JPH09252777A - マウス肝癌細胞由来増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】マウスＨＤＧＦをコードする遺伝子、該遺伝子
を持つ発現ベクター、該ベクターにより形質転換された
形質転換体を提供すること、および該形質転換体により
マウス肝癌由来培養細胞成長因子を生産する方法を提供
すること。 【解決手段】マウス睾丸組織より抽出した mＲＮＡより
作製した cＤＮＡライブラリーをヒトＨＤＧＦのＤＮＡ
をプローブとしてスクリーニングすることによりマウス
ＨＤＧＦ cＤＮＡを取得した。この cＤＮＡを用いて改
めてマウス各種臓器由来の mＲＮＡを用いてノーザンブ
ロッティングを行い、単一バンドが睾丸で非常に強く検
出された。得られた遺伝子を発現ベクターに組み込んで
宿主細胞を形質転換し、その培養上清よりマウスＨＤＧ
Ｆを採取した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マウス肝癌細胞由
来増殖因子（マウスHepatoma-Derived GF 、マウスＨＤ
ＧＦと略記する）をコードする遺伝子、該遺伝子を含有
する発現ベクター、該発現ベクターにより宿主細胞を形
質転換して得られる形質転換体に関し、さらに該形質転
換体を用いたマウス肝癌細胞由来増殖因子の製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトＨＤＧＦはヒト肝癌由来培養細胞Ｈ
ｕＨ−７ {Nakabayashi, H., Taketa,K., Miyano, K.,
Yamane, T. and Sato, J. (1982) Cancer Res. 42, 385
8-3863.} の培養上清よりＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対す
る増殖活性を持つ分画として粗精製された{Nakamura,
H., Kambe, H., Egawa, T., Kimura, Y., Ito, H., Hay
ashi, E., Yamamoto, H., Sato, J. and Kishimoto, S.
(1989), Clinica Chimica Acta 183, 273-284.}。

【０００３】この粗精製の分画より分子量約２５０００
のタンパク質がヒトＨＤＧＦとして抽出され、そのＮ末
端アミノ酸配列が決定された（特開平６−２２００９４
号公報参照）。

【０００４】さらにその遺伝子がクローニングされ、組
み換え型のヒトＨＤＧＦが作製された（特開平６−３４
３４７０号公報参照）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】マウスは遺伝子の機能
解明や病態のモデル動物として頻繁に使用されている動
物である。マウスを使って種々の実験を行うためには、
ヒトＨＤＧＦのマウスホモログ遺伝子（即ちマウスＨＤ
ＧＦの遺伝子）を取得することが必要である。

【０００６】本発明の目的は、マウスＨＤＧＦをコード
する遺伝子、該遺伝子を持つ発現ベクター、該ベクター
により形質転換された形質転換体を提供すること、およ
び該形質転換体によりマウス肝癌由来培養細胞成長因子
を生産する方法を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、予備実
験の結果、マウスの各種臓器のうちで睾丸組織において
マウスＨＤＧＦが多量に発現していることを見いだし
た。

【０００８】そこでマウス睾丸組織より抽出した mＲＮ
Ａより作製した cＤＮＡライブラリーをヒトＨＤＧＦの
ＤＮＡをプローブとしてスクリーニングすることにより
マウスＨＤＧＦ cＤＮＡを取得した。この cＤＮＡを用
いて改めてマウス各種臓器由来の mＲＮＡを用いてノー
ザンブロッティングを行ったところ、約２５００塩基対
（２．５ｋｂ）の単一バンドが睾丸で非常に強く検出さ
れ、その他の臓器でも普遍的に検出された。

【０００９】さらに得られた遺伝子を発現ベクターに組
み込んで宿主細胞を形質転換し、その培養上清よりマウ
スＨＤＧＦを採取できることを見いだし、本発明を完成
するに至った。

【００１０】すなわち、本発明によるマウス肝癌細胞由
来増殖因子は、配列番号１の配列表に示されるアミノ酸
配列を持ったマウス肝癌細胞由来増殖因子（マウスＨＤ
ＧＦ）をコードするＤＮＡ塩基配列である。

