JPH0411886A - ラット多機能プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、多機能プロテアーゼ、より詳しくは新規な細
胞内プロテアーゼとしての多機能プロテアーゼのコンポ
ーネントに関する。

従来の技術 多機能プロテアーゼは不活性型で細胞内に局在する高分
子量のプロテアーゼであり、酵母からヒトに至るまで広
く存在している（特開平１−３０９６８６号）。該酵素
はトリプシン型酵素の基質である塩基性アミノ酸、キモ
トリプシン型酵素の基質である中性アミノ酸、そしてプ
ロテアーゼ基質としては稀な酸性アミノ酸を含む合成ペ
プチドのカルボキシ末端のペプチド結合を切断する活性
を同一分子内に持っている。さらに種々の阻害剤に対す
る反応性の違いから、これらの基質が互いに異なった複
数の触媒活性部位によって分解されていると推定されて
いる。

ラット肝臓プロテアーゼの分子量は約７５万と推定され
、プロテアーゼとしては例外的に大きい、該多機能プロ
テアーゼを電子顕微鏡観察により、その分子は環状型粒
子構造を有していると認められた。さらに該酵素をドデ
シル硫酸ナトリウム存右下で電気泳動すると分子量が２
．２〜３．２万の位置に８〜１０本の染色バンドが観察
された。

その後、ラットから褥られた多機能プロテアーゼは少な
くとも１３個のコンポーネントよりなっていると考えら
れ、この内、比較的大きなコンポーネントの一つである
Ｃ２の一次構造が明らかになった（Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓ
ｔｒ７．２８　（１８）　、　　７３３２〜７３４０．
１９８９）。

かかる多機能プロテアーゼは、非リソシーム系蛋白質分
解経路に関与する酵素と推定されており、細胞質全蛋白
質の約１％を占めるほど多量に存在すること等、その生
物学的重要性が強く指摘されている。しかし、本酵素を
構成する個々のコンポーネントの詳細については明らか
になっていない。

発明が解決しようとする課題 本発明は、新規な多機能プロテアーゼ、すなわち、ラッ
トの多機能プロテアーゼの各構成成分の内、Ｃ３、Ｃ５
、Ｃ８、及びＣ９を提供するものである。さらにこれら
のコンポーネントを明らかにすることにより、該酵素の
機能の解明に役立つのみならず、各種病態との係わり、
及び治療法を解明する技術が提供される。

課題を解決するための手段 本発明者等はラット多機能プロテアーゼについて鋭意研
究を重ねてきた結果、ラット多機能プロテアーゼのコン
ポーネントの内、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ８及びＣ９のポリペプ
チドをコードする遺伝子を単離し、そのアミノ酸配列を
明らかにすることに成功した。

本明細書において、アミノ酸、ペプチドはＩＵＰＡＣ−
ＩＵＢ−生化学命名委員会で採用された略記法により表
示され、例えば下記の略号が使用される。なお、アミノ
酸等に関して光学異性体があり得る場合は、特に明示し
なければＬ体を示すものとする。

Ｇｌｎ：グルタミン残基 Ａｓｐ：アスパラギン酸残基 Ｐｒｏニブロリン残基 Ｔ７ｒ：チロシン残基 Ｖａｌ：バリン残基 Ｌ７ｇ＋リジン残基 Ｇｌｕ：グルタミン酸残基 Ａｌａ：アラニン残基 Ａｓｎ：アスパラギン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基 ＧＩ７：グリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｓｅｒ：セリン残基− Ｔｈｒ：スレオニン残基 １１ξ：イソロイシン残基 Ｔｒｐ：　）リプトファン残基 Ａｒｇ：アルギニン残基 Ｍｅｔ：メチオニン残基 Ｃ７ｓコシステイン残基 また、ポリデオキシリボヌクレオチド及びオリゴヌクレ
オチドは下記の略号で表されるデオキシリボヌクレオチ
ドの配列により表記する。

Ａ：２′−デオキシアデニル残基 Ｃ：２′−デオキシシチジル残基 Ｇ：２′−デオキシグアニル残基 Ｔ：チミジル残基 特にことわらない限り、デオキシリボヌクレオチド配列
の左端は５′端である。

本発明によれば、次式（１） ％式％ Ｈｉｓ−１１ｅ−ＧＩ７−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−３
ｅｒ−Ｇ！ｙ−Ｍｅｆ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−７７
ｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ−旧ｓ−Ａｒｇ
−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｎ−Ｔ７ｒ−Ｔ７ｒ−Ｌｓｕ−Ｖａ　Ｉ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｇ１７−Ｇ１７−
Ｖａｌ−Ａｔｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇ１７−Ｖａｌ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃ７ｓ−Ｇ１７−Ｔｒ
ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇ１７−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔ７ｒ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌｉ−Ｔ７ｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔ
ｒｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇ１
７−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇ１７
−Ｌ７ｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌ７ｓ−
Ａｒｇ−Ｔ７ｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｈｉ
ｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｅｕ−ｔｈｒ−Ｌｅｕ
−１４ｓ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｐｈｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｍｅｊ−Ｔｈｒ−ＧＩＩＩ−Ａｇｐ−Ａｇｎ−
Ｊｌｓ−Ｇｌｕ−ＶａｉＧｌｙ−１１ｅ−Ｃ７ｓ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−ＧＩＹ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒ、
ｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａ　
Ｉ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−ＴＹｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ
−１１ｅ−Ａｌａ で表されるアミノ酸配列を有するラット多機能プロテア
ーゼのコンポーネントＣ３が提供される。

さらに、次式（２） ％式％ で表されるアミノ酸配列を有するラット多機能プロテア
ーゼのコンポーネントＣ５が提供される。

さらにまた、次式（３） ％式％ Ａｓｐ−＾ｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｍｓｊで表されるア
ミノ酸配列を有するラット多機能プロテアーゼのコンポ
ーネントＣ８が提供される。

さらにまた、次式（４） ％式％ で表されるアミノ酸配列を有するラット多機能プロテア
ーゼのコンポーネントＣ９が提供される。

本発明のラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ
３、Ｃ５、Ｃ８及びＣ９はまた上記のアミノ酸配列のＮ
末端にメチオニンが結合していないポリペプチド、およ
び上記アミノ酸配列のＮ末端にラット多機能プロテアー
ゼのコンポーネントＣ３のためのシグナルペプチドの部
分もしくは全部が結合、または欠損した中間体も包含す
る。自然の変異により、または人工の変異によりポリペ
プチドの主たる活性に変化を与えることなく、ポリペプ
チドをコードするＤＮＡの構造の一部を変化させること
が可能である。本発明のラット多機能プロテアーゼのコ
ンポーネントＣ３、Ｃ５、Ｃ８又はＣ９のポリペプチド
は、前記アミノ酸配列を有する相同変異体に相当する構
造を有するポリペプチドも包含する。

本発明のもう一つの態様によれば、式（１）で表される
アミノ酸配列を有するラット多機能プロテアーゼのコン
ポーネントＣ３をコードする次式（５）で表される塩基
配列を有するデオキシリボ核酸が提供される。

式（５） ％式％ ＧＡＣＴＴＡ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＧＡ
Ｔ　　ＧＣＧ　　ＡＴＴ　　ＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣ
ＴＴＡ　　ＡＣＣＣＴＴ　ＡＡＧ　　ＧＡＡ　ＡＧＣＴ
ＴＴ　　ＧＡＡＧＧＧ　　ＣＡＧ　　ＡＴＧ　　ＡＣＡ
　　ＧＡＡ　　ＧＡＴ　　ＡＡＣＡＴＡ　　ＧＡＡ　　
ＧＴＴＧＧＧ　ＡＴＣＴＧＣＡＡＴ　ＧＡＡ　　ＧＣＴ
　ＧＧＣＴＴＴ　ＡＧＧ　ＡＧＧＣＴＣＡＣＣＣＣＡ　
ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＡＧＧ　ＧＡＴ　ＴＡＣＴＴ
ＧＧＣＴ　　ＧＣＴ　　ＡＴＡ　　ＧＣＧ本発明のもう
一つの態様によれば、式（２）で表されるアミノ酸配列
を有するラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ
５をコードする次式（６）で表さ−れる塩基配列を有す
るデオキシリボ核酸が提供される。

式（６） ％式％ 本発明のもう一つの態様によれば、式（３）で表される
アミノ酸配列を有するラット多機能プロテアーゼのコン
ポーネントＣ８をコードする次式（７）で表される塩基
配列を有するデオキシリボ核酸が提供される。

