KR20040063906A - 인간 3 릴랙신 - Google Patents

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KR20040063906A KR10-2004-7005136A KR20047005136A KR20040063906A KR 20040063906 A KR20040063906 A KR 20040063906A KR 20047005136 A KR20047005136 A KR 20047005136A KR 20040063906 A KR20040063906 A KR 20040063906A
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Abstract

본 명세서에서는 인간 H3 프리프로릴랙신, 인간 H3 프로릴랙신, 인간 H3 릴랙신, 변형된 A 사슬 및/또는 변형된 B 사슬을 갖는 인간 릴랙신 유사체에 대해 개시한다. 본 명세서는 또한 인간 H3 프리프로릴랙신, 인간 H3 프로릴랙신, 인간 H3 릴랙신, 인간 릴랙신 유사체를 코딩하는 핵산 서열을 개시한다. 또한, H3 릴랙신 또는 이의 유사체의 투여에 반응하는 상태의 치료 방법을 개시한다.

Description

인간 3 릴랙신{HUMAN 3 RELAXIN}
Hisaw(1926)에 의한 초창기 연구에서 처음으로, 펩티드 호르몬 릴랙신이 동물에서 치골 결합을 팽창시키는 효과를 통해 출산 과정을 촉진하는 중요한 역할을 한다고 제안하였다. 릴랙신은 임신 중에 난소의 황체에서 합성되어 분만 전에 혈류로 분비된다. 난소 조직을 입수할 수 있게 되어 돼지[James 등(1977), Nature, 267, 554-546], 래트[John 등(1981) Endocrinology 108, 726-729], 및 상어[Schwabe 등(1982) Ann. N.Y. Acad. Sci. 380, 6-12]로부터의 릴랙신의 분리 및 아미노산 서열 결정이 가능하게 되었다.
릴랙신 유전자 및 코딩된 릴랙신 폴리펩티드는 인간, 돼지, 래트, 양 및 상어를 비롯한 다수의 종에서 확인되었다. 이들 모든 종에 있어서 포유동물에서는 단지 하나의 릴랙신 유전자가 규명되었으며, 단, 인간 및 고등 영장류에서는 두 개의 독립적인 유전자가 규명되었다. 상기 독립적 인간 유전자는 본 출원인에 의해 동정되었고, H1[Hudson 등(1993) Nature 301, 628-631] 및 H2[Hudson 등(1984) Embo. J. 3, 2333-2339]라 명명하였다.
H2 유전자에 의해 코딩된 펩티드는 인간에서 저장 및 순환되는 주요 형태이다[Winslow 등(1992) Endocrinology 130, 2660-2668]. H1 릴랙신 발현은 탈락막, 태반 및 전립선에 국한되지만[Hansell 등(1991) J. Clin. Endocrinol. Metab. 72, 899-904], H1 펩티드는 래트 심방의 생물학적 분석에서 H2 릴랙신의 생물학적 활성과 유사한 활성을 갖는다[Tan 등(1998) Br. J. Pharmacol 123, 762-770].
릴랙신의 작용은 자궁근 수축을 억제하는 능력, 결합 조직의 리모델링을 자극하는 능력 및 산도 조직의 연화를 유도하는 능력을 포함한다. 또한 릴랙신은 유선 및 유두의 성장 및 분화를 증가시키고, 결합 조직의 주요 성분 중 하나인 콜라겐의 분해를 유도한다. 릴랙신은 콜라겐 합성을 감소시키고 콜라게나제의 분비를 증가시킨다[Unemori 등(1990) J. Biol. Chem. 265, 10682-10685]. 이러한 발견은 릴랙신 유전자 넉아웃 마우스[Zhao 등(1999) Endocrinology 140, 445-453]의 구축을 통해 최근에 확인되었으며, 이 마우스는 임신과 관련된 다수의 표현형적 특성을 나타내었다. 기능적 활성이 있는 릴랙신 유전자가 결여된 암컷 마우스는 치골 결합의 치골간 인대를 이완 및 신장시키지 못하여 새끼들에게 젖을 먹이지 못하고, 이로 인해 새끼들은 릴랙신 야생형 또는 릴랙신 이형접합 유모에게서 젖을 얻어먹지 못하면 24 시간 이내에 사망하였다.
연구 자료의 축적으로 인하여, 릴랙신은 단순히 임신 호르몬에 불과한 것이 아니라 암컷 생식계의 세포 및 조직 외에 다른 세포 및 조직에도 작용한다는 사실이 제안되었다. 릴랙신은 신장, 맹장간막, 폐 및 말초 맥관구조에서 혈관의 확장(혈관확장)을 유도하며, 이는 이들 조직에서 혈류 또는 관류 속도를 증가시키는 결과를 초래한다[Bani 등(1997) Gen. Pharmacol. 28, 13-22]. 이것은 또한 심박수 및 관상동맥 혈류의 증가를 자극하고, 사구체 여과율 및 신혈장 유량을 증가시킨다[Bani 등(1997) Gen. Pharmacol. 28, 13-22]. 뇌 역시, 릴랙신 펩티드가 뇌실 주변 장기의 수용체에 결합하여 혈압 및 흡입(drinking)에 영향을 주는[Parry 등(1990) J Neuroendocrinol. 2, 53-58; Summerlee 등(1998) Endocrinology 139, 2322-2328; Sinnahay 등(1999) Endocrinology 140, 5082-5086] 것으로 확인된 릴랙신에 대한 또다른 표적 조직이다[Osheroff 등(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6413-6417; Tan 등(1999) Br. J. Pharmacol 127, 91-98].
릴랙신의 중요한 임상적 용도는 혈관확장에 반응하는 다양한 질환, 예컨대 관상동맥 질환, 말초 혈관 질환, 세동맥경화증 또는 기타 신장 모세혈관 협착 관련 신장 질환, 또는 눈 또는 사지, 맹장간막, 폐 및 말초 맥관구조와 같은 신체의 모세혈관 협착의 치료에 사용되는 것이다.
거의 20년 전에는, 2종의 인간 릴랙신 유전자 및 코딩된 인간 릴랙신 펩티드 생성물의 발견은 발견 자체로서 매우 놀라운 일이었다.
릴랙신 생물학에 있어서의 거의 20년간의 국제적인 추가 연구 및 발달로 인하여 더욱 더 놀랍게도, 본 출원인들은 제3의 인간 릴랙신 유전자(H3)를 코딩하는핵산 서열, 코딩된 H3 릴랙신 펩티드 및 그 구성성분 펩티드 사슬을 동정하고 분리하고 규명하게 되었다. H3 릴랙신 및 그 유사체의 제조가 가능하게 되었고, 이의 치료 방법에서의 용도를 발견하게 되었다.
발명의 개요
제1 양태에서 본 발명은 펩티드 인간 H3 릴랙신, H3 프로릴랙신 및 H3 프리프로릴랙신에 관한 것이고, 이들 서열을 구성하는 개개의 펩티드 사슬 및 그 유사체, 특히 절두 및/또는 아미노산 치환 변형 유사체에 관한 것이다. 바람직하게는 이 펩티드는 다양한 치료 경로에 의한 인간 또는 동물 투여용 약학적 허용 조성물로서 제공된다. 펩티드는 오염 펩티드 및 단백질이 없는 정제된 또는 균질한 형태로, 또는 순도 약 90∼99%의 형태로 분리되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제2 양태에서 본 발명은 A 사슬 및 B 사슬을 갖는 인간 H3 릴랙신 또는 인간 H3 릴랙신 유사체를 포함하는 조성물을 제공하는데,
상기 A 사슬은 하기 서열 번호 4의 아미노산 서열:
또는 N-말단에서부터 약 9개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열을 가지며,
상기 B 사슬은 하기 서열 번호 2의 아미노산 서열:
또는 아미노 말단에서부터 9개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열 및/또는 카르복시 말단에서부터 약 5개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열을 가지며,
상기 A 사슬 및 B 사슬은 A11-B10 및 A24-B22에서 사슬간 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체는 릴랙신 생물활성을 보유한다.
본 발명의 제3의 양태에서 본 발명은 변형된 A 사슬 및/또는 변형된 B 사슬을 보유하는 인간 H3 릴랙신 유사체를 포함하는 조성물을 제공하는데,
상기 H3 릴랙신 A 사슬은 하기 서열 번호 4의 아미노산 서열:
[상기 서열에서 카르복시 말단은 아미드 유도체이고/이거나, 12번 위치의 Lys은 Glu로 치환되고/되거나, 19번 위치의 Glu는 Gln으로 치환됨]을 가지며,
상기 H3 릴랙신 B 사슬은 하기 서열 번호 2의 아미노산 서열:
[상기 서열에서 카르복시 말단은 아미드 유도체이고/이거나, 2번 위치의 Ala은 Pro으로 치환되고/되거나, 8번 위치의 Arg은 Lys으로 치환됨]을 가지며,
상기 A 및 B 사슬은 A11-B10 및 A24-B22 사이의 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 인간 H3 릴랙신 유사체는 릴랙신 생물활성을 보유한다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 본 발명은 인간 H3 프리프로릴랙신에 대하여 시그널, A 사슬, B 사슬 및 C 사슬을 보유하고, 인간 H3 프로릴랙신에 대하여 A 사슬, B 사슬 및 C 사슬을 보유하는 인간 H3 프리프로릴랙신 또는 인간 H3 프로릴랙신을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 아미노산 사슬은
하기 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 A 사슬:
하기 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 B 사슬:
하기 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 시그널 서열:
하기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 C 사슬:
의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 본 발명은 인간 H3 릴랙신의 C 사슬을 포함하는 조성물을 제공하는데, 상기 C 사슬은 하기 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제6 양태에 따르면 본 발명은 하기 서열 번호 6의 핵산 서열을 포함하는 인간 프리프로-H3 릴랙신을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
(서열 번호: 6)
본 발명의 제7 양태에 따르면 본 발명은 A 사슬, B 사슬 및 C 사슬 서열을 포함하는 인간 프로-H3 릴랙신을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는데,
상기 A 사슬은 하기 서열 번호 7의 핵산 서열을 포함하며,
상기 B 사슬은 하기 서열 번호 8의 핵산 서열을 포함하며,
상기 C 사슬은 하기 서열 번호 9의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 제8 양태에서 본 발명은 A 사슬 및 B 사슬을 갖는 인간 H3 릴랙신을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는데,
상기 A 사슬은 하기 서열 번호 7의 핵산 서열을 포함하고,
상기 B 사슬은 하기 서열 번호 8의 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 제9 양태에서 본 발명은 인간 H3 릴랙신의 A 펩티드 사슬, B 펩티드 사슬 또는 C 펩티드 사슬을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는데, 상기 사슬은
하기 서열 번호 7의 A 사슬:
하기 서열 번호 8의 B 사슬:
하기 서열 번호 9의 C 사슬:
의 핵산 서열을 포함한다.
핵산 서열은 분리 및 정제된 핵산으로서, 벡터 예컨대, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스 DNA 또는 RNA 내에 함유될 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 형태일 수 있으며, 또한 숙주계 예컨대, 박테리아 세포내 발현에 대히여 상승 효과, 강화 효과 또는 기타 효과를 부여하는 프로모터 또는 인핸서 또는 기타 서열을 포함할 수 있다.
핵산의 트리플릿 코돈은 특정 아미노산을 코딩한다. 당업계에 널리 공지되어 있고 확립되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 코돈이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있다. 뿐만 아니라, 핵산 서열을 변형 또는 변경시키는 방법도 당업계에 널리 공지되어 있다. 지금까지 본 발명은 인간 H3 릴랙신, 프로-H3 릴랙신, 프리프로-H3 릴랙신 및 이들의 구성 펩티드 사슬을 코딩하는 핵산에 대한 여러가지 양태에 관한 것이었으나, 본 발명은 또한 상기 단백질 생성물, 또는 릴랙신 활성을 갖는 단백질 생성물을 코딩하는 핵산 변이체를 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열의 양태는 또한 엄중한 하이브리드화에 의하여 한정되는 밀접하게 관련된 핵산 서열을 포함하는데, 여기서 상기 엄중한 하이브리드화는 [0.25 M H2PO4, pH 7.2, 1 mmol EDTA, 20% SDS, 65℃, 밤새동안] →[2 ×SSC, 0.1% SDS, 실온에서 5분간 3회 세척] →[마지막으로 0.1% SSC, 65℃, 30분간 세척] (이 경우 6 ×SSC는 0.9 M NaCl, 0.3 M Na3CO2ㆍH2O, pH 7.0임) 조건하에 상보 서열들이 어닐링하는 것을 의미한다. 이러한 서열들은 H3 릴랙신의 활성에 해당하는 생물학적 활성, 면역학적 활성 또는 기타 활성을 갖는 H3 릴랙신 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 중 하나 이상의 치료 또는 예방을 필요로 하는 피험체에게 치료 유효량의 인간 H3 릴랙신, 또는 본원에서 정의한 이의 유사체를 선택적으로 1종 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 투여하는 단계를 포함하는 치료 또는 예방 방법을 제공한다: 관상동맥 질환, 말초 혈관 질환을 비롯한 혈관 질환; 레이노드 현상을 비롯한 혈관경련, 중추 신경계 및 말초 신경계, 신장, 눈 및 기타 장기와 관련된 미세혈관 질환; 동맥 고혈압; 폐, 심장 및 심혈관계, 신장 및 비뇨생식관, 위장계, 피부계, 류머티즘계 및 간담계의 섬유증을 비롯한 섬유형성 질환과 같은 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환; 혈관 질환, 간질성 섬유증, 사구체경화증, 또는 기타 신장 장애를 비롯한 신장 질환; 공황 발작, 광장공포증, 범불안장애, 공포증을 비롯한 불안 상태를 포함하는 정신 장애; 주 우울증, 기분변조, 양극성 및 단극성 우울증을 비롯한 우울증 또는 우울 장애; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환(기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병 포함); 학습, 주의력 및 동기부여 장애(주의력 결핍 과잉행동 장애, 투렛병, 충동, 반사회적 인격 장애, 정신분열증, 후천적 뇌 손상 및 전두엽 병변으로 인한 정신 이상 증상을 비롯한 부정적 정신 이상 증상 포함); 중독 장애(약물, 알콜 및 니코틴 중독포함); 운동 및 보행 장애(파킨슨병, 헌팅턴병 및 발작, 뇌 손상, 수술, 종양 또는 척수 손상 후의 운동신경 결함 포함); 면역 장애(면역결핍상태, 혈액 악성종양 및 세망내피 악성종양 포함); 유방 장애(섬유낭포성 질환, 수유 장애 및 암 포함); 착상 장애로 인한 불임을 비롯한 자궁내막 장애; 내분비 장애(스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및 고환 장애 포함); 지연 분만 및 자궁경관 숙화 장애의 치료, 및 태아 난산으로 인한 지연 분만; 동서맥; 탈모; 독두증; 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 비롯한 수분 균형 장애; 또는 태반 기능부전의 예방.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 전술한 바와 같은 특정 치료를 필요로 하는 피험체에게 본원에서 정의한 인간 H3 릴랙신, 또는 이의 유사체를, 필요에 따라서는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 다음중 하나 이상의 치료 방법에 사용되는 약물의 제조에 있어서 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체의 용도를 제공한다: 관상동맥 질환, 말초 혈관 질환을 비롯한 혈관 질환; 레이노드 현상을 비롯한 혈관경련, 중추 신경계 및 말초 신경계, 신장, 눈 및 기타 장기와 관련된 미세혈관 질환; 동맥 고혈압; 폐, 심장 및 심혈관계, 신장 및 비뇨생식관, 위장계, 피부계, 류머티즘계 및 간담계의 섬유증을 비롯한 섬유형성 질환과 같은 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환; 혈관 질환, 간질성 섬유증, 사구체경화증, 또는 기타 신장 장애를 비롯한 신장 질환; 공황 발작, 광장공포증, 범불안장애, 공포증을 비롯한 불안 상태를 포함하는 정신 장애; 주 우울증, 기분변조, 양극성 및 단극성 우울증; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환(기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병 포함)을 비롯한 우울증 또는 우울 장애; 주의력 결핍 과잉행동 장애, 투렛병, 충동, 반사회적 인격 장애를 비롯한 학습, 주의력 및 동기부여 장애, 정신분열증, 후천적 뇌 손상 및 전두엽 병변으로 인한 정신 이상 증상을 비롯한 학습, 주의력 및 동기부여 장애; 약물, 알콜 및 니코틴 중독을 비롯한 중독 장애; 파킨슨병, 헌팅턴병 및 발작 후의 운동신경 결함, 뇌 손상, 수술, 종양 또는 척수 손상을 비롯한 운동 및 보행 장애; 면역결핍상태, 혈액 악성종양 및 세망내피 악성종양을 비롯한 면역 장애; 섬유낭포성 질환, 수유 장애 및 암을 비롯한 유방 장애; 착상 장애로 인한 불임을 비롯한 자궁내막 장애; 스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및 고환 장애를 비롯한 내분비 장애; 지연 분만 및 자궁경관 숙화 장애의 치료, 및 태아 난산으로 인한 지연 분만; 동서맥; 탈모; 독두증; 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 비롯한 수분 균형 장애; 또는 태반 기능부전의 예방.