【００１１】上記マウスＨＤＧＦをコードする cＤＮＡ
は、好ましくは、配列番号２の配列表で示される塩基配
列を含むか、あるいはその一部で表されるものである。

【００１２】本発明によるマウス肝癌細胞由来増殖因子
の１例は、配列番号２の配列表に示されるアミノ酸配列
の１位のメチオニン(Met) から237 位のロイシン(Leu)
までのペプチドをコードする塩基配列を含むものであ
る。

【００１３】好適な実施態様においては、上記遺伝子は
配列番号２の配列表に示されるアミノ酸配列の２位のセ
リン(Ser) から237 位のロイシン(Leu) までのペプチド
をコードする塩基配列を含む。

【００１４】別の好適な実施態様においては、上記遺伝
子は配列番号２のアミノ酸配列の４位のセリン(Ser) か
ら237 位のロイシン(Leu) までのペプチドをコードする
塩基配列を含む。

【００１５】また、塩基配列については、本発明の好適
な実施態様においては、上記遺伝子は配列番号２の配列
表に示される塩基配列の１位のアデニン(A) から711 位
のグアニン(G) までの塩基配列を含む。

【００１６】好適な実施態様においては、上記遺伝子は
配列番号２の配列表に示される塩基配列の４位のチミン
(T) から711 位のグアニン(G) までの塩基配列を含む。

【００１７】好適な実施態様においては、上記遺伝子は
配列番号２の配列表に示される塩基配列の10位のチミン
(T) から711 位のグアニン(G) までの塩基配列を含む。

【００１８】本発明によって、また、上記記載のＤＮＡ
塩基配列を大腸菌の宿主・ベクター系で用いられるベク
ターに組み込んだ組み替えＤＮＡ分子、この組み替えＤ
ＮＡ分子で形質転換された大腸菌、配列番号１の配列表
に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号
１の配列表に示されるアミノ酸配列のアミノ末端の１ア
ミノ酸を欠失したアミノ酸配列を有するタンパク質、配
列番号１の配列表に示されるアミノ酸配列のアミノ末端
の３アミノ酸を欠失したアミノ酸配列を有するタンパク
質、上記記載のＤＮＡ塩基配列を動物細胞の宿主・ベク
ター系で用いられるベクターに組み込んだ組み替えＤＮ
Ａ分子、この組み替えＤＮＡ分子で形質転換された動物
細胞が提供せられる。

【００１９】さらに、本発明によって、こうして形質転
換された形質転換体を培養し、培養液から上記記載のタ
ンパク質を採取するタンパク質の製造方法が提供せられ
る。

【００２０】好適な実施態様においては、上記遺伝子は
ヒト肝癌由来培養細胞ＨｕＨ−７由来である。

【００２１】本発明の発現ベクターは、上記遺伝子を含
有する。

【００２２】本発明の形質転換体は、上記発現ベクター
により宿主細胞を形質転換させて得られる。

【００２３】本発明のマウスＨＤＧＦの製造法は、上記
形質転換体を培養し、培養上清よりマウスＨＤＧＦを採
取する工程を包含する。

【００２４】以下に本発明を工程の順に詳細に説明する (1) マウス睾丸 cＤＮＡライブラリーの作成 mＲＮＡを抽出するためには細胞を壊すと同時にＲＮａ
ｓｅを含めたすべてのタンパク質を変性させてしまうよ
うな試薬を用いる方法、例えばフェノール法{Parish,
J. H. (1972). Principles and Practice of Experimen
ts with NucleicAcids . Halstead Press}、塩酸グアニ
ジン法{Cox, R. A. (1968). In Methodsin Enzymology,
12B (pp. 120).} 、またはチオシアン酸グアニジン法
{Chirgwin, J. M.et al (1979). Biochem., 18, 5294.}
などで臓器を処理することによって細胞内の全ＲＮＡを
抽出することができる。

【００２５】次に抽出した全ＲＮＡをオリゴ(dT)−セフ
ァロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー
｛Aviv, H., & Leder, P. (1972). Proc. Natl. Acad.
Sci.(USA), 69, 1408 ｝を行うことにより mＲＮＡを抽
出することができる。得られた睾丸 mＲＮＡを鋳型とし
て、ギュブラーらの方法{Gubler, U. and Hoffman, B.
J. (1983) Gene 25, 263-269.}およびオカヤマらの方法
{Okayama, H. and Berg,P. (1982) Mol. Cell. Biol.
2, 161.}を利用して、 cＤＮＡを合成し、アダプターラ
イゲーション法{Haymerle, H. and et al. (1986) Nuc
l. Acid. Res. 14,8615.} を用いて原核生物用のベクタ
ーＤＮＡに組み込み、 cＤＮＡライブラリーを作成す
る。

