JP2020124226A - 細胞構造体、非ヒトモデル動物、非ヒトモデル動物の製造方法、及び被験物質の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物、上記非ヒトモデル動物の製造に有用な細胞構造体、上記非ヒトモデル動物を用いた被験物質の評価方法、並びに上記非ヒトモデル動物の製造方法を提供することである。【解決手段】本発明によれば、生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、がん疾患に対する非ヒトモデル動物の製造に有用な細胞構造体に関する。本発明はさらに、がん疾患に対する非ヒトモデル動物及びその製造方法に関する。本発明はさらに、上記非ヒトモデル動物を用いた被験物質の評価方法に関する。

がんの一例である膵臓がんは平均生存期間が３〜６ヶ月という難治性がんである。膵臓がんなどのがん治療薬の開発には種々の動物モデルが利用されている。例えば、ヒト膵がん細胞を免疫不全マウスに移植する異種移植（Xenograft）モデルである担がんマウスモデルが用いられている。しかし、特に膵臓がんなどのある種のがんは、間質が豊富で線維化が顕著であることから、上記のような動物モデルでは、十分な間質組織が発達せず、実際の膵臓がんの状態とはかなり異なり、結果として、有効ながん治療薬の開発には適さないことが分かってきている。実際の所、上記の動物モデルにより有効な治療薬であるとして開発されたゲムシタビンが、ヒトで十分な有効性を示さかったことが知られている。その原因が、実際の膵臓がんは間質（stroma tissue）が線維性で血管に乏しいことから、ゲムシタビンががん細胞に届かないことに起因すると報告されている（非特許文献１）。

一方、特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献１に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。また、特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。

Science 324:1457-1461, 2009 Inhibition of Hedgehog Signaling Enhances Delivery of Chemotherapy in a Mouse Model of Pancreatic Cancer

国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号 特開２０１４−１２１１４号公報

膵臓がんなどのがんの評価モデルとして豊富な間質組織を有した評価モデルを提供するために、がん患者由来の腫瘍組織をマウスに移植することで、間質を有するがん評価モデルを得る試みがなされており、PDX（Patient-derived xenograft：患者由来異種移植）として多くの研究がなされている。しかしながら、実際には十分な間質組織が形成されないことが分かってきた。がん患者検体由来の腫瘍組織は、腫瘍組織中の複数種類の細胞や細胞外マトリックスなどの混合物であることから、内容物の組成が特定できず、結果として間質形成が豊富であったり、貧困であったりと、評価モデルで得られる結果がばらつく原因となる。また、がん患者由来組織を用いることから、安定して増幅させることも不可能であり、同一評価モデルとして使用できる検査数に限界があるという問題もある。

上記の通り、がんをインビボで評価することができる、豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物の開発が望まれていた。本発明は、豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記非ヒトモデル動物の製造に有用な細胞構造体、上記非ヒトモデル動物を用いた被験物質の評価方法、並びに上記非ヒトモデル動物の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞及び間葉系細胞とを含む細胞構造体を作製し、上記細胞構造体をマウスに移植することによって、豊富な間質組織を有するがんインビボ評価モデル動物を製造できること見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１） 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体。
（２） 非ヒトモデル動物の作製のために非ヒト動物に移植される、（１）に記載の細胞構造体。
（３） 上記がん細胞が株化されたがん細胞である、（１）又は（２）に記載の細胞構造体。
（４） 上記がん細胞が、膵臓がん細胞である、（１）から（３）の何れか一に記載の細胞構造体。
（５） 上記間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、（１）から（４）の何れか一に記載の細胞構造体。

（６） 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、（１）から（５）の何れか一に記載の細胞構造体。
（７） リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、（６）に記載の細胞構造体。
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
（８） リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（６）又は（７）に記載の細胞構造体。

