CN1990501B - 固相多肽合成缩宫素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相多肽合成缩宫素(又名催产素)的制备方法，包括如下步骤：以Rink Amide树脂(包括Rink Amide MBHA树脂、RinkAmide AM树脂)为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU或HBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品，加入碱性物质，在pH为7.5-10.0的条件下通空气氧化或用双氧水进行氧化，获得氧化型粗品，最后采用C18或C8柱进行分离纯化，获得目标产物。本发明的方法，生产成本低，工艺简单，环境污染低，收率高，便于工业化实施。
Description
技术领域
本发明涉及缩宫素的制备方法，具体涉及固相多肽合成缩宫素的制备方法。
背景技术
缩宫素，又称催产素，英文名为Oxytocin，结构式：
分子式为：C43H66N12O12S2，分子量为1007.2。
缩宫素为多肽类激素子宫收缩药。具有如下的功能：
(1)刺激子宫平滑肌收缩，模拟正常分娩的子宫收缩作用，导致子宫颈扩张，子宫对缩宫素的反应在妊娠过程中逐渐增加，足月时达高峰。(2)刺激乳腺的平滑肌收缩，有助于乳汁自乳房排出，但并不增加乳腺的乳汁分泌量。肌内注射后3～5分钟起效，作用持续30～60分钟；静脉滴注立即起效，15～60分钟内子宫收缩的频率与强度逐渐增加，然后稳定：滴注完毕后20分钟，其效应渐减退。T1/2一般为1～6分钟。本品经肝、肾代谢，经肾排泄，极少量是原形物。临床用于引产、催产、产后及流产后因宫缩无力或缩复不良而引起的子宫出血。
缩宫素最早由中国科学院上海生物化学研究所研发，目前的缩宫素的制备方法均为液相合成法，采用苄氧羰酰(Cbz)路线，如文献Bodansky M.and du Vigneand V.：J.Amer.Chem.Soc.，81，5688(1959)公开的方法，也有报导采用固相合成Boc路线，如文献“生物化学与生物物理学报，1976年6月，第8卷，第2期，第121-128页”公开的方法，该方法以Boc-Gly-氯甲基树脂为起始原料，依次接上Boc-Leu、Boc-Pro、Boc-Cys(Bzl)、Boc-Asn、 Boc-Gln、Boc-Ile、Boc-Tyr(Bzl)、Boc-Cys(Bzl)，再经氨解、钠氨、氧化等反应制得缩宫素。由于该工艺三废较严重，收率也较低，反应时间长，不具备规模生产能力，工艺复杂，成本高，环境污染严重，质量较差，不能满足临床的需要。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相多肽合成缩宫素的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤：
以Rink Amide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU或HBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；
然后加入切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀，获得还原型粗品；
加入碱性物质，在pH为7.5-10.0的条件下通入空气、双氧水或DMSO氧化，获得氧化型粗品；
最后采用C18柱进行分离纯化，获得目标产物。
按照本发明优选的方案：
以Rink Amide树脂，包括Rink Amide MBHA树脂或Rink AmideAM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU或HBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸的方法包括如下步骤：
(1)Rink Amide树脂的预处理：
将Rink Amide树脂(0.93mmol/g)用DMF浸泡10～60分钟，使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃反应10～60分钟，氮气吹去六氢吡啶，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干，获得(A)；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为10～50％；
六氢吡啶的DMF溶液中，Rink Amide树脂的重量浓度为5～20％；
(2)Fmoc-Gly-树脂的制备：
将步骤(1)的(A)加入Fmoc-Gly-OH(MW：297.3)、TBTU或HBTU(MW：321)、HOBT(MW：153.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，(A)的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
(3)Fmoc-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(2)的Fmoc-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干，加入Fmoc-Leu-OH(MW：353.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干，获得Fmoc-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，Fmoc-Leu-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中，步骤(2)的Fmoc-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(4)Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(3)的Fmoc-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮 气吹干，加入Fmoc-Pro-OH(MW：337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，步骤(3)的Fmoc-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(5)Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(4)的Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW：585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，步骤(4)的Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为 5～15ml/g；
(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干，
加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW：596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，步骤(5)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。
加入Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW：610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，步骤(6)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Gln(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(8)Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。
加入Fmoc-Ile-OH(FW：353.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，步骤(7)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Ile-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(8)的Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加 入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。