【００２６】cＤＮＡを組み込む方法としては、ホモポ
リマー法{Villa-Komaroff, L. andet al. (1978) Proc.
Natl. Acad. Sci.(USA) 75, 3727.}、リンカーライゲ
ーション法{Kurtz, D. T. and Nicodemus, C. F. (198
1) Gene 13, 145.}などがある。

【００２７】使用する原核生物用のベクターはいかなる
ものでもよく、例えばプラスミドベクター、バクテリオ
ファージベクターなどが挙げられる。

【００２８】具体的には、例えばpUC18, pUC118, pBlue
script, λgt10, λgt11などがある。 あるいは、すで
にある睾丸 mＲＮＡ由来の cＤＮＡライブラリーの市販
品（例えば、Clontech社製）をそのまま使用してもよ
い。

【００２９】(2) マウス睾丸 cＤＮＡライブラリーのス
クリーニング (1) 項で得たマウス睾丸 cＤＮＡライブラリーを、ヒト
肝癌細胞由来増殖因子（ヒトHepatoma-Derived GF 、ヒ
トＨＤＧＦと略記する）のＤＮＡをスクリーニング用の
プローブとして用いて、プラークハイブリダイゼーショ
ン法あるいはコロニーハイブリダイゼーション法によ
り、スクリーニングを行う。

【００３０】ハイブリダイゼーションは、例えば"Molec
ular Cloning 12,45-12,57"(Cold Spring Harbor Labor
atory Press (1989)) の方法により行うことができる。

【００３１】その結果、マウスＨＤＧＦをコードする約
1.5kb の cＤＮＡ断片（Ｙ２６）を含むプラスミドｐＹ
２６を得ることができる。

【００３２】(3) マウスＨＤＧＦの塩基配列の決定 Ｙ２６の塩基配列は、ジデオキシ法などの常法により決
定される。得られた全塩基配列を配列番号３の配列表に
示す。また得られた塩基配列のうちマウスＨＤＧＦをコ
ードしている部分を配列番号２の配列表に、推定される
アミノ酸配列を配列番号１の配列表に示す。

【００３３】本発明は、この配列番号２の配列表に示さ
れる塩基配列１位の(A) から、あるいは１０位の(T) か
ら始まる塩基配列を包含するが、その配列の一部が改変
されていても、その配列由来のポリペプチドがマウス肝
癌由来培養細胞成長因子の活性を有する場合には、該塩
基配列も本発明に包含される。

【００３４】(4) マウスＨＤＧＦの mＲＮＡの検出( ノ
ーザンブロッティング) マウスＨＤＧＦがどの臓器で発現しているかを確かめる
ためにマウス各種臓器より mＲＮＡを抽出しノーザンブ
ロットを行った。

【００３５】(1) 項で得られた mＲＮＡを常法によりニ
トロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレンに
転写し、マウスＨＤＧＦのＤＮＡをプローブとしてノー
ザンブロッティングに用いる。

【００３６】またすでに mＲＮＡをナイロンメンブレン
に転写した市販品（例えば、Clontech社製）をそのまま
使用してもよい。

【００３７】マウスの、心臓、脳、脾臓、肺臓、肝臓、
筋肉、腎臓、睾丸を検査した結果、睾丸で最も多く mＲ
ＮＡが発現していることが明らかになった（図１参
照）。

【００３８】(5) 発現ベクターの構築 高等動物細胞を用いた組み替えタンパク質の発現系は、
天然に近い翻訳後修飾(posttranslational modificatio
n) が賦課されるなど、他の系では得がたい特徴を備え
ているために広く用いられている。

【００３９】高等動物細胞へのＤＮＡの導入は、モニタ
ーする時間の長さにより一過性発現法(transient expre
ssion)と安定形質発現法(stable transformation) とに
大別される。

【００４０】本発明のＨＤＧＦ cＤＮＡは高い発現を期
待できる一過性発現法により発現させる。

【００４１】これらは基本的にＳＶ４０複製起点配列を
含むベクターをＣＯＳ細胞を宿主として用いる方法であ
る{Gluzman, Y. (1987) Cell 23, 175.}。