서열목록 표
서열 번호 1 시그널 펩티드 서열
서열 번호 2 B 사슬 펩티드 서열
서열 번호 3 C 사슬 펩티드 서열
서열 번호 4 A 사슬 펩티드 서열
서열 번호 6 게놈 DNA 서열
서열 번호 7 A 사슬 핵산 서열
서열 번호 8 B 사슬 핵산 서열
서열 번호 9 C 사슬 핵산 서열
본 발명은 인간 3 릴랙신(이하 "H3 릴랙신"이라 칭함)에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 H3 릴랙신, 프로- 및 프리프로-H3 릴랙신, 이들 서열을 구성하는 개개의 펩티드 사슬, H3 릴랙신의 유사체, 약학 조성물을 비롯한 조성물 및 치료적 용도 및 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 H3 릴랙신, H3 프로- 및 프리프로-릴랙신, H3 릴랙신 유사체, 및 상기 서열들을 구성하는 개개의 펩티드 사슬을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
도 1은 H3(A) 및 M3(B) 유전자의 어셈블링된 DNA 서열을 나타내는 것이다.
개시 및 종결 코돈 및 예상 TATA 박스 및 폴리아데닐화 서열에 밑줄을 그어 표시하였다. 추정 시그널 펩티드, 그리고 B-, C- 및 A-사슬 펩티드 서열의 위치는 화살표로 표시하였다. A- 및 B-사슬 서열은 박스안에 표시하였고, 릴랙신 수용체 결합에 관여할 것으로 추정되는 잔기들은 어둡게 표시하였다. 인간(A) 및 마우스(B) 서열 모두에 존재하는 C-사슬내 동일한 위치에 있는 인트론 서열은 밑의 케이스안에 문자로 나타내었으며, 인트론의 정확한 크기도 표시하였다.
도 2는 기타의 릴랙신 및 인슐린 군에 속하는 일원과, H3 및 M3 릴랙신과의 서열 비교 결과를 나타내는 것이다.
도 2a의 A는 기타 인간 및 마우스 릴랙신 서열과 H3 및 M3 릴랙신으로부터 유래된 A-사슬 및 B-사슬 서열의 배열을 나타낸다. 컨센서스 서열은 박스로 나타내었다 ;Cons 1,2,3은 인간 릴랙신 1, 2 및 3 사이의 컨센서스 서열을 나타내고,Cons 3는 B-사슬에 대한 H3 및 M3 릴랙신과, A-사슬에 대한 H3, R3 및 M3 릴랙신 사이의 컨센서스 서열을 나타내며,Cons Mouse는 M1 및 M3 릴랙신 사이의 컨센서스 서열을 나타낸다. 래트 서열은 EST 클론(상세한 것은 결과 참조)으로부터 유래된다. "+"는 보존적 치환을 의미하며, " ·"는 상동성이 없음을 의미한다. 도 2b의 B는 릴랙신/인슐린/IGF 상과에 속하며 인간 서열을 보유하는 H3 및 M3 릴랙신 전장 서열의 진화에 관한 계통수이다.
도 3은 인간 릴랙신 수용체 발현 세포주에 있어서 H1 및 H2 릴랙신에 대한 H3의 생물 활성 비교 결과를 나타내는 것이다.
도 3의 A는 펩티드에 의하여 자극됨에 따라서 THP-1 세포에 cAMP가 축적되었을 때의 결과를 나타낸다. 데이터는 H2 릴랙신에 대한 최대 반응률(%)의 평균값 ±SEM (n=3)으로 표시하였다. 또한 소 인슐린(bINSL) 및 인간 INSL3(hINSL3)에 대한 반응률 역시 분석의 특이성을 강조하기 위해 제시하였다. H1, H2, H3은 각각 인간 1, 2 및 3 릴랙신을 나타낸다. 도 3의 B는 H1(n=7), H2(n=11) 및 H3(n=3) 릴랙신 펩티드가 THP-1 세포에 대해33P-표지화된 H2 릴랙신(B33)과 경쟁하는 능력을 나타낸다. 데이터는 특이적 결합률(%)의 평균값 ±SEM으로 표시하였다.
도 4는 특성규명이 잘 된 H2 릴랙신 항체가 H3 릴랙신을 인지하는능력을 나타내는 것이다.
H2 릴랙신 항체를 ELISA 평판상에 고정시킨 다음, H1, H2 및 H3 릴랙신을 사용하여125I-표지화된 H2 릴랙신에 대한 경쟁 실험을 수행하였다. 그 결과를 각각의 분석법으로부터 얻은 3회 측정값에 대한 특이적 결합률(%)의 평균값 ±SEM으로 나타내었다.
의외로, 인간 릴랙신을 동정한지(그때 당시에는 2개의 인간 릴랙신 유전자의 동정은 획기적인 것이었음) 수십년이 경과한후, 추가의 릴랙신 유전자가 동정되었다. 본 발명의 다양한 양태에서, 본 발명은 인간 H3 릴랙신을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 특성규명 ; 정제된 핵산 물질의 분리 ; H3 릴랙신을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(mRNA, cDNA 및 DNA)의 증폭 ; H3 릴랙신 서열의 핵산 클로닝 ; 핵산 서열 동정 및 인간 H3 프리프로릴랙신, H3 프로릴랙신 및 H3 릴랙신을 코딩하는 펩티드 서열을 제공한다.
인간 H3 릴랙신 폴리펩티드는 A 및 B 사슬간 이황화 결합을 포함한다. 인간 H3 릴랙신의 아미노산 서열은 서열 번호 4에 제시하였다, 인간 릴랙신의 B 사슬에 대한 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시하였다.
인간 H3 릴랙신의 A 및 B 사슬은 시스테인 잔기를 통하여 결합되어 있으며, 이 시스테인 결합 사이에 A11∼B10, A24∼B22 이황화 결합이 형성되어 있다.
따라서, 인간 H3 릴랙신 A 및 B 사슬의 아미노산 서열은 다음과 같으며, 여기서 상기 A 및 B 사슬은 A11∼B10, A24∼B22 사이의 이황화 결합에 의하여 결합되어 있다 :
A 사슬
B 사슬
인간 H3 릴랙신은 고전적인 릴랙신 생물활성을 보유한다. 인간 릴랙신인 H1 및 H2 릴랙신은 릴랙신 수용체를 발현하는 세포 예컨대, THP-1 세포에 결합한다[Parsell 등(1996), J.Biol.Chem. 271, 27936-27941]. H2 릴랙신은 상기 세포로부터의 cAMP 생성량을 투여량 의존적으로 증가시킨다. 본 발명에 의하여 제조된 합성 H3 릴랙신은 인간 H2 릴랙신과 함께 존재하면서 cAMP가 투여량 의존적으로 증가하는 것을 촉진시켰다. H3 릴랙신에 의하여 나타내어지는 인간 릴랙신 수용체를 보유하는 표적 세포에 있어서의 반응의 특이성은 소 인슐린(bINSL) 또는 인간 인슐린(hINSL3)이 THP-1 세포내에서 1 um 이하의 투여량으로 cAMP 반응을 촉진시킬 수 없는 능력에 의하여 기술된다.
인간 H3 릴랙신으로 인간 릴랙신을 자극함으로써 제2의 메신저 반응(cAMP)을 유발시킨 결과, 인간 H3 릴랙신이 고전적인 생물학적 릴랙신 활성을 갖는다는 명백한 증거가 제공된다. 전술한 바와 같은 릴랙신 수용체를 함유하는 세포 예컨대, THP-1 세포내에서의 이와 같은 분석법을 통하여, 릴랙신 활성을 측정하는 용이한 방법을 제공한다. 더욱이, 릴랙신 수용체를 발현하는 세포내 릴랙신 결합 위치와 결합하는데에 있어서 인간 H3 릴랙신이 P32-표지화된 H2 릴랙신과 경쟁하는 능력은 또한 릴랙신 활성에 관한 명확한 확증을 제공한다.
릴랙신 활성을 측정하기 위한 다른 생물학적 활성/분석법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 임신중 및 임신이 아닐때 활성 릴랙신을 측정하는데 사용되는 생물분석법 예컨대, 기니아 피그 치골간 인대 분석법이 사용될 수 있다[Steinetz 등(1960) Endocrinology 67, 102-115 및 Sirosi 등(1983) American Journal of Obstetrics and Gynaecology 145:402-405]. 기타 생물분석법으로는 THP-1 세포내에서의 cAMP 생성법을 포함한다[Parsell 등(1996)J.Biol.Chem.271, 27936-27941].
본 출원인은 A 사슬의 N-말단으로부터 9개 이하의 아미노산이 절두되었고, B 사슬의 N-말단으로부터 9개 이하의 아미노산이 절두되었으며, B 사슬의 C-말단으로부터 5개 이하의 아미노산이 절두된 H3 릴랙신 유사체가 제조될 수 있다는 것을 발견하였다.
생성된 릴랙신 유사체는 H3 릴랙신 A 및 B 사슬을 포함하며, 여기서 A 사슬은 아미노 말단으로부터 약 9개 이하의 아미노산이 절두된 하기 서열 번호 4와 같은 아미노산 서열을 가지며, 상기 B 사슬은 아미노 말단으로부터 9개 이하의 아미노산이 절두되었고/되었거나 카르복실 말단으로부터 약 5개 이하의 아미노산이 절두된 하기 서열 번호 2와 같은 아미노산 서열을 가진다는 사실을 발견하였으며, 여기서 상기 A 및 B 사슬은 A11∼B10과 A24∼B22 사이의 이황화 결합에 의하여 결합되어 있으며, 상기 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체는 릴랙신 생물활성을 보유한다.
인간 H3 릴랙신의 A 사슬은 제10번 및 제15번 Cys 잔기 사이에 사슬내 이황화 결합을 함유한다.
인간 릴랙신 수용체를 보유하는 세포내에서 제2 메신저를 유발시키기 위한 표준적인 분석법에서, 전술한 H3 릴랙신 유사체는 모두 전장의 비절두형 인간 H3 릴랙신, 및 실제로는 인간 H2 릴랙신에 특징적인 방식으로 사이클릭 AMP를 생성함을 규명하였다. 그러므로, 이러한 절두형 H3 릴랙신 유사체는 릴랙신의 생물 활성을 보유한다.
본 발명의 다른 양태는 변형된 A 사슬 및/또는 변형된 B 사슬을 보유하는 인간 H3 릴랙신 유사체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 A 사슬의 카르복실 말단, 및/또는 상기 B 사슬의 카르복실 말단은 아미드 유도체일 수 있다. A 사슬내 12번 위치에 존재하는 Lys은 Glu과 치환될 수 있고/있거나, 19번 위치에 존재하는Glu는 Gln과 치환될 수 있다. B 사슬에서, 2번 위치에 존재하는 Ala는 Pro와 치환될 수 있고/있거나, 8번 위치에 존재하는 Arg은 Lys으로 치환될 수 있다. 변형된 아미노산을 보유하는 결과의 H3 릴랙신 유사체는 다음과 같이 나타낼 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 변형된 A 사슬 및/또는 변형된 B 사슬을 보유하는 인간 H3 릴랙신 유사체를 제공하며, 여기서 상기 H3 릴랙신의 A 사슬은 카르복실 말단이 아미드 유도체이고/이거나, 12번 위치에 존재하는 Lys이 Gln으로 치환되고/되거나, 19번 위치에 존재하는 Glu가 Gln으로 치환된, 하기 서열 번호 4와 같은 아미노산 서열을 갖고, 변형된 B 사슬은 카르복실 말단이 아미드 유도체이고/이거나, 2번 위치에 존재하는 Ala가 Pro로 치환되고/되거나, 8번 위치에 존재하는 Arg이 Lys으로 치환된, 하기 서열 번호 2와 같은 아미노산 서열을 가지며, 여기서 상기 A 및 B 사슬은 A11∼B10과 A24∼B22 사이의 이황화 결합에 의하여 결합되어 있고, 인간 H3 릴랙신 유사체는 릴랙신 생물활성을 갖는다.
인간 H3 릴랙신을 코딩하는 핵산 서열의 분리, 정제 및 특성규명을 통하여인간 H3 릴랙신의 시그널 서열과, 인간 H3 릴랙신의 프로 서열의 특성규명 및 제조가 가능하다.
인간 H3 릴랙신의 시그널 서열과 C 사슬의 동정, 정제 및 특성규명을 통하여 프리프로- 및 프로-인간 H3 릴랙신의 제조가 가능하다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 인간 H3 프리프로릴랙신의 시그널 사슬, A 사슬, B 사슬 및 C 사슬과, 인간 H3 프로릴랙신의 A 사슬, B 사슬 및 C 사슬을 보유하는 인간 H3 프리프로릴랙신 또는 인간 H3 프로릴랙신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 아미노산 사슬은 다음과 같은 서열들을 포함한다 :
A 사슬은 하기와 같은 서열 번호 4의 서열을 포함하고, B 사슬은 하기와 같은 서열 번호 2의 서열을 포함하며, 시그널 서열은 하기와 같은 서열 번호 1의 서열을 포함하고, C 사슬은 하기와 같은 서열 번호 3의 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에 의하면, 하기와 같은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 보유하는 인간 H3 릴랙신의 C 사슬을 제공한다 :
인간 H3 프로릴랙신은 특징적인 릴랙신 생물활성을 보유한다.
인간 H3 릴랙신, 프로릴랙신, 프리프로릴랙신 및 구성 펩티드 사슬은 릴랙신의 제조에 유용한 것으로 이미 기술한 바 있는[예컨대, 미국 특허 제5,991,997호, 동 제4,758,516호, 동 제4,871,670호, 동 제4,835,251호, PCT/US90/02085 및 PCT/US94/0699] 기법을 사용한 결과로 생성되는 생성물일 수 있다.
아미노산이 전술한 바와 같이 치환된 릴랙신 유사체 및 유도체는 예를 들어, 전술한 바와 같은 위치 유도성 돌연변이발생 기법[Tsurushita 등(1988) Gene Tissue:135-139]을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다.
