IT9048315A1 - Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina umana con proprieta' regolative dell'angiogenesi - Google Patents
Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina umana con proprieta' regolative dell'angiogenesi Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE a corredo della domanda di brevetto per invenzione dal titolo:
"Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina umana con proprietà regolative dell'angiogenesi"
La presente invenzione riguarda una sequenza di nucleotidi codificante per una proteina umana con proprietà regolative dell'angiogenesi.
Più in particolare la presente invenzione si riferisce all’isolamento e alla caratterizzazione molecolare di un gene codificante per una nuova proteina con proprietà di fattore angiogenico, regolante in vivo la formazione e/o la rigenerazione dei vasi del sistema vascolare dei vertebrati, nonché alla stessa proteina. L'invenzione si riferisce anche a vettori contenenti tale sequenza o porzioni di essa, a cellule procariotiche e eucariotiche trasformate con tali vettori, nonché all'uso di tali vettori e di tali cellule per la produzione della proteina e di anticorpi policlonali e/o monoclonali corrispondenti.
Come è noto, i fattori di crescita sono polipeptidi sintetizzati e secreti da cellule di mammifero capaci di agire non solo sulla proliferazione ma anche sul differenziamento e sulla morfogenesi delle cellule bersaglio. E' stato infatti dimostrato come alcuni fattori di crescita esercirtino la loro azione regolando meccanismi quali la chemiotassi, l'attivazione delle cellule del sistema infiammatorio e il riparo dei tessuti (Whitman, M. and Melton, D.A., 1989, Annu. Rev. Celi Biol., 5, 93-117).
A causa del fenotipo simile tra cellule stimolate in coltura con fattori di crescita e cellule trasformate da retrovirus, è stato proposto che meccanismi comuni controllino tali fenomeni. Infatti, il legame di un fattore di crescita al proprio specifico recettore, presente sulla superficie cellulare della cellula bersaglio, attiva indirettamente proteine regolatrici dell'attività genica, attraverso reazioni intermedie che coinvolgono diverse protein-chinasi. Molti dei componenti di questa catena metabolica sono stati identificati come corrispondenti cellulari di geni oncogeni virali, suggerendo come questi ultimi interferiscano con i normali processi cellulari.
A tutt'oggi sono stati identificati molti fattori di crescita, ne sono stati clonati i geni corri spondenti, e sono stati raggruppati in base ad attività simili e/o ad omologie di sequenze in famiglie, tra cui quella dei fattori angiogenici.
L ' angiogenesi, o formazione dei vasi del sistema vascolare, è un processo complesso che ha luogo durante l'embriogenesi, la rimarginazione di ferite e la rigenerazione di organi. Inoltre, alcune patologie, come la crescita di tumori solidi, alcune retinopatie e l'artrite reumatoide inducono una angiogenesi aberrante (Risau W. 1990, Progress in Growth Factor Research, 2, 71-79).
Il processo di formazione o di rigenerazione dei vasi, in vivo, è costituito da diversi stadi, di cui due degli eventi chiave sono rappresentati dalla migrazione e dalla proliferazione di cellule endoteliali adibite alla formazione dei vasi.
Negli ultimi anni sono stati identificati diversi fattori angiogenici e ne sono stati clonati i corrispondenti geni. Tra questi vi sono quelli codificanti: un fattore di crescita con proprietà angiogeniche , denominato angiogenina, oggetto della domanda di brevetto PCT N. 8701372; il fattore di crescita endoteliale derivato dalle piastrine, PD-ECGF (Ishigawa et al., 1989, Nature, 338, 557); il fattore di permeabilità vascolare umano, VPF, (Keck et al., 1989, Science, 246, 1309), clonato anche nel topo con la denominazione di fattore di crescita vascolare endoteliale, VEGF, (Leung et al., 1989, Science, 246, 1306); i fattori di crescita per fibroblasti acido, a-FGF, e basico, b-FGF, i fattori di crescita trasformanti alfa, TGF-α e beta, TGF-/0,(Folkman and Klagsburn, 1987, Science, 235, 442).
Tali fattori sono stati divisi in due gruppi, secondo che essi agiscano direttamente sulle cellule endoteliali vascolari per stimolarne la motilità o la mitosi, o indirettamente su cellule produttrici di fattori di crescita di cellule endoteliali .