【００４２】一過性発現法には高い発現を得る目的にデ
ザインされたいくつかのベクター、例えばＳＲαプロモ
ーター( ＳＶ４０およびＨＴＬＶＩ−ＬＴＲとの融合プ
ロモーター) を持ったｐｃＤＬＳＲα２９６ベクター{T
akebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Hoy, P., Yokot
a, K., Arai, K., Yoshida, M. and Arai, N. (1988)Mo
l. Cell. Biol. 8, 466-472.}、ヒトサイトメガロウイ
ルス極初期プロモーターを持ったCDM8ベクター{Seed,
B. (1987) Nature 329, 840-842.}、アデノウイルス主
要後期プロモーターを持ったp91023ベクター{Wong, G.
G., Witek, J. S., Temple, P. A., Wilkens, K. M., L
eary, A. C., Luxenberg, D. P., Jones,S. S., Brown,
E. L., Kay, R. M., Orr, E. C., Shoemaker, C., Gol
de, D. W., Kaufman, R. J., Hewick, R. M., Wang, E.
A. and Clark, S. C. (1985) Science 228, 810-815.}
などがある。

【００４３】本発明の発現ベクターは、マウスＨＤＧＦ
の cＤＮＡをこれらのベクターＤＮＡに導入することに
より得られる。

【００４４】(6) 形質転換体の作成およびマウスＨＤＧ
Ｆの生産 本発明の形質転換体は、(5) 項の方法で構築された発現
ベクターを適当な宿主に導入(transfection)することに
より得られる。

【００４５】宿主細胞としてはCOS 細胞が好適に用いら
れる。

【００４６】細胞へのＤＮＡの導入はリン酸カルシウム
法{Graham, F. L. and van der Eb,A. J. (1973) Virol
ogy 52, 456.; Chen, C. and Okayama, H. (1987) Mol.
Cell. Biol. 7, 2745-2752.}またはデアエデキストラ
ン法{McCutchan, J. H. andPagano, J. S. (1968) J. N
atl. Cancer Inst. 41, 351.; Warden, D. and Thorne,
H. V. (1968) }により行う。

【００４７】マウスＨＤＧＦは上記の形質転換体を培養
し、その培養上精より回収することができる。形質転換
体は、例えば１０％の子牛血清を含む培地中で培養され
る。

【００４８】この培養温度は例えば３７℃であり、培養
時間は例えば４８時間である。

【００４９】その後に形質転換体は、例えば血清を含ま
ない培地中で培養される。

【００５０】この培養温度は例えば３７℃であり、培養
時間は例えば２４時間である。

【００５１】その結果得られたＨＤＧＦを含む培養上清
は、例えば分子量１万以下をカットするメンブレンなど
既知の方法を用いて１０倍程度に濃縮され、その増殖活
性が測定される。

【００５２】マウスＨＤＧＦの増殖活性測定は、例えば
Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成刺激をガンバ
リニ{Gambarini, A., G. and Aramerin, H., A. (1982)
J.Biol. Chem. 257, 9692-9697.}らの方法に従って、
放射性物質である ³Ｈ−チミジン(thymidine) の細胞へ
の取り込みを測定することによって行うことができる。
その増殖活性を測定した結果、形質転換体の培養上清中
にマウスＨＤＧＦの増殖活性が存在することが明らかと
なった（図３参照）。

【００５３】

【発明の実施の形態】本発明を実施例によりさらに説明
する。

【００５４】（工程１）マウス睾丸 cＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニング マウスＨＤＧＦ cＤＮＡを含むクローンを得るために、
マウス cＤＮＡライブラリー（クローニングベクターと
してｐＹＥＵｒａ３組み換え体プラスミド；Clontech社
製）を用いた。

【００５５】この組み換え体プラスミドをふくむ大腸菌
約４万個を直径１５０ｍｍのＬＢ寒天培地（ＬＢ培地＋
１．５％寒天）に撒き、３７℃で一晩培養してコロニー
を形成させた。

【００５６】これらのコロニーをナイロンメンブレンＨ
ｙｂｏｎｄ Ｎ⁺ （アマシャム社製）に添付の説明書に
従って固定した。このようなメンブレンを１０枚作成し
ハイブリダイゼーションに使用した。