（９） 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含み、複数個上記記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を移植物として有する、がん疾患に対する非ヒトモデル動物。
（１０） 上記がん細胞が株化されたがん細胞である、（９）に記載の非ヒトモデル動物。
（１１） 上記がん細胞が、膵臓がん細胞であり、上記がん疾患が膵臓がんである、（９）又は（１０）に記載の非ヒトモデル動物。
（１２） 上記間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、（９）から（１１）の何れか一に記載の非ヒトモデル動物。
（１３） 細胞構造体の移植部位が皮下である、（９）から（１２）の何れか一に記載の非ヒトモデル動物。
（１４） 免疫力が低下しているか、または免疫不全である、（９）から（１３）の何れか一に記載の非ヒトモデル動物。

（１５） （１）から（８）の何れか一に記載の細胞構造体を、非ヒト動物に移植することを含む、がん疾患に対する非ヒトモデル動物の製造方法。
（１６） （９）から（１４）の何れか一に記載の非ヒトモデル動物に被験物質を投与することを含む、被験物質の評価方法。

本発明の細胞構造体は、豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物の作製に有用である。本発明の非ヒトモデル動物は、豊富な間質組織を有することから、がん疾患に対するモデル動物として有用である。本発明による非ヒトモデル動物及びその製造方法によれば、上記したがん疾患に対するモデル動物を提供することができる。本発明による被験物質の評価方法によれば、薬剤の評価を効率的に行うことができる。

図１は、実施例の条件Ａの液温プロファイルを示す。 図２は、実施例の条件Ｂの液温プロファイルを示す。 図３は、実施例の条件Ｃの液温プロファイルを示す。 図４は、生体親和性高分子ブロックを添加したモザイク細胞塊と、生体親和性高分子ブロックを添加しない細胞塊を顕微鏡観察した結果を示す。 図５は、生体親和性高分子ブロックを添加したモザイク細胞塊、又は生体親和性高分子ブロックを添加しない細胞塊を動物に移植して観察した結果を示す。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体に関する。さらに本発明は、上記細胞構造体を移植物として有するがん疾患に対する非ヒトモデル動物、上記非ヒトモデル動物を用いた被験物質の評価方法、及び上記非ヒトモデル動物の製造方法に関する。
なお、本発明の細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。

本発明においては、生体親和性高分子ブロックとがん細胞及び間葉系細胞とを含む細胞構造体を非ヒト動物に移植することによって、豊富な間質組織を有するがんインビボ評価モデル動物を製造することが可能になった。生体親和性高分子ブロックを使用することなく、がん細胞及び間葉系細胞を含む細胞塊を非ヒト動物に移植してモデル動物を製造した場合と比較して、より豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物を製造することが可能になったことは、本発明により初めて見出された知見であり、従来からは全く予想できない意外なことである。

本発明が達成されたことによって、その結果から考えると、生体親和性高分子ブロックは、がん細胞と間葉系細胞の生着に寄与すると同時に、がん細胞と間葉系細胞の間に適度なスペースを供与することによって、間質形成するための場を上手く提供できているのではないかと考えられた。間質形成するための場が提供されることによって、間葉系細胞とがん細胞だけでは生まれてこなかった間質組織が形成されていったと考察することができる。

（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体性親和性高分子
生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、及びＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的にはリコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。

リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成セラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。

化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記の（１−３）リコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。

本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ_４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。

本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。

本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。

（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。

酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。

架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。但し、Ｔ〔ケルビン：Ｋ〕＝ｔ〔セルシウス度：℃〕＋２７３．１５である。

（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。

リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。

リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。

リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。

一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。

一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。

本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。

本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。

リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。

好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）_ｎ］_ｍ−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。

より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、 式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）_６３］_３−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。

繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。

本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオン及びアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。

好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。

本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである。

「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。

本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。

（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。

本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上７００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。

ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。

（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。

上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。

生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができる。

生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、又は０．９℃以上でもよい。

工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。

好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。

好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。

工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。

工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。

本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。

（２）細胞
本発明の細胞構造体は、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含む。
がん細胞が由来するがんの具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝臓がん、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がんなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。がん細胞の一例としては、膵臓がん細胞が挙げられる。