인간 H3 릴랙신, 하나 이상의 아미노산이 A 및/또는 B 사슬의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 절두된 이의 유사체, 또는 전술한 바와 같이 아미노산 치환된 인간 H3 릴랙신 유사체는 릴랙신을 합성하기 위하여 문헌[Bullesbach(1991)J.Biol.Chem.266, 10754-10761]에 기술된 방법에 따라서 합성될 수 있다. 뿐만 아니라, 펩티드 합성에 관한 널리 공지된 방법은 본원에 언급된 다양한 형태의 H3 릴랙신을 제조하는데 사용될 수 있다.
따라서, 릴랙신은 각종 질환 및 장애의 치료 및 진단에 연루되어 있다. 예를 들어, 릴랙신은 피부경화증, 동서맥, 심혈관 질환, 신경퇴행성 및 신경 장애, 탈모, 우울증의 치료에 효과적이라는 증거를 연구 결과 얻었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,166,191호 및 국제 특허 출원 PCT/US92/069호 참조. 또한 이러한 증거는, 질환 및 장애에서의 릴랙신의 용도가 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비정상적인 발현, 예컨대 류마티스성 관절염과 관계가 있다는 것을 시사한다.
본 발명에 의해 제공되는 인간 H3 릴랙신, 인간 H3 릴랙신 절두형 유사체, 아미노산 변형된 H3 릴랙신 유사체 및 인간 프로릴랙신은 릴랙신 수용체에 결합하고 릴랙신의 생물학적 활성을 보유한다. 따라서, 릴랙신의 생물학적 활성을 보유하는 인간 H3 릴랙신 형태는 상기 언급한 질환 및 기타 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 관상동맥 질환, 말초 혈관 질환을 비롯한 혈관 질환, 레이노드 현상을 비롯한 혈관경련, 중추 신경계 및 말초 신경계, 신장, 눈 및 기타 장기와 관련된 미세혈관 질환; 동맥 고혈압; 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환, 예컨대 섬유증 장애(폐, 심장 및 심혈관계, 신장 및 비뇨생식관, 위장계, 피부계, 류머티즘계 및 간담계의 섬유증 포함); 혈관 질환, 간질성 섬유증, 사구체경화증, 또는 기타 신장 장애와 관련된 신장 질환; 공황 발작, 광장공포증, 범불안장애, 공포증을 비롯한 불안 상태를 포함하는 정신 장애; 주 우울증, 기분변조, 양극성 및 단극성 우울증을 비롯한 우울증 또는 우울 장애; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환(기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병 포함); 학습, 주의력 및 동기부여 장애(주의력 결핍 과잉행동 장애, 투렛병, 충동, 반사회적 인격 장애, 정신분열증, 후천적 뇌 손상 및 전두엽 병변으로 인한 정신 이상 증상을 비롯한 부정적 정신 이상 증상 포함); 중독 장애(약물, 알콜 및 니코틴 중독 포함); 운동 및 보행 장애(파킨슨병, 헌팅턴병 및 발작, 뇌 손상, 수술, 종양 또는 척수 손상 후의 운동신경 결함 포함); 면역 장애(면역결핍상태, 혈액 악성종양 및 세망내피 악성종양 포함); 유방 장애(섬유낭포성 질환, 수유 장애 및 암 포함); 착상 장애로 인한 불임을 비롯한 자궁내막 장애; 내분비 장애(스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및고환 장애 포함); 지연 분만 및 자궁경관 숙화 장애의 치료, 및 태아 난산으로 인한 지연 분만; 동서맥; 탈모, 독두증(alopecia); 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 비롯한 수분 균형 장애; 태반 기능부전의 예방 중 하나 이상의 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 상기 정의한 바와 같은 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체의 치료 유효량을, 경우에 따라 하나 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 상기 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 관상동맥 질환, 말초 혈관 질환을 비롯한 혈관 질환, 레이노드 현상을 비롯한 혈관경련, 중추 신경계 및 말초 신경계, 신장, 눈 및 기타 장기와 관련된 미세혈관 질환; 동맥 고혈압; 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환, 예컨대 섬유증 장애(폐, 심장 및 심혈관계, 신장 및 비뇨생식관, 위장계, 피부계, 류머티즘계 및 간담계의 섬유증 포함); 혈관 질환, 간질성 섬유증, 사구체경화증, 또는 기타 신장 장애와 관련된 신장 질환; 공황 발작, 광장공포증, 범불안장애, 공포증을 비롯한 불안 상태를 포함하는 정신 장애; 주 우울증, 기분변조, 양극성 및 단극성 우울증을 비롯한 우울증 또는 우울 장애; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환(기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병 포함); 학습, 주의력 및 동기부여 장애(주의력 결핍 과잉행동 장애, 투렛병, 충동, 반사회적 인격 장애, 정신분열증, 후천적 뇌 손상 및 전두엽 병변으로 인한 정신 이상 증상을 비롯한 부정적 정신 이상 증상 포함); 중독 장애(약물, 알콜 및 니코틴 중독 포함); 운동 및 보행 장애(파킨슨병, 헌팅턴병 및발작, 뇌 손상, 수술, 종양 또는 척수 손상 후의 운동신경 결함 포함); 면역 장애(면역결핍상태, 혈액 악성종양 및 세망내피 악성종양 포함); 유방 장애(섬유낭포성 질환, 수유 장애 및 암 포함); 착상 장애로 인한 불임을 비롯한 자궁내막 장애; 내분비 장애(스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및 고환 장애 포함); 지연 분만 및 자궁경관 숙화 장애의 치료, 및 태아 난산으로 인한 지연 분만; 동서맥; 탈모, 독두증; 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 비롯한 수분 균형 장애; 태반 기능부전의 예방 중 하나 이상의 질환을 치료하는 약제의 제조에 사용되는 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체의 용도가 제공되며, 이 약제는 상기 정의한 바와 같은 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체의 치료 유효량을, 경우에 따라 하나 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 상기 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여된다.
작용 기전에 구애받지 않으면서, 본 출원인은 H3 릴랙신이, 예컨대 세포에서 eAMP 생성을 유도함으로써 뇌와 신경을 포함하는 신체의 다른 부분의 신경전달물질 또는 신경조절물질로서 작용할 수 있다고 생각한다. H3 릴랙신은 세포가 양분을 흡수할 수 있게 하거나, 또는 자동조절 시냅스전 및/또는 통상적인 시냅스후 작용에 관여할 수 있다. 또한, 출원인은 H3 릴랙신이 신경 투사에 의해 축삭 운반될 수 있다고 믿고 있다.
이하에 정의된 바와 같이, H3 릴랙신은 놀랍게도nucleus incertus라고도 불리우는 등쪽 피개핵 pars ventromedialis(vmDTg)의 신경해부학 부위에서 발현되는 것으로 밝혀졌다[Goto et al(2001) Journal of Comparative Neurology 438:86-122].nucleus incertus유래의 주요 전뇌 부위에서의 날신경과 들신경의 광범위한 패턴을 고려하면, 이 영역은 주의력, 동기부여, 보행 및 학습력에 영향을 미침으로써 행동 활성화를 조절할 수 있고(Goto 등) 본 명세서에 개시된 처치학적 치료 방식의 근원이 되는 뇌 줄기 망의 일부로서 제안된 바 있다. 이것은 대뇌 피질 및 다른 관련 뇌 부위에서의 풍부한 릴랙신 결합 부위 분포와 일치하는 것이다[Osheroff and Phillips (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6413-6417; 및 Tan 등 (1999) Br. J. Pharmacol. 127, 91-98].
H3 릴랙신은 혈뇌 장벽을 통과할 수 있거나, 또는 H3 릴랙신과 함께 동시 투여/간격을 두고 투여될 수 있는 1종 이상의 당 또는 아미노산, 또는 혈뇌 장벽을 개방하거나 또는 누출되기 쉽도록 하는 기타 물질을 사용하는 것(예컨대 Natio 미국 특허 제6,294,520호), 예컨대 친지성 비히클을 사용한 Frey(미국 특허 제6,313,093호)의 방법에 따른 비강내 투여 및 PCT/WO89/10134호에 개시된 방법을 비롯한 당업계에 공지된 방법으로 혈뇌 장벽의 통과를 촉진하도록 처리될 수 있다.
본 명세서에 개시된 H3 릴랙신과 유사체는 정신 장애, 학습, 주의력 및 기억 장애, 중독 장애와 운동 및 보행 장애를 비롯하여 신경 질환으로서 광범위하게 개시되어 있는 각종 질환의 치료에 효과적일 수 있다.
H3 릴랙신은 이하 개시된 릴랙신 수용체에 결합한다.
편의를 위해서, 달리 언급하지 않는 한 인간 H3 릴랙신, 하나 이상의 아미노산이 인간 H3 릴랙신의 A 및 B 사슬의 N- 및/또는 C-말단으로부터 절두되어 있는 인간 H3 릴랙신의 유사체, 하나 이상의 아미노산이 변형되거나 본 명세서에 개시된또 다른 아미노산으로 치환되어 있는 인간 H3 릴랙신의 유사체, 인간 H3 프리프로릴랙신은 모두 인간 H3 릴랙신으로서 언급된다.
본 발명에 사용하기 적절한 약학 조성물은, 활성 성분이 의도하는 목적을 실현하기 위한 유효량으로 포함된 조성물을 포함한다. 더욱 구체적으로, 치료 유효량이란 치료할 피험체의 증상 발생을 예방하거나 또는 기존 증상을 경감시키는 유효량을 의미한다. 유효량은, 당업자가 특히 본 명세서의 상세한 설명으로부터 결정할 수 있는 사항이다.
본 발명의 방법에 사용된 임의의 화합물의 경우, 치료 유효량은 처음에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물에서 측정되는 바와 같은 IC50을 포함하는 혈중 농도 범위를 실현하는 동물 모델에서 투여량을 산정할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다.
치료 유효량은 환자의 증상 개선 또는 생존 증가를 유도하는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예컨대 LD50(개체군의 50%의 치사를 유도하는 투여량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료 효과가 있는 투여량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 절차로 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과간의 용량비가 치료 지수이며, LD50및 ED50의 비로서 표시될 수 있다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석과 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간 용도의 투여량 범위를 정하는 데 이용될 수 있다. 이러한화합물의 투여량은, 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 혈중 농도 범위 내인 것이 바람직하다. 투여량은 이러한 범위 내에서 사용된 제형과 이용된 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 배합, 투여 경로 및 투여량은 환자의 증상을 고려하여 각 담당의가 선택할 수 있다. (예컨대 Fingl 등, 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p1).
투여량 및 투여 간격은 릴랙신 활성 및 효과를 유지하기에 충분한 활성부의 혈청 농도를 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다.
H3 릴랙신은 유사한 유용성을 제공하는 제제를 위한 임의의 허용되는 투여 방식으로, 바람직하게는 전신 투여로 투여될 수 있다.
상기 확인된 다수의 릴랙신 관련 질환 또는 장애를 치료하기 위한 H3 릴랙신의 인간 투여량 농도가 개략적으로 최적화되었으며, 1일 투여량은 1일, 체중 1 kg당 약 0.05∼500 ㎍, 바람직하게는 약 5.0∼200.0 ㎍, 가장 바람직하게는 약 10.0∼100.0 ㎍이다. 일반적으로 H3 릴랙신의 혈청 농도는 임신시 릴랙신의 정상 혈중 농도, 즉 1.0 ng/㎖와 유사하거나 또는 그 이상, 예컨대 1.0∼20 ng/㎖, 바람직하게는 1.0∼20 ng/㎖이 되도록 한다.
70 kg의 사람에게 투여하는 경우, 투여량 범위는 1일 약 7.0 ㎍∼3.5 ㎎, 바람직하게는 42.0 ㎍∼2.1 ㎎, 가장 바람직하게는 약 84.0∼700.0 ㎍이다. 투여되는 H3 릴랙신의 양은 피험체와 병의 경중, 투여 방식과 계획, 처방 의사의 판단, 그리고 유사체 또는 유도체의 생물학적 활성에 따라 달라지는 것은 물론이다. 한 치료법에서는 초기 투여 농도를 높게 한 다음(예, 100∼200 ㎍/kg/일), 약 1.0 ng/㎖의정상 상태의 H3 릴랙신 혈청 농도를 실현하도록 투여량을 줄인다. 또 다른 치료법, 특히 산후 우울증의 치료법에서는 릴랙신의 정상 임신중 농도(약 1.0 ng/㎖)를 얻기에 충분한 양으로 H3 릴랙신을 투여한 다음에 H3 릴랙신 혈청 농도가 더 이상 검출가능하지 않게 될 때까지(예컨대 약 20 pg/㎖ 미만) 투여량을 점차로 줄이고, 경우에 따라 투여량 농도에 도달하면 치료를 중단한다.
임의의 약학적 허용 투여 방식을 사용할 수 있다. H3 릴랙신은 단독으로 또는 다른 약학적 허용 부형제와 함께, 예를 들면 고체, 반고체, 액체 또는 에어로졸 제형, 예컨대 정제, 캡슐, 산제, 액상, 겔, 현탁액, 좌약, 에어로졸 등으로 투여될 수 있다. 이러한 단백질은 소정의 속도로 장기간 투여하기 위한 지속방출형 또는 제어방출형의 제형(서방형의 생체부식성 전달계를 사용), 예컨대 데포우 주사, 삼투압 펌프(예, 알자가 제조한 Alzet 이식체), 환제, 경피(예, 전기수송) 패치 등으로, 바람직하게는 정확한 투여량을 1회 투여하기에 적절한 단위 제형으로 투여될 수 있다. 조성물은 종래의 약학적 담체 또는 부형제 및/또는 H3 릴랙신, H3 프로릴랙신 및 H3 프리프로릴랙신 또는 이의 유도체를 포함한다. 또한, 이들 조성물은 다른 활성제, 담체, 보강제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 지속방출/제어방출 H3 릴랙신 제제는 약물 분배 오프닝을 구비한 선택적 투과성 외부 장벽과, H3 릴랙신의 용량을 소정 속도로 점차 감소시켜 전달하도록 고안된(예컨대, 매트릭스 중 H3 릴랙신 약 30 ㎎이 함유되어 초기에는 약 500 ㎍/일을 전달한 후, 1일 10 ㎍의 속도로 점차 감소되도록 고안된) 내부 H3 릴랙신 함유 부분을 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 측면에서, H3 릴랙신의 지속방출/제어방출 제제는 약물 분배 오프닝을 구비한 선택적 투과성 외부 장벽, 1일 치료 유효량으로 H3 릴랙신을 정상 상태 방출하도록 고안된 제1 내부 H3 함유 부분(예컨대, 1일 약 500 ㎍을 연속 전달하기 위해 매트릭스 중 H3 릴랙신 약 50 ㎎ 함유)과, 제1 내부 부분으로부터 H3 릴랙신의 배출이 개시된 후 소정 속도로 점차 감소되는 용량의 H3 릴랙신을 전달하도록 고안된 제2 내부 H3 릴랙신 부분(예컨대, 매트릭스 중 H3 릴랙신 약 3 ㎎을 함유하여 초기에는 1일 약 500 ㎍을 전달한 후, 1일 50 ㎍의 속도로 점차 감소되도록 고안됨)을 갖는다.
일반적으로, 목적하는 투여 방식에 따라서 약학적 허용 조성물은 단독으로 또는 H3 릴랙신과 함께 H3 릴랙신을 약 0.1∼90 중량%, 바람직하게는 약 0.5∼50 중량%를 포함하며, 나머지는 안정한 약학적 부형제, 담체 등으로 구성된다. 이러한 제형의 실제 제조 방법은 당업계에 공지되어 있거나, 또는 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975] 참조.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우에, 약물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다.
투여되는 조성물의 양이 치료할 피험체, 피험체의 체중, 병의 경중, 투여 방식 및 처방의사의 판단에 따라 좌우되는 것은 당연하다.
