kyky syrjäyttää LHRH, mikä on LHRH:n antagonistien päätuntomerkki.

20 Kirjallisuusviitteet: 1. J.P. Greenstein ja M. Winitz: Chemistry of the Amino Acids, John Wiley + Sons, New Yor, NY, 1961. (Cit: 2 491 - 2 494).

2. K. Eisele: Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.

25 356, 845 - 854 (1975).

3. J.E. Rivier, J. Porter, C.L.Rivier, M. Perrin, A. Corriogan, W.A. Hook, R.P. Siraganiean ja W.W. Vale: J. Med. Chem. 29, 1 846 - 1 851 (1986).

4. C. Hoes, J. Raap, W. Bloemhoff ja K.E.T.

30 Kerling: Reel. Trav. Chim. Pay-Bas 99, 99 - 104 (1980).

5. J.M. Stewart ja J.D. Young: Solid Phase Peptide Synthesis, toinen painos. Pierce Chemical Company, Rockford Illinois, 19846.

3i 101884

Esimerkki 1

Kaavan Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-f Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 mukainen peptidi

Synteesi tapahtuu välipeptidistä Ac-D-Nal(2)-Pro-5 D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2.

Tämä välipeptidi rakennettiin asteittain n. 0,6 mekv.

NH2/g sisältävään bentshydryyliamiinihartsiin kiinnittyneenä Beckman 990 -syntetisaattorissa aloittaen Boc-D-Ala:lla alla kuvatun menetelmän mukaan.

10 Kytkeminen suoritetaan ohjeen A mukaan seuraavasti:

Ohje A

Reagenssi Sekoitusaika _(minuutteja) 15 1. Boc-aminohappo 60 - 90 (2-3 mmoolia/g hartsia) + ekviv. määrä DIC:ä 2. MeOH (kaksi kertaa) 1 3. CH2C12 (kaksi kertaa) 1 20

Esteenpoisto suoritetaan ohjeen B mukaan seuraavasti :

Ohje B

25 Reagenssi Sekoitusaika _(minuutteja) 4. 50 % TFA/1 % etaanidiotioli CH2Cl2:ssa (kaksi kertaa) 15 + 15 5. IpOH/1 % etaaniditioli 1 30 6. 10 % TEA CH2Cl2:ssa 2 7. MeOH 1 8. 10 % TEA CH2Cl2:ssa 2 9. MeOH (kaksi kertaa) 1+1 10. CH2C12 (kaksi kertaa) 1+1 35 101884 32

Lyhyesti sanottuna käytetään Boc: ä φ,-aminoryhmien suojaamiseen. Tos:ä käytetään suojaamaan Arg:n guanidi-noryhmää. DCB:ä käytetään Tyr:n fenolisen hydroksyyli-ryhmän suojaryhmänä ja Ser:n OH-ryhmä suojataan BzL:n 5 avulla. Käytetään suojattujen aminohappojen kaksin- - kolminkertaista ylimäärää perustuen bentshydryyliamiinihartsin Nl^-pitoisuuteen plus yhteen ekvivalenttiin DIC:ä CHjC^ Cl^C^iSsa tai 10 - 50 % DMF/CH2CI2: ssa, kulloinkin Boc-aminohapon liukoisuuden mukaan, kahden tunnin ajan.

10 N-terminaalinen asetylointi suoritetaan käyttäen etikkahapon anhydridin 50-kertaista ylimäärää CHjClj^sa 0,5 tunnin aikana. Näin saadulla suojatulla välipeptidil-lä on seuraava kokoonpano:

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser(X4)-Tyr-(X5)-D-15 Lys(X^)-Leu-Arg(X^)-Pro-D-Ala-NH-X^, missä X4 on Bzl ja X^ on DCB, X^ on Z(2-C1), X® on Tos ja X^ on hartsiin kuuluva bentshydryyliryhmä.