式（７） ％式％ 本発明のもう一つの態様によれば、式（４）で表される
アミノ酸配列を有するラット多機能プロテアーゼのコン
ポーネントｃ９をコードする次式（８）で表される塩基
配列を有するデオキシリボ核酸が提供される。

式（８） ％式％ および該塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選
ばれる少なくとも一つの塩基配列を含有するデオキシリ
ボ核酸が提供される。

本発明のラット　プロテアソームのコンポーネントは、
これを用いることにより該酵素の機能の解明に役立つの
みならず、各種病態との係わり、及び治療法を解明する
技術が提供される。

最近、アルツハイマー病患者の脳内にはユビキチンが異
常蓄積し、少なくともこの疾患の原因の一つに細胞内に
おける蛋白質分解系の異常があることの可能性が示唆さ
れた。また、この疾患の発現にかかわる遺伝子の機能ド
メインにはプロテアーゼ阻害剤がコードされていること
も判明し、非すソソーム系に関与すると考えられるプロ
テアソームがアルツハイマー病に本質的に関係している
ことが考えられる。従って、本発明のラット　プロテア
ソームのコンポーネントは、その機能及びその阻害メカ
ニズムの解明により、アルツノ１イマー病と本酵素との
関係や異常の生じるメカニズムのラットにおける研究に
有用である。

さらに本発明者らの研究によれば、乳癌細胞や白血病細
胞等の腫瘍細胞の核にプロテアソームが異常蓄積、さら
にこれらの腫瘍細胞でのプロテアソーム遺伝子発現の異
常昂進が観察されている。

本発明のラット　プロテアソームのコンポーネントの使
用或いはその測定法の開発は、これらの病態と本酵素と
の関わりのラットにおける研究、診断及び／又は治療法
の開発に有用である。かかる測定には、例えば通常の免
疫測定法が使用でき、本発明のコンポーネントは該測定
に使用する抗体の抗原として用い得る。

本発明のＤＮＡは、ラット肝臓細胞や株化培養細胞によ
って成熟ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ
３、Ｃ５、Ｃ８およびＣ９を生産するために、前記式（
４）、（５）、および（６）の５′末端にＡＴＧが結合
した塩基配列からなるＤＮＡを包含する。本発明のＤＮ
Ａはまた、ラット多機能プロテアーゼのコンポーネント
Ｃ３、Ｃ５、Ｃ８およびＣ９のシグナルペプチドの部分
または全部をコードする５′−フランキングＤＮＡを含
むＤＮＡも包含する。

自然の変異により、または人工的変異により、主たる活
性に変化を与えることなく、ＤＮＡの構造及びそれから
演鐸されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめるこ
とが可能である。従って本発明のＤＮＡは、前述のすべ
てのポリペプチドの相同異性体に相当する構造を有する
ポリペプチドをコードする塩基配列を含有することも可
能である。

遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から生産されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子の塩基
配列の少なくとも一つの塩基を他の種類の塩基に置換す
ることができる。従って、本発明のＤＮＡはまた、遺伝
暗号の縮重に基づく置換によって変化された塩基配列を
含有することも可能である。この場合、上記置換により
得られた塩基配列より演鐸されるアミノ酸配列は前記に
定義した式（１）、（２）、（３）、または（４）のア
ミノ酸配列と一致する。

本発明のラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ
３、Ｃ５、Ｃ８及びＣ９の特性を有するポリペプチドを
得る方法、及び該ポリペプチドをコードする遺伝子を得
る方法の概要について説明すると以下の通りである。

蛋白質の解析 ラット多機能プロテアーゼは日中等の方法（Ｔａｎａｋ
ａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、。

２６１．１５１９７〜１５２０３，１９８６：Ｔａｎａ
ｋａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｏ＋、、　２６３゜１６２０９〜１６２１７．１９８
８）に従ってラット肝臓から、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて単一に精製した。

次いで、上記方法によって精製したラット多機能プロテ
アーゼのコンポーネントの分離は藤原等の方法（Ｆｕｊ
ｉｖａｒａ、Ｔ、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｔｔ
ｒｉｓｔｒｙ１２８　（１８）、７３３２〜７３４０．
１９８９）に従って、精製したラット多機能プロテアー
ゼをコスモシル５Ｃ４３００カラムを用いて分離精製し
た。この結果、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）上で１０個
の主要なコンポーネントが確認された。得られたコンポ
ーネントに０１〜Ｃ１０まで番号を付した。ここでＣ３
はアセトニトリル濃度が４８％付近に溶出し、Ｃ５は５
０％付近、Ｃ８は５２％付近、Ｃ９は５３％付近に溶出
してきた。これらの物質を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分子
量を測定した結果、コンポーネントＣ３は２５．８００
±７００であり、Ｃ５は ２６．５００±７００、Ｃ８は２８，８００±５００、
Ｃ９は２８，７００±７００であった。

得られたコンポーネントはＡ　ｋｅｔａｇａｖａ等の方
法（Ａｋｅｔａｇａｗａ、　　Ｊ、、ｅｔ　　ａｌ、、
Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２６１．７３５７〜７３６５．１９８６）に従って、Ｓ
−ピリジルエチル化を行った。Ｓ−ピリジルエチル化し
た蛋白質は酵素（リジル・エンドペプチダーゼ）１に対
して基質４０の割合で、２Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で３７℃、１２時間反応
させた。次いでこれをケムコソルブ　７−ＯＤＳ−Ｈカ
ラムに付加し、０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトリルの濃度勾配によって分離した。蛋白とベブタイ
ドは６Ｎ塩酸で減圧下、１１０”Ｃｌ２Ｏ時間加水分解
し、この加水分解物をＰ　Ｉ　Ｃ０−ＴＡＧシステムを
用いてフェニルチオカルバミル法によって解析を行った
。ペブタイドのアミノ酸配列はガス相シークエンサーで
測定し、フェニルチオヒダントイン誘導体はアプライド
・バイオシステムズ　１２０Ａフ工ニルチオヒダントイ
ン分析機により同定した。

プローブの調製 上記の解析によって得られた情報をもとに遺伝子の検索
に必要なプローブ用のベブタイドを１コンポーネントに
対して２〜５個を選択し、これに対応する相補的ポリヌ
クレオチドを合成した。Ｃ３については２個のフラグメ
ントＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ
　、及びＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓを選択し、これに対応する相補的オリゴヌ
クレオチドプローブとして、５’　−ＧＴＣＡＴＹＴＧ
ＮＣＣＹＴＣＲＡＡ−３′、および５’−ＴＴＧＣＣＲ
ＴＴＮＡＣＲＴＡＲＴＴＴＴＴ−３’を合成した。Ｃ５
についそは３個のフラグメントＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ
−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　、　Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｙを選択した。これに対する相補的オリゴヌク
レオチドプローブとして、５′−ＡＣＲＴＴＹＴＧＣＡ
ＴＲＴＴＹＴＴ−３’　、５’−ＣＣＮＡＣＹＴＧＲＴ
ＴＲＴＣ−３、および５’−ＣＣＲＴＴＲＡＡＮＧＣＲ
ＴＡ−：４’を合成した。Ｃ８は３個のフラグメントＬ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ　。

Ｈｉｓ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｔ及び
Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａを選
択した。これに対応する相補的オリゴヌクレオチドプロ
ーブとして５’　−ＣＫＲＣＡＲＧＴＣＡＴＹＴＣＹＴ
Ｔ−３’　、５’、−ＡＣＮＧＣＣＡＴＮＣＣ３ＡＣＡ
ＴＧ−３’　、５’−ＡＣＮＧＣＣＡＴＮ（ｌ′ＣＹＡ
ＣＡＴＧ−３′、５′−ＧＣＲＴＧＮＡＣＲＴＡＣＡＴ
ＳＧＣ−３′及び５’−ＧＣＲＴＧＮＡＣＲＴＡＣＡＴ
ＷＧＣ−３’を合成した。Ｃ９は２個のフラグメントＴ
ｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　。

及びＡｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓ
を選択し、これに対応する相補的オリゴヌクレオチドプ
ローブとして５’−ＴＴＲＴＣＣＣＡＮＣＣＤＡＴＲＴ
Ａ−３’　、及び５’−ＣＡＮＧＣＣＡＴＲＴＣＹＴＣ
ＲＴＴ−３’を合成した（但し、Ｎ＝ＡＳＧＳＴ又はＣ
５Ｄ＝ＡＳＧ又はＴ、、Ｙ＝Ｔ又はＣ５Ｋ＝Ｇ又はＴ、
Ｓ＝Ｇ又はＣ，Ｒ＝Ａ又はＧ及びＷ＝Ａ又はＴ）。使用
するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位置の
アミノ酸配列に基づくものであっても良い。