적절한 투여 경로는, 예컨대 경구, 직장, 경점막 또는 장 투여를 포함할 수 있다. 비경구 투여는 일반적으로 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 주사, 바람직하게는 피하 주사를 특징으로 한다. 액상 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액상의 용액 또는 현탁액으로 하기 적절한 고체 형태 또는 에멀젼의 통상적인 형태로 주사가능하게 제조할 수 있다. 적절한 부형제는, 예컨대 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 필요에 따라 투여하고자 하는 약학 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 용해도 증진제 등과 같은 비독성 보조 물질, 예컨대 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 시클로덱스트린 등을 소량 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위해 더욱 최근에 고안된 방법은 서방형 또는 지속방출형 시스템을 이식하여, 일정한 농도의 용량이 유지되도록 한다. 예컨대 미국 특허 제3,710,795호 참조.
또는, 전신 방식보다는 국소 방식, 예컨대 흔히 데포우 또는 지속방출 제제 형태로 화합물을 고형 종양에 직접 주사하는 방식으로 H3를 투여할 수 있다.
또한, 표적화된 약물 전달계, 예컨대 종양 특이적 항체로 코팅된 리포좀 내의 약물을 투여할 수 있다. 종양이 선택적으로 리포좀을 표적화하여 흡수하게 된다.
본 발명의 약학 조성물은, 예컨대 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분쇄(levigating), 유화, 캡슐화, 포집화 또는 동결건조 공정을 이용하여 자체 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은, 약학적으로 사용될 수 있는 조제물로의 활성 성분의 가공을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리적 허용 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
화합물은, 예컨대 환괴 주사 또는 연속 주입과 같은 주사로 비경구 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 보존제가 첨가된 단위 제형, 예컨대 앰플 또는 다회 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 에멀젼 형태일 수 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화 제제를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 약학 제제는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 비히클은 참깨유와 같은 지방유, 또는 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 주사용 수성 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 현탁액은 적절한 가용화제 또는 고도로 농축된 용액을 제조하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 제제를 포함할 수 있다.
또는, 활성 성분은 사용 전에 적절한 비히클, 예컨대 발열원을 함유하지 않는 멸균수로 구성될 수 있는 분말형일 수 있다.
화합물은, 예컨대 코코아 버터 또는 기타 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 보유 관장제 등의 직장용 조성물로 제형화될 수 있다.
화합물은, 전술한 제제 외에 데포우 제제로 제형화될 수 있다. 이렇게 장기간 작용하는 제제는 이식(예, 피하 또는 근육내)으로 또는 근육내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 화합물은 적절한 중합체 또는 소수성 물질(예, 허용가능한 오일 중의 에멀젼) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화되거나, 잘 녹지 않는 유도체, 예컨대 잘 녹지 않는 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 소수성 화합물에 대한 약학적 담체는 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 수혼화성 유기 중합체 및 수성상을 포함하는 조용매계이다. 조용매계는 VPD 조용매계일 수 있다. VPD는 무수 에탄올 중에 용해된 3% w/v의 벤질 알코올, 8% w/v의 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80 및 65% w/v의 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. VPD 조용매계(VPD:5W)는 수용액 중 5% 덱스트로스로 1:1 희석된 VPD로 구성된다. 이 조용매계는 소수성 화합물을 잘 용해시키며, 그 자체는 전신 투여시 독성이 낮다. 조용매계의 비율은 용해도 및 독성 특성을 변화시키지 않으면서 다양하게 할 수 있음은 당연하다. 또한, 조용매 성분을 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 다른 저 독성의 비극성 계면활성제가 폴리소르베이트 80 대신에 사용될 수 있으며, 폴리에틸렌 글리콜의 분획 크기를 변화시킬 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 다른 생체적합성 중합체, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈으로 교체할 수 있다. 덱스트로스 대신에 다른 당류 또는 다당류를 사용할 수 있다.
또는, 소수성 약학적 화합물을 위한 다른 전달계를 사용할 수 있다. 리포좀 및 에멀젼이 소수성 약물을 위한 전달 비히클 또는 담체로서 잘 알려진 예이다. 디메틸설폭시드와 같은 일부 유기 용매는 일반적으로 독성이 크기는 하지만 사용될수는 있다. 또한, 지속방출계, 예컨대 치료제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 사용하여 화합물을 전달할 수 있다. 각종 지속방출 물질이 확정되어 있으며, 당업자에게 공지되어 있다. 지속방출 캡슐은 그 화학적 성질에 따라서 수 주 내지 100일 이상 화합물을 방출할 수 있다. 치료제의 화학적 성질과 생물학적 안정성에 따라서, 단백질 안정화를 위한 추가의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 약학 조성물은 적절한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 비제한적인 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당류, 전분류, 셀룰로스 유도체, 젤라틴 및 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 등이 있다.
인간 H3 릴랙신을 포함하는 제제는, 비강 또는 폐 흡입 에어로졸 또는 네블라이저용 용액, 또는 통기용 미세 분말로서 단독으로 또는 락토스와 같은 불활성 담체와 함께, 또는 기타 약학적 허용 부형제와 함께 기도로 투여될 수 있다. 이 경우, 제제의 입자는 50 ㎛ 미만, 바람직하게는 10 ㎛ 미만의 직경을 갖는 것이 유리하다. 예컨대, H3 릴랙신 투여에 적용할 수 있는 인슐린 투여 방법이 개시되어 있는 미국 특허 제5,364,838호 참조.
독두증과 같은 장애 치료용 H3 릴랙신은, 두피에 적용되는 제제 형태, 예컨대 샴푸(예, 미국 특허 제4,938,953호, 단백질 성분을 포함하도록 당업자에게 공지된 방법에 따라 변형시킴) 또는 겔(예, 특허 결정된 미국 출원 제08/050,745호에 개시됨)로 국소 투여될 수 있으며, 경우에 따라 흡수를 촉진하기 위해 H3 릴랙신 농도를 증가시킬 수 있다.
경구 투여를 위해서, 활성 화합물을 당업계에 공지된 약학적 허용 담체와 함께 혼합하여 화합물을 쉽게 제형화할 수 있다. 이러한 담체를 이용하면, 본 발명의 화합물을 치료할 환자가 경구 섭취하기 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화할 수 있다. 경구용의 약학 제제는 얻어진 고체 부형제일 수 있으며, 경우에 따라 생성된 혼합물을 제분하고, 필요에 따라 적절한 보조제를 첨가한 후에 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 얻을 수 있다. 적절한 부형제는 특히 충전재, 예컨대 당류(예, 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨); 셀룰로스 제제, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸스 고무, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다. 필요에 따라, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염 등의 붕해제를 첨가할 수 있다.
당의정 코어에는 적절한 피막이 구비되어 있을 수 있다. 이를 위해서, 아라비아 고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티탄, 락커 용액과 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수도 있는 농축 당 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 용량의 상이한 조합을 확인하거나 또는 특성화하기 위해서 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 피막에 첨가할 수 있다.
경구 사용될 수 있는 약학 제제는 젤라틴으로 만든 푸쉬핏 캡슐과, 젤라틴 및 가소제(예, 글리세롤 또는 소르비톨)로 만든 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬핏 캡슐은 충전재(예, 락토스), 결합제(예, 전분) 및/또는 윤활제(예, 활석 또는스테아르산마그네슘), 그리고 경우에 따라 안정화제와의 혼합물로서 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 성분은 적절한 액체, 예컨대 지방유, 액상 파라핀 또는 액상 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수 있다. 경구 투여용의 모든 제제는 투여에 적절한 용량으로 제형화되어야 한다.
흡입 투여의 경우, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 편리하게는 적절한 추진제(예, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 기체)를 사용하여 가압 팩 또는 네블라이저로부터 에어로졸 분무 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 제형 단위를 측정할 수 있다. 화합물과 락토스 또는 전분 등의 적절한 분말 베이스의 분말 혼합물을 포함하고, 흡입기 또는 주입기에서 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예, 젤라틴)가 제형화될 수 있다.
본 발명의 각종 측면이 하기 비제한적인 실시예에 상세히 설명될 것이다.
하기 실시예에서, 래트는 래트 뇌의 mRNA 및 단백질 수준에서의 H3 릴랙신 발현을 지도화하기 위한 실험 모델로서 사용되며, 이것으로 인간 뇌 지도화가 가능해진다. 이러한 점에서, 래트 뇌는 인간 뇌의 표준 비교용 해부학적 모델이다[Goto et al(2001) The Journal of Comparative Neurology 438:86-122].
실시예 1
뉴클레오티드 서열 확인, 특성 규명, 정제 및 조작
조직 RNA/DNA 추출 및 RT-PCR
인간 게놈 DNA는 표준 프로토콜을 이용하여 인간 CL로부터 추출하였다(Sambrook 등, 1989 In Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY). 인간 CL 및 마우스 조직은 액체 질소의 존재하에서 미세하게 저미고, RNAWiz 시약(미국 텍사스 오스틴에 소재하는 Ambion Inc.)과 함께 균질화하고, RNA는 제조사의 지침에 따라 추출하였다. 각각의 샘플로부터 얻은 전체 RNA(5 ㎍)는 역전사(RT) 반응을 위해 사용하였는데, 역전사 반응은 제조사의 지침에 따라 20 ㎕ 부피로 Superscript II RT-PCR 키트(Gibco-BRL, Rockville, MD)를 이용하여 수행하였다. 프라이머 100 ng 및 cDNA 주형 150 ng을 함유하는 반응물 50 ㎕를 모든 PCR 반응을 위해 사용하였다. 마우스 조직은 319 bp 생성물을 생성하는, 특이적인 순방향 프라이머 [5'TGCGGAGGCTCACGATGGCGC 3'] 및 역방향 프라이머 [5'GACAGCAGCTTGCAGGCACGG 3']를 이용하는 M3 릴랙신 발현에 대해 스크리닝하였다. 마우스 릴랙신(M1) 발현은 150 bp 생성물을 생성하는 공지된 서열(Evans 등 (1993) J. Mol.Endocrinol. 10, 15-23)에 기초한 특이적인 순방향 프라이머 [5'GTGAATATGCCCGTGAATTGATC3'] 및 역방향 프라이머 [5' AGCGTCGTATCGAAAGGCTCT 3']를 이용하여 결정하였다.
인간 CL cDNA는 각각 순방향 1/역방향 및 순방향 2/역방향에 대해 504 bp 및 310 bp의 생성물을 생성하는 H3 릴랙신에 대한 특이적인 프라이머, 즉 H3 릴랙신, 순방향 1 프라이머 [5' ACGTTCAAAGCGTCTCCGTCC 3'], 순방향 2 프라이머 [5' CGGTGGAGACGATCAGACATC 3'] 및 역방향 프라이머 [5' ATGGCAGGACTGGGGCATTGG 3']를이용하는 RT-PCR 반응에서 사용하였다. 모든 프라이머 조합에서, 본 발명자들은 게놈 DNA 오염을 제어하기 위해서, 각각 마우스 및 인간 릴랙신 서열에서 단일 인트론을 교차하는 것을 확인하였다. 모든 실험에서, 246 bp의 생성물을 생성하는 GAPDH 순방향 프라이머 [5 'TGATGACATCAAGAAGGTGG 3'] 및 역방향 프라이머 [5' TTTCTTACTCCTTGGAGGCC 3']는 cDNA의 등가물 로딩 및 품질을 조절하는 별도의 PCR에서 사용하였다. 단지 하나의 대표적인 실험 결과만을 제시하고 있지만, RT-PCR에 의한 M3 릴랙신 발현은 2 이상의 동물로부터 추출한 하나의 DNA 샘플에 대해 수행하였다. 마우스 PCR 반응은 퍼킨 엘마 유전자 증폭기 내에서 완료하였는데, 다음과 같은(터치-다운) 어닐링 온도를 이용하였다: 64℃ (2 사이클), 63℃ (2 사이클), 62℃ (2 사이클), 61℃ (2 사이클), 60℃ (32 사이클). 인간 CL cDNA 중에서 H3 릴랙신 발현은 다음과 같은 어닐링 온도에서 RT-PCR에 의해 수행하였다: 60℃ (2 사이클), 59℃ (2 사이클), 58℃ (2 사이클), 57℃ (2 사이클), 56℃ (32 사이클). 소량의 PCR 생성물은 2%(w/v) 아가로즈 겔 상에서 전기영동하고, EtBr로 염색하고, 촬영하였다. 마우스 조직 샘플은 Hybond NX 막(영국 아이리시버리에 소재하는 Amersham International)에 이전하고 서던 블롯 분석을 수행하였다.
추가의 PCR 반응은 ATG 개시 코돈 전방으로부터 역방향 M3 프라이머(상기함) 및 순방향 프라이머(5' GGG TCGCAGGCATCTCAACTG 3')를 이용하여 마우스 뇌 및 난소 cDNA를 이용하여 수행하였다. 생성된 생성물은 완전한 H3 릴랙신 코딩 서열을 함유하였다. PCR은 상기한 바와 같이 수행하였으나, 다음과 같은 어닐링 온도를 사용하였다: 60℃ (2 사이클), 59℃ (2 사이클), 58℃ (2 사이클), 57℃ (2 사이클), 56℃ (32 사이클).32P-표지화를 위해 특이적인 H3 릴랙신 cDNA 프로브를 생성하고, 인간 다중 조직 어레이의 후속 프로빙에 사용하기 위해, 인간 게놈 DNA (50 ng)에 대해 RT-PCR을 수행하였다. H3 릴랙신 유전자의 엑손 II 서열로부터 유래한 특이적인 순방향 프라이머(5' CGGATGCAGATGCTGATGAAG 3') 및 역방향 프라이머(5' GTGCCTGAGCCCACAGTGCCT 3')는 하기 어닐링 온도에서 사용하였다: 60℃(2 사이클), 59℃(2 사이클), 58℃(2 사이클), 56℃(2 사이클), 54℃(32 사이클). 이들 생성물 뿐만 아니라 상기한 마우스 PCR 생성물은 2% 아가로즈 겔 상에서 분리하였다. 밴드는 UV 광 하에서 예상된 크기(마우스 319 bp, 478 bp; 인간 374 bp)로 검출되었으며, 절단하고, Ultraclean TM 15 DNA 정제 키트(오스트레일리아 아델라이드에 소재하는 Geneworks Pty Ltd)를 이용하여 겔로부터 용출시켰다. 상기 밴드들은 후속적으로 pGEM-T 벡터(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 Promega)내로 서브클로닝하였으며, 이어서 다수의 서브클론들은 제조사의 지침에 따라 ABI PRISM 377 자동 DNA 서열결정기를 이용하여 양 스트랜드의 서열을 결정하였다(오스트레일리아 멜버른에 소재하는 Applied Biosystems).
서던 블롯 분석
막 상의 PCR 생성물은 M1 릴랙신에 대한 특이적인 내부 올리고뉴클레오티드 프라이머(5' CAAGCAGAGCTGGCTCCTCCTGGCT CAAAGCCAATCTTC 3') 및 M3 릴랙신 (5' AATTTGGCTCTTGCTACAGCCCCACTCG CAGCAACTGCT 3') cDNA 서열에 하이브리드화하였는데, 이는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 [γ-32P] ATP를 이용하여 표지하였다. 하이브리드화는 5 x SSC(1 x SSC; 0.15 M NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨, pH 7), 5 x 덴하르트, 1 % SDS 및 100 pg/ml 초음파처리한 청어 정자 중에서 55℃에서 하룻밤 동안 수행하였다. 막은 실온의 2 x SSC, 0.1% SDS 중에서 5분 동안 3회 세척한 후, 55℃의 0.1 x SSC, 0.1% SDS 중에서 30분 동안 세척한 후, 실온에서 24 시간 동안 BioMAX MR 필름(미국 뉴욕 로체스터에 소재하는 Eastman Kodak Co.)에 노출시켰다.