【００５７】プローブとしてはイズモトらにより報告さ
れた前記ヒトＨＤＧＦ cＤＮＡ（ＹＫＴ２）を用い、フ
ァインバーグ方法{Feinberg, A. P., & Vogelstein, B.
(1984). Anal. Biochem.(137), 266-267.} に基づい
た"Random Primer DNA Labeling Kit" (宝酒造社) を用
いて³²Ｐ−ｄＣＴＰで放射能ラベルした。

【００５８】上記のコロニーを転写したナイロンメンブ
レンを、５倍濃度ＳＳＰＥ／５倍濃度デンハルツ溶液／
０．５％ＳＤＳ／２０ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中
で、６５℃で６時間プレハイブリダイゼーションした。
放射能ラベルしたプローブを１００℃で５分間処理して
変性させ、このプレハイブリダイゼーション溶液に１×
１０⁵ 〜１×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌになるように加え、６
５℃で２０時間ハイブリダイゼーションした。

【００５９】そののちにメンブレンを２倍濃度ＳＳＰＥ
／０．１％ＳＤＳで室温にて５分、２倍濃度ＳＳＰＥ／
０．１％ＳＤＳで６５℃にて１０分間ずつ２回、そして
１倍濃度ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳで６５℃にて１５
分、順次洗浄し、Ｘ線フィルム（XAR-5,コダック(Koda
k) 製）に−８０℃で１２時間露光させた。

【００６０】現像後、強い陽性のシグナルを与えたコロ
ニー２０個を滅菌した爪楊枝で掻き取り、１ｍｌのＬＢ
培地によく懸濁した。

【００６１】この懸濁液を適度に希釈し、組み換え体プ
ラスミドを含む大腸菌が約４万個になるように直径１５
０ｍｍのＬＢ寒天培地（ＬＢ培地＋１．５％寒天）に撒
き、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。

【００６２】形成されたコロニーで再度上記のようにコ
ロニーハイブリダイゼーションを行い、単一コロニーか
らなる陽性クローンを得た。得られた陽性コロニーのう
ち１４個がマウスＨＤＧＦ cＤＮＡに属するものであっ
た。

【００６３】（工程２）塩基配列決定 陽性クローンのうち最も長いクローン（Ｙ２６）の塩基
配列を、合成プライマーを用い、ジデオキシ法に基づい
たシーケナーゼ・７−デアザ−ddＧＴＰ−シーケンシン
グキット（アマシャム社）により決定した。

【００６４】得られた cＤＮＡの全長の塩基配列、およ
び、その塩配列により翻訳されるポリペプチドのアミノ
酸配列を共に配列番号３の配列表に示す。

【００６５】（工程３）マウスＨＤＧＦの mＲＮＡの検
出 マウス各種臓器におけるマウスＨＤＧＦ mＲＮＡの発現
を見るために、すでにマウスの心臓、脳、脾臓、肺臓、
肝臓、筋肉、腎臓、睾丸由来の mＲＮＡをナイロンメン
ブレンに固定化した市販品、マウスＭＴＮブロット（ア
マシャム社製）を用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００６６】ハイブリダイゼーッションの条件は添付の
説明書に従い、プローブとしてはマウスＨＤＧＦのアミ
ノ酸配列の９４番目のトレオニンから２４０番目のロイ
シンに対応する４４１塩基対のＤＮＡ配列を選んだ。

【００６７】この領域をＰＣＲ (Polymeraze chain rea
ction)で増幅するためにセンスプライマー(5'-ACAGTCAA
GGCCTCTGGCTACCAG-3')とアンチセンスプライマー(5'-CA
GGCTCTCATGATCTCTGACGCC-3')をＤＮＡ自動合成機（モデ
ル３９４、Applied Biosystems社製) により合成し、マ
ウスＨＤＧＦ cＤＮＡ（Ｙ２６）を鋳型としてＰＣＲ反
応を行った。