Un'analisi in vitro dei meccanismi di azione dei fattori angiogenici ha evidenziato come essi esercitino effetti differenti sulla motilità e sulla proliferazione delle cellule endoteliali. Infatti, alcuni di essi stimolano solo uno dei due eventi, altri entrambi, altri ancora sembrano non avere alcun effetto in vitro, alcuni infine mostrano persino un'attività inibitrice della proliferazione cellulare endoteliale. Tali dati indicano come la regolazione dell'angiogenesi sia un processo complesso mediato da componenti differenti, di cui molti non ancora identificati.
E' stato anche suggerito come i fattori angionenici contribuiscano al processo di rimarginazione delle ferite e all'accrescimento di tumori solidi.
E' evidente quindi l'esigenza di poter disporre di nuovi fattori angiogenici capaci di stimolare la migrazione e il differenziamento delle cellule endoteliali, da utilizzare in campo diagnostico, come marcatori tumorali e nelle malattie infiammatorie, e in campo terapeutico, per uso topico o interno, per esempio nel trattamento delle ferite, dei tessuti in fase post-operatoria, dei trapianti, delle ustioni, delle ulcere, ecc.. Tali fattori possono essere utilizzati con successo anche in vitro, come stimolatori di colture cellulari.
Inoltre la tecnica del DNA ricombinante permette di produrre tali fattori in quantità adeguate in tempi brevi e con costi notevolmente ridotti.
Tuttavia, i risultati fino ad oggi ottenuti sono ben lontani dal fornire un quadro chiaro e completo dei fattori e dei meccanismi che regolano l'angiogenesi, limitando cosi le potenziali utilizzazioni in campo diagnostico e terapeutico. Infatti vi è una crescente esigenza di identificare nuovi marcatori tumorali specifici, a causa dell'incertezza nelle diagnosi dei tumori. Inoltre procedure sperimentali di produzione di proteine ibride (Fitgerald D. and Pastan I., 1989, J. Nati. Cancer Inst. 81, 1455-1463) e/o anticorpi coniugati (Pearson, J.W. et al., 1989 Cancer Res. 49, 3562-3567) con molecole tossiche stanno dando dei promettenti risultati nel campo della sieroterapia tumorale, con una crescente domanda di nuovi fattori da saggiare. Infine molti dei geni per fattori angiogenici sono stati clonati partendo da cellule tumorali, mentre risulta evidente la migliore applicabilità in campo terapeutico di geni provenienti da materiale non neoplastico.
La presente invenzione si propone pertanto di fornire sequenze di nucleotidi codificanti per una proteina con attività regolativa dell'angiogenesi, ottenute da tessuto non neoplastico, vettori contenenti tali sequenze, cellule trasformate da tali molecole producenti una proteina con attività biologiche e/o immunologiche di un nuovo fattore angiogenico, nonché la stessa proteina, da utilizzare in campo diagnostico e terapeutico.
La presente invenzione si propone anche di fornire un procedimento per ottenere la proteina o parti di essa per via ricombinante, nonché la sua utilizzazione come antigene per la produzione di anticorpi policlonali o monoclonali corrispondenti.
Infatti, sonde molecolari contenenti sequenze codificanti per il fattore angiogenico oggetto della presente invenzione possono essere utilizzate come marcatori nella diagnosi di patologie legate ad una sua aberrante produzione, come accade per altri fattori angiogenici in alcune patologie tumorali.
Inoltre la proteina oggetto della presente invenzione può essere utilizzata nella terapia delle malattie infiammatorie, nel trattamento delle ferite, dei tessuti in fase post-operatoria, dei trapianti, delle ustioni, delle ulcere, ecc.. Tale fattore può essere utilizzato con successo anche in vitro, come stimolatore della crescita di colture cellulari.
Infine la tecnica del DNA ricombinante utilizzata nella presente invenzione permette la produzione delle sonde molecolari e delle proteine descritte in quantità adeguate, in tempi brevi e con costi notevolmente ridotti.
Le catene nucleotidiche e aminoacidiche oggetto della presente invenzione potranno essere utilizzate sia come derivati direttamente dalla cellula ospite, che dopo opportune modificazioni per una loro migliorata produzione per composizioni da utilizzare sia per saggi diagnostici che per. scopi terapeutici.