本発明で用いるがん細胞は、株化されたがん細胞、又は株化されていないがん細胞のいずれでもよいが、好ましくは、株化されたがん細胞である。
株化されたがん細胞とは、生体より採取した細胞であって、適切な培養条件下で培養した場合にほぼ無限に増殖することができる状態の細胞である。ここでいう適切な培養条件とは、各細胞に応じた温度、栄養分、増殖因子、付着面などが提供される条件を言う。株化されていないがん細胞としては、生体から採取した組織や細胞を最初に播種して培養した細胞である初代培養細胞が挙げられる。
本発明で用いるがん細胞の種類は、１種類でも２種類以上でもよく、好ましくは１又は２種類、さらに好ましくは１種類である・

間葉系細胞とは、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、腱細胞、脂肪細胞、毛乳頭細胞、歯髄細胞などの結合組織の細胞、並びに上記の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。具体的には、繊維芽細胞、毛乳頭細胞、脂肪細胞、歯髄細胞などが挙げられる。間葉系細胞の存在する組織としては、骨、軟骨、筋肉、腱、脂肪組織、毛乳頭、歯髄などが挙げられる。間葉系細胞は、さらに血管、肝臓又は膵臓などの実質臓器の内部や周囲、並びに骨髄や臍帯の中にも存在する。骨髄中には、多くの結合組織細胞への多分化能を有した細胞として間葉系幹細胞が存在する。本発明においては好ましくは、間葉系幹細胞を使用することができる。間葉系細胞は、動物から目的とする組織を摘出し、分離培養を行うことにより得ることができる。
本発明で用いる間葉系細胞の種類は、１種類でも２種類以上でもよく、好ましくは１又は２種類、さらに好ましくは１種類である・

本発明の細胞構造体におけるがん細胞と間葉系細胞との細胞数の比率は、特に限定されないが、好ましくは１０：１〜１：１０であり、より好ましくは５：１〜１：５であり、さらに好ましくは２：１〜１：２である。
本発明の細胞構造体は、がん細胞および間葉系細胞以外に、その他の細胞を含んでいてもよい。その他の細胞としては、血管内皮細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、間質細胞、線維芽細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞などが挙げられるが、特に限定されない。

ある細胞が、上記した所定の細胞であるかどうかの確認は、対象細胞が、各細胞の機能を有するかどうかを確認することにより行うことができ、あるいは対象細胞が、各細胞に特異的なマーカーを発現するかどうかを確認することによっても行うことができるが、特に限定されない。

上記した本発明で使用する各細胞は、各用語の最も広義の範囲を意味するものとし、生体から採取した細胞、生体から採取した細胞に操作（遺伝子導入操作など）を施した細胞、並びに他の細胞からの転換により得られる細胞（例えば、ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞）などのいずれでもよい。

使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。

（３）細胞構造体
本発明においては、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞および間葉系細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能となる。さらに、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元に配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体が形成され、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能となる。

本発明の細胞構造体においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。

また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。

なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能とすることを意味するものである。

本発明の細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。細胞構造体の厚さ又は直径を上記の範囲内とすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達がより良好になる。

本発明の細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。

本発明の細胞構造体は、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞１個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、細胞をより均一に存在させることができる。下限を上記範囲とすることにより、所望の用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。

（４）細胞構造体の製造方法
本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞および間葉系細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、上記細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、細胞と生体親和性高分子ブロックとを混合する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞および間葉系細胞を含有する培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。がん細胞および間葉系細胞を含有する培養液におけるがん細胞と間葉系細胞との細胞数の比率は特に限定されないが、好ましくは１０：１〜１：１０であり、より好ましくは５：１〜１：５であり、さらに好ましくは２：１〜１：２である。

本発明においては、例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックとをモザイク状に配置することができる。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックとからなる細胞構造体の形成を促進又は制御することが好ましい。