【００６８】１μｇのプラスミドｐＹ２６をＴＥ緩衝液
５０μｌに溶解させた。

【００６９】この cＤＮＡ溶液５μｌに、合成したセン
スプライマーおよびアンチセンスプラアイマーを各々１
００ｐｍｏｌｅ添加し、さらに１０μｌの１０倍濃度の
アンプリフィケーション溶液（500mM KCl, 100mM Tris
HCl pH8.3, 15mM MgCl₂ , 0.1% (W/V)ゼラチン）および
１６μｌのｄＮＴＰｓ mixture(1.25mM dATP, 1.25mMdG
TP,1.25mM dCTP, 1.25mM dTTP) を添加し、水を加え、
さらに0.５μｌのTaqＤＮＡポリメラーゼ（５ｕｎｉｔ
ｓ／μｌ、パーキンエルマーシータス社製) を加え、反
応液の容量を１００μｌとした。

【００７０】この反応液を９４℃で３分間置いて cＤＮ
Ａを変性させた。

【００７１】さらにこれを９４℃で１分間放置して変性
を行い、５０℃で１分間放置してアニーリングを行い、
ついで７２℃で２分間放置して伸張反応を行うという操
作を３０回行った。

【００７２】その後に７２℃で２分間放置して伸張反応
を完成させた。

【００７３】反応生成物を微量脱塩チューブ"Suprec-0
2" （宝酒造社）によって脱塩、濃縮した。

【００７４】チューブのメンブレン上に残った反応産物
を２０μｌのＴＥ緩衝液で回収した。

【００７５】この反応生成物を０．５倍濃度のＴＢＥ緩
衝液中、１％低融点アガロース電気泳動により分離した
ところ、目的とする約４４１ｂｐのバンドが得られた。

【００７６】そこでこのバンドを切り取り、"Molecular
Cloning 6.28-6.29"(Cold SpringHoubor Laboratory P
ress 1989) に記載の方法に従って、５倍濃度のＴＢＥ
緩衝液中、電気的溶出によりＤＮＡを回収した。

【００７７】これにより約１μｇのＤＮＡ断片を得、２
０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。

【００７８】抽出したＤＮＡをファインバーグ方法{Fei
nberg, A. P., & Vogelstein, B. (1984). Anal. Bioch
em.(137), 266-267.} に基づいた"Random Primer DNA L
abeling Kit"( 宝酒造社) を用いて³²Ｐ−ｄＣＴＰで放
射能ラベルしてプローブとした。

【００７９】その結果、約2.5kb のバンドが普遍てきに
検出された。特に睾丸組織で最も多く発現していること
が明らかになった（図１参照）。

【００８０】( 工程４） 発現ベクターの構築 Ｙ２６を動物細胞での発現用プラスミドｐｃＤＬＳＲα
２９６{Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Hoy,
P., Yokota, K., Arai, K., Yoshida, M. and Arai, N.
(1988) Mol. Cell. Biol. 8, 466-472.}のEcoRI 部位
に、図２の工程に従って、以下のように導入した。

【００８１】プラスミドｐＹ２６を保持した大腸菌を"M
olecular Cloning 1.33-1.34,1.42-1.43" の方法に従っ
て大量に調整した。

【００８２】得られたプラスミドＤＮＡ５０μｇを５０
０μｌの制限酵素EcoRI 緩衝液中、１００units の制限
酵素EcoRI で３７℃、２時間処理した。

【００８３】この反応生成物を０．５倍濃度のＴＢＥ緩
衝液中、０．７％アガロース電気泳動により分離し、Ｙ
２６のバンドを切り取り、"Molecular Cloning 6.28-6.
29"(Cold Spring Houbor Laboratory Press 1989) に記
載の方法に従って、０．５倍濃度のＴＢＥ緩衝液中、電
気的溶出によりＤＮＡを回収した。

【００８４】これにより約１５μｇのＤＮＡ断片を得、
５０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。

【００８５】これとは別に、５μｇの発現用プラスミド
ベクターｐｃＤＬＳＲα２９６を、５０μｌの制限酵素
EcoRI 緩衝液中、５０units の制限酵素EcoRI （東洋紡
績社）で３７℃、２時間処理し、常法によりフェノール
抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮ
Ａを回収し、これを４０μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。

【００８６】この制限酵素EcoRI 消化発現用プラスミド
ベクターｐｃＤＬＳＲα２９６の２μｌと、先のY26/Ec
oRI 断片の２μｌを２０μｌのＴ４ライゲース緩衝液中
で、１０units のＴ４ライゲース（東洋紡績社）で、１
５℃、１５時間処理することによってベクターとＹ２６
を結合した。