ｃＤＮＡライブラリーの構築 ラット胎児肝臓、または正常ラット肝臓より１０倍以上
ｍＲＮＡの発現量が高いＲｅｕｂｅｒＨ４ＴＧヘパトー
マ細胞系にグアニジンチオシアネート溶液を加えてホモ
ジナイズし、塩化セシウム密度勾配遠心法によって全Ｒ
ＮＡを得た。

この全ＲＮＡからオリゴｄＴセルロースカラムによりポ
リ（Ａ）”　ＲＮＡを選別した後、５′端に制限酵素Ｎ
ｏｔＩ切断部位を持つオリゴｄＴブライマーをｍＲＮＡ
のポリＡにアニールさせ、逆転写酵素により１本鎖ｃＤ
ＮＡを合成し、ＤＮＡポリメラーゼエにより２本鎖ｃＤ
ＮＡを合成した。

このｃＤＮＡをＮｏｔＩ切断後、発現ベクターＢｌｅｕ
ｓｃｒｉｐｔ　　ＫＳ　（ストラタジーン社製）ノクロ
ーニンク部位’（７）ＥＣＯＲＶとＮｏｔＩに挿入した
。これらの方法の詳細についてはＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、２８．７３３２．　（１９８９）に記載されてい
る。

クローンの単離と塩基配列の決定 クローニングは得られたベプタイドの情報より、相補的
オリゴヌクレオチドを合成し、その５′端を標識化しプ
ローブとして使用した。Ｃ３は上記ライブラリーを使用
して１８０．０００のトランスフォーマントから、最終
的に２４のクローンが得られ、さらにＣ５は３０．００
０のトランスフォーマントから１１のクローンが得られ
た。Ｃ８は１１０，０００のトランスフォーマントから
８のクローンが得られ、またＣ９は同様に３０．０００
のトランスフォーマントから１０のクローンが得られた
。得られた各々のクローンの中から最も長いクローンを
選択して全塩基配列を決定した。

得られたＤＮＡの塩基配列は７−ＤＥＡＺＡシークエン
シング・キット（宝酒造社製）を用いてジデオキシ法（
Ｓａｎｇｅｒ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、７４，５４６３．１９７
７）に従って決定した。

Ｃ３のヌクレオチド配列は非コード領域の５′端から３
′端を含めて８５２ヌクレオチド残基を決定した。この
内コード領域は７０２ヌクレオチド残基であり、アミノ
酸残基数２３４個に相当した。この値から分子量を求め
ると２５，９２５ダルトンと算出された。

Ｃ５については非コード領域を含めて７９９残基のヌク
レオチド配列を有し、コード領域は７２０ヌクレオチド
残基よりなっていた。これは２４０残基のアミノ酸より
なる蛋白質であり、その分子量は２６，４７９ダルトン
と算出された。

Ｃ８については非コード領域を含めて８９７残基のヌク
レオチド配列を決定した。この内コード領域は７６５ヌ
クレオチド残基であり、これは２５５残基のアミノ酸に
相当した。この値から分子量を求めると２８，４００ダ
ルトンと算出された。

Ｃ９は非コード領域５′端から３′端まで１１２１ヌク
レオチド残基よりなり、コード領域は７８３ヌクレオチ
ド残基であった。これはアミノ酸２６１−残基に相当し
、これより算出されるＣ９の分子量は２９，４９６ダル
トンであった。

実施例 以下具体例に沿って本発明のラット多機能プロテアーゼ
のコンポーネントＣ３、Ｃ５、Ｃ８及びＣ９の遺伝子を
含む塩基配列を得る方法、本発明の蛋白質のアミノ酸配
列、及びＤＮＡ塩基配列を決定する方法について述べる
が、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない
。

実施例１ （１）ラット多機能プロテアーゼのコンポーネン）Ｃ３
の精製 ラット多機能プロテアーゼは日中等によって報告されて
いる方法（Ｔａｎａｋａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１．１５１９７〜１５２０
３゜１９８６　：　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　
２６３゜１６２０９〜１６２１７．１９８８）に従って
ラットの肝臓より精製した。

ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ３は藤原
等の方法（Ｆｕｊｉｗａｒａ、Ｔ、、ｅｔ　　ａｌ、。

ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒＬ２８　（１８）　、　　７３
３２〜７３４０．１９８９）に従って精製した。即ち、
上記の方法によって得られたラット多機能プロテアーゼ
を０．０５％トリフルオロ酢酸で平衡化したコスモシル
５Ｃ４３００カラム（１０Ｘ２５０關、ナカライ　テス
ク社製）に付加した。

次いで０．０５％トリフルオロ酢酸を含む４５〜６０％
のアセトニトリルで直線濃度勾配により溶出した。溶出
速度はＩＩＩＩＱ／ｗｉｎで１或づつ分取した。

この方法によってラット多機能プロテアーゼのコンポー
ネントＣ３はアセトニトリル濃度が４８％の位置に溶出
された。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＣ３の分子量は２５，
８００±７００であった。

（２）蛋白質の解析 ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ３は還元
して、システィンを保護するために、Ａ　ｋｅｔａｇａ
ｖａ等の方法（Ａ　ｋｅｔａｇａｗａ、　　Ｊ　、　、
ｅｔ　　ａｔ　、　。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１．７３５７〜７３６
５゜１９８６）により、Ｓ−ピリジルエチル化した。

そしてこの試料をＴＳＫゲルやフェニール−５ＰＷＲＰ
（）−ソー社製）を用いて、０〜６０％のアセトニトリ
ルの直線濃度勾配により逆相高速液体クロマトグラフィ
ーを行った。この結果、Ｃ３はＣ３ａ、Ｃ３ｂ、及びＣ
３ｃの３成分に分割された。

さらにＣ３ｂとＣ３ｃをリジルエンドペプチダーゼを１
に対して、基質４０の割合で２Ｍ尿素を含む４０ｍＭ）
リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で、３７℃、１２時
間分解した。得られた分解物をケムコソルブ　７−ＯＤ
Ｓ−Ｈカラム（ケムコ社製）を用いて、０．１％トリフ
ルオロ酢酸を含む０〜８０％のアセトニトリルの濃度勾
配によって、逆相高速液体クロマトグラフィーを行った
。

この結果、リジルエンドペプチダーゼ消化したＣ３Ｃか
ら１１個のフラグメントを得た。

得られたフラグメントはさらに６Ｎ塩酸で減圧下、１１
０℃、２０時間分解し、次いでこれをＰＩ　Ｃｏ−ＴＡ
Ｇシステム（ウォーターズミリポア社製）を用いてフェ
ニルチオカルバメイト法にょってアミノ酸分析を行った
。蛋白質とフラグメントのアミノ酸配列はガス相−シー
クエンサー（アプライド・バイオシステムズ社製）で測
定し、フェニルチオヒダントイン誘導体はアプライド・
バイオシステムダ１２０Ａフエニルチオヒダントイン分
析機（アプライド・バイオシステムズ社製）により同定
した。

（３）プローブの調製 Ｃ３ｃの１１個のフラグメントのうちＣ３αとＣ３βを
選択した。Ｃ３ａはＰｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｍｅｔ−Ｔｈｒのアミノ酸配列を有し、Ｃ３βはＬｙｓ
−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓの
アミノ酸配列を有していた。これに対応する相補的オリ
ゴヌクレオチドとして、５’　−ＧＴＣＡ’ｒＹＴＧＮ
ＣＣＹＴＣＲＡＡ−３’　　と５’　−ＴＴＧＣＣＲＴ
ＴＮＡＣＲＴＡＲＴＴＴＴＴ−３’　（ＭＳＮ及びＲは
前記に同じ）をＤＮＡ合成機３８０Ｂ　（アプライド・
バイオシステムズ社製）により自動合成を行った。該方
法はカルサス（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）等の方法（Ｊ、　
Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０３，３１８５．１９８１）ｌ
こ基づいており、ホスホアミダイド法といわれている。

即ち、５′のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）を脱保
護したｄＡまたはｄＴ−８（Ｓ：支持体）にテトラゾー
ルで予め活性化したＤＭＴｒ−ｄＡ、またはＤＭＴｒ−
ｄＧ、またはＤＭＴｒ−ｄＴ。