Formano pertanto, oggetto della presente, invenzione sequenze di nucleotidi codificanti per una proteina, denominata d'ora in poi PIGF, con. proprietà immunogeniche e/o biologiche di fattore regolativo dell'angiogenesi, avente la seguente sequenza di aminoacidi:
Oggetto della presente invenzione sono anche sequenze di nucleotidi codificanti per la. proteina. PIGF mancante,e/o sostituita in uno o più aminoacidi preferibilmente deleta dall'aminoacido 1 al 31; fanno parte, della, presente invenzione anche sequenze di nucleotidi che sono derivati alleici della sequenza descritta, cosi come se-_ quenze di nucleotidi complementari a quelle descritte.
Sempre secondo l'invenzione la sequenza di nucleotidi può essere covalentemente legata ad una sequenza di nucleotidi traducibile in una sequenza di aminoacidi utilizzando la stessa cornice di lettura del gene codificante per PIGF, preferibilmente non interferente con l'attività regolativa dell 'angiogenesi di PIGF, ancora più preferibimente codificante per una porzione proteica con attività tossica.
Formano oggetto della presente invenzione
sequenze di nucleotidi aventi la seguente formula
(d'ora in poi seq. nucl.1):
anche mancante e/o sostituita in uno o più nucleotidi, codificanti per la sequenza di aminoacidi
indicata, corrispondente alla proteina PIGF.
Oggetto della presente invenzione sono anche sequenze di nucleotidi che ibridizzano con la
sequenza descritta o con parti di essa, sequenze di _ nucleotidi ottenute mediante metodi sia naturali o
sintetici o semi-sintetici, per mutazioni di sostituzione, di delezione, di inserzione e di inversione, sia concernenti,basi.singole che multiple, di
qualsiasi delle sequenze descritte o parti di esse,
e sequenze di nucleotidi comprendenti sequenze
codificanti per una proteina con proprietà immunogene e/o biologiche simili a quelle esibite dalla
proteina PIGF o parti di essa.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda la proteina PIGF avente la sequenza
descritta, ottenuta con tecniche di DNA ricombinante, cosi come isolata da tessuti biologici. Tale
proteina, o parti di essa immunologicamente attive,
possono essere utilizzate come antigeni nella
produzione di anticorpi policlonali e/o monoclonali .
Formano oggetto della presente invenzione
anche vettori di clonaggio e/o di espressione, sia procariotlci che eucariotlcl, contenenti le sequenze di nucleotidi descritte, sequenze promotrici della trascrizione posizionate a monte di esse e, in generale, un marcatore selettivo. Preferibilmente possono essere presenti sequenze promotrici della trascrizione in modo inducibile, intensificatori (enhancers), segnali di poiiadeni1azione, ecc ..
Sempre oggetto della presente invenzione sono cellule procariotiche ed eucariotiche trasformate con tali vettori utilizzate, nel caso di vettori di espressione, per la produzione della proteina PIGF o parti di essa.
A titolo di esempio illustrativo ma non limitativo la presente invenzione verrà ora descritta in relazione all1isolamento e all'identificazione della sequenza del cDNA codificante per la proteina PIGF, alla dimostrazione della presenza dell'mRNA specifico corrispondente in alcuni tessuti, al mappaggio cromosomico del gene codificante per essa, ai subclonaggio del cDNA in un vettore di espressione procariotico e alla produzione della proteina PIGF in un ceppo batterico di E. coli.
In quanto segue si farà riferimento alle seguenti figure in cui:
la figura 1 rappresenta la mappa di restri- . .zione del fago λ GT11 ricombinante, comprendente il .frammento sub 32;
la figura 2 rappresenta un esperimento di "Northern blot" che utilizza come sonda molecolare^ il frammento di cDNA sub 32;
la figura 3 rappresenta la mappa di restrizione del plasmide pPlGF-2;
la figura 4 rappresenta uno schema esemplificativo del subclonaggio di un frammento codificante per parte della proteina PIGF nel vettore di espressione pET3 (Novagen, Madison WI, USA);
la figura 5 rappresenta un'elettroforesi su gel di poiiacri1ammide della proteina PIGF, prodotta per via ricombinante.
Isolamento del cDNA codificante per un nuovo fattore angiogenico.
A tale scopo un primo frammento di cDNA, denominato sub 32, è stato isolato da un clone di una genoteca di cDNA da placenta umana, costruita nel vettore λGT11 secondo metodiche convenzionali e utilizzata anche in altrilaboratori (Wataneb et al. J. BioL.Chem.264,12611-19,1989).