노던 블롯 분석
웅성 마우스의 심장, 뇌, 폐, 흉선 및 비장, 및 임신 7.5일, 10.5일 및 18.5일된 자성 마우스 풀로부터 유래한 자성 마우스의 난소, 자궁내막, 자궁근육층, 자궁경부 및 질로부터 유래한 M3 릴랙신 mRNA, 전체 RNA(5-25 ㎍)의 발현을 추가로 조사하기 위해, 표준 MOPS/포름알데히드 겔 상에서 영동시켰다. 이어서, RNA는 최적화된 Hybond-NX 막에 이전하고, M3 릴랙신에 대한 특이적인 프라이머에 의해 생성된 319 bp PCR 생성물에 상응하는32P-표지된 프로브를 이용하여 M3 릴랙신 막에 대해 프로빙하였다(상기 참조). 이 생성물은 특이적인 역방향 프라이머(상기함) 및 상기한 바와 같은 T7 폴리머라제를 이용하여 [α-32P] dCTP로 표지하였다(31). 상기 막은 65℃의 0.25 M NaH2P04, pH 7.2, 1 mM EDTA, 20% SDS 중에서 하룻밤 하이브리드화하고, 이어서 실온의 2 x SSC, 0.1% SDS 중에서 5분 동안 3회 세척하고, 최종적으로 65℃의 0.1 x SSC, 0.1% SDS 중에서 30분 동안 세척하였다. 막은 일차로 실온에서 48 시간 동안 포스포이미져 플레이트에 노출시킨 후, FujiX 2000 포스포이미져(일본에 소재하는 Fuji Photo Company)에서 분석하고, 이어서 -80℃에서Hyperscreen(오스트레일리아 시드니에 소재하는 Amersham Pharmacia)을 이용하여 BioMAX MS 필름(오스트레일리아 멜버른에 소재하는 Integrated Sciences)에 노출시켰다. 별도의 실험에서, 뇌, 비장, 간 및 고환에서 유래한 전체 RNA (200 ㎍)는 mRNA 정제 키트(Amersham Pharmacia)를 이용하여 poly-A RNA로 정제하고, 상기한 바와 같이 노던 블로팅을 수행하였다. 인간 다중 조직 발현 에레이(미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 CLONTECH laboratories)는 제조사의 지침에 따라32P-표지된 H3 릴랙신 특이적인 프로브와 하이브리드화시켰다. 게놈 DNA로부터 분리된 H3 릴랙신 서열의 374 bp 단편은 H3 릴랙신 특이적인 역방향 프라이머(상기함) 및 T7 폴리머라제를 이용하여 [α-32P] dCTP로 표지하였다(Bathgate 등 (1999)Biol. Reprod. 61,1090-1098). 상기 막은 상기한 바와 같이 포스포이미져 플레이트 및 BioMAX 필름에 노출시켰다.
원위치 하이브리드화 조직화학
-16℃의 저온 유지 장치 상에서 두정부(14 ㎛)를 절단하고, 실란-코팅된 슬라이드 상에 거치시켰다. 상기 두정부는 클로로포름 내에서 10분 동안 탈지하고, 세정하고, 4℃의 100% 에탄올 중에 저장하였다. M3 릴랙신 mRNA 서열의 3개의 올리고뉴클레오티드(39 량체) [5' GGTGGTCTGTATTG GCTTCTCCATCAGCGAAGAAGTCCC 3'], [5' AATTTGGCTCTTGCTACAGCCCCACTC GCACGAACTGCT 3'] 및 [5' TAAGGAGACAGTGGACCCCTTGGTGCCTCGCCTGT AGGA 3'] 및 기공지된 M1 릴랙신 서열(Evans 등 (1993) J. Mol. Endocrinol. 10, 15-23)의 3개의 올리고뉴클레오티드 [5'GCACATCCGAATGAATCCGTCCATCCACTCCTCCGAGAC 3'], [5' CAAGCAGAGCT GGCTCCTCCTGGCTCAAAGCCAATCTTC 3'] 및 [5' GTTGTAGCTCTGGGAGCGAGGC CTGAGCCTCAGACAGTA 3']는 상업적으로 제조하였다(gENEWORKS pTY lTD.). 프로브는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(Roche Diagnotics; Wisden 등 (1994) In In situ Hybridazation Protocols for the Brain(Wisden, W. 및 Morris, B.J. eds), pp 9-34, Academic Press, London)를 이용하여 1 x 109d.p.m./㎍의 특이 활성으로 [α-35S]dATP(1200 Ci/mmol; NEN, 오스트레일리아 멜버른에 소재하는 AMRAD-Biotech)로 표지하였다. 유전자 서열 데이타베이스(Celera, EMBL 및 Genbank; NCBI/NIH Blast Service)에 대한 사용된 서열의 스크리닝 결과 적합한 M1 및 M3 릴랙신 mRNA에만 상동성이 있음을 확인하였다.
상기 두정부는 다수의35S-표지된 프로브(각각의 프로브 30 fmol/슬라이드)와 함께 42℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 상기 항온처리는 50% 포름아미드, 4 x SSC, 10% 덱스트란 설페이트 및 0.2 M 디티오트레이톨을 함유하는 하이브리드화 버퍼 중에서 수행하였다. 슬라이드는 55℃에서 1 시간 동안 1 x SSC 중에서 세척하고, 0.1 x SSC 중에서 세정하고, 이어서 탈수한 후, 10일 동안 Kodak BioMAX MR에 병치시켰다.
하이브리드화의 신뢰성은 비특이적이거나 또는 백그라운드 하이브리드화(도시하지 않음)에 상응하는 것을 제외하고 하이브리드화 버퍼에 100배 과량의 미표지 프로브의 첨가에 의해 모든 부분에서 신호가 성공적으로 차단될 수 있는지 여부로확인하였다. 또한, M3 릴랙신 유전자 서열의 상이한 비중첩 영역에 상보적인 3개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하였다.
인간 릴랙신 (H3) 연구
고체 상 합성
H3 유전자에 의해 코딩된 추정 펩티드 서열은 예상된 신호 펩티드 및 신호 펩티드와 B-사슬, 및 H3 릴랙신 프로호르몬의 B/C와 C/A 사슬 연접부단백질분해 효소 절단 부위에 기초한 고체 상 합성 과정에 의해 조립하였다(상세한 내용을 결과 부분을 참조할 것). 용이한 합성을 위해, 본 발명자들은 A-펩티드 및 B-펩티드를 그들의 카르복시-말단 아미드 유도체로서 제조하는 방식을 선택하였다. 선택적으로 S-보호된 A-사슬 및 B-사슬은 문헌(Dawson 등 (1999)J.Pept. Res. 53, 542-547)에 이미 기술된 바와 같은 연속 흐름 Fmoc 고체 상 기법에 의해 0.1 mmol 스케일로 합성하였다. 선택적인 S-보호는 다음과 같은 시스테인 잔기에 대해 수행하였다: Al0,l5및 B22에 대한 트리틸(Trt), A24에 대한 tert-부틸 및 All및 B10에 대한 아세트아미도메틸(Acm)(아미노산 잔기 번호매김에 대해서는 도 2A를 참조할 것).
합성이 완료되면, S-보호된 A-사슬 및 B-사슬은 고형 지지체로부터 절단하고, 동시에 스케빈져의 존재 하에서 TFA 처리를 이용하여 탈보호된 곁사슬도 제거하였다. 선택적인 이황화 결합 형성은 본질적으로 봄빅신의 합성에 대해 기술된 바와 같이 달성되었다(Maruyama 등 (1992) J.Prot.Claim. 11, 1-12).
펩티드 특성 규명
펩티드는 GBC 자동 분석기(오스트레일리아 멜버른) 상에서 24 시간 산 가수분해물의 이중 아미노산 분석에 의해 정량하였다. MALDITOF 질량 분석법(MS)은 지연된 이온 추출을 수행할 수 있는 Bruker Biflex 장치(독일 브레멘) 상에서 19.5 kv의 선형 모드로 수행하였다.
기타 릴랙신 및 인슐린 펩티드
인간 INSL3은 양 INSL3을 위해 사용된 방법(Dawson 등 (1999) J. Pept. Res. 53,542-547)과 동일한 방법을 이용하여 합성하였으며, 개략적으로 이미 설명한 MS 및 아미노산 분석을 통해 그 특성을 규명하였다. H1 릴랙신은 이미 합성되었으며(Wade 등 (1996) Biomed. Pept. Prot. Nucl. Acids 2, 27-32), 재조합 H2 릴랙신은 Connetics Corporation(미국 캘리포니아 팔로알토)으로부터 기증받았으며, 소 인슐린은 Roche Diagnostics(오스트레일리아 시드니)에서 구입하였다.
THP-1 세포 생분석
인간 단핵구 세포주(THP-1)에서 cAMP 생성을 유도할 수 있는 H3 릴랙신의 능력을 H1 및 H2 릴랙신과 비교하였다. 이와 같은 비교를 위해 Parsell과 동역자들의 방법을 이용하였으나(Parsell 등 (1996) J. Biol. Chem. 271,27936-27941), 그대로 사용하지는 않고 다음과 같이 약간 변경하여 사용하였다; 트립판 블루를 이용하여 생존성 테스트된 THP-1 세포는 배지에 재현탁하고, 60,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 이전하였다. 펩티드(H1, H2, H3 릴랙신, 인간 INSL3 및 소 인슐린)는 RPMI 배지 내의 1 μM 포르스콜린 및 50 μM 이소부틸메틸잔틴(IBMX)과 함께 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 이어서, 상기 플레이트는 약식 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포는 용해 버퍼에 재현탁시켰다. cAMP 레벨은 cAMP Biotrak EIA 시스템(영국 아일리스버리에 소재하는 Amersham International)을 이용하여 용해물 중에서 측정하였다. 결과는 H2 릴랙신으로 달성된 cAMP의 최대 자극과 비교하여 최대 릴랙신 반응(%)으로 나타냈다. 데이타는 4회 실시한 3가지 실험의 평균 ±SEM으로 나타냈으며, PRISM(미국 샌프란시스코 샌디에고에 소재하는 Graphpad Inc.)을 이용하여 플롯하였다.
THP-1 세포 결합 분석
THP-1 세포는 회전 침강시키고 결합 버퍼(20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1.5 mM CaCl2, 1% BSA, 0.1 mg/ml 라이신, 0.01% NaN4, pH 7.5)(Parsell 등 (1996) J. Biol. Chez. 271, 27936-27941)중에 재현탁시켜 96 웰 플레이트에서 1 x 106세포/웰을 얻었다. 상기 세포들은 농도가 증가하는 미표지 H1, H2 및 H3 릴랙신(100 pM 내지 30 nM)의 존재 또는 부재하에서 25℃에서 90분 동안33P-표지된 H2(B33) 릴랙신(100 pM: 문헌(Tan 등 (1999) Br. J. Pharmacol. 127, 91-98)에 이미 기술된 바와 같이 표지함)과 함께 결합 버퍼 중에서 항온처리하였다. 비특이적인 결합은 H2 릴랙신(1 μM)과의 결합이었다. 세포들은 Packard 96-웰 플레이트 세포 수집기 및 0.5% 폴리에틸렌이민으로 처리한 Whatman GF/C 유리 섬유 필터를 이용하여 수집하였다. 상기 필터는 개질된 결합 버퍼(20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1.5 mM CaCl2)로 3회 세척하고, 37℃ 오븐에서 건조하고, 액체 섬광 분석기(오스트레일리아 캔버라에 소재하는 Packard TopCount(상표명))를 이용하여 방사능을 계수하였다.
항체 교차반응성
H3 릴랙신을 인식할 수 있는 특성이 잘 규명된 인간 릴랙신 항체의 능력은 방사능면역분석법을 이용하여 H1 및 H2 릴랙신과 비교 테스트하였다. 개략적으로, 염소 항-H2 릴랙신(Lucas 등 (1989) J. Endocrinol. 120, 449-57)dms 1:1,000의 희석률로 0.05 M 탄산나트륨 버퍼와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 96 웰 ELISA 플레이트(일회용 제품, 오스트레일리아 아델레이드)에 코팅하였다. PBS-T(인산염 완충 염수; 0.05% 트윈 20, pH 7.4)로 3회 세척한 후, 분석 버퍼(PBS-T 중의 1% BSA) 50 ㎕ 중에 용해시킨 인간 릴랙신 펩티드의 희석물을 분석 버퍼 50 ㎕중의 50,000 cpm125I-표지된 릴랙신과 함께 첨가하였다. H2 릴랙신은125I-표지하고, HPLC (Palejwala 등 (1998) Endocrinology 139, 1208-1212)로 정제하였다. 4℃에서 하룻밤 항온처리한 후, 플레이트는 PBS-T로 2회 세척하였다. 항체-결합-l25I-표지된 H2 릴랙신은 1 M NaOH를 첨가하여 수집하고, 튜브 내로 경사분리하고, Packard 5010 감마 계수기(오스트레일리아 캔버라에 소재하는 Packard) 상에서 계수하였다. 실험은 2회 이상 수행하였으며, 유사한 결과를 얻었다. 데이타는 3회 실시한 한가지 대표적인 실험으로부터 평균 ±SEM으로 PRISM을 이용하여 플롯하였다.
마우스 릴랙신 (M3) 연구
동물
본 연구에 사용한 모든 웅성 및 자성 마우스는 나이별로 매칭시켰으며(age-matched), 동일한 백그라운드를 갖고 있었다(C57BLK6J). 동물들은 조절된 환경에서사육하였으며, 설치류 랩 사료(오스트레일리아 멜버른에 소재하는 Barastock Stockfeeds) 및 물을 공급하면서 14 시간의 명기와 10 시간의 암기 스케쥴 하에 유지하였다. 웅성 마우스(3.5 개월령)는 교배시키고, 질 플러그의 확인을 통해 임신 기간을 측정하였다. 임신 7.5일, 10.5일 및 18.5일에, 마우스를 희생시키고 조직을 수집하였다. 또한, 조직은 임신하지 않은 자성 마우스 및 웅성 마우스(4월령)로부터도 수집하였다. 이들 실험은 하워드 플로리 인스티튜트의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 득한 것으로, 과학적 목적을 위한 실험실 동물의 보호와 이용을 위한 오스트레일리아 실천 요강을 준수한다.
조직 수집
동물은 과량의 이소플루오란(오스트레일리아 시드니에 소재하는 Abbott Australasia Pty Ltd)을 이용하여 희생시켰다. 뇌, 심장, 흉선, 비장, 폐, 간, 신장, 피부 및 위장을 자성 마우스(난소, 자궁내막, 자궁근육층, 자궁경부, 질; 각각의 임신 단계에서 n=2) 및 웅성 마우스(고환, 부고환, 전립선; n=3)로부터 재생성 장기와 함께 수집하였다. 추가 동물로부터, 웅성 마우스 뇌(n=3)는 시상하부, 피질, 해마, 시상, 수질 및 소뇌를 포함하는 특정 영역으로 절개하고, 즉시 액체 질소내에 위치시켜 RNA 제조를 위해 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 자성 마우스 뇌(n=3)를 수집하고, 원위치 하이브리드화 조직화학을 위해 드라이아이스 상에서 즉시 동결시켰다(Burazin 등 (2001) J. Neuroendocrinol. 13, 358-370). 하워드 플로리 인스티튜트 인간 윤리 위원회의 승인 및 환자 동의하에 자궁외 임신에 대한 수술을 받고 있는 임신 초기의 여성으로부터 취한 인간 CL을 사용하였다.