用いられる容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。

上記の方法で得られた細胞構造体（モザイク細胞塊）は、例えば、
（ａ）別々に調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造してもよい。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。

例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。

別々に調製した細胞構造体同士を融合させる場合には、例えば、複数個の生体親和性高分子ブロックと複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部又は全部に、一又は複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させることができる。上記（ａ）に記載の通り本発明の細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体も、本発明の範囲内である。

本発明の細胞構造体の製造方法にかかる「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。

上記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径は好ましくは１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。融合後の厚さ又は直径は好ましくは４００μｍ以上３ｃｍ以下であり、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下であり、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。

上記した生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を製造する方法としては、具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部又は全部に、一又は複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする方法を挙げることができる。ここで、「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。

融合させたい細胞構造体同士は、０以上５０μｍ以下の距離に設置することが好ましく、より好ましくは、０以上２０μｍ以下、更に好ましくは０以上５μｍ以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合させることが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。

本発明の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。

細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックの添加するペースは、使用する細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと細胞が細胞構造体の外側へと移動し、細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、細胞の割合が多くなる箇所ができ、細胞の均一性が低くなるため、使用する細胞の増殖速度を考慮し、選択する。

（５）非ヒトモデル動物及びその製造方法
本発明の細胞構造体は、非ヒトモデル動物の製造のために非ヒト動物に移植することができる。本発明の細胞構造体からなる、非ヒトモデル動物の製造のために移植物は、本発明に包含される。さらに本発明によれば、上記した本発明の細胞構造体を移植物として有する、がん疾患に対する非ヒトモデル動物が提供される。
がん疾患に対する非ヒトモデル動物とは、がんを有するモデル動物を意味する。
がん疾患は、好ましくはヒトがん疾患である。

がん疾患としては、「がん細胞が由来するがんの具体例」として、本明細書中上記したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細胞構造体を構成する生体親和性高分子ブロック、がん細胞及び間葉系細胞、並びに好ましい範囲は、本明細書中上記した通りである。

非ヒトモデル動物における細胞構造体の移植部位は特に限定されないが、例えば、皮下、腹腔内、又は器官又は組織（好ましくは、移植するがん細胞が由来する器官又は組織）などが挙げられ、好ましくは皮下である。

細胞構造体を移植する動物としては、非ヒト動物であれば特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物の中では、マウス、ラット、ウサギ又はハムスターなどのげっ歯類が、取り扱いが容易さの観点から好ましい。

また、非ヒト動物としては、免疫力が低下している動物、または免疫不全動物が好ましい。免疫力が低下している非ヒト動物は、細胞構造体が生着可能な程度に免疫力が低下した動物であればよい。例えば、ヌードマウス、ヌードラット、ＳＣＩＤ（severe combined immunodeficiency；重度複合免疫不全症）マウス、ＮＯＤ（non-obese diabetic：非肥満糖尿病）−ＳＣＩＤマウス、ＡＬＹ（遺伝性リンパ節欠損）マウスなどの免疫不全動物を挙げることができ、市販品を使用することもできる。免疫力を低下させるために、非ヒト動物にＸ線などの放射線を照射してもよい。用意する非ヒト動物は例えばマウス又はラットの場合には、４〜１２週齢のものを使用することができる。非ヒト動物は、免疫力低下の度合いに応じて、感染を防御した環境下で飼育することができる。感染防御の目的で、非ヒト動物に抗生剤を投与してもよい。

本発明によれば、上記した本発明の細胞構造体を、非ヒト動物に移植することを含む、がん疾患に対する非ヒトモデル動物の製造方法が提供される。
細胞構造体の移植方法としては、切開、注射、内視鏡などが使用可能である。

細胞構造体は、培地（例えば、Lonza社のMSCGM BulletKit^TM等）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などに懸濁させた状態で、移植部位に移植することができる。
細胞構造体は、非ヒト動物１匹当たり１〜１０００個、好ましくは１〜１００個を移植することができる。
本発明の細胞構造体は、がん細胞を含むことから、本発明の細胞構造体を非ヒト動物に移植することによって、上記非ヒト動物にがんを形成することができる。