In breve, l'RNA è stato estratto mediante lisi con guanidina tiocianato e centrifugazione su gradiente discontinuo di cloruro di cesio (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition. Vol. 1, 7.19. Cold Spring Harbor Lab. Press). Il poli A* RNA è stato purificato mediante cromatografia su oligo dT cellulosa (ibid. 7.26). La sintesi di cDNA e il clonaggio nel vettore fagico λ GT11 (Stratagene, La Jolla Ca. USA) nel sito di restrizione Eco R1 è _stata fatta seguendo il protocollo descritto in ibid. 8.54-8.79. Un clone, la cui mappa è mostrata in fig. 2, è stato identificato perchè contenente, tra l'altro, una sequenza di 2600 nucleotidi capace di ibridare in 5x SSC a 65 “C, secondo la metodica di ibridazione su filtro descritta in ibid. 8.46, con una sequenza codificante per il cDNA dell'enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6P0) (Persico, M. et al., 1986, Nucl. Acid Res., 14, 2511). Da questo fago ricombinante è stato isolato anche un frammento di 240 nucleotidi, dopo digestione con Eco R1 e Barn HI, denominato sub 32. Tale frammento, dopo marcatura con 32P mediante la tecnica della "nick translation" descritta in ibid. 10.6-10.8, è stato utilizzato per:
a) analizzare RNA estratti da diversi tessuti e linee cellulari usando la tecnica del "Northern blot" descritta in ibid. 7.37. I risultati mostrati in fig. 2 dimostrano come il frammento sub 32 evidenzi mRNA presente nella placenta (riga 2 ), in cellule di epatoma HEPG2, ATCC N. HB8065, (riga 3), in cellule di coriocareinoma JEG, ATCC N. HTB36 (riga 4) e, in minore quantità in cellule Mela S3, ATCC N. CCL2.2 (riga 5), ma non in cellule HL60 , ATCC N. CCL240 (riga 1);
b) sondare una genoteca di cDNA da cellule di coriocarcinoma umano JEG, ATCCN.HTB36, costruita secondo le metodiche descritte per la genoteca di cDNA da placenta umana, nel vettore λGT10 (Stratagene, La Jolla Ca. USA) nel sito di restrizione Eco R1. A seguito di ibridizzazione della sonda radioattiva in condizioni analoghe a quelle sopra descritte, due cloni sono stati isolati, digeriti con l'enzima Eco R1 e subclonati nel vettore pUC 18 (Stratagene, La Jolla Ca. USA). La sequenza di tali frammenti è stata determinata con il metodo di Sanger (ibid. 13.6-13.10). Tali frammenti di cDNA, che si sovrapponevano parzialmente tra loro, non comprendevano l'intera sequenza codificante per l'mRNA corrispondente.
Sono stati utilizzati, quindi, per una seconda ibridazione, utilizzando le medesime tecniche, al fine di ottenere un clone contenente l'intera informazione codificante. La genoteca utilizzata è stata la stessa di cDNA da placenta umana, da cui proveniva il frammento iniziale sub 32. Sono stati isolati quindi due cloni, il loro DNA è stato digerito con Eco R1, gli inserti risultanti sono stati subclonati nel vettore pGem 1 (Promega Corporation, Madison WI. USA) e la loro sequenza determinata con il metodo di Sanger. I due frammenti di DNA ottenuti dopo digestione con Eco R1 sono stati riligati insieme mediante T4 ligasi e.clonati nello stesso vettore pGEM 1 nel sito Eco R.1, per.ricostituire l’intera sequenza di cDNA corrispondente.al mRNA presente in placenta in _un solo._ plasmide, denominato pPLGF-2 (ATCC Dep. No.40892 ), la cui mappa è mostrata in fig. 3.
Al fine di confermare che il frammento risultante coprisse l'intera sequenza codificante, la sua sequenza è stata confrontata con la sequenza di un frammento genomico, ottenuto dopo ibridazione dello stesso frammento con una genoteca di DNA da fibroblasti umani WI38 (No. 944201 Stratagene, La Jolla Ca. USA) nel vettore λfix.