【００８７】得られた組み替えプラスミドはｐＳＲαＭ
Ｕ５と命名した。

【００８８】ｐＳＲαＭＵ５はＳＲαと呼ばれる高い発
現効率を持つプロモーターを転写のドライブユニットと
して持ち、下流に組み込まれたマウスＨＤＧＦ cＤＮＡ
をＣＯＳ−７細胞などを宿主として発現させることがで
きる。

【００８９】（工程５）形質転換体の作成 チェン- オカヤマ(Chen-Okayama)の方法(Chen, C., Oka
yama, H. 1987. Mol.Cell. Biol., 7, 2745-2752.) に
従い、プラスミドｐＳＲαＭＵ５を用いて、ＣＯＳ−７
細胞の形質転換体を、以下のようにして作成した。

【００９０】対数増殖期のＣＯＳ−７細胞を常法により
トリプシン処理し、１０ｃｍ径のプレート中、１０ｍｌ
の１０％子牛血清( フローラボラトリー社) 、60μｇ／
ｍｌのカナマイシン( 明治製菓社) を含むＤＭＥ(Dulbe
cco's modified Eagle's) 培地中、５×１０⁵ Ｃｅｌｌ
となるように撒き、３７℃、５％炭酸ガスで一夜培養し
た。２８μｇのプラスミドＤＮＡ（１５μｌＴＥ緩衝液
中) を０．５ｍｌの０．２５Ｍ ＣａＣｌ₂ および０．
５ｍｌの２倍濃度のＢＢＳ {50mM BES (N,N-bis [2-h
ydroxyethyl]-2-aminoethaesulfonic acid)/280mM NaCl
/1.5mM Na2HPO4, pH6.95}と混ぜ、室温に２０分間置い
た。

【００９１】この溶液を一滴ずつ培地に加え、プレート
をよく拡散させた後、５％の炭酸ガス濃度中、３７℃で
１６時間培養した。

【００９２】そののちに培地を除き、ＣＯＳ−７細胞を
１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液で２度洗い、１０％子牛血清、
６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭＥ培地中、５
％の炭酸ガス濃度中、３７℃の条件でもう一晩培養し
た。

【００９３】細胞を常法によりトリプシン処理し、４倍
の倍率で希釈して、１０％子牛血清、６０μｇ／ｍｌの
カナマイシンを含むＤＭＥ中、５％の炭酸ガス濃度中、
３７℃の条件で４８時間培養した。

【００９４】このようにして得た形質転換体をＣＯＳ
（ｐＳＲαＭＵ５）と名付け、プラスミドｐｃＤＬＳＲ
α２９６で同様にして形質転換したＣＯＳ細胞をＣＯＳ
（ｐｃＤＬＳＲα２９６）と名付けた。

【００９５】（工程６）マウスＨＤＧＦの生産 １０％子牛血清、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む
ＤＭＥ培地で培養したＣＯＳ（ｐＳＲαＭＵ５）とＣＯ
Ｓ（ｐｃＤＬＳＲα２９６）の培地を６０μｇ／ｍｌの
カナマイシンを含むＤＭＥ培地で置換し、３７℃、５％
炭酸ガスで２４時間培養した。

【００９６】このようなプレートを４枚使用して、集め
た合計４０ｍｌの培地をセントリカットミニ( 分子量カ
ット１万)(倉敷紡績社) で約１０倍に濃縮した。

【００９７】（工程７）マウスＨＤＧＦの増殖活性の測
定 得られたマウスＨＤＧＦの増殖活性の測定は、Ｓｗｉｓ
ｓ３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成刺激を測定することに
より行った。

【００９８】Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に対するＤＮＡ合成
刺激はガンバリニ{Gambarini, A.,G. and Aramerin,
H., A. (1982) J. Biol. Chem. 257, 9692-9697.}らの
方法に従って、放射性物質である ³Ｈ−チミジン(thymi
dine) の細胞への取り込みを以下のように測定した。

【００９９】Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を、底面２５ｃｍ²
のフラスコで、１０％子牛血清、６０μｇ／ｍｌのカナ
マイシンを含むＤＭＥ培地、３７℃、５％炭酸ガスで維
持した。

【０１００】常法によりトリプシン処理し、９６ウエル
のマルチウエルプレートに１ウエル当たり３×１０³ 個
の細胞を分注し、２００μｌの１０％子牛血清、６０μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＤＭＥ培地で、３７℃、
５％炭酸ガスで４８時間培養した。