本発明の非ヒトモデル動物は、がん治療薬の開発、がん治療効果の検証、がん治療による副作用の検証、がんを検出及びイメジングする試薬の開発などに有用である。

（６）被験物質の評価方法
本発明によれば、上記した本発明の非ヒトモデル動物に被験物質を投与することを含む、被験物質の評価方法が提供される。被験物質として、抗がん剤などのがん治療薬の候補物質を使用する場合には、がん治療薬をスクリーニングすることができる。

本発明による被験物質の評価方法は好ましくは、本発明の非ヒトモデル動物に被験物質を投与する工程；及び上記非ヒトモデル動物におけるがんの病態を評価する工程を含む。

被験物質は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、有機低分子化合物などの化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸、糖質、脂質、細胞抽出物、細胞培養上清、植物抽出物、微生物産生物等が挙げられる。化合物、ペプチド、タンパク質、抗体はそれぞれのライブラリーを使用することもできる。例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー又は抗体ライブラリーなどを使用することができる。

被験物質の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口的投与としては、例えば、静脈内、動脈内又は筋肉内等の全身投与、あるいは局所投与等が挙げられる。被験物質の投与量、投与間隔、投与開始時期、及び投与期間は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、投与対象の非ヒト動物の種類、被験物質の種類等に応じて適宜選択することができる。

非ヒトモデル動物におけるがんの病態を評価する工程においては、がん（腫瘍）を縮小、又はがん（腫瘍）の増大を抑制できる被験物質を、がん治療薬の候補物質として選択することができる。がん（腫瘍）の縮小、又はがん（腫瘍）の増大の抑制は、がん（腫瘍）の大きさ（体積など）を測定することにより評価することができる。あるいは、非ヒトモデル動物におけるがんの病態を評価する工程においては、がんに起因する症状、又はがん関連マーカーの数値を指標にしてもよい。
また、非ヒトモデル動物におけるがんの病態の評価は、被験物質を投与しない非ヒトモデル動物を陰性対照として、評価することができる。
上記のようにして選択された被験物質は、がん治療薬の候補となりうる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造： ＧＡＰ［（ＧＸＹ）_６３］_３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)₃G

[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。

[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。

[温度差の小さい凍結工程、及び乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、及び棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。

条件Ａ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。 棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０^５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。

条件Ｂ：
アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。 棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０^５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。

条件Ｃ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。 棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０^５Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。

[各凍結工程での温度測定]
条件Ａ〜条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。

図１、図２、図３から条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」−「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。

以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。

条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃

条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃

条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃

[実施例３] 生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２で得られた条件Ａ及び条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。

以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。Ｅ及びＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、Ｅ及びＦでは性能に差が見られなかった。以下、実施例３で得られた生体親和性高分子ブロックを「花弁状ブロック」とも称する。以下の実施例では、条件Ａ、サイズ５３〜１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。

[実施例４]細胞構造体の作製（ｈＭＳＣとCapan-1）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ：human mesenchymal stem cell、Lonza社より購入）が終濃度４ｘ１０^５cells/mL、及び株化されたヒト膵・腺がん細胞（Capan-1、ATCCより購入）が終濃度４ｘ１０^５cells/mLとなるように、MSCGM BulletKit^TM培地（会社名：Lonza Japan、製品名MSCGM^TM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit^TM）で調整した細胞懸濁液を用意し、２５μＬずつ混和した。その細胞懸濁液に実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（サイズ５３〜１０６μｍ）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加した。得られた混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ又は直径１．３ｍｍ程度の球状の、生体親和性高分子ブロックとCapan-1とｈＭＳＣからなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇのブロック）。得られたモザイク細胞塊１６個を９６Ｕプレートの１ウェルに集め、更に２４時間静置しモザイク細胞塊が集合した組織を調製した。
また、比較例として、生体親和性高分子ブロックを添加しないで細胞塊（ｈＭＳＣとCapan-1）を作製した。