실시예 2
인간 및 마우스에서 인간 H3 릴랙신 유전자
인간 및 마우스에서 둘 다의 H3 릴랙신 서열은 기능적 유전자의 대표적인 특징들을 보유하였다(도 1A 인간; 도 1B 마우스). 이들 각각은 인간 및 마우스 각각에 대한 추정적인 ATG 개시 코돈의 65 bp 및 59 bp에 전사 개시를 위한 추정적인 TATA 박스를 함유하였다. 폴리아데닐화 신호는 상기 유전자 둘 다의 3' 미해독 영역에 존재하였으며, 각각 인간 유전자 및 마우스 유전자의 경우 프레임내 TAG 종결 코돈으로부터 582 bp 위치 및 448 bp 위치에 존재한다. 단일 인트론은 다른 릴랙신 및 인슐린 훼밀리 구성원의 위치와 유사한 위치에 상응하는 상기 유전자 둘 다의 서열내 동일한 위치내의 코딩 영역에 개입된다(Hudson 등 (1983) Nature 301, 628-631; Evans 등 (1993) J. Mol. Endocrinol. 10, 15-23; Ivell, R (1997) Rev. Reprod. 2, 133-138). 상기 H3 릴랙신 유전자는 19p13.3에서 염색체 19 상에 편재하는 반면, 마우스 유전자는 8C2에서 염색체 8에 위치한다. H3 및 M3 릴랙신 유전자의 유도된 코딩 영역은 각각 142 및 141 아미노산이다.
이황화 결합 형성을 위한 시스테인 잔기는 올바른 위치내에 시스테인 연결부 주위의 유연성을 위해 필요한 보존된 글리신 잔기와 함께 보유된다(Biillesbach 등 (2000) Int. J. Pept. Prot. Res. 46, 238-243). 가장 중요한 것은, B-사슬의 코어(R-X-X-X-R-X-X-I)(Bullesbach 등 (2000) J. Biol. Chem. 275, 35276-35280) 내에서 릴랙신 수용체 결합에 필수적인 것으로 확인된 잔기들은 인간 및 마우스 서열 내에 보유되어 있다. 따라서, 인간 서열이 직접적인 아미노산 상동성에 있어서hINSL5 펩티드 서열과 가장 밀접하게 유사함에도 불구하고, 이러한 결합 모티프의 존재는 상기 펩티드가 릴랙신 펩티드와 더 유사함을 의미하는 것이다. 흥미롭게도, M3 릴랙신 A 사슬은 훼밀리 구성원들의 시스테인 패턴에 부합하는 반면, 이미 특성이 규명된 M1 릴랙신 서열은 최종 시스테인 잔기 이전에 여분의 티로신 잔기를 함유한다(도 2A).
H3 서열(인간 H3) 및 M3 서열(마우스 "3" 릴랙신)은 뉴클레오티드 레벨에서 코딩 영역내에 70% 이상의 상동성을 공유한다. 그러나, 상동성은 유도된 아미노산 서열에서 가장 현저하다. 유도된 프로호르몬 서열 둘 다는 인간 및 마우스 펩티드 둘 다에서 알라닌과 아르기닌 사이의 동일한 위치에서 절단되는 것으로 생각되는 ATG 개시 코돈 이후의 전형적인 신호 서열을 함유한다(Nielsen 등 (1997) Prot. Engineer. 10, 1-6). 릴랙신 훼밀리의 다른 구성원에서 확인된 B/C 연접부에서 염기성 아미노산의 아르기닌-아르기닌 쌍은 트립토판과 아르기닌 사이의 절단을 강하게 암시하는 것이다. 유사하게, C/A 연접부에서의 절단은 도 1A 및 도1B에 나타낸 바와 같이 아르기닌과 아스파르트산 사이에서 가장 잘 일어날 것으로 생각되는데, 그 이유는 이 위치가 약한 푸린(furin)(프로단백질 프로테아제) 절단 위치에 상응하기 때문이다(Nakayama, K. (1997) Biochem. J. 327, 625-635). 따라서, H3 및 M3 릴랙신 둘 다는 27개의 아미노산으로 이루어진 B-사슬, 66개의 아미노산으로 이루어진 C-펩티드 및 24개의 아미노산으로 이루어진 A-사슬을 포함하는 것으로 생각된다.
H3 및 M3 릴랙신의 A-사슬 및 B-사슬과 H1, H2 및 M1 릴랙신과의 비교는 도2A에 개괄적으로 설명하였다. M3 서열과 H3 서열간의 A-사슬 및 B-사슬 둘 다에서 단지 2개의 아미노산 서열 차이가 존재하며, 이들 변화중 3개는 보존된다. 대조적으로, M1 릴랙신과 H2 릴랙신 사이의 상동성은 단지 A-사슬 및 B-사슬 각각에서 단지 42% 및 45%였다. 또한, B-사슬내 중요한 코어 요소 및 A-사슬내 중요한 구조 요소 이외에, H2 릴랙신과 H3 릴랙신 사이, 및 M1 릴랙신과 M3 릴랙신 간에는 상동성이 거의 존재하지 않는다. 흥미롭게도, H3 및 M3 릴랙신은 다른 인슐린/릴랙신 훼밀리 구성원의 이 영역에서의 20% 미만의 상동성과 비교하여 C-펩티드 도메인의 높은 상동성(73%)을 나타낸다. H3 및 M3 릴랙신의 C-펩티드 길이는 각각 65 아미노산과 66 아미노산이며, 다른 릴랙신의 C-펩티드 길이보다 훨씬 더 짧다(H1과 H2에 대한 102 아미노산 및 M1 릴랙신에 대한 99 아미노산). C-펩티드 사슬 길이 및 서열 상동성은 INSL5(24%)에 가장 유사하다.
상기 두 유전자의 전장 아미노산 서열은 인슐린/릴랙신 훼밀리의 다른 구성원에 정렬시켜 계통수를 생성한다(도 2B). 또한, H3 및 M3 릴랙신 서열은 별개의 브랜치로 그룹화되는데, 이는 이들 특정 릴랙신의 진화가 진화의 초기에 다른 릴랙신으로부터 발산되었음을 의미하는 것이다. 또한, 이는 이 분석에서 H3 릴랙신과 일차 구조적으로 가장 근접한 유사성을 공유하는 INSL5의 경우였다.
실시예 3
펩티드 합성
H3 릴랙신은 낮은 전체 수율(0.7%)로 고체 상 합성에 의해 제조하였다. MALDITOF MS는 MH+가 5,494.7(이론값: 5,497.5)인 단일 생성물을 나타냈다. 또한,아미노산 분석을 통해 그의 올바른 조성을 확인하였다.
인간 릴랙신 H3 [hRlx-3A(1-24) 아미드-B(1-27) 아미드의 화학 합성
별개의 H3 릴랙신 펩티드 사슬의 아미노산 서열을 나타내는 선택적으로 S-보호된 A-사슬 및 B-사슬은 문헌(Atherton, E 및 Sheppard, RC. Solid Phase Peptide Synthesis. IRL Press at Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 1989)에 기재된 일반 절차를 이용하여 연속 흐름 9-플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc) 고체 상 기법에 의해 합성하였다. 상기 펩티드 둘 다는 펩티드 아미드 링커 폴리에틸렌 글리콜 폴리스티렌(Fmoc-PAL-PEG-PS) 지지체(Applied Biosystems)를 이용하여 펩티드-카르복실 말단 아미드로서 0.1 mmol 스케일로 제조하였다. A-사슬 어셈블리에 있어서, 4배 과량의 Fmoc-아미노산(오스트레일리아 멜버른에 소재하는 Auspep)은 디메틸포름아미드(DMF) 중의 1,3-디이소프로필카르보디이미드(DIC) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)에 의해 활성화되는 반면, B-사슬 합성 중에 각각의 잔기는 DMF 중의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 디이소프로필에틸아민(DIEA)에 의해 활성화되었다. 상기 사슬 어셈블리 둘 다에 있어서 Nα-Fmoc 탈보호는 DMF 중의 20% 피페리딘을 이용하여 수행하였다. 일반적으로 커플링은 30분 동안 지속하였으며(이중 커플링은 배제함), A-사슬 잔기 Ser7,8,21및 모든 시스테인에 대해서는 시간을 연장하였으며, B-사슬 잔기 Arg1,12,16, Ala2,3,17및 Cys10에 대해서는 이중 커플링하였다. 곁사슬 보호는 Asp, Glu, Thr 및 Ser에 대해서는 tert-부틸 에스테르 및 에테르로수행하였으며, Lys 및 Trp에 대해서는 부톡시카르보닐(Boc)로 수행하였으며, Arg에 대해서는 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf)로 수행하였으며, B-사슬 Gly11에 대해서는 아미드 결합 보호 Nα-(2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질)[FmocHmb] 로 수행하였다. 선택적인 S-보호는 하기 시스테인 잔기에 대해 수행하였다: A-사슬내 Cys10,15및 B-사슬내 Cys22에 대해 트리틸(Trt), A-사슬내 Cys24에 대해 tert-부틸(tBu) 및 A-사슬 Cys11및 B-사슬 Cys10에 대해 아세트아미도메틸(Acm).
(i) 인간 릴랙신 H3, A-사슬[Cys 11 (Acm), Cys 24 (tBu)](1-24) 아미드 [1]의 합성
합성이 완료되면, 보호된 A-사슬 수지는 실온에서 2.5 시간 동안 95% 트리플루오로아세트산(TFA)/2.5% 에탄디티올(EDT)/2.5% H20 + 4 방울의 트리에틸실란으로 처리하여 티올의 켄칭에 도움을 주었다. TFA는 질소 스트림 하에서 최소 부피로 제거하였으며, 냉각된 디에틸 에테르로부터 2회 침전시켰다. 이어서, 침전은 0.1% 수성 TFA 내에 용해시키고 동결건조하였다. 미정제 S-환원된 [티올-Cys10,15, Cys11(Acm), Cys24(t-Bu)] A-사슬은 실온에서 4 시간 동안 0.1 M Gly-NaOH, pH 8.3 중에서 직접 공기 산화를 수행하였다. 순수한 TFA 수 방울을 첨가하고 미정제 산화된 물질을 직접 동결건조한 후, 분석 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 모니터링을 통해 분자내 이황화 결합의 완전성을 확인하였다.
(ii) 인간 릴랙신 H3, B-사슬[Cys 10 (Acm)](1-27)아미드[2]의 합성
합성이 완료되면, 보호된 B-사슬 수지는 실온에서 2.5 시간 동안 82.5% TFA/5% 페놀/5% H20/5% 티오아니솔/2.5% 에탄디티올 + 4 방울의 트리에틸실란으로 처리하여 티올의 켄칭에 도움을 주었다. TFA는 질소 스트림 하에서 최소 부피로 제거하였으며, 냉각된 디에틸 에테르로부터 2회 침전시켰다. 이어서, 침전은 0.1% 수성 TFA 내에 용해시키고 동결건조하였다. 이어서, 미정제 B-사슬은 후술하는 바와 같이 RP-HPLC로 정제하였다.
(iii) 인간 릴랙신 H3, A-사슬[Cys 11 (Acm), Cys 24 (Pyr)](1-24)아미드[3]의 합성
펩티드 1(9.65 μmol) 25 mg 및 2,2'-디피리딜 디설파이드(DPDS)(158.86 μmol) 35 mg은 TFA 4.5 ml 및 티오아니솔 0.5 ml 중에 용해시키고, 생성된 용액은 냉각하였다. 상기 냉각 용액에 트리플루오로메탄설폰산(TFMSA)/TFA(1:5 v/v) 5 ml를 첨가하고, 전체 혼합물은 ≤0℃에서 30분 동안 교반하였다. [Cys11(Acm), Cys24(Pyr)] A-사슬 아미드 펩티드는 냉 에테르로부터 침전시키고, 이어서 원심분리시 얻은 펠릿은 6 M 구아니딘 히드로클로라이드(GdHCl), pH 8.0에 현탁시키고, RP-HPLC로 정제하였다(수율 펩티드 3: 4%). (RP-HPLC 정제에 대한 대안으로, 펩티드 3은 20% 수성 아세트산 중의 세파덱스 G-25 겔 여과 컬럼 상에서 탈염하였다.
(iv) 인간 릴랙신 H3, A[Cys 11 (Acm)](1-24) 아미드-B[Cys 10 (Acm)](1-27) 아미드[4]의 합성
정제된 A-사슬 펩티드 3(1.0 mg, 0.38 μmol) 및 정제된 B-사슬 펩티드 2(1.2 mg, 0.38 μmol)는 각각 1.0 ml 및 0.5 ml의 0.1 M NH4HC03에 별도로 용해시켰다. 이어서, B-사슬 용액을 A-사슬에 첨가하고, 반응 혼합물은 실온에서 30분 동안 강하게 교반하였다. 상기 용액은 빙초산 0.5 ml로 산성화하고, 이어서 후술하는 바와 같이 RP-HPLC를 수행하여 비스-이황화 연합 사슬 결합 생성물을 얻었다. (RP-HPLC 정제에 대한 대안으로, 생성되는 A/B 생성물, 펩티드 4는 20% 수성 아세트산 중의 세파덱스 G-25 겔 여과 컬럼 상에서 탈염하였다.
(B-사슬 용해도를 개선시키는 사슬 연합을 위한 대안적인 방법은 다음과 같다: 펩티드 3 및 정제된 [Cys11(Acm)] B-사슬은 8 M GdHCl, pH 4.5 버퍼 중에서 1.0 ml/mg의 농도로 별도로 용해시켰다. 이어서, B-사슬 용액을 서서히 A-사슬에 첨가하고 반응 혼합물은 37℃에서 24 시간 동안 강하게 교반하였다.
(v) 인간 릴랙신 H3 [hRlx-3A(l-24) 아미드-B(l-27) 아미드의 합성
정제된 4개의 펩티드 모두를 이용하여 제3 및 제4 이황화 결합을 형성하였다(회수율 100%, 0.39 μmol로 예상됨). 상기 펩티드는 80 mM HCl 및 아세트산 중에 용해시켰다. 이어서, 95% 수성 아세트산 중의 20 mM 요오드를 적가하였다(Acm 기당 요오드 25 당량). 과량의 산화제는 20 mM 수성 아스코르브산으로 켄칭한 후, 실온의 암실에서 1 시간 동안 반응을 수행하였다. 릴랙신은 출발 물질인 펩티드 3에 대해 최종 수율 0.74%로 RP-HPLC로 정제하였다.
정제
별도의 미정제 사슬 및 중간 펩티드는 모델 996 포토다이오드 어레이 검출기에 연결된 Waters 600 다용매 전달 시스템으로 정제하였다. C4실리카 겔이 충전된 10 x 250 mm Vydac 218 TP 컬럼(330A의 세공 크기, 1O ㎛의 입자 크기)을 사용하였다. 상기 펩티드는 아세토니트릴 중의 (A) 0.1 % 수성 TFA(v/v) 및 (B) 0.1% TFA(v/v)로 이루어진 용매 시스템을 이용하여 선형 구배 모드(30분에 걸쳐 25-50% B)로 용출시켰다. 표적 분획을 수집하고, 매트릭스-지원된 레이저 탈착 이온화 질량 분석기(MALDI-TOF MS)로 확인하고, 동결건조하였다.
펩티드 특성 규명
펩티드는 GBC 자동 분석기(오스트레일리아 멜버른) 상에서 24 시간 산 가수분해물의 이중 아미노산 분석에 의해 정량하였다. MALDITOF MS는 지연 이온 추출이 가능한 Bruker Biflex 장치(독일 브레멘)상에서 19.5 kv의 선형 모드로 수행하였다.