La sequenza del cDNA è stata identificata secondo il metodo di Sanger (ibid. 13.3-13.10) ed ha evidenziato:
a) una regione al 5' non tradotta di 321 nucleotidi comprendente una sequenza capace di formare una struttura secondaria tipo stelo-anello (stem-loop), indicativa di un segnale di regolazione della traduzione;
b) una sequenza di 447 nucleotidi a cornice di lettura aperta, codificante per una proteina di 149 aminoacidi, comprendente una sequenza idrofobica di 32 aminoacidi al terminale, indicativa di un peptide segnale caratteristico delle proteine secrete ;
c) una regione al 3' non tradotta di 877 nucleotidi comprendente un sito di poliadenilazione.
La sequenza di aminoacidi dedotta dalla sequenza del cDNA è stata inserita nella banca dati dell 'European Molecular Biology Laboratory {EMBL), rivelando nessuna proteina nota con la stessa sequenza, ma un'omologia del 50%, ristretta a 120 aminoacidi, con il fattore di permeabilità vascolare VPF (Keck et al., 1989, Science, 246, 1309), un potente fattore angiogenico, suggerendo cosi come la nuova proteina PIGF possa avere essa stessa un'attività regolativa dell'angiogenesi.
Infine il gene codificante per la proteina PIGF è stato mappato sul cromosoma 14, mediante "Southern blot" utilizzando DNA proveniente da differenti linee ibride cellulari contenenti ciascuna differenti cromosomi umani (non mostrato). Subclonaggio del cDNA codificante per PIGF in un vettore di espressione procariote
Uno schema della strategia di subclonaggio è mostrata in fig. 4, in cui è stato usato il vettore pET3 (Novagen MacH son Wi. USA), contenente essenzialmente il promotore della RNA polimerasi del fago T7, il terminatore dello stesso fago, l'origine della replicazione (ori) e la resistenza al l'ampicillina (amp).
L'inserto di cDNA da subclonare in esso è stato ottenuto secondo la metodica della reazione a catena delle polimerasi PCR (ibid. 14.6) in modo che venissero sintetizzati i nucleotidi codificanti la proteina, mancante dei primi 31 aminoacidi. A tal fine è stato usato come stampo il frammento di DNA ottenibile mediante digestione con l'enzima Eco R1 dal nucleotide 1 al nucleotide 940. Come inneschi (primer) per la RNA-polimerasi sono stati utilizzati i seguenti oligonucleotidi, ottenuti mediante sintesi con un sintetizzatore di oligonucleotidi Applied Biosystem 381A:
- 01igonucleotide A complementare all'elica di cDNA codificante dal nucleotide 768 al nucleotide 787, in cui è stata inserita la sequenza GGATCC, sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione Barn H1, tra i nucleotidi 775 e 776, avente la seguente sequenza :
Oligonucleotide B complementare all'elica di cDNA -non codificante dal- nucleotide 404 al nucleotide-421, in cui è stata inserita tra i nucleotidi 414 e.
415 la sequenza CATATG, sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione Nde 1, avente la seguen-. te sequenza:
La catena di nucleotidi ottenuta dalla PCR è stata sottoposta a digestione con gli enzimi di restrizione Nde 1 e Barn H1 e ligata con il vettore di espressione procariotico pET3 negli stessi siti Nde 1 e Bam H1, secondo protocollo standard. Il prodotto della reazione di ligazione è stato utilizzato per trasformare il ceppo di E. coli HB101 reso competente con il metodo del CaCl2 . Il plasmide ricombinante è stato identificato e utilizzato per trasformare il ceppo di E. coli JM109 (DE3, Promega Corporation, Madison Wi. USA).
Sintesi ed isolamento della proteina PIGF da batteri
Una colonia del ceppo è stata inoculata in brodo LB contenente 100 μg/ml .di ampicillina (.Sigma, St. Louis, Mo. USA) e 4 g/1 di glucosio e lasciata crescere a 37°C fino ad una densità ottica 0.D.=0.35 a 600 nm. E' stato aggiunto IPTG (Sigma) ad una concentrazione finale di 1 mM e la coltura incubata a 37°C per altre 3 ore. La coltura è stata centrifugata e risospesa in 1/10 del volume iniziale di un tampone contenente 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE). In seguito a ulteriore centrifugazione il precipitato è stato risospeso in 1/60 del volume iniziale in un tampone di lisi contenente TE, 1% SDS, 0.1 M NaCl. I batteri sono stati suddivisi in aliquote di 500 μl e lisati in seguito a 3 cicli di congelamento e scongelamento seguiti da sonicazione a media intensità.