Suojatun peptidihartsin halkaisemiseksi ja suojauksen poistamiseksi siitä sitä käsitellään 1,4 ml:11a m-20 kresolia ja 15 ml:11a fluorivetyä grammaa kohden peptidi-hartsia 0,5 tunnin ajan 0 °C:ssa ja 0,5 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen kun fluorivety on poistettu suurtyhjössä peptidihartsi pestään dietyylieetterillä ja peptidi uutetaan sitten DMF:lla ja erotetaan hartsista 25 suodattamalla. DMF-liuos konsentroidaan sitten suurtyhjössä pieneen tilavuuteen ja sitä hierretään sitten dietyyli-eetterin kanssa. Näin saatu raakatuote puhdistetaan yllä kuvatulla tavalla valmistavan HPLC:n avulla. Näin saadaan yllä annetun kaavan mukainen puhdas vapaa välipeptidi, 30 jossa X4, X5, X6, X® ja X1^ merkitsevät vetyä.

Vapaan, D-Lys(X^):n sisältävän välipeptidin annetaan sitten reagoida huoneen lämpötilassa kaliumsyanaatin kanssa 80 % DMF:n vesiliuoksessa (81 mg KCNO/ml; aika: 24 tuntia). Sen jälkeen kun liuotin on poistettu suurtyh-35 jössä seuraa reaktiotuotteen puhdistus preparatiivisen HPLC:n avulla; näin saadaan haluttu D-Hci:n sisältävä peptidi.

101884 33 Näin saatu D-Hci:n sisältävä peptidi on oleellisesti puhdas (95 %:iin saakka). HPLC-analyysi suoritetaan '=-· Hewlett-Packard 1090A -gradienttinestekromatografiasys- teemissä PHENOMENEX (W-Porex 5C18) -pylväässä ja eluoidaan 5 liuottimilla, joista A on: 0,1 % TFA, B: 0,1 % TFA 70 % CH^CNsssa, käyttäen gradienttia 30 - 60 % 30 minuutissa. Halutulla peptidillä ilmenee HPLC-retentioaika (retention time) 28,2 minuuttia.

Peptidien puhdistaminen suoritetaan Beckman Prep-10 350-gradienttinestekromatografissa käyttäen 41,4 x 250 mm:n kartussia, jossa on valmistava käänteinen DYNEMAX C18 -faasi (300 A, 12 um), ja liuottimia, joista A on: 0,1 % TFA ja B: 0,1 % TFA 70 % CH^C^ssa, ja käyttäen painegradienttia 45 - 60 % 30 minuutissa. Puhdas peptidi, 15 joka on saatu TFA-suolan muodossa, voidaan haluttaessa muuttaa asetaattimuotoon, nimittäin saattaen asetaatti-muotoon johtamalla AG3X (Bio-Rad) -pylvään lävitse ja sen jälkeen lyofilisoiden.

Esimerkki II

20 Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyy li) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-N^

Valmistaminen tapahtuu vastaavasta välipeptidis-tä, joka issältää 6-asemassa D-Hci(etyyli):n asemesta aminohapon D-Lys, vastaavalla tavalla kuin esimerkissä 25 I antamalla reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa (0,1 mg 10 ml:ssa 1 g: a kohden välipeptidiä) DMF:ssa~ 0-10 °C:ssa 10 tunnin aikana. Retentioaika (retention time) on 30,8 minuuttia.

Esimerkki III

30 Peptidin Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr- D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-N^ synteesi suoritetaan esimerkissä I kuvatulla tavalla. Lähtöpeptidi sisältää 6-asemassa Boc-D-Orn (Z) : n Boc-D-Lys/Z(2-Cl)y :n asemesta, jota käytetään esimerkissä I. Tämä lähtöpeptidi valmiste-35 taan vastaavasti kuin esimerkissä I. Retentioaika 27,8 minuuttia. Lähtöpeptidin retentioaika 25,5 minuuttia.

101884 34

Esimerkki IV

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(etyyli) -Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Tämä peptidi valmistetaan Ac-D-Nal(2)-Phe(4-C1)-5 D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2:sta ja N-etyyli-isosyanaatista DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden välipeptidiä) 0-10 °C:ssa esimerkin III mukaisesti. Reaktioaika 10 tuntia. HPLC-retentioaika 30,4 minuuttia.