실시예 4
릴랙신의 생물학적 활성
합성 H3 릴랙신의 릴랙신 활성의 입증
합성 H3 릴랙신 C-말단 아미드 유도체는 릴랙신 수용체 발현 세포주 내에서 릴랙신 활성에 대해 테스트하였다(Parsell 등 (1996) J. Biol. Chem. 271, 27936-27941). H2 릴랙신은 이들 세포로부터의 cAMP 생성에서 용량 응답 증가를나타냈다(도 3A). 또한, 합성 H3 릴랙신은 H1 릴랙신(pEC50= 9.10 ± 0.05 [0.794 nM] ;n=3) 및 H2 릴랙신(pEC50= 9.67 ± 0.11 [0.214 nM]; n=3) 보다 약간 낮은 활성임에도 불구하고, H1cAMP에서 용량 응답 증가를 자극하였다(pEC50= 8.68 ± 0.08 [2.11 nM]; n=3). 이 반응의 특이성은 1 μM 이하의 용량에서 cAMP 반응을 자극할 수 없는 소 인슐린(bINSL) 또는 인간 인슐린 3(hINSL3)의 능력에 의해 입증하였다.
또한, 합성 H3 릴랙신은 THP-1 세포 중에서 릴랙신 결합 위치에 대한33P-표지된 H2 릴랙신 결합에 대해 경쟁할 수 있는 그의 능력에 대해 테스트하였는데(도 3B), 이때 H3 릴랙신의 결합 친화성은 H2 릴랙신의 결합 친화성(pKi = 8. 74 ± 0.11; n = 11) 및 H1 리랙신의 결합 친화성(pKi = 8. 9 ± 0.11; n = 7) 보다 낮은 (pKi = 7.5 ± 0.16; n = 3)이었다.
H3 릴랙신을 인식할 수 있는 특성이 잘 규명된 H2 릴랙신 항체의 능력
H1 릴랙신 및 H3 릴랙신을 인식할 수 있는 특성이 잘 규명된 항-H2 릴랙신 항체의 능력은 방사능면역분석법으로 테스트하였다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, H2 릴랙신은 높은 특이성으로 항-H2 릴랙신 항체에 대한125I-표지된 H2 릴랙신 결합을 변화시킬 수 있었다.
실시예 5
H3 릴랙신 발현
마우스에서 릴랙신 유전자 발현
M3 릴랙신 mRNA의 발현은 RT-PCR 생성물의 서던 블롯팅을 이용하여 M1 릴랙신 mRNA 발현과 비교하였다. 이 기법은 단지 반정량적임에도 불구하고, 본 발명자들은 이를 이용하여 M1 릴랙신과 비교된 M3 릴랙신의 발현 부위를 결정할 수 있었다. 대표적인 실험 및 이중 실험의 결과는 동일하였다. M3 릴랙신 mRNA는 M1 릴랙신이 확인되는 C57BLK6J 마우스내 다수의 조직에서 발현되었으나, 이들 두가지 마우스 릴랙신간의 발현 패턴은 상이하였다. 웅성 마우스의 비재생성 조직에서, M1 릴랙신 발현의 최고 레벨은 뇌에서 확인되었고, 중간 레벨은 흉선, 심장 및 신장에서 확인되었고, 낮은 레벨은 폐, 비장 및 피부에서 확인되었으나, 위장에서는 발현되지 않았다. 흥미롭게도, M3 릴랙신 발현은 뇌에서 최고 레벨로 검출되었으나, 흉선, 폐 및 비장에서는 중간 레벨로 검출되었으며, 심장과 간에서는 매우 낮은 레베로만 검출되었고, 신장, 피부 및 위장에서는 전혀 검출되지 않았다. 자성 마우스는 이들 조직에서 상기 유전자 둘 다에 대해 거의 동일한 발현 패턴을 나타냈다. 웅성 마우스의 재성성 조직에서, M3 릴랙신 mRNA는 고환에서만 현저히 발현되는 반면, M1 릴랙신 mRNA는 고환, 부고환 및 전립선에서 검출되었다. 또한, 상기 릴랙신 둘 다는 자성 마우스의 유선내 재생성 장기, 임신하지 않은 마우스, 임신한 마우스 및 수유중인 마우스의 난소 및 임신한 마우스의 자궁내막 및 자궁근육층에서 검출되었다. M3 릴랙신 mRNA의 현저한 발현은 모든 단소 단계에서 관찰된 반면, M1 릴랙신 발현은 임신하지 않은 마우스 및 수유중인 마우스로부터 유래한 난소와 비교하여 임신 후기의 난소에서 더 높았다. 높은 수준의 M3 릴랙신 mRNA는 뇌에서 검출되었으며, 이 조직을 추가 분석한 결과 상기 릴랙신 둘 다는 몇몇 구별되는 영역에서 발현되었음을 확인하였다. M1 릴랙신 mRNA는 시상하부, 해마, 피질, 시상, 뇌교/수질 및 소뇌에서 일정하게 발현되는 반면, M3 릴랙신 mRNA는 시상 및 뇌교/수질에서 고발현되는 것으로 확인되었는데, 이는 상기 두개의 릴랙신은 마우스에서 구별되는 역할을 할 수 있음을 의미하는 것이다.
노던 분석
M3 릴랙신 mRNA가 RT-PCR 및 서던 블롯 분석에 의해 긍정적으로 확인된 조직은 노던 블롯팅으로 추가 조사하였다. 심장, 뇌, 폐, 흉선, 비장, 난소, 자궁내막, 자궁근육층, 자궁경부 및 질에서 유래한 전체 RNA(5-25 ㎍)는32P-표지된 M3 릴랙신 특이성 프로브를 이용하여 초기 프로빙하였으나, 어떤 조직에서도 특이적인 하이브리드화 밴드는 확인되지 않았다. 이어서, 뇌, 비장, 간 및 고환으로부터 취한 폴리-A-RNA(각각, 15 ㎍, 5 ㎍, 5 ㎍ 및 25 ㎍)를 분석하였으며, 특이적인 ∼1.2 kb 하이브리드화 밴드는 뇌에서 확인되었는데, 이는 RT-PCR 및 서던 블롯 분석에 의해 검출된 M3 릴랙신 발현과 일치하였다. 이렇게 얻은 전사체 크기는 M3 릴랙신 전사체 서열(∼1 kb) + 폴리-A-꼬리(∼200 bp)에 기초한 예상된 크기와 일치하였다.
인간 조직에서 H3 릴랙신의 발현
클론테크 다중 조직 발현 어레이를 이용하여 인간 조직에서 H3 릴랙신의 발현 부위를 조사하였다. 상기 어레이는 나일론 막 상에 스포팅된 8개의 상이한 RNA 및 DNA를 포함하는 76개의 상이한 인간 조직으로부터 유래한 정규화된 폴리-ARNA(50-750 ng)를 함유하였다. 상기 어레이는 게놈 DNA로부터 생성된 H3 릴랙신 전사체의 3' 단부에서 유래하는32P-표지된 374 bp H3 릴랙신 특이성 유전자 단편으로 프로빙하였다. 이 DNA 단편은 스트랜드 둘 다에 대해 서열결정하였다. 비장, 흉선, 말초혈액 백혈구, 림프결절 및 고환에서 매우 약한 하이브리드화 신호가 관찰되었지만, 이들 신호는 거의 백그라운드와 구별할 수 없었으며, 따라서 데이타는 제시하지 않았다. 또한, RT-PCR은 H3 릴랙신 서열에 기초한 2개의 상이한 프라이머 조합을 이용하여 임신 초기의 인간 CL에 대해 수행하였다. PCR 조건을 변경한 후에도 어떤 PCR 반응에서 특이적인 밴드는 검출되지 않은 반면, H2 릴랙신 및 GAPDH에 대한 전사체는 용이하게 증폭되어(데이타는 제시하지 않음), cDNA의 완전성을 확인할 수 있었다.
마우스 뇌에서 릴랙신 mRNA의 분포
뇌에서 RT-PCR 및 노던 블롯팅에 의해 높은 레벨의 M3 릴랙신 mRNA 발현이 검출되면, 원위치 하이브리드화 조직화학을 이용하여 그의 분포를 추가 조사하였다(Burazin 등 (2001) J Neuroendocrinol. 13, 358-370). 다수의 특이적인35S-표지된 올리고뉴크레오티드 프로브를 이용하여 자성 C57BLK6J 마우스 뇌의 두미 영역(頭尾領域; rostrocaudal extent) 전체에서 M3 릴랙신 mRNA의 세포성 분포를 결정하였다. M3 릴랙신 mRNA는 뇌 핵 전체에서 광범위하게 검출되지는 않았지만, 뇌교/수질에서는 가장 강하게 검출되었다(도 7). M3 릴랙신 mRNA의 가장 강한 수준은 등쪽 피개 핵의 복측정중부에서 존재하였다. 또한, M3 릴랙신 mRNA는 낮은 수준이지만 해마 및 후관 영역에서 검출되었다. M3 릴랙신을 코딩하는 낮은 수준의 mRNA를 함유하는 뇌 영역은 본 연구에서는 검출되지 않았는데, 그 이유는 원위치 하이브리드화 조직화학과 관련된 감도 한계 때문이다. 뇌에서의 M3 릴랙신 mRNA의 분포는 M1 릴랙신 mRNA의 분포와 상이한데, 그 이유는 M1 릴랙신 mRNA는 등쪽 피개 핵의 복측정중부에서 검출되지 않았기 때문이다(데이타는 제시하지 않음).
실시예 6
인간, 마우스 및 래트에서 유래한 프로릴랙신 H3 cDNA 서열은 적합한 발현 전이 벡터를 이용하여 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에서 발현되었다. 이들 시스템은 적합한 포유류 숙주 세포, 기타 고등 진핵 세포(곤충 세포, 식물 세포 및 조류 세포를 포함함) 뿐만 아니라 박테리아 및 효소 발현 시스템을 포함한다. 또한, 이들 3개 서열의 융합 단백질 생성물은 숙주 세포의 특징적인 원핵 단백질 부분 또는 진핵 단백질 부분을 연결함으로써 생성된다. 융합 생성물은 단백질 생성물의 정제를 용이하게하여 융합 생성물이 후속적으로 제거될 수 있도록 한다. 또한, 모든 전이 벡터들은 코돈 치환/결실/첨가에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형으로 인해 B/C 및 C/A 연접부 변형을 보유하는 짧아진 C 펩티드 프로릴랙신을 산출하여 변형된 C 펩티드 서열의 제거를 용이하게 한다.
짧아진 C 펩티드 치환 및 B/C 및 C/A 연접부 변형을 이용하는 릴랙신 합성은 미국 특허 제5,759,807호에 기술되어 있으며, 이러한 방법들을 이용하여 H3 릴랙신을 합성할 수 있다.
본원 명세서 전체 및 후술하는 특허청구의 범위에서 특별히 언급하지 않으면"포함하다" 또는 "포함하는"이란 용어는 기술된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 의미로 이해해햐 하며, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 배제하는 의미로 사용한 것은 아님을 밝혀둔다.
본원의 종래 기술 부분에 인용한 참고문헌들은 단지 참고로 인용한 것일뿐이어서 어떤 사실인정이나 어떤 형태의 암시로 받아들여져는 아니된다는 점과 종래 기술은 오스트레일리아에서 통용되는 일반 지식을 형성함을 밝혀둔다.