またはＤＭＴｒ−ｄＣのホスホアミダイド体を縮合させ
た後、未反応の水酸基をアセチル化し、次いで水存在下
でヨウ素酸化を行ってリン酸体を導いた。ＤＭＴｒ基を
脱保護し、以後同様に縮合を繰り返して、上記１７ｍｅ
ｒ及び２０ｍｅｒの相補的オリゴヌクレオチドを合成し
た。合成したオリゴヌクレオチドの精製はオリゴヌクレ
オチド・カートリッジ（アプライド・バイオシステムズ
社製）を使用した。

（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 ウィスター系ラットをエーテル麻酔下で肝臓を摘出し、
得られた肝臓３ｇを液体窒素中でブレングーにより細片
化し、それを５倍量のＧＴＣホモジネート緩衝液（５，
３Ｍグアニジウムチオシアネート、０．０２Ｍ　　Ｎ−
ラウリルザルコシルナトリウム、０．０３Ｍ　　クエン
酸三ナトリウム、０．８％β−メルカプトエタノール、
０．７％アンチフオームＤＢ−１１ＯＮエマルジョン）
の入れたボッター式ホモジナイザーに加える。１０往復
させた後、ビーカーに移し、２０ｘｌシリンジに２２Ｇ
の注射針を付けいきおい良く３回通しシアリングする。

５．７Ｍの塩化セシウム、０、ＩＭＥＤＴＡを遠心チュ
ーブに約１２１！入れ、その上にホモシネイト約２４１
！を重層した後、　　２８．０００ｒｐｍＦ２０時間遠
心分離を行って全ＲＮＡ的９＋ａｇを回収した。

全ＲＮＡを５　ｗａｇ　／　ｘｉ以下の濃度に希釈し、
６５℃、７分間インキュベート後、水冷中で２分間急冷
した。等量の２倍オリゴｄＴ結合緩衝液（１，０Ｍ　　
ＮａＣ１，２０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＮ　、ｐＨ
７，５）　、及び１／１００容量の２０％ＳＤＳを添加
してよく混合した。ついでオリゴｄＴ結合緩衝液（０，
５Ｍ　　ＮａＣΩ、１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ
　ｐＨ７，５，０，１％５ＤＳ）で平衡化したオリゴｄ
Ｔセルロースカラム（バイオ・ラド社製）に付加した。

未吸着区分は再度６５℃で７分間反応し、水冷中で２分
間急冷して再度カラムに付加した。カラムは１００倍量
オリゴｄＴ結合緩衝液で洗浄し、さらに１００倍量オリ
ゴｄＴ洗浄液（０，１Ｍ　　Ｎａ（Ｊ）、１０ｍＭ　　
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＮ　　ｐＨ７，５，０，１％　５Ｄ
Ｓ）を用いて洗浄した。オリゴｄＴセルロースに結合し
たポリ（Ａ）”　ＲＮＡはオリゴｄＴ溶出液（１０ｍＭ
　　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣＮｐＨ７，５，０，０５％５
ＤＳ）により溶出した。

溶出液に１／２５容量の５ＭＮａＣＪ及び２．５容量の
エタノールを加え、よく混合して一２０℃で一昼夜放置
した。次いでこれを１２００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分
離を行いポリ（Ａ）”　ＲＮＡを沈殿させ、７０％エタ
ノールに再度懸濁して同様に遠心分離し、沈殿を乾燥後
、適当量の水に溶かした。

上記の方法で得られたポリ（Ａ）”　ＲＮＡからゴブラ
ーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、、　ａｎｄ　Ｈｏ
ｆｆｍａｎ。

Ｂ、、Ｇｅｎｅ、２５，２６３〜２６８．１９８３）の
方法に従ってｃＤＮＡを合成した。

（１）１本鎖の合成 １．５ｚＡ’チユーブ（エッペンドルフ社製）に３０ｐ
ｇ反応用緩衝液（５００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ
Ｈ８，５，７００ｍＭ　　ＫＣｊＪ、５０ｍＭ　　Ｍ　
ｇ　Ｃ１ｌ　２　）−１１５μＪのｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、３μｇの５００ｍＭ　
　ＤＴＴ、３．７５ｔ、ｔ（ｌの１６０ｍＮ　　ナトリ
ウムピロホスフェイト、蒸留水４８．７５μｇをよく混
合後、３０μρ　（１，７３μｇ）のブライマー（５’
　−ＴＡＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３′）と上記ポリ（Ａ）”　ＲＮ
Ａ　　９′μｆＩ　（９μｇ）を混合後、７０℃、５分
間処理し、水中で急冷して上記溶液を加えた。さらにこ
の反応液に７．５μｇのα−”ＰｄＣＴＰ　（３０００
Ｃｉ／ｍｍｏρ、１ｍＣ１／ｘｆフアルマシア社製）と
３μＤ　　（６０ｕｎｉｔｓ）のニワトリ骨髄芽球症ウ
ィルス由来の逆転写酵素（ライフ・サイエンス社製）を
加え、４２℃で４５分間反応させた。反応後、停止液３
０μｇ　（０，１Ｍ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０，５％　
５ＤＳ）を加えて反応を終了させ、フェノールクロロホ
ルム処理後、エタノールで沈殿させて一本鎖ｃＤＮＡを
合成した。

（ｉｉ）２本鎖の合成 上記のＲＮＡ−ＤＮＡハイブーリッド沈殿物に水５０μ
ｇを加えて溶解した後、次の反応溶液を加えて２本鎖ｃ
ＤＮＡの合成を行った。

即ち、４０ｔｔｌ）の反応緩衝液（１００ｍＭＴｒ　ｉ
　５−ＨＣＩ　　ｐＨ７，５，３５ｍＭＭｇＣ，Ｑ　２
．５００ｍＭ　　ＫＣ４Ｊ　２．２’５０ｔ１ｇ／ｘｉ
　　ＢＳＡ）　、２０ｔｔ！ｌの１ｍＭｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、５μｇのα３２ｐ−ｄ
ＣＴＰ、３ａΩの１０ｍＭ　　β−ＮＡＤ、　４μｇ　
（２ｕｎｉｔｓ）のＲＮａ　ｓ　ｅＨ，４，ｃｚΩ　（
４０ｕｎｉｔｓ）のＤＮＡポリメラーゼ１．１μｇ　（
１２ｕｎｉｔｓ）の大腸菌ＤＮＡリガーゼ、蒸留水７５
μｇを加えて、よく撹拌し、１２℃で１時間、さらに２
２°Ｃで１時間反応させた。フェノール処理、エタノー
ル沈殿を行った。これらの操作によって、９μｇのポリ
（Ａ）”　ＲＮＡから０．８μｇのｃＤＮＡが合成され
た。

（ｉｉｉ　）クレノー処理とＮｏｔＩ切断ｃＤＮＡの両
端を平滑化するためにクレノー（ＤＮＡポリメラーゼＩ
のラージフラグメント）処理を行った。２８μρのｃＤ
ＮＡに５μｇの０．５ｍＭ　　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄ
ＴＴＰ。

ｄＣＴＰ、及び５μＮの反応液（６６ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＮ　　　ｐＨ７，５，０，５ＭＮａＣｌ、６６ｍＭ　
　ＭｇＣρ２．１０　ｍ　ＭＤＴＴ）　、０．５μＢ　
　（２，５ｕｎｉｔｇ　）のクレノー（ベーリンガー社
製）、蒸留水１１．５μｇを加えてよく混合し、２０℃
で３００分間反応せた。

反応後、フェノール処理、エタノールで沈殿させて回収
した。

上記のｃＤＮＡを４４μｇの蒸留水に溶解し、５μｇの
反応緩衝液（１００ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩＩ　
　ｐＨ７，５，７０ｍＭ　　ＭｇＣｌ１２、ｊ５００ｍ
Ｍ　　ＮａＣＮ　、７０ｍＭ　　β−メルカプトエタノ
ール）、１μｇのＮｏｔＩ（１２ｕｎＮｓ）を加えてよ
く混合し、３７℃で１時間反応させた。ＮｏｔＩ断片を
除くために、平衡化緩衝液（４００ｍＭ　ＮａＣｊ７．
５０ｍＭ　ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン
スルホン酸）、１５％エタノール、ｐＨ７，０）で平衡
化したＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐミルカラムナコシ社製）に
付加し、洗浄緩衝液（１０００ｍＭ　　ＮａＣＲ，５０
ｍＭ　　ＭＯＰＳ、１５％エタノール　ｐＨ７，０）で
洗浄後、溶出緩衝液（１５００ｍＭＮａＣρ、４０ｍＭ
　　ＭＯＰＳ、１５％エタノール　ｐＨ７，５）で溶出
した。