加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW：403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro--Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，步骤(8)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Il e-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，15～45℃脱帽反应10～60分钟，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW：585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反应0.5～5小时，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；
NMM和DMF中，步骤(9)的树脂重量体积浓度为5～15ml/g， Fmoc-Cys(Trt)-OH摩尔数为树脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍；NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中
Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
按照本发明优选的方案，加入切肽试剂进行切肽包括如下步骤：
将上述保护的9肽树脂加入切肽试剂：(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，15～35℃反应1.5～5小时，过滤，滤液加乙醚沉淀，获得还原型粗品；
保护的9肽树脂在切肽试剂中的重量体积比为5～20ml/g；
按照本发明优选的方案，还原型粗品氧化(二硫键的形成)的方法包括如下步骤：
将还原型粗品溶于水中，在搅拌下缓慢加入0.5～1.5mol/L的氨水或NaOH或KOH，调节pH至7.5-10.0，通入空气、双氧水氧化或DMSO等氧化剂，于10-50℃搅拌氧化至还原型消失，过滤，收集滤液；
按照本发明优选的方案，纯化包括如下步骤：
滤液经C18或C8柱柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1，体积比)；流速为：100-650ml/min；检测波长为：280nm；用HPLC跟踪收集所需要的流出液，然后采用常规的方法冻干，获得目标产物。总收率约为：27％。
由上述公开的技术方案可见，本发明的方法，采用RinkAmide树脂(包括Rink Amide MBHA树脂、Rink AmideAM树脂)为起始原料，每步接肽收率≥99％，简化了工艺，降低了生产成本，采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS)进行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用剧毒 的氟化氢，三废污染少，切肽收率高达92％，采用弱碱性氧化(pH7.5-10.0)的方法，氧化收率高，反应时间短，采用C18(或C8)柱进行分离纯化，避免使用三氟乙酸，减少三废，纯化收率高达40％，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率为：92％，分离纯化收率为：25％，总收率约为：21％。由此可见，本发明的方法生产成本低，工艺简单，收率高，便于工业化实施。
具体实施方式
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下：
| No | 品名 | 生产厂商 |
| 1 | Fmoc-Gly-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 2 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 3 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 4 | Fmoc-Ile-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 5 | Fmoc-Gln(Trt)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 6 | Fmoc-Asn(Trt)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 7 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 8 | Fmoc-Pro-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 9 | Fmoc-Leu-OH | 四川三高生化股份有限公司 |
| 10 | Rink Amide树脂 | 天津和成科技有限公司 |
| 11 | 1-羟基苯并三氮唑(HOBt) | 四川三高生化股份有限公司 |
| 12 | TBTU | 四川三高生化股份有限公司 |
| 13 | 三氟乙酸(TFA) | Merck公司 |
| 14 | 三异丙基硅烷(TIS) | Merck公司 |
| 15 | 乙二硫醇(EDT) | Merck公司 |
| 16 | N-甲基吗啡啉(NMM) | 上海科帆公司 |
| 17 | 二甲基甲酰胺(DMF) | 上海化学试剂公司 |
| 18 | 无水甲醇(MeOH) | 上海振兴化工一厂 |
| 19 | 六氢吡啶(PIP) | 上海化学试剂公司 |
实施例1
肽链制备：
溶胀和脱帽：
称取Rink Amide树脂50克(200目，0.93mmol/g，46.5mmol)，用800mlDMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，氮气吹干。加入800毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹滤去六氢吡啶，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Gly-树脂的制备：
加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，186mmol)55.3g，TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBT(MW：153.1，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加Fmoc-Leu-OH(MW：353.4，186mmol)65.7g，TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBt(MW：153.1，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，186mmol)62.8g，TBTU或HBTU(MW：321， 186mmol)59.7g，HOBT(MW：153.1，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400ml DMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加108.9g(585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBT(MW：153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加111.0g(596.7，186mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBT(MW：153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加113.6g(610.7，186mmol)Fmoc-Gln(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBT(MW：153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分 钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加65.7g(FW：353.4，186mmol)Fmoc-Ile-OH，TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBT(MW：153，186mmol)32.7g，NMM41.4ml(MW＝101.2)，400mlDME将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加75.0g(403.4，186mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBT(MW：153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