Un esempio del quadro elettroforetico risultante è mostrato in fig. 5 in cui le linee 1, 2, 3 e 4 rappresentano i quadri elettroforetici di proteine dei lisati del ceppo descritto rispettivamente dopo 0, 1, 2 e 3 ore dall'induzione con IPTG.
La linea 5 è invece il controllo rappresentato dallo stesso ceppo trasformato con il solo vettore mancante di inserto, indotto con IPTG per 3 ore. L'elettroforesi è stata eseguita secondo Laemmli, Nature, 227, 680-685, 1970, in un gel di 15% poli-, acrilammide colorato con il metodo descritto da. Bradley et al. Anal. Biochem. 182,.157-159, 1989.
La presente invenzione è stata descritta con riferimento specifico ad alcune sue forme preferite di realizzazione, ma è da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.
Claims (51)
- RIVENDICAZIONI 1. Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina con attività regolativa dell'angiogenesi avente la seguente sequenza di aminoacidi:
- 2. Sequenza di nucleotidi codificante,.per., una proteina con attività regolativa dell'angioge-. nesi secondo la rivendicazione 1 in cui detta Proteina è mancante diuno o più aminoacidi.
- 3.Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina secondo la rivendicazione 2 in cui detta proteina ha una alterata attività regolativa dell 'angiogenesi.
- 4. Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina secondo le rivendicazioni 2 o 3 in cui detta proteina è deleta dall'aminoacido 1 all'aminoac ido 31.
- 5. Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina con attività regolativa dell'angiogenesi secondo la rivendicazione 1 in cui a detta proteina sono stati sostituiti uno o più aminoacidi .
- 6. Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina secondo la rivendicazione 5 in cui detta proteina ha una alterata attività regolativa dell'angiogenes i.
- 7. Sequenza di nucleotidi codificante per una proteina con attività regolativa dell'angiogennesi in cui detta proteina è un derivato alleiico della sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 1.
- 8. Sequenza di nucleotidi complementare ad una sequenza di nucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
- 9. Sequenza di nucleotidi comprendente la sequenza di nucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti a cui è stata legata covalentemente al 51 o al 31 una sequenza di nucleotidi traducibile nella stessa cornice di lettura.
- 10. Sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 9 in cui la sequenza di nucleotidi legata codifica per una sequenza di aminoacidi non interferenti con l'attività regolativa dell'angiogenesi della proteina.
- 11. Sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 9 o 10 in cui la sequenza di nucleotidi legata codifica per una proteina con attività tossica.
- 12. Sequenza di nucleotidi avente la seguente formula:comprendente una regione al 5' dal nucleotide 1 al nucleotide 321 non tradotta, una regione dal nucleotide 322 al nucleotide 768 che codifica per una proteina avente la sequenza secondo la rivendicazione 1, una regione al 3'.non tradotta.
- 13. Sequenza di nucleotidi. secondo la rivendicazione 12 mancante,di uno o più nucleotidi, codificante per una proteina con..attività regolativa dell'angiogenesi.
- 14. Sequenza di nucleotidi secondo la ri vendicazione 13 codificante per una.proteina con una alterata attività regolativa del.l1angiogenesi.
- 15. Sequenza di nucleotidi secondo le rivendicazioni 13 o 14 deleta dal nucleotide 322 al nucleotide 414.
- 16. Sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 12 in cui sono stati sostituiti uno o più nucleotidi, codificante per una proteina con att ività regolativa dell'angiogenesi.
- 17. Sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 16 codificante per una proteina con una alterata attività regolativa dell'angiogenesi.
- 18. Sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 12 in cui detta sequenza al 5' non tradotta comprende una regione regolatrice della traduzione .
- 19. Sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 18 in cui detta sequenza al 5' forma una struttura secondaria del tipo stelo-anello.
- 20. Sequenza di nucleotidi allelica alla sequenza di nucleotidi secondo la rivendicazione 12.
- 21. Sequenza di nucleotidi complementare ad una sequenza di nucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 12 a 20.
- 22. Proteina avente la sequenza di aminoacidi secondo la rivendicazione 1 con attività regolativa dell'angiogenesi.
- 23. Proteina con attività regolativa dell'angiogenesi secondo la rivendicazione 22 in cui detta proteina è mancante di uno o più aminoacidi.