Esimerkki V

10 Peptidin Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr- D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi suoritetaan esimerkissä I kuvatulla tavalla, sillä poikkeuksella, että läh-töpeptidin 1-asemaan sijoitetaan Boc-D-Phe(4-C1) Boc-D-Nal(2):n asemesta, jolloin saadaan välittömänä lähtöpep-15 tidinä Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4—Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2. Retentioaika 26,6 minuuttia; lähtöpep-tidin, jossa on Ac 1-asemassa, retentioaika: 24,0 minuuttia .

Esimerkki VI

20 Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci- (etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on Ac-D-Phe(4-Cl)-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki V), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa 25 (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa DMF:ssa. Reaktioaika 10 tuntia. HPLC-retentioaika: 29,2 minuuttia.

Esimerkki VII

Peptidin Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-30 D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi suoritetaan kuten on kuvattu esimerkissä I, sillä poikkeuksella, että Boc-D-Phe(4-Cl) sijoitetaan Boc-D-Nal(2):n asemesta 1-ase-maan ja Boc-D-Orn(Z) Boc-D-Lys/Z (2-C1)_/: n asemesta 6-ase-maan, niin että välittömänä lähtöpeptidinä saadaan Ac-35 D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D—Ala—NH2 (retentioaika 24,0 minuuttia), jonka annetaan 101884 35 sitten reagoida esimerkin I mukaisesti KCNO:n kanssa. HPLC-retentioaika 26,3 minuuttia.

Esimerkki VIII

Ac-D-Phe(4—Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-5 (etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on Ac-D-Phe(4-Cl)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki VII), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 10 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 28,6 mi nuuttia.

Esimerkki IX

Peptidin Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj synteesi suoritetaan esimerkin 15 I mukaisesti. Saadulla peptidillä ilmenee HPLC-retentioaika 27,4 minuuttia.

Esimerkki X

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyyli) -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 20 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Nal(2)-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-

Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (katso esimerkki IX), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 30,0 minuuttia.

25 Esimerkki XI

Ac-Pro-d-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr- D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 16,8 minuuttia), 30 jonka annetaan reagoida esimerkin I mukaisesti kaliumsya-naatin kanssa. Lähtöpeptidi saadaan vastaavasti kuin esimerkissä I, sillä poikkeuksella, että Boc-Pro sijoitetaan Boc-D-Nal(2):n asemesta 1-asemaan. HPLC-retentioaika 19,3 minuuttia.

101884 36

Esimerkki XII

Ac-Pro-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Pro-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-5 D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki XI), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 22 minuuttia.

Esimerkki XIII

10 Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro- D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 16,85 minuuttia), jonka annetaan esimerkin I mukaisesti reagoida kaliumsya-15 naatin kanssa. Lähtöpeptidi saadaan myös vastaavasti kuin esimerkissä I, sillä erotuksella, että Boc-Pro sijoitetaan Boc-D-Nal(2):n asemesta 1-asemaan ja Boc-D-Orn(Z) Boc-D-Lys/Z (2-Cl)_/:n asemesta 6-asemaan. HPLC-retentioaika 18,8 minuuttia.

20 Esimerkki XIV

Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-Pro-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-0rn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki xin), jonka 25 annetaan esimerkin VI mukaisesti reagoida N-etyyli-isosya-naatin kanssa. HPLC-retentioaika 24,9 minuuttia.

Esimerkki XV

Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 30 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr- " D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 20,8 minuuttia), jonka annetaan esimerkin I mukaisesti reagoida kaliumsya-naatin kanssa. Lähtöpeptidi saadaan vastaavasti kuin esimerkissä I, jolloin kuitenkin 1-asemaan sijoitetaan Boc-35 D-Nal(2):n asemesta aminohappojäännös Boc-D-Phe. HPLC-retentioaika 23,4 minuuttia.

101884 37

Esimerkki XVI

Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-D-Phe{4-Cl)-D-Trp-Ser-5 Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-N^ (katso esimerkki XV), jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 mlsssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 26,0 minuuttia.

Esimerkki XVII

10 Ac-D-Phe-D-Phe(4 —Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-

Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (retentioaika 21,0 minuuttia) , jonka annetaan esimerkin I mukaisesti reagoida ka-15 liumsyanaatin kanssa. Lähtöpeptidin valmistus tapahtuu esimerkin I mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Nal(2):n asemesta sijoitetaan 1-asemaan Boc-D-Phe ja Boc-D-Lys/Z (2-Cl)_7: n asemesta 6-asemaan Boc-D-Orn (Z) . HPLC-retentioaika 23,1 minuuttia.