（ｉＶ　）ブルースクリプトＫＳへの挿入ブルースクリ
プトＫＳ（ストラタジーン社製）のマルチクローニング
部位のＥｃｏＲＶ　　ＮｏｔＩ間に挿入した。即ち、Ｋ
Ｓプラスミド１０μｇ（１１μｇ）に２０μｇの反応用
緩衝液（１００ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ（ｌ　　ｐ
Ｈ７，５，７０ｍＭＭｇＣ１）２．１５００ｍＭ　　Ｎ
ａＣｌ２．β−メルカプトエタン−ル）−１５μＮ（７
）ＥｃｏＲＶ　（５０ｕｎｉｊｓ）、５μｇのＮｏ　ｔ
　Ｉ　（６０ｕｎｉｔｓ）、１７０μｇの蒸留水を加え
、３７℃で２時間反応させた。

ついで０．８％アガロースゲルを用いて分離後、必要と
するバンドをＤ　Ｅ　８１　？Ｆ紙に吸着させて回収し
た。Ｄ　Ｅ　８１　か紙に吸着したＤＮＡは１．５Ｍ　
　ＮａＣ，Ｑで回収してフェノール処理、エタノール沈
殿を行った。

上記で処理したベクター２μｇ　（２０ｎ　ｇ）に２μ
ｇ　（２０ｎｇ）ｃＤＮＡ、２μｇの反応用緩衝液（６
６０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ，Ｑ　　ｐＨ７，５，
５０ｍＭ　　Ｍｇ（Ｊ１２．５０ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭ
　　ＡＴＰ）　、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｍ１　　（３
５０ｕｎｉｔｓ）　（ベーリンガー社製）、水１３μｇ
を混合して１６℃で、−昼夜反応させた。

（５）クローンの単離 （ｉ）形質転換 上記（ｉＶ　）の反応液１μｇを５０μｇのコンピーテ
ントセルＨＢＩＯＩ　（宝酒造社製）と混合し、氷中３
０分間放置した。次いで４２℃で４５秒処理した後、ｌ
　ｘｌのＳＯＣ溶液（２％バクト・トリプトン、０．５
％酵母抽出液、１０ｍＭ　　ＮａＣＲ，２，５ｒｎＭ　
　ＫＣｊｌ）、１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ　　
ＭｇＣΩ２．２０ｍＭ　　グルコース）を加え、３７℃
で１時間振盪培養した。ＬＢプレー１　（１０ｇバクト
・トリプトン、５ｇ酵母抽出液、５ｇ食塩、１５ｇ寒天
に水１ｇを加えてオートクレーブ処理した後、６０℃ま
で温度を下げて５０ｍｇのアンピシリン・ナトリウムを
加え、よ（混合して９ｃｍシャーレに注ぐ）上にナイロ
ンフィルター（デュポンのコロニー／プラークスクリー
ン）を乗せ、その上に均一にコロニーを撒いた。

１プレート当り約９０００コロニー、計２０プレートＣ
約１８００００コロニー）について以下のスクリーニン
グを行った。

（ｉｉ　）スクリーニング 各フィルターをＱ、５Ｎ　　ＮａＯＨで処理し、ＩＭ　
　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＵ　　（ｐＨ７，５）で洗浄後、
濾紙上で乾燥させた。次いでこれを十分■の２ｘＳＳＣ
（０，３Ｍ　　ＮａＣＲ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム
　ｐＨ７，０）中でよく洗浄した。

これを濾紙上で風乾した。

全フィルターをナイロンバックに入れ、２０１１のプレ
ハイブリダイゼーション溶液（ＩＭＮａＣ，Ｑ、５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣρ　ｐＨ７，５，１％　ＳＤＳ、
２００μｇ／ｌ／イーストＲＮＡ）を加え、泡を抜いて
３７℃で６時間反応させた。

全フィルターを新しいナイロンバックに移し、サケ精子
ＤＮＡ　（１０＋ｎｇ／ｖＡ’）を１００μｇと３２ｐ
標識化合成オリゴＤＮＡプローブ１００μｇを１００℃
で５分間熱処理を行った後、水中で２分急冷した。この
変性ＤＮＡと２０１１のプレハイブリダイゼーション溶
液を混合し、ナイロンバッグに加え、泡を抜いて３７℃
で一昼夜反応させた。

次いでフィルターを６ｘＳＳＣ（０，９ＭＮａＣＮ、９
０ｍＭ　　クエン酸三ナトリウムｐＨ７，０”）を用い
て室温で５分、３７℃で５分洗浄してオートラジオグラ
フィーを行った。

２４個の強い陽性を示すクローンがみつかった。

（６）制限酵素地図、及びＤＮＡ塩基配列の決定（ｉ）
制限酵素地図 （５）　−（ｉｉ）で得られた２４個のクローンはいず
れも同様の制限酵素地図を示した。これらのクローンの
うち最長のｃＤＮＡを含むものにつき、塩基配列を決定
した。

コンポーネントＣ３のｃＤＮＡの制限酵素地図は第１図
に示す。即ち、図中黒いカラムはＣ３の翻訳領域を示−
し、白いカラムは５′端の非翻訳領域、及び３′端の非
翻訳領域を示す。実線はベクター（ブルースクリプトＫ
Ｓ）部分を示す。カラムの下の数字は開始コドンＡＴＧ
の１番目及び終止コドンの一つ前のヌクレオチドの位置
を示しており、配列を決定した部分は破線、実線、点線
の矢印で示した。破線は直接、市販のＴ３ブライマー　
（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’　
）　、及びＴ７プライマー（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧ−３”）を、実線は矢印の起点の塩基
配列の情報をもとに合成したプライマーを、点線は制限
酵素Ｓａｃ　Ｉ、Ｈｉｎｄ■で消化しサブクローン後、
Ｔ３、Ｔ７ブライマーを用いて配列決定を行った。バー
の長さは１００塩基長を表している。

（ｉｉ　）塩基配列の決定 ｃＤＮＡの塩基配列の決定は７−ＤＥＡＺＡシーケンシ
ングキット（宝酒造社製）を用い、サンガー（Ｓａｎｇ
ｅｒ　）等のジデオキシターミネーション法（Ｐｔｏ、
　　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　
７４゜５４６３〜５４６７．１９７７）に基づいて行っ
た。即ち、プラスミドＤＮＡ　　１０μＮ　　（２μｇ
）に２Ｎ　　ＮａＯＨを２ｔｔ（１，２ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａを２μｇ、蒸留水６μｇを加えてよく混合し、３７℃
で５分間放置した。次いで５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ
４，５）を８μＮ　、−ｘ−タ）−４１００μｇを加え
て一２０℃で２０分間放置した。この反応液をエッペン
ドルフ遠心機で１０分間遠心分離後、沈殿を７０％エタ
ノールで洗浄して乾燥させた。乾燥した沈殿物に蒸留水
を９．５μｇ加えて溶解後、１．　５μｇの反応緩衝液
（７０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２　　ｐＨ７，５，１ｍＭ
ＥＤＴＡ、２００ｍＭ　　Ｎａ（Ｊ！、７０ｍＭＭｇＣ
ｆｆ　２　）　、１　μｎ　　（０，５μｍｏＵ　）の
Ｔ３プライマー（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡ
ＡＡＧ−３’　）あるいは１μｇのＴ７プライマー（５
’　−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’　）
を加えてよく混合した。これを６０℃、２０分間反応し
た後、室温に２０分以上放置してプライマーをアニール
させた。