- 24. Proteina secondo la rivendicazione 23 in cui detta proteina ha una alterata attività regolativa dell'angiogenesi.
- 25. Proteina secondo la rivendicazione 23 o 24 in cui detta proteina è deleta dall'aminoacido 1 all'aminoacido 31.
- 26. Proteina con attività regolativa dell'angiogenesi secondo la rivendicazione 22, in cui a detta proteina sono stati sostituiti uno o più aminoacidi.
- 27. Proteina secondo la rivendicazione 26 in cui detta proteina ha una. alterata attività regolativa dell'angiogenesi.
- 28. Proteina con attività .regolativa dell'angiogenesi in cui detta proteina è un derivato allelico della sequenza di nucleotidi.secondo la rivendicazione 1.
- 29. Proteina comprendente una sequenza di am inoacidi secondo una quaIsiasi delle rivendicazioni da 22 a 28 a cui è covalentemente legata al COOH o al NHg terminale una catena di aminoacidi.
- 30. Proteina secondo la rivendicazione 29 in cui detta catena di aminoacidi non interferisce con l'attività regolativa dell'angiogenesi della proteina .
- 31. Proteina secondo una delle rivendicazioni 29 o 30 in cui detta catena di aminoacidi ha attività tossica cellulare.
- 32. Vettore di clonaggio comprendente: a) l'origine di replicazione di un plasmide batterico, b) un marcatore selettivo, c) un promotore e, sotto il controllo di detto promotore, d) la sequenza di nucleotidi secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 21.
- 33. Vettore secondo la rivendicazione 32 in cui detto marcatore selettivo è il gene codificante per la resistenza ad un antibiotico.
- 34. Vettore secondo una delle rivendicazioni 32 o 33 in cui detto promotore è il promotore della RNA-polimerasi del fago T7.
- 35. Vettore secondo le rivendicazioni da 32 a 34 in cui detto vettore è il plasmide pGem 1.
- 36. Vettore secondo le rivendicazioni da 32 a 34 in cui detto vettore è il plasmide pET3.
- 37. Vettore secondo le rivendicazioni da 32 a 36 comprendente una o più sequenze regolatrici della trascrizione.
- 38. Vettore secondo la rivendicazione 37 in cui dette sequenze comprendono un intensificatore della trascrizione (enhancer).
- 39. Vettore secondo la rivendicazione 37 in cui dette sequenze comprendono un promotore inducibi1e.
- 40. Vettore secondo le rivendicazioni da 32 a 39 comprendente un sito di poiiadenilazione.
- 41. Cellule trasformate con un vettore secondo le rivendicazioni da 32 a 40.
- 42. Cellule secondo la rivendicazione 41 in cui dette cellule sono dei batteri.
- 43. Cellule trasformate secondo la rivendicazione 42 in cui detti batteri sono E.coli.
- 44. Cellule trasformate secondo la rivendicazione 41 in cui dette cellule sono cellule eucariotiche.
- 45. Procedimento per la produzione e per la estrazione della proteina PIGF da cellule secondo le rivendicazioni da 41 a 43 comprendente: crescere la coltura batterica in terreno liquido fino ad una O.D. compresa da 0.2 a 0.6 a 600 nra; indurre con IPTG; centrifugare e risospendere in TE; centrifugare e risospendere in un tampone di lisi; lisare le cellule.
- 46. Procedimento secondo la rivendicazione 45 in cui detto terreno liquido è il brodo LB contenente ampicillina e glucosio.
- 47. Procedimento secondo le rivendicazioni 45 0 46 in cui detta O.D. è compresa tra 0.3 e 0.4.
- 48. Procedimento secondo le rivendicazioni da 45 a 47 in cui detta incubazione con IPTG dura 3 ore.
- 49. Procedimento secondo le rivendicazioni da 45 a 48 in cui detto TE è in un volume pari ad 1/10 di quello della coltura iniziale.
- 50. Procedimento secondo le rivendicazioni da 45 a 49 in cui detto tampone di lisi contiene TE, 1% SDS e 0.1M NaCl, in un volume pari ad 1/60 di quello della coltura iniziale.
- 51. Procedimento secondo le rivendicazioni da 45 a 50 in cui detta lisi avviene per congelamento e scongelamento e/o per sonicazione.
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