20 Esimerkki XVIII

Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit(etyyli)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 Lähtöpeptidi on: Ac-D-Phe-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (katso esimerkki XVII), 25 jonka annetaan reagoida N-etyyli-isosyanaatin kanssa DMF:ssa (0,1 mg 10 ml:ssa grammaa kohden lähtöpeptidiä) 0-10 °C:ssa 10 tunnin ajan. HPLC-retentioaika 25,4 minuuttia.

Esimerkki XIX

30 Esimerkki kaavan Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-

Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 omaavan keksinnön mukaisen peptidin yleisestä valmistuksesta.

Tämä peptidi valmistetaan asteittain käyttäen bentshydryyliamiinihartsia, joka sisältää suunnilleen 35 1,0 moolia ekvivalenttisia aminoryhmiä grammaa kohden, käyttäen Beckman 990 -syntetisaattoria, jolloin aloite- 101884 38 taan Boc-D-Alasta. Kytkeminen tapahtuu esimerkissä I annetun ohjeen A mukaan. D-esteen poistaminen suoritetaan esimerkissä I annetun ohjeen B mukaan. Muut olosuhteet’ ovat vastaavien esimerkissä I annettujen tietojen mukai-5 set.

Näin saatu suojattu välipeptidi on kokoonpanoltaan seuraavanlainen:

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser(X4)-Tyr(X5)-D-

Hci-Leu-Arg(X8)-Pro-D-Ala-NHX10, jolloin X4 = Bzl ja X5 8 10 10 = Bzb, X = Tos ja X on bentshydryyliryhmä, joka kuuluu hartsiin.

Näin saadun suojatun peptidin lohkaisu tapahtuu esimerkin I mukaan käyttäen 1,4 ml m-kresolia ja 15 ml fluorivetyä grammaa kohden peptidihartsia (0,5 tuntia 15 0 °C:ssa ja 0,5 tuntia huoneen lämpötilassa). Kaikki muut toimenpiteet ovat esimerkissä I ilmoitetun mukaiset. Saatu raakatuote puhdistetaan preparatiivisen HPLC-kromato-grafian avulla. HPLC-analyysi suoritetaan esimerkin I mukaisesti Hewlett-Packard 1090A -gradienttinestekromato-20 grafiasysteemissä käyttäen Phenomenex-pylvästä ja eluoi-den seuraavilla liuottimilla:

Liuotin A: 0,1 % TFA, liuotin B: 0,1 % TFA 70 % CH3CN:ssa käyttäen gradienttia 35 - 75 % 30 minuutissa.

Saadun peptidin, jossa on 6-asemassa D-Hci, HPLC-retentio-25 aika on 22,9 minuuttia. Lisäpuhdistus tapahtuu Beckmann-Prep-350-gradientti-nestekromatografissa esimerkin I mukaisesti .

Esimerkki XX

Peptidi H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-30 D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 saadaan esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Nal(2):n asemesta sijoitetaan 1-asemaan H2N-CO-D-Nal(2) ja N-terminaalista asylointia ei suoriteta. HPLC-retentioaika 24,0 minuuttia.

Esimerkki XXI

35 Peptidin Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-

Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi tapahtuu kuten on ku- 101884 39 vattu esimerkissä XIX sillä poikkeuksella, että Boc-D-Cit sijoitetaan asemaan 6 Boc-D-Hci:n asemesta. Halutulla peptidillä on HPLC-retentioaika 22,5 minuuttia.

Esimerkki XXII

5 Ac-D-Phe(4-C1)-D-Phe(4—Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-

Arg-Pro-D-Ala-NH2

Valmistus esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Phe(4-C1) sijoitetaan 1-asemaan Boc-D-Nal(2):n asemesta. HPLC-retentioaika 24,0 minuuttia.