加入500毫升重量浓度为20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加108.9g(FW：585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH，TBTU或HBTU(MW：321，186mmol)59.7g，HOBT(MW：153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护9肽树脂。
切肽：
保护的9肽树脂转移到切肽瓶中，冷却下，边搅拌边加入切肽试剂：(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，25℃搅拌2小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀。
氧化(二硫键的形成)：
将还原型缩宫素粗品溶于纯化水中，在搅拌下缓慢加入1mol/L氨水，调节PH至8，通入空气或双氧水，搅拌过夜，采用HPLC跟踪反应进程，至还原型缩宫素消失，过滤，获得氧化型缩宫素粗品溶液；
纯化：
滤液经C18柱(10×30cm)纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1，体积比)；流速为：300ml/min；检测波长为：280nm；用HPLC跟踪收集所需要的流出液，然后冻干，获得12.5g目标产物，总收率约为：27％。
Claims (6)
1.一种固相多肽合成缩宫素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以Rink Amide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸；
然后加入切肽试剂进行切肽，切肽试剂为TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml，切肽试剂用量为5～20ml/g，于15～35℃反应1.5～5小时，过滤，滤液加入乙醚沉淀，获得还原型粗品；
加入碱性物质，在pH为7.5-10.0的条件下用双氧水进行氧化，获得氧化型粗品；
最后采用C18柱进行分离纯化，流动相为0.1MNH4Ac或磷酸缓冲液∶乙腈＝9∶1，指体积比；流速为：100-650ml/min；检测波长为：280nm；用HPLC跟踪收集所需要的流出液，然后采用常规的方法冻干，获得目标产物，以Rink Amide树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以TBTU/HOBt为缩合剂，依次逐个接上氨基酸的方法包括如下步骤：
(1)树脂的预处理：
将Rink Amide树脂用DMF浸泡10～60分钟，使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～60分钟，氮气吹去六氢吡啶，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为15～25％；
六氢吡啶的DMF溶液中，Rink Amide树脂的重量浓度为5～15ml/g；
(2)Fmoc-Gly-树脂的制备：
将步骤(1)的预处理的树脂加入Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(1)的预处理的树脂的重量体积浓度为5～15 ml/g，Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，步骤(1)的预处理的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(3)Fmoc-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(2)的Fmoc-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
加入Fmoc-Leu-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，Fmoc-Leu-OH的重量体积浓度为5～15ml/g；
六氢吡啶的DMF溶液中，步骤(2)的Fmoc-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(4)Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(3)的Fmoc-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
加入Fmoc-Pro-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(3)的Fmoc-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(5)Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(4)的Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(4)的Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
加入Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；然后获得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(5)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，Fmoc-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(6)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g， Fmoc-Gln(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(8)Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
加入Fmoc-Ile-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(7)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Ile-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(8)的Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干。
加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF。接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(8)的树脂的重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中
Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g：
(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的制备：
将步骤(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂加入六氢吡啶的DMF溶液，脱帽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反应，氮气吹干，分别用DMF、甲醇、DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂；
NMM和DMF中，步骤(9)的树脂重量体积浓度为5～15ml/g，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中
Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-树脂的重量体积浓度为5～15ml/g；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接肽反应温度为15～40℃，时间为0.5～5小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，脱帽反应温度为15～45℃，时间为10～60分钟。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，NMM和DMF中，TBTU的摩尔数为树脂的1～6倍；，HOBT的摩尔数为树脂的1～6倍，NMM的摩尔数为树脂的2～12倍；六氢吡啶的DMF溶液的重量浓度为10～50％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还原型粗品氧化的方法 包括如下步骤：将还原型粗品溶于水中，在搅拌下加入0.5～1.5mol/L的氨水，调节pH至5.0-10.0，双氧水氧化，过滤，收集滤液。
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