新しいエラペンチューブに２μΩずつｄＡＴＰ−ｄｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ−ｄｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ−ｄｄＴＴＰ、
ｄＣＴＰ−ｄｄＣＴＰの混合液を取り、上記の鋳型ＤＮ
Ａ−プライマー混合液にα−”Ｐ−ｄＣＴＰ　（４００
Ｃｉ／ｍｍｏｆｆ　）２μΩとクレノー酵素１μＤ　　
（２ｕｎｉｔｓ）を加えて混合した液を３．５μｇずつ
上記４本のｄＡＴＰ−ｄｄＡＴＰＳ　ｃｌＧＴＰ−ｄｄ
ＧＴＰＳ　ｄＴＴＰ−ｄｄＴＴＰＳｄＣＴＰ−ｄｄＣＴ
Ｐに加えて４６℃、２０分伸長反応させ、１μｇのｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰＳｄＣＴＰを加えてさらに
４６℃で２０分反応させた。６μｇのホルムアミド停止
液（８０％ホルムアミド、１０ｍＭＮａＯＨ，１ｒｎＭ
　　ＥＤＴＡ、０．１％キシレンジアール、０．１％ブ
ロモフェノールブルー）を加え、８０℃で３分間熱処理
を行った後、水中で急冷した。これを６％ポリアクリル
アミド−７Ｍ尿素ゲルにアプライし、２５００Ｖ、３〜
９時間泳動後、オートラジオグラフィーを行って、塩基
に特異的に伸長停止したバンドの位置より塩基配列を決
定した。この結果を第２図に示す。コード領域は７０２
ヌクレオチドであり、アミノ酸残基数２３４個に相当し
た。この値から算出される分子量は２５９２５ダルトン
であった。該図よりラット多機能プロテアーゼのコンポ
ーネントｃ３より調製したプローブ用ポリペプチドＣ３
αは１９９−２０４番目のアミノ酸配列に一致しており
、Ｃ３βは１６５〜１７１番目のアミノ酸配列に一致し
ていた。このような事実より本発明遺伝子は精製によっ
て得られたう・ソト多機能プロテアーゼのコンポーネン
トＣ３の遺伝子であると確認された。

実施例２ （１）ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ５
の精製 ラット多機能プロテアーゼは田中等によって報告されて
いる方法（Ｔａｎａｋａ、に、、ｅｔ　　ａＦ、＋Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１．１５１９７〜１５２０
３゜１９８６　：　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　
２６３゜１６２０９〜１６２１７．１９８８）に従って
ラット肝臓より精製した。

ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ５は田中
等の方法（Ｔａｎａｋａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｊｏｌ、、２０：３，９８５〜９９６゜１９
８８）に従って精製した。即ち、上記の方法によって得
られたラット多機能プロテアーゼを０．０５％トリフル
オロ酢酸で平衡化したコスモシル５Ｃ４３００カラム（
１０Ｘ２５０ｍｍ、ナカライ・デスク社製）に付加した
。次いで０．０５％トリフルオロ酢酸を含む４５〜６０
％のアセトニトリルで直線濃度勾配により溶出した。

溶出速度はＩｎＩＱ／ｗｉｎで１ｍｌずつ分取した。こ
の方法によってラット多機能プロテアーゼのコンポーネ
ントＣ５はアセトニトリル濃度が５０％の位置に溶出さ
れた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は２６．５００
±７００であった。

（２）蛋白質の解析 ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ５蛋白質
は実施例１（２）と同様にＡ　ｋｅｔａｇａＷａ等の方
法（Ａｋｅｔａｇａｖａ、　　Ｊ　、、ｅｔ　　ａｌ、
、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２６１．７３５７〜７３６５．１９８６）
により、還元し、Ｓ−ピリジルエチル化を行った後、リ
ジルエンドペプチダーゼで分解し、これをケムコソルブ
　７−ＯＤＳ−Ｈカラム２．　　ｌＸｌ５０ＩＩｌｌ１
１ケムコ社製）を用いて分離分画を行った。

分画したベプタイドはそれぞれ塩酸加水分解後、アミノ
酸分析を行い、また実施例１（２）と同様にしてアミノ
酸配列を決定した。

（３）プローブの調製 上記（２）の方法で得られたりジルエンドペプチダーゼ
消化したコンポーネントＣ５から６個のフラグメントが
得られた。この中からＣ５αとＣ５β、及びＣ５γ３個
のフラグメントを選択した。

得られたフラグメントはアミノ酸自動シークエンサー（
アプライド・バイオシステムズ社製）によりアミノ酸配
列を決定したところ、Ｃ５αはＬｙｓ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ
−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　、Ｃ５βはＡｓｐ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ　、及びＣ５７はＴｙｒ−Ａ
ｌａ−Ｐｈｅ−ＡＳｎ−Ｇｌｙの各配列を有していた。

これに対応する相補的オリゴヌクレオチドとして、Ｃ５
αには５’−ＡＣＲＴＴＹＴＧＣＡＴＲＴＴＹＴＴ−３
’　、Ｃ５βに対しては５’　−ＣＣＮＡＣＹＴＧＲＴ
ＴＲＴＣ−３’、及びＣ５γには５’　−ＣＣＲＴＴＲ
ＡＡＮＧＣＲＴＡ−３’　（Ｒ，Ｙ及びＮは前記に同じ
）をＤＮＡ合成機３８０Ｂ　（アプライド・バイオシス
テムズ社製）により合成した。該方法はカルサス等の方
法（Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１０３．３１８５．１９８
１）に基づいている。即ち、５′のジメトキシトリチル
基（ＤＭＴｒ）を脱保護したｄＴまたはｄＣ。

またはｄＡ−８（Ｓ：支持体）にテトラゾールであらか
じめ活性化したＤＭＴｒ−ｄＡ、またはＤＭＴｒ−ｄＧ
、またはＤＭＴｒ−ｄＴ、またはＤＭＴｒ−ｄＣのホス
ホアミダイト体を縮合させた後、未反応の水酸基をアセ
チル化し、次いで水存在下でヨウ素酸化を行ってリン酸
体を導いた。ＤＭＴｒ基を脱保護し、以後同様に縮合を
繰り返して、上記１４ｍｅｒ、及び１７ｍｅｒの相補的
オリボヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレ
オチドはオリゴヌクレオチド・カートリ・ソジ（アプラ
イド・バイオシステムズ社製）を使用して精製した。

（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 正常ラット肝臓より１０倍以上ｍＲＮＡの発現量が高い
Ｒｅｕｂｅｒ　　Ｈ４ＴＧヘノくトーマ細胞を１０％牛
脂児血清を含むダルベ・ノコ培地を用いて、ＩＣＮＩＩ
Ｑシャーレ４０枚で、３日間培養後、遠心分離によって
細胞を集めた。この方法によってＲｅｕｂｅｒ　　Ｈ４
ＴＧ細胞が約２ｇ得られた。

この細胞を実施例１（４）と同様の方法により全ＲＮＡ
の抽出に用いた。この方法により、全ＲＮＡを約３ｍｇ
回収した。次いで、回収した全ＲＮＡは実施例１（４）
と同様に一本鎖ｃ　ＤＮＡの合成、二本鎖ｃＤＮＡの合
成、クレノー処理とＮｏｔＩ切断、及びブルースクリプ
トＫＳへの挿入を行った。

（５）クローンの単離 （ｉ）形質転換 形質転換は実施例１　（５）（ｉ）と同様に行った。

（１１）スクリーニング スクリーニングは（３）で得られたプローブを用い、実
施例１　（５）　　（ｉｉ）の方法と同様に行った。３
０，０００のトランスフォーマントから、各プローブに
陽性のクローンが１１得られた。最長のｃＤＮＡを含む
クローンにつき塩基配列を決定した。

（６）制限酵素地図、及びＤＮＡ塩基配列の決定（ｉ）
制限酵素地図 コンポーネントＣ５のｃＤＮＡの制限酵素地図は第３図
に示す。即ち、図中の黒いカラムはＣ５の翻訳領域を示
し、白いカラムは５′端の非翻訳領域、及び３′端の非
翻訳領域を示す。実線はベクター（ブルースクリプトＫ
Ｓ）部分を示す。カラムの下の数字は開始コドンＡＴＧ
の１番目及び終止コドンの一つ前のヌクレオチドの位置
を示しており、配列を決定した部分は破線、実線の矢印
で示した。破線は直接、市販のＴ３ブライマー（５’−
ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’　”）　、
及びＴ７プライマー（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧ−３”）を用い、実線は制限酵素ＰｓｔＩ、
及びＲｓａＩで消化しサブクローン後Ｔ３及びＴ７プラ
イマーを用いて配列決定を行った。バーの長さは１００
塩基長を表している。