10 Esimerkki XXIII

Ac-D-Phe(4-C1)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Valmistus tapahtuu esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Phe(4-C1) sijoitetaan Boc-D- 15 Nal(2):n asemesta 1-asemaan ja Boc-D-Cit Boc-D-Hci:n asemesta 6-asemaan. Saadun peptidin retentioaika on 20,8 minuuttia.

Esimerkki XXIV

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu- 20 Arg-Pro-Gly-NH2

Valmistus tapahtuu eismerkin XIX mukaisesti, sillä erotuksella, että Boc-Gly sijoitetaan 10-asemaan Boc-D-Ala:n asemesta. Saadun peptidin HPLC-retentioaika on 22,4 minuuttia.

25 Esimerkki XXV

Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4-Cl) -D-Pal (3) -Ser-Tyr.-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

Valmistus tapahtuu esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Pal(3) sijoitetaan Boc-D-Trp:n 30 asemesta 3-asemaan. Saadun peptidin HPLC-retentioaika on 13,6 minuuttia.

Esimerkki XXVI

Ac-D-Nal-D-Phe(4—Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 35 Valmistus tapahtuu esimerkin XIX mukaisesti sillä erotuksella, että Boc-D-Cit sijoitetaan D-Hci:n asemesta 101884 40 6-asemaan ja Boc-D-Pal(3) Boc-D-Trp:n asemesta 3-asemaan. Saadun peptidin HPLC-retentioaika on 13,3 minuuttia.

Esimerkki XXVII

Peptidin H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-5 Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NHL, synteesi suoritetaan kuten on kuvattu esimerkissä XIX, sillä erotuksella, että Boc-D-Cit sijoitetaan Boc-D-Hci:n asemesta asemaan 6, Boc-D-Pal(3) sijoitetaan Boc-D-Trp:n asemesta asemaan 3 ja N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Näin saadaan 10 välipeptidi: H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-

Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2· Näin saadun vapaan peptidin annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa 80 % DMF:n vesiliuoksessa (81 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kun on haihdutet-15 tu suurtyhjössä reaktioseos puhdistetaan valmistavan HPLC:n avulla. Näin saadun peptidin HPLC-retentioaika on 14,4 minuuttia.

Esimerkki XXVIII

H2N-Co-D-Nal(2)-D-Phe(4-C1)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hci-20 Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 valmistetaan esimerkin XIX mukaisesti, sillä erotuksella, että Boc-D-Pal{3) sijoitetaan Boc-D-Trp:n asemesta asemaan 3 ja että N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Näin saadaan välipeptidi H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2.

25 Näin saadun vapaan peptidin annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa DMF:n vesiliuoksessa (81 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kun on haihdutettu suurtyhjössä reaktioseos puhdistetaan preparatiivisen HPLC:n avulla. Näin saadun pep-30 tidin HPLC-retentioaika on 14,7 minuuttia.

Esimerkki XXIX

Peptidin H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH2 synteesi alkaa välipepti-din H-D-Nal(2)-D-Phe(4-Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-35 Pro-D-Ala-NH2 valmistamisesta. Välipeptidin synteesi suoritetaan kuten on kuvattu esimerkissä XIX, sillä erotuk- 101884 41 sella, että Boc-D-Orn(Z) sijoitetaan asemaan 6 Boc-D-Hci:n asemesta ja että N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Vapaan, 6-asemassa D-Orn:n sisältävän peptidin annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa 80 % 5 DMF:n vesiliuoksessa (162 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen on haihdutettu suurtyhjössä reaktioseos puhdistetaan preparatii-visen HPLCsn avulla. Näin saadun peptidin HPLC-retentio-aika on 23,6 minuuttia.

10 Esimerkki XXX

Peptidin H2N-CO-D-Nal(2)-D-Phe(4—Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Hci-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 synteesi alkaa välipep-tidin H-D-Nal(2)-D-Phe(4—Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NHj valmistamisella. Välipeptidin synteesi suo-*5 ritetaan kuten on kuvattu esimerkissä XIX, sillä erotuksella, että Boc-D-Lys/Z(2-Cl7 sijoitetaan 6-asemaan Boc-D-Hci:n asemesta ja että N-terminaalinen asetylointi jätetään pois. Vapaan peptidin, joka sisältää 6-asemassa D-Lys:n, annetaan sitten reagoida kaliumsyanaatin kanssa 2® 80 % DMF:n vesiliuoksessa (164 mg KOCN/300 mg peptidiä/ml) huoneen lämpötilassa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kun on haihdutettu suurtyhjössä reaktioseos puhdistetaan prepa-ratiivisen HPLC:n avulla. Näin saadun peptidin HPLC-re-tentioaika on 14,0 minuuttia.