SEQUENCE LISTING <110> Howard Florey Institute of Experimental Physiology and Medicine University of Melbourne <120> H3 Relaxin <130> 7640120/PAS <160> 10 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> H3-signal <400> 1 Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr 1 5 10 15 Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala 20 25 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> H3-B chain <400> 2 Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp 20 25 <210> 3 <211> 66 <212> PRT <213> H3-C chain <400> 3 Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly Asp Thr Phe Pro 1 5 10 15 Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu Leu Asp Glu Ala 20 25 30 Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser Pro Gln Ala Phe 35 40 45 Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly Val Leu Arg Gly 50 55 60 Ser Arg 65 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> H3-A chain <400> 4 Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser 1 5 10 15 Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys 20 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> H3-Prorelaxin <400> 5 Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile 20 25 30 Leu Ala His Glu Ala Met Gly Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp 35 40 45 Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu 50 55 60 Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro 65 70 75 80 Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu 85 90 95 Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu 100 105 110 Ile Ser Ser Leu Cys 115 <210> 6 <211> 3449 <212> DNA <213> human <400> 6 tataaatggg gggccaagag gcagcagaga cactggccca ctctcacgtt caaagcgtct 60 ccgtccagca tggccaggta catgctgctg ctgctcctgg cggtatgggt gctgaccggg 120 gagctgtggc cgggagctga ggcccgggca gcgccttacg gggtcaggct ttgcggccga 180 gaattcatcc gagcagtcat cttcacctgc gggggctccc ggtggagacg atcagacatc 240 ctggcccacg aggctatggg tgaggctggg gagagagtgg atgtagaagg ggaacaggtg 300 gctggatggg tcccaggagc taaggacaga gataagagga ggttgctgga ggaggagggt 360 ccctgtcctg ccacattcag ccagggacac ctgcccagcc ttgaaacaag ggctcaggag 420 ttagcagagc tgcagagctg ggatggggtg ttgcaagcca tccatggggg ctggaagtct 480 gaggacaggt gggggcgggg agcgtgccat ttgcaaagac aacaccgaag tgttttccaa 540 ccctttccag caggtaatgt gaagggtgtg gtatacacat agctgggttt gtcacctaat 600 gcatgacctc tccccagcaa gttggttttt cttccgtctc tgagtgtctt ttttttggag 660 atgtggtctc actccattgc ccaggcttga atgcagtggc ccaatcactg ctcattgcag 720 cctcgacctc ccaggctcaa gtgattctcc tgcctccgcc tccagagtag ttgagaccac 780 aggcacctga caccatgcct ggctagtttt aaattttttt tttgtagaaa caggggtctc 840 actatgttgc ctaggctggt ctcgaactcc tgggctcaag tgatcctccc acctcggcct 900 ccctaagtgc tgagattaga gtctctgagt gtctttatct tcaaatggga gacacagttc 960 ctgaatcttg caggattaag tggtatgatt aaatcaaaac agattagggc agagtctcag 1020 cagggcagcg gcacaatctg ggatccatca ggagagtcag agggaacaga agacctagct 1080 tcatgagggg cagggacctg gcaaatagat attcatgatg gtgagaagga ggataggtat 1140 gagcgtggac atagaagaca caccacttgg attcagatag tagctctaca atgtaatagt 1200 tgtgtgttca tgtgctacta tttttttttt ttttgagaca gaatctcatt ctgttgccca 1260 ggctggagtg cagtggtgca atcttggctc actgtaacct ccatcacctg ggttcaagcg 1320 attctcgtgc ctccagcctc ccaagtagct gggattacag atgtgtgcca ccatacctcg 1380 ctaatctttt tatttttagt agagacagtt tcaccatgtt ggccaggctg gtctccaact 1440 cctgacctca ggtgatcctc ccacctcagc ctcccaaagt gctgggatta caggcatgag 1500 ccaccgcgcc cagccatgca aattctttac tgagtcctgc ctcagtggtc tcctctggaa 1560 aatacgggtg ataactgcac ccacctcaac tggttatcac tgagaagaat aaagaagtta 1620 acctgctaaa gcacttaaaa cgttgtttga cacaaagtaa gtgatcaata aattattatt 1680 attattatta ttattattat tattattatt tttgagacag ggtcttgctc tgttgcccag 1740 actggagtgc agtggtgtga tcacagctca ctgcagcttc aacctcttgg gctcaagcaa 1800 ttctcctgcc tcagcctcct gagtagctgg gactacaggc ttgtgccaac atgtctaact 1860 ttttattatt tgtagagaca gggtagtgct gtgttgtcca ggctgttctt gaactcctgg 1920 ttctggtgat cctccagcat gtgcccctgg aagtgctggg attacaggtg tgagacaccg 1980 tgcccggact caatagtcat ttttgagtgc tcatcatgtt ccagacattg ttctaagttt 2040 ttttttttaa tgaatattaa ctccttataa aacttgagaa ggttggagta attatttttt 2100 tccactttgc agaaaagaac attgaggctc caagaagtaa atttacttgc tcacgattag 2160 agaagctgga ttcatgctca gtcagcccag ctcccaaatg taccaggtcc tcaattaata 2220 aagagtaagg agaaataaat gacagggctg ggtgcggtgg ctcacgcctg taatcccagc 2280 actttgggtg gctgaggtgg gcacatcact tgaggtcagg agtttgcgac cagcctgaac 2340 aacatggtga accccatctc tataacaata caaaaatcag ccaggcctgc tggcagacac 2400 ctgtaatccc acctactctg gcagagccag aatttgaacc caggactggg tggaataaaa 2460 actctgaact atgtctatga ctgttgtcac aagatcagag ctagactggc caggagccat 2520 gactgtgggt gcagcagcag ctgagccctg atcactaact ctgttcatct tttgcaggag 2580 ataccttccc ggatgcagat gctgatgaag acagtctggc aggcgagctg gatgaggcca 2640 tggggtccag cgagtggctg gccctgacca agtcacccca ggccttttac agggggcgac 2700 ccagctggca aggaacccct ggggttcttc ggggcagccg agatgtcctg gctggccttt 2760 ccagcagctg ctgcaagtgg gggtgtagca aaagtgaaat cagtagcctt tgctagtttg 2820 agggctgggc agccgtgggc accaggacca atgccccagt cctgccatcc actcaactag 2880 tgtctggctg ggcacctgtc tttcgagcct cacacattca ttcattcatc tacaagtcac 2940 agaggcactg tgggctcagg cacagtctcc cgacaccacc tatccaaccc tgccctttga 3000 ccagcctatc atgaccctgg cccctaagga agctgtgccc ctgcctggtc aagtggggac 3060 ccccccatcc tgacccctga cctctcccca gccctaacca tgcgtttgcc tggcctacac 3120 actccactgc cacaactggg tccctactct acctaggctg gccacacaga gacccctgcc 3180 cccttcccag tccaaactgt ggccattgtc ccctgaccag ctaaaatcaa gcctctgtct 3240 cagtccagcc tttgcacgca cgcttccttt gccctgcttt ccatcccctc tccctccaac 3300 tcccctgcca gagttccaag gctgtggacc ccagagaagg tggcaggtgg cccccctagg 3360 agagctctgg gcacattcga atcttcccaa actccaataa taaaaattcg aagactttgg 3420 cagagagtgt gtgtgtgtgt gtatggttg 3449 <210> 7 <211> 72 <212> DNA <213> A chain <400> 7 gatgtcctgg ctggcctttc cagcagctgc tgcaagtggg ggtgtagcaa aagtgaaatc 60 agtagccttt gc 72 <210> 8 <211> 81 <212> DNA <213> B chain <400> 8 cgggcagcgc cttacggggt caggctttgc ggccgagaat tcatccgagc agtcatcttc 60 acctgcgggg gctcccggtg g 81 <210> 9 <211> 198 <212> DNA <213> c chain <400> 9 agacgatcag acatcctggc ccacgaggct atgggagata ccttcccgga tgcagatgct 60 gatgaagaca gtctggcagg cgagctggat gaggccatgg ggtccagcga gtggctggcc 120 ctgaccaagt caccccaggc cttttacagg gggcgaccca gctggcaagg aacccctggg 180 gttcttcggg gcagccga 198 <210> 10 <211> 351 <212> DNA <213> cDNA <400> 10 cgggcagcgc cttacggggt caggctttgc ggccgagaat tcatccgagc agtcatcttc 60 acctgcgggg gctcccggtg gagacgatca gacatcctgg cccacgaggc tatgggagat 120 accttcccgg atgcagatgc tgatgaagac agtctggcag gcgagctgga tgaggccatg 180 gggtccagcg agtggctggc cctgaccaag tcaccccagg ccttttacag ggggcgaccc 240 agctggcaag gaacccctgg ggttcttcgg ggcagccgag atgtcctggc tggcctttcc 300 agcagctgct gcaagtgggg gtgtagcaaa agtgaaatca gtagcctttg c 351

Claims (44)

  1. 혈관 질환; 동맥 고혈압; 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환; 신장 질환; 정신 장애; 우울증 또는 우울 장애; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환; 학습, 주의력 및 동기부여 장애; 중독 장애; 운동 및 보행 장애; 면역 장애; 유방 장애; 자궁내막 장애; 내분비 장애; 지연 분만 및 자궁경관 숙화 장애의 치료, 및 태아 난산으로 인한 지연 분만; 동서맥; 탈모; 독두증(alopecia); 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 비롯한 수분 균형 장애; 또는 태반 기능부전의 예방 중 한 가지 이상의 치료 또는 예방 방법으로서, 치료 유효량의 인간 H3 릴랙신 또는 본 명세서에 정의된 이의 유사체를 선택적으로 1종 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 상기한 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, H3 릴랙신 또는 이의 유사체는 인간 H3 릴랙신, 인간 H3 프로릴랙신, 인간 H3 프리프로릴랙신, 또는 이들의 구성성분인 A 펩티드 사슬, B 펩티드 사슬 또는 C 펩티드 사슬인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 인간 H3 릴랙신 또는 인간 H3 릴랙신의 유사체는 A 사슬 및 B 사슬을 포함하며,
    상기 A 사슬은 하기 서열 번호 4의 아미노산 서열:
    또는 N-말단에서부터 약 9개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열을 가지며,
    상기 B 사슬은 하기 서열 번호 2의 아미노산 서열:
    또는 아미노 말단에서부터 9개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열 및/또는 카르복시 말단에서부터 약 5개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열을 가지며,
    상기 A 사슬 및 B 사슬은 A11-B10 및 A24-B22에서의 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체는 릴랙신 생물활성을 보유하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 인간 H3 릴랙신 유사체는 변형된 A 사슬 및/또는 변형된 B 사슬을 포함하며,
    상기 H3 릴랙신 A 사슬은 하기 서열 번호 4의 아미노산 서열:
    [상기 서열에서 카르복시 말단은 아미드 유도체이고/이거나, 12번 위치의 Lys은 Glu로 치환되고/되거나, 19번 위치의 Glu는 Gln으로 치환됨]을 가지며,
    상기 H3 릴랙신 B 사슬은 하기 서열 번호 2의 아미노산 서열:
    [상기 서열에서 카르복시 말단은 아미드 유도체이고/이거나, 2번 위치의 Ala은 Pro으로 치환되고/되거나, 8번 위치의 Arg은 Lys으로 치환됨]을 가지며,
    상기 A 사슬 및 B 사슬은 A11-B10 및 A24-B22에서의 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 인간 H3 릴랙신 유사체는 릴랙신 생물활성을 보유하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 동맥 고혈압의 치료 방법인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 관상동맥 질환, 말초 혈관 질환, 레이노드 현상을 비롯한 혈관경련, 중추 신경계 및 말초 신경계, 신장, 눈 및 기타 장기와 관련된 미세혈관 질환을 포함하는 혈관 질환의 치료 방법인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 혈관 질환, 간질성 섬유증, 사구체경화증, 또는 기타 신장 장애를 포함하는 신장 질환의 치료 방법인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 공황 발작, 광장공포증, 범불안장애, 공포증을 비롯한 불안 상태를 포함하는 정신 장애를 포함하는 섬유증의 치료 방법인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 주 우울증, 기분변조, 양극성 및 단극성 우울증을 포함하는 우울증 또는 우울 장애; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환(기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병 포함)의 치료 방법인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 투렛병, 충동, 반사회적 인격 장애, 및 정신분열증, 후천적 뇌 손상 및 전두엽 병변으로 인한 정신 이상 증상을 비롯한 부정적 정신 이상 증상을 포함하는 학습, 주의력 및 동기부여 장애의 치료 방법인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 약물, 알콜 및 니코틴 중독과 관련된 탈모증의 치료 방법인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병을 포함하는 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환의 치료 방법인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 파킨슨병, 헌팅턴병, 및 발작, 뇌 손상, 수술, 종양 또는 척수 손상 후의 운동신경 결함을 포함하는 운동 및 보행 장애의 치료 방법인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 폐, 심장 및 심혈관계, 신장 및 비뇨생식관, 위장계, 피부계, 류머티즘계 및 간담계의 섬유증을 포함하는 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환의 치료 방법인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 지연 분만, 자궁경관 숙화 장애의 치료 방법 및 태아 난산으로 인한 지연 분만의 예방 방법인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및 고환 장애를 포함하는 내분비 장애의 치료 방법인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 섬유낭포성 질환, 수유 장애 및 암을 포함하는 유방 장애의 치료 방법인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 면역결핍상태, 혈액 악성종양 및 세망내피 악성종양을 포함하는 면역 장애의 치료 방법인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 착상 장애로 인한 불임을 포함하는 자궁내막 장애의 치료 방법인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및 고환 장애를 포함하는 내분비 장애의 치료 방법인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 포함하는 수분 균형과 관련된 질환의 치료 방법인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 태반 기능부전의 치료 방법인 방법.
  23. 혈관 질환; 동맥 고혈압; 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환; 신장 질환; 정신 장애; 우울증 또는 우울 장애; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환; 학습, 주의력 및 동기부여 장애; 중독 장애; 운동 및 보행 장애; 면역 장애; 유방 장애; 자궁내막 장애; 내분비 장애; 지연 분만 및 자궁경관 숙화 장애의 치료, 및 태아 난산으로 인한 지연 분만; 동서맥; 탈모; 독두증; 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 비롯한 수분 균형 장애; 또는 태반 기능부전의 예방 중 한 가지 이상의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 사용되는 H3 릴랙신 또는 이의 유사체의 용도로서, 상기 치료 또는 예방은 치료 유효량의 인간 H3 릴랙신 또는 본 명세서에 정의된 이의 유사체를 선택적으로 1종 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 상기한 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 용도.
  24. 제23항에 있어서, H3 릴랙신 또는 이의 유사체는 인간 H3 릴랙신, 인간 H3 프로릴랙신, 인간 H3 프리프로릴랙신, 또는 이들의 구성성분인 A 펩티드 사슬, B 펩티드 사슬 또는 C 펩티드 사슬인 용도.
  25. 제25항에 있어서, 인간 H3 릴랙신 또는 인간 H3 릴랙신의 유사체는 A 사슬 및 B 사슬을 포함하며,
    상기 A 사슬은 하기 서열 번호 4의 아미노산 서열:
    또는 N-말단에서부터 약 9개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열을 가지며,
    상기 B 사슬은 하기 서열 번호 2의 아미노산 서열:
    또는 아미노 말단에서부터 9개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열 및/또는 카르복시 말단에서부터 약 5개 이하의 아미노산이 절두된 아미노산 서열을 가지며,
    상기 A 사슬 및 B 사슬은 A11-B10 및 A24-B22에서의 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 인간 H3 릴랙신 또는 이의 유사체는 릴랙신 생물활성을 보유하는 것인 용도.
  26. 제23항에 있어서, 인간 H3 릴랙신 유사체는 변형된 A 사슬 및/또는 변형된 B 사슬을 포함하며,
    상기 H3 릴랙신 A 사슬은 하기 서열 번호 4의 아미노산 서열:
    [상기 서열에서 카르복시 말단은 아미드 유도체이고/이거나, 12번 위치의 Lys은 Glu로 치환되고/되거나, 19번 위치의 Glu는 Gln으로 치환됨]을 가지며,
    상기 H3 릴랙신 B 사슬은 하기 서열 번호 2의 아미노산 서열:
    [상기 서열에서 카르복시 말단은 아미드 유도체이고/이거나, 2번 위치의 Ala은 Pro로 치환되고/되거나, 8번 위치의 Arg은 Lys으로 치환됨]을 가지며,
    상기 A 사슬 및 B 사슬은 A11-B10 및 A24-B22에서의 이황화 결합에 의해 연결되고, 상기 인간 H3 릴랙신 유사체는 릴랙신 생물활성을 보유하는 것인 용도.
  27. 제23항에 있어서, 동맥 고혈압의 치료에 사용되는 것인 용도.
  28. 제23항에 있어서, 관상동맥 질환, 말초 혈관 질환, 레이노드 현상을 비롯한 혈관경련, 중추 신경계 및 말초 신경계, 신장, 눈 및 기타 장기와 관련된 미세혈관 질환을 포함하는 혈관 질환의 치료에 사용되는 것인 용도.
  29. 제23항에 있어서, 혈관 질환, 간질성 섬유증, 사구체경화증, 또는 기타 신장 장애를 포함하는 신장 질환의 치료에 사용되는 것인 용도.
  30. 제23항에 있어서, 공황 발작, 광장공포증, 범불안장애, 공포증을 비롯한 불안 상태를 포함하는 정신 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  31. 제23항에 있어서, 주 우울증, 기분변조, 양극성 및 단극성 우울증을 포함하는 우울증 또는 우울 장애; 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환(기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병 포함)의 치료에 사용되는 것인 용도.
  32. 제23항에 있어서, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 투렛병, 충동, 반사회적 인격 장애, 및 정신분열증, 후천적 뇌 손상 및 전두엽 병변으로 인한 정신 이상 증상을 비롯한 부정적 정신 이상 증상을 포함하는 학습, 주의력 및 동기부여 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  33. 제23항에 있어서, 약물, 알콜 및 니코틴 중독과 관련된 탈모증의 치료에 사용되는 것인 용도.
  34. 제23항에 있어서, 기억 상실 또는 기타 기억 장애, 치매, 알츠하이머병을 포함하는 신경 질환 또는 신경퇴행성 질환의 치료에 사용되는 것인 용도.
  35. 제23항에 있어서, 파킨슨병, 헌팅턴병, 및 발작, 뇌 손상, 수술, 종양 또는 척수 손상 후의 운동신경 결함을 포함하는 운동 및 보행 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  36. 제23항에 있어서, 폐, 심장 및 심혈관계, 신장 및 비뇨생식관, 위장계, 피부계, 류머티즘계 및 간담계의 섬유증을 포함하는 콜라겐 또는 피브로넥틴의 비조절 또는 비정상적 형성과 관련된 질환의 치료에 사용되는 것인 용도.
  37. 제23항에 있어서, 지연 분만, 자궁경관 숙화 장애를 포함하는 태아 난산의치료 및 태아 난산으로 인한 지연 분만의 예방에 사용되는 것인 용도.
  38. 제23항에 있어서, 스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및 고환 장애를 포함하는 내분비 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  39. 제23항에 있어서, 섬유낭포성 질환, 수유 장애 및 암을 포함하는 유방 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  40. 제23항에 있어서, 면역결핍상태, 혈액 악성종양 및 세망내피 악성종양을 포함하는 면역 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  41. 제23항에 있어서, 착상 장애로 인한 불임을 포함하는 자궁내막 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  42. 제23항에 있어서, 스테로이드 또는 펩티드 호르몬 생성과 관련된 부신 장애, 난소 장애 및 고환 장애를 포함하는 내분비 장애의 치료에 사용되는 것인 용도.
  43. 제23항에 있어서, 손상된 또는 부적절한 바소프레신 분비를 포함하는 수분 균형과 관련된 질환의 치료에 사용되는 것인 용도.
  44. 제23항에 있어서, 태반 기능부전의 치료에 사용되는 것인 용도.
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