（ｉｉ　）塩基配列の決定 Ｃ５のｃＤＮＡ塩基配列の決定を実施例１（６）と同様
にして行った。その結果を第４図に示す。

最長のオープンリーディングフレームは１−７２０ヌク
レオチドであり、これは２４０残基のアミノ酸を有する
タンパク質であり、これから算出される分子量は２６，
４７９ダルトンであった。該図よりラット多機能プロテ
アーゼのコンポーネントＣ５より調製したプローブ用ポ
リペプチドＣ５αは１８３〜１８８番目のアミノ酸配列
に一致しており、Ｃ５βは１７７〜１８１番目のアミノ
酸配列に一致しており、Ｃ５γは３２〜３６番目のアミ
ノ酸配列に一致していた。このような事実から、本発明
遺伝子は精製によって得られたラット多機能プロテアー
ゼのコンポーネントＣ５の遺伝子であることが確認され
た。

実施例３ （１）ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ８
の精製 ラット多機能プロテアーゼは日中等によって報告されて
いる方法（Ｔａｎａｋａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６１．１５１９７〜１５２０
３゜１９８６　：　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　
２６３゜１６２０９〜１６２１７．１９８８）に従って
ラットの肝臓より精製した。

ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ８は日中
等の方法（Ｔａｎａｋａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、２０３，９８５〜９９６゜１９８
８）に従って精製した。即ち、上記の方法によって得ら
れたラット多機能プロテアーゼを０．０５％トリフルオ
ロ酢酸で平衡化したコスモシル５Ｃ，−３００カラム（
１０Ｘ２５０ｍｍ、ナカライ・デスク社製）に付加した
。次いで０．０５％トリフルオロ酢酸を含む４．５〜６
０％のアセトニトリルで直線濃度勾配により溶出した。

溶出速度は１ｍＱ／ａ＋ｉｎで１ｍｌずつ分取した。こ
の方法によってラット多機能プロテアーゼのコンポーネ
ントＣ８はアセトニトリル濃度が５２％の位置に溶出さ
れた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は２８．８００
±５００であった。

（２）蛋白質の解析 ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ８蛋白質
は実施例１（３）と同様にＡ　ｋｅｔａｇａｖａ等の方
法（Ａｋｅｔａｇａｗａ、　　Ｊ　、、ｅｔ　　ａｌ、
、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２６１．７３５７〜７３６５．１９８６）
により、還元し、Ｓ−ピリジルエチル化を行った後、リ
ジルエンドペプチダーゼで分解し、これをケムコソルブ
　７−ＯＤＳ−Ｈカラム２．１×１５０ｍｍ、ケムコ社
製）を用いて分離分画を行った。分画したベプタイド及
び蛋白質はそれぞれ塩酸加水分解後、アミノ酸分析を行
い、また実施例１（２）と同様にしてアミノ酸配列を決
定した。

（３）プローブの調製 上記（２）の方法で得られたりジルエンドペプチダーゼ
消化したコンポーネントｃ８がら６個のフラグメントが
得られた。この中がらＣ８αとＣ８β、及びＣ８γ３個
のフラグメントを選択した。

得られたフラグメントはアミノ酸自動シークエンサー（
アプライド・バイオシステムズ社製）によりアミノ酸配
列を決定したところ、Ｃ８αはＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ
−Ｔｈｒ７Ｃｙｓ−Ａｒｇ　ＳＣ８βは）ｆｉｓ−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｔ　、及びＣ８７は
Ａ　Ｉａ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＨｉＳ−Ａｌａの
各配列を有していた。これに対応する相補的オリゴヌク
レオチドとして、Ｃ８αには５　’−ＣＫＩ？ＣＡＲＧ
ＴＣＡＴＹＴＣＹＴＴ−３’　　　Ｃ８βに対しては５
　’−ＡＣＮＧＣＣＡＴＮＣＣ８ＡＣＡＴＧ−３’及び
５　’−ＡＣＮＧＣＣＡＴＮＣＣＹＡＣＡＴＧ−３″、
Ｃ８γには５’−ＧＣＲＴＧＮＡＣＲＴＡＣＡＴＳＧＣ
−３’及び５’−ＧＣＲＴＧＮＡＣＲＴＡＣＡＴ１＋１
ＧＣ−３’　　（ＲＳＹＳＫ、　Ｓ。

Ｗ及びＮは前記に同じ）をＤＮＡ合成機３８０Ｂ（アプ
ライド・バイオシステムズ社製）により合成した。該方
法はカルサス等の方法（Ｌ　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、
、１０３，３１８５．１９８１）に基づいている。即ち
、　５′のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）を脱保護
したｄＴまたはｄＣ，またはｄＡ−８（Ｓ　：支持体）
にテトラゾールであらかじめ活性化したＤＭＴｒ−ｄＡ
、またはＤＭＴｒ　−ｄ　Ｇ、またはＤＭＴｒ−ｄＴ、
またはＤＭＴｒ−ｄＣのホスホアミダイト体を縮合させ
た後、未反応の水酸基をアセチル化し、次いで水存在下
でヨウ素酸化を行ってリン酸体を導いた。ＤＭＴｒ基を
脱保護し、以後同様に縮合を繰り返して、上記１４ｍｅ
ｒ、及び１７ｍａｒの相補的オリゴヌクレオチドを合成
した。合成したオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチ
ド・カートリッジ（アプライド・バイオシステムズ社製
）を使用して精製した。

（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 正常ラット肝臓より１０倍以上ｍＲＮＡの発現量が高い
Ｒｅｕｂｅｒ　　Ｈ４ＴＧヘパトーマ細胞を１０％牛脂
児血清を含むダルベツコ培地を用いて、１０鵬シヤ一レ
４０枚で、３日間培養後、遠心分離によって細胞を集め
た。この方法によってＲｅｕｂｅｒ　　Ｈ４ＴＧ細胞が
約２ｇ得られた。

この細胞を実施例１（４）と同様の方法により全ＲＮＡ
の抽出に用いた。この方法により、全ＲＮＡを約３ＩＩ
ｇ回収した。次いで、回収した全ＲＮＡは実施例１（４
）と同様に一本鎖ｃ　ＤＮＡの合成、二本鎖ｃＤＮＡの
合成、クレノー処理とＮｏｔＩ切断、及びブルースクリ
プトＫＳへの挿入を行った。

（５）クローンの単離 （ｉ）形質転換 形質転換は実施例１　（５）（ｉ）と同様に行った。

（ｉｉ　）スクリーニング スクリーニングは（３）で得られたプローブを用い、実
施例１　（５）　　（ｉｉ）の方法と同様：二行った。

８０．０００のトランスフォーマントから、各プローブ
に陽性のクローンが４個得られた。これらのうち最長の
ｃＤＮＡを有するクローンにつき塩基配列を決定した。

（６）制限酵素地図、及びＤＮＡ塩基配列の決定（ｉ）
制限酵素地図 コンポーネントＣ８のｃＤＮＡの制限酵素地図は第５図
に示す。即ち、図中の黒いカラムはＣ８の翻訳領域を示
し、白いカラムは５′端の非翻訳領域、及び３′端の非
翻訳領域を示す。実線はベクター（ブルースクリプトＫ
Ｓ）部分を示す。カラムの下の数字は開始コドンＡＴＧ
の１番目及び終止コドンの一つ前のヌクレオチドの位置
を示しており、配列を決定した部分は破線、実線の矢印
で示した。破線は直接、市販のＴ３プライマー（５’−
ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３”　）　、及
びＴ７プライマー（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ
ＡＴＡＧ−３′）を、実線は制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ、
及びＳ　ａｃ　Ｉで消化しサブクローン後Ｔ３、及びＴ
７プライマーを用いて配列決定を行った。バーの長さは
１００塩基長を表している。

（１１）塩基配列の決定 Ｃ８のｃＤＮＡ塩基配列の決定を実施例１（６）と同様
にして行った。その結果を第６図に示す。

読図よりラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ
８より調製したプローブ用ポＩＪペプチドＣ８αは１８
３〜１８８番目のアミノ酸配列ｌこ一致しており、Ｃ８
βは７３〜７８番目のアミノ酸配列に一致しており、Ｃ
８γは１１７〜１２２番目のアミノ酸配列に一致してい
た。また、Ｎ末アミノ酸配列５ｅｒ−８ｅｒ−１１ｅ−
Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−は（２）で得られたＮ末アミノ酸配
列に一致していた。このような事実から、本発明遺伝子
は精製によって得られたラット多機能プロテアーゼのコ
ンポーネントＣ８の遺伝子であることが確認された。

実施例４ （１）ラット多機能プロテアーゼのコンボーネン）Ｃ９
の精製 ラット多機能プロテアーゼは田中等によって報告されテ
ィる方法（Ｔａｎａｋａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６１．　１５１９７〜ｌ　
５２０３゜１９８６　：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
２６３゜１６２０９〜１６２１７．１９８８）に従って
ラットの肝臓より精製した。

ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ９は田中
等の方法（Ｔａｎａｋａ、に、、ｅｔ　　ａｌ、、　Ｊ
　。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、２０３．９８５〜９９６゜１９８
８）に従って精製した。即ち、上記の方法によって得ら
れたラット多機能プロテアーゼを０．０５％トリフルオ
ロ酢酸で平衡化したコスモシル５Ｃａ　　３００カラム
（１０Ｘ２５０ｍｍ、ナカライ・デスク社製）に付加し
た。次いで０．０５％トリフルオロ酢酸を含む４５〜６
０％のアセトニトリルで直線濃度勾配により溶出した。

溶出速度は１ｎｌＱ／ｗｉｎで１鵬ずつ分取した。この
方法によってラット多機能プロテアーゼのコンポーネン
トＣ９はアセトニトリル濃度が５３％の位置に溶出され
た。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したＣ９の分子量は２８７
００±７００であった。

（２）蛋白質の解析 ラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ９蛋白質
は実施例１（３）と同様にＡ　ｋｅｔａｇａｗａ等の方
法（Ａｋｅｔａｇａｗａ、　　Ｊ、、ｅｔ　　ａｌ、、
Ｊ、　　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅａｐ、、２６１．７３５７〜７３６５，１９８．
６）により、Ｓ−ピリジルエチル化を行った後、酵素分
解し、これをケムコソルブ　７−ＯＤＳ−Ｈカラム２．
ＩＸ１５Ｃ１ａｍ、ケムコ社製）を用いて分離分画を行
った。分画したベプタイド及び蛋白質はそれぞれ塩酸加
水分解後、アミノ酸分析を行い、実施例１の方法に従い
アミノ酸配列を決定した。

（３）プローブの調製 上記（２）の方法で得られたりジルエンドペプチダーゼ
消化したコンポーネントＣ９から７個のフラグメントが
得られた。この中からＣ９α及びＣ９βの２個のフラグ
メントを選択した。

得られたフラグメントはアミノ酸自動シークエンサー（
アプライド・バイオシステムズ社製）によりアミノ酸配
列を決定した。Ｃ９αはＴｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒ
ｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　、及びＣ９βはＡｓｎ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｃｙｓの各配列を有していた
。これに対応する相補的オリゴヌクレオチドとして、Ｃ
９αには５’−ＴＴＲＴＣＣＣＡＮＣＣＤＡＴＲＴＡ−
３’　、及びＣ９βに対しては５’−ＣＡＮＧＣＣＡＴ
ＲＴＣＹＴＣＲＴＴ−３’　　（Ｒ，Ｎ、　Ｄ及びＹは
前記に同じ）をＤＮＡ合成機３８０Ｂ　（アプライド・
バイオシステムズ社製）により合成した。

該方法はカルサス等の方法（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏ
ｃ、、１０３，３１８５．１９８１）に基づいている。

即ち、５′のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）を脱保
護したｄＴまたはｄＣ，またはｄＡ−３（Ｓ：支持体）
にテトラゾールであらかじめ活性化したＤＭＴｒ−ｄＴ
、またはＤＭＴｒ−ｄＣ。

またはＤＭＴｒ−ｄＡ、またはＤＭＴ　ｒ　−ｄ　Ｇの
ホスホアミダイト体を縮合させた後、未反応の水酸基を
アセチル化し、次いで水存在下でヨウ素酸化を行ってリ
ン酸体を導いた。ＤＭＴｒ基を脱保護し、以後同様に縮
合を繰り返して、上記１７ｍｅｒの相補的オリゴヌクレ
オチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドはオリ
ゴヌクレオチド・カートリッジ（アプライド・／くイオ
システムズ社製）を使用して精製した。

（４）ｃＤＮＡライブラリーの調製 正常ラット肝臓より１０倍以上ｍ　ＲＮ　Ａの発現量が
高いＲｅｕｂｅｒ　　Ｈ４ＴＧへ７マトーマ細胞を１０
％牛脂児血清を含むダルベ・ノコ培地を用（Ｘで、１０
１ｔＱシヤーレ４０枚で、３日間培養後、遠心分離によ
って細胞を集めた。この方法によってＲｅｕｂｅｒ　　
Ｈ４ＴＧ細胞が約２ｇ得られた。

この細胞を実施例１（４）と同様の方法により全ＲＮＡ
の抽出に用いた。この方法により、全ＲＮＡを約３＋ａ
ｇ回収した。次いで、回収した全ＲＮＡは実施例１（４
）と同様に一本鎖ｃ　ＤＮＡの合成、二本鎖ｃＤＮＡの
合成、クレノー処理とＮｏｔＩ切断、及びブルースクリ
プトＫＳへの挿入を行った。

（５）クローンの単離 （ｉ）形質転換 形質転換は実施例１　（５）（ｉ）と同様に行って、１
プレート当り３０００コロニーを撒き、計１０プレート
（３００００コロニー）についてスクリーニングを行っ
た。

（ｉｉ）スクリーニング スクリーニングは（３）で得られたプローブを用い、実
施例１　（５）　　（ｉｉ）の方法と同様に行った。各
プローブに陽性のクローンが１０個得られた。このうち
最長のｃＤＮＡを含むクローンにつき塩基配列を決定し
た。

（６）制限酵素地図、及びＤＮＡ塩基配列の決定（ｉ）
制限酵素地図 コンポーネントＣ９のｃＤＮＡの制限酵素地図は第７図
に示す。即ち、図中の黒いカラムはＣ９の翻訳領域を示
し、白いカラムは５′端の非翻訳領域、及び３′端の非
翻訳領域を示す。実線はべフタ−（ブルースクリプトＫ
Ｓ）部分を示す。カラムの下の数字は開始コドンＡＴＧ
の１番目及び終止コドンの一つ前のヌクレオチドの位置
を示しており、配列を決定した部分は破線、実線の矢印
で示した。破線は直接、市販のＴ３プライマー（５’−
ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’　）　、及
びＴ７プライマー（５’　−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＴＡＴＡＧ−３’　）を、実線は制限酵素　ＰｖｕＩＩ
、ＮｃｏＩ、Ｈｉｎｄｍ及びＥｃｏＲＶで消化しサブク
ローン後、Ｔ３、及びＴ７プライマーを用いて配列決定
を行った。バーの長さは１００塩基長を表している。

（ｉｉ）塩基配列の決定 Ｃ９のｃＤＮＡ塩基配列の決定を実施例１（６）の方法
に従って行った。その結果を第８図に示す。

コード領域は７８３ヌクレオチド残基であり、これはア
ミノ酸２６１残基に相当し、これより算出されるＣ９の
分子量は２９，４９６ダルトンであった。読図よりラッ
ト多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ９より調製し
たプローブ用ポリペプチドＣ９αは１３６〜１４１番目
のアミノ酸配列に一致しており、Ｃ９βは６９〜７４番
目のアミノ酸配列に一致していた。このような事実から
、本発明遺伝子は精製によって得られたラット多機能プ
ロテアーゼのコンポーネントｃ９の遺伝子であることが
確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図、第３図、第５図及び第７図はそれぞれ本発明ラ
ット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ３、Ｃ５、
Ｃ８及びＣ９の制限酵素地図を示す。 第２図、第４図、第６図及び第８図はそれぞれ本発明ラ
ット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ３、Ｃ５、
Ｃ８及びＣ９の決定されたＤＮＡ塩基配列を示す。 （以　上） 第 図 第 図 Ｘ−−−一一一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の構造的特性を有することを特徴とするラッ
   ト多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ３。 【遺伝子配列があります】 （２）下記の塩基配列を有する特許請求の範囲第１項記
   載のラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ３の
   遺伝子。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （４）下記の塩基配列を有する特許請求の範囲第３項記
   載のラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ５の
   遺伝子。 【遺伝子配列があります】 （５）下記の構造的特性を有することを特徴とするラッ
   ト多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ８。 【遺伝子配列があります】 （６）下記の塩基配列を有する特許請求の範囲第５項記
   載のラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ８の
   遺伝子。 【遺伝子配列があります】 （７）下記の構造的特性を有することを特徴とするラッ
   ト多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ９。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （８）下記の塩基配列を有する特許請求の範囲第７項記
   載のラット多機能プロテアーゼのコンポーネントＣ９の
   遺伝子。 【遺伝子配列があります。】