【０１０１】そののちに各ウエルの培地を１５０μｌの
０．２％子牛血清、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含
むＤＭＥ培地で置換して、３７℃、５％炭酸ガスで３６
時間培養した。

【０１０２】この操作により細胞を血清飢餓の状態(ser
um-stavation) にすることができた。

【０１０３】各ウエルに２０μｌのＨＤＧＦサンプルを
加え、３７℃、５％炭酸ガスで２０時間培養することに
よってＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の増殖を刺激した。

【０１０４】そののちに０．５μCiの ³Ｈ−チミジンを
加え、３７℃、５％炭酸ガスで４時間培養することによ
って、 ³Ｈ−チミジンを細胞に取り込ませた。

【０１０５】細胞内のＤＮＡに取り込まれた ³Ｈ−チミ
ジンはセルハーベスターによってグラスフィルター上に
細胞を集め、液体シンチレーションカウンターにて測定
した。その結果を図３に示す。

【０１０６】対照のＣＯＳ（ｐｃＤＬＳＲα２９６）に
比べて本発明のＣＯＳ（ｐＳＲαＭＵ５）より得られた
マウスＨＤＧＦのサンプルでは明らかに ³Ｈ−チミジン
の取り込みが増えており、増殖活性を確認することがで
きた。

【０１０７】よってｐＳＲαＭＵ５を有するＣＯＳ細胞
ではマウスＨＤＧＦが生産されていることが判明した。

【０１０８】

【発明の効果】上述したように、本発明によれば、マウ
スＨＤＧＦをコードする遺伝子、該遺伝子を持つ発現ベ
クター、該ベクターにより形質転換された形質転換体を
提供することができ、また、該形質転換体によりマウス
肝癌由来培養細胞成長因子を生産する方法を提供するこ
とができる。

【０１０９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２３７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖 配列番号：２ 配列の長さ：７１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類： cＤＮＡ ｔｏ mＲＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 起源：マウス 直接の起源 生物名：マウス 株名：ＢＡＣＢ／Ｃ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．．７１１ 配列番号：３ 配列の長さ：１５６３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類： cＤＮＡ ｔｏ mＲＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 起源：マウス 直接の起源 生物名：マウス 株名：ＢＡＣＢ／Ｃ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６２．．．７７２

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスの各種臓器におけるマウスＨＤＧＦの発
現を調べた結果を示すノーザンブロットである。

【図２】ＣＯＳ細胞での発現用プラスミドｐＳＲαＭＵ
５の造成を示す概略図である。

【図３】ＣＯＳ−７細胞で発現されたＨＤＧＦの増殖活
性を示すグラフである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の配列表に示されるアミノ酸
   配列を持ったマウス肝癌細胞由来増殖因子（マウスＨＤ
   ＧＦ）をコードするＤＮＡ塩基配列。
2. 【請求項２】 マウス肝癌細胞由来増殖因子（マウスＨ
   ＤＧＦ）をコードするｃＤＮＡが配列番号２の配列表に
   示される塩基配列を含むか、あるいはその一部で表され
   る請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のＤＮＡ塩基配列
   を大腸菌の宿主・ベクター系で用いられるベクターに組
   み込んだ組み替えＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組み替えＤＮＡ分子で形
   質転換された大腸菌。
5. 【請求項５】 配列番号１の配列表に示されるアミノ酸
   配列を有するタンパク質。
6. 【請求項６】 配列番号１の配列表に示されるアミノ酸
   配列のアミノ末端の１アミノ酸を欠失したアミノ酸配列
   を有するタンパク質。
7. 【請求項７】 配列番号１の配列表に示されるアミノ酸
   配列のアミノ末端の３アミノ酸を欠失したアミノ酸配列
   を有するタンパク質。
8. 【請求項８】 請求項１または２記載のＤＮＡ塩基配列
   を動物細胞の宿主・ベクター系で用いられるベクターに
   組み込んだ組み替えＤＮＡ分子。
9. 【請求項９】 請求項８記載の組み替えＤＮＡ分子で形
   質転換された動物細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の形質転換体を培養し、
    培養液から請求項５、６または７記載のタンパク質を採
    取することを特徴とするタンパク質の製造方法。