生体親和性高分子ブロックを添加したモザイク細胞塊と、生体親和性高分子ブロックを添加しない細胞塊を調製した４日後に，１０質量％中性ホルマリン緩衝液にて固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色にて細胞塊を顕微鏡観察した。結果を図４に示す。
生体親和性高分子ブロックを添加しない場合、細胞塊内部ではｈＭＳＣの壊死が観察され、相対的にCapan-1細胞が多く見られた。残ったｈＭＳＣは未分化なままであり、線維芽細胞への分化は弱かった。
生体親和性高分子ブロックを添加した場合、細胞塊内部でもｈＭＳＣは壊死せず、Capan-1細胞とほぼ１：１の割合で生存していた。ｈＭＳＣは不完全ながら線維芽細胞への分化が観察された。

[実施例５]モザイク細胞塊及び細胞塊の移植（動物モデルでの評価）
麻酔下のＮＯＤ−ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病−重度複合免疫不全症）マウス 6週齢メスの皮下に、スパーテル(PPミクロスパーテル アズワン #1-9404-01)を用いて、実施例４で作製したモザイク細胞塊（生体親和性高分子ブロックを添加したもの）又は細胞塊（生体親和性高分子ブロックを添加しないもの）を移入後、挿入部を縫合した。

移植７日後に，麻酔下にて放血と殺を実施し，モザイク細胞塊又は細胞塊を確認した。周辺の皮下組織ごと採取し、１０質量％中性ホルマリン緩衝液にて固定し，定法によりヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製後，顕微鏡観察した。結果を図５に示す。

モザイク細胞塊を移植した場合、花弁状ブロックと考えられる好塩基性構造物の間隙に，線維芽細胞と線維状組織が認められた。線維状組織は比較的豊富で，Capan-1膵がん細胞由来の細胞が島状に存在する間質細胞に富んだ組織形態を示す腫瘍であった(図５の右図)。
細胞塊を移植した場合、ｈＭＳＣ由来と考えられる間葉系組織の中に，Capan-1由来と考えられる腺管構造を呈した細胞が島状に存在していた。モザイク細胞塊を移植したものに比し，線維状組織は乏しかった (図５の左図)。
上記の通り、Capan-1とｈＭＳＣをモザイク細胞塊にして移植した場合に、in vivoで豊富な線維化・間質形成が認められ、ヒト膵臓がんの病態に近いモデルを構築することができた。

Claims (12)

1. 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞を含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、細胞構造体が間葉系細胞を含む、細胞構造体（但し、生体親和性高分子ブロックがシート状と繊維状のものを除く）。
2. 生体親和性高分子ブロックが不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、又は紡錘状である、請求項１に記載の細胞構造体。
3. 生体親和性高分子ブロック一つの大きさが、１μｍ以上７００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞構造体。
4. 生体親和性高分子が、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドである、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞構造体。
5. 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞を含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、生体親和性高分子がリコンビナントゼラチンであり、細胞構造体が間葉系細胞を含む、細胞構造体。
6. 前記がん細胞が株化されたがん細胞である、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞構造体。
7. 前記がん細胞が、膵臓がん細胞である、請求項１から６の何れか一項に記載の細胞構造体。
8. 前記間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞構造体。
9. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から４及び６から８の何れか一項に記載の細胞構造体。
10. 生体親和性高分子が、下記式で示される、請求項１から９の何れか一項に記載の細胞構造体。
    式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
    式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配
    列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立
    にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。
    なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
11. 生体親和性高分子が、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
    は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
    配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からな
    り、かつ生体親和性を有するペプチド；
    の何れかである、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞構造体。
12. 生体親和性高分子ブロックと、がん細胞及び間葉系細胞を含有する培養液との混合物をインキュベートすることを含む、細胞構造体の製造方法。