; Esimerkki XXXI,

Pitkään vaikuttava, lihaksen sisään ruiskutettava valmiste

Pitkään vaikuttava lihaksen sisään ruiskutettava seesamiöljygeeni 30 LHRH:n antagonisti 10,0 mg : alumiinimonostearaatti 20,0 mg seesamiöljy 10 ml:aan asti.

Alumiinimonostearaattia kuumennetaan yhdessä seesamiöl jyn kanssa sekoittaen kauan 125 °C:een, kunnes saa-35 daan kirkas keltainen liuos. Tämä seos steriloidaan sit- 42 101884 ten sterilointilaitteessa ja jäähdytetään. Sitten lisätään aseptisesti LHRH:n antagonisti käyttäen avuksi hiertämistä. Erityisen mielellään käytettyjä LHRH:n antagonisteja ovat vähäisen liukoisuuden omaavat suolat, esim.

5 sinkkisuolat, sinkkitannaattisuolat, pamoaattisuolat ja vastaavat. Näillä esiintyy tavattoman pitkä aktiivisuuden kestoaika.

Esimerkki XXXII

Pitkätehoisia lihaksen sisään ruiskutettavia bio-•j^q hajoittuvia polymeerimikrokapseleita LHRH:n antagonisteja 1 % 25/75 Glycolid/Lactid-kopolymeeriä (glykolihaposta ja maitohaposta saatua kopolymeraattia) (rajaviskositeet-tiluku 0,5) 99 % 15 Yllä esitetyn koostumuksen omaavia mikrokapseleita (0 - 150 Angströmiä) suspendoituna seuraavaan seokseen: dekstroosi 5,0 % karboksimetyyliselluloosa-natrium 0,5 % bentsyylialkoholi 0,9 % 20 Tween 80 0,1 % vettä, puhdistettu, riittävästi 100,0 %:iin asti 25 mg mikrokapseleita suspendoidaan 1,0 ml:an ve-hikkeliä.

25 30 35

Claims (6)

101884

1. Peptidi, jolla on kaava

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että X on asetyyli- tai karbamoyyli-ryhmä, R1 on D-Nal(2), D- tai L-Pro, D-Phe tai D-Phe(4-C1), R2 on D-Phe(4-Cl) tai D-Phe(4-F) ja R3 on 25 D-Trp tai D-Pal(3).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että X on asetyyli, R1 on D-Nal(2) tai D-Phe(4-Cl), R2 on D-Phe(4-Cl), R3 on D-Trp tai D-Pal(3) ja R10 on D-Ala.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen pep tidi, tunnettu siitä, että X on asetyyli.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että X on karbamoyyli.

5 X-R^R^R^Ser-Tyr-R^Leu-Arg-Pro-R^-NH;, (I) jossa X on asyyliryhmä, joka on saatu 1-7 hiiliatomia sisältävien, alifaattisten tai alisyklisten karboksyyli-happojen suorista tai haarautuneista ketjuista, tai kar-10 bamoyyliryhmä, R1 on D- tai L-Pro, D- tai L-A3-Pro, D-Phe, D-Phe(4-H1), D-Ser, D-Thr, D-Ala, D-Nal(l) tai D-Nal(2), R2 on D-Phe tai D-Phe(4-Hl), R3 on D-Trp, D-Phe, D-Pal(3), D-Nal(l) tai 15 D-Nal(2), R6 on D-Cit, D-Hci, D-Cit(Q) tai D-Hci(Q) ja R10 on Gly tai D-Ala, jolloin Hl on fluori, kloori tai bromi ja Q on C^-alkyy-li, tai sen fysiologisesti hyväksyttävä happoadditiosuo-20 la.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen pep- 35 tidi, tunnettu siitä, että R6 on D-Cit tai D-Hci. 101884