JP6710211B2 - 細胞構造体、非ヒトモデル動物、非ヒトモデル動物の製造方法、及び被験物質の評価方法 - Google Patents

細胞構造体、非ヒトモデル動物、非ヒトモデル動物の製造方法、及び被験物質の評価方法 Download PDF

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Description

本発明は、がん疾患に対する非ヒトモデル動物の製造に有用な細胞構造体に関する。本発明はさらに、がん疾患に対する非ヒトモデル動物及びその製造方法に関する。本発明はさらに、上記非ヒトモデル動物を用いた被験物質の評価方法に関する。
がんの一例である膵臓がんは平均生存期間が3〜6ヶ月という難治性がんである。膵臓がんなどのがん治療薬の開発には種々の動物モデルが利用されている。例えば、ヒト膵がん細胞を免疫不全マウスに移植する異種移植(Xenograft)モデルである担がんマウスモデルが用いられている。しかし、特に膵臓がんなどのある種のがんは、間質が豊富で線維化が顕著であることから、上記のような動物モデルでは、十分な間質組織が発達せず、実際の膵臓がんの状態とはかなり異なり、結果として、有効ながん治療薬の開発には適さないことが分かってきている。実際の所、上記の動物モデルにより有効な治療薬であるとして開発されたゲムシタビンが、ヒトで十分な有効性を示さかったことが知られている。その原因が、実際の膵臓がんは間質(stroma tissue)が線維性で血管に乏しいことから、ゲムシタビンががん細胞に届かないことに起因すると報告されている(非特許文献1)。
一方、特許文献1には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献1に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献1の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。また、特許文献2には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。
Science 324:1457-1461, 2009 Inhibition of Hedgehog Signaling Enhances Delivery of Chemotherapy in a Mouse Model of Pancreatic Cancer
国際公開WO2011/108517号 特開2014−12114号公報
膵臓がんなどのがんの評価モデルとして豊富な間質組織を有した評価モデルを提供するために、がん患者由来の腫瘍組織をマウスに移植することで、間質を有するがん評価モデルを得る試みがなされており、PDX(Patient-derived xenograft:患者由来異種移植)として多くの研究がなされている。しかしながら、実際には十分な間質組織が形成されないことが分かってきた。がん患者検体由来の腫瘍組織は、腫瘍組織中の複数種類の細胞や細胞外マトリックスなどの混合物であることから、内容物の組成が特定できず、結果として間質形成が豊富であったり、貧困であったりと、評価モデルで得られる結果がばらつく原因となる。また、がん患者由来組織を用いることから、安定して増幅させることも不可能であり、同一評価モデルとして使用できる検査数に限界があるという問題もある。
上記の通り、がんをインビボで評価することができる、豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物の開発が望まれていた。本発明は、豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記非ヒトモデル動物の製造に有用な細胞構造体、上記非ヒトモデル動物を用いた被験物質の評価方法、並びに上記非ヒトモデル動物の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞及び間葉系細胞とを含む細胞構造体を作製し、上記細胞構造体をマウスに移植することによって、豊富な間質組織を有するがんインビボ評価モデル動物を製造できること見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
(1) 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体。
(2) 非ヒトモデル動物の作製のために非ヒト動物に移植される、(1)に記載の細胞構造体。
(3) 上記がん細胞が株化されたがん細胞である、(1)又は(2)に記載の細胞構造体。
(4) 上記がん細胞が、膵臓がん細胞である、(1)から(3)の何れか一に記載の細胞構造体。
(5) 上記間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、(1)から(4)の何れか一に記載の細胞構造体。
(6) 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、(1)から(5)の何れか一に記載の細胞構造体。
(7) リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、(6)に記載の細胞構造体。
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
(8) リコンビナントゼラチンが、
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである、(6)又は(7)に記載の細胞構造体。
(9) 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含み、複数個上記記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を移植物として有する、がん疾患に対する非ヒトモデル動物。
(10) 上記がん細胞が株化されたがん細胞である、(9)に記載の非ヒトモデル動物。
(11) 上記がん細胞が、膵臓がん細胞であり、上記がん疾患が膵臓がんである、(9)又は(10)に記載の非ヒトモデル動物。
(12) 上記間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、(9)から(11)の何れか一に記載の非ヒトモデル動物。
(13) 細胞構造体の移植部位が皮下である、(9)から(12)の何れか一に記載の非ヒトモデル動物。
(14) 免疫力が低下しているか、または免疫不全である、(9)から(13)の何れか一に記載の非ヒトモデル動物。
(15) (1)から(8)の何れか一に記載の細胞構造体を、非ヒト動物に移植することを含む、がん疾患に対する非ヒトモデル動物の製造方法。
(16) (9)から(14)の何れか一に記載の非ヒトモデル動物に被験物質を投与することを含む、被験物質の評価方法。
本発明の細胞構造体は、豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物の作製に有用である。本発明の非ヒトモデル動物は、豊富な間質組織を有することから、がん疾患に対するモデル動物として有用である。本発明による非ヒトモデル動物及びその製造方法によれば、上記したがん疾患に対するモデル動物を提供することができる。本発明による被験物質の評価方法によれば、薬剤の評価を効率的に行うことができる。
図1は、実施例の条件Aの液温プロファイルを示す。 図2は、実施例の条件Bの液温プロファイルを示す。 図3は、実施例の条件Cの液温プロファイルを示す。 図4は、生体親和性高分子ブロックを添加したモザイク細胞塊と、生体親和性高分子ブロックを添加しない細胞塊を顕微鏡観察した結果を示す。 図5は、生体親和性高分子ブロックを添加したモザイク細胞塊、又は生体親和性高分子ブロックを添加しない細胞塊を動物に移植して観察した結果を示す。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体に関する。さらに本発明は、上記細胞構造体を移植物として有するがん疾患に対する非ヒトモデル動物、上記非ヒトモデル動物を用いた被験物質の評価方法、及び上記非ヒトモデル動物の製造方法に関する。
なお、本発明の細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊(モザイク状になっている細胞塊)と称する場合もある。
本発明においては、生体親和性高分子ブロックとがん細胞及び間葉系細胞とを含む細胞構造体を非ヒト動物に移植することによって、豊富な間質組織を有するがんインビボ評価モデル動物を製造することが可能になった。生体親和性高分子ブロックを使用することなく、がん細胞及び間葉系細胞を含む細胞塊を非ヒト動物に移植してモデル動物を製造した場合と比較して、より豊富な間質組織を有する非ヒトモデル動物を製造することが可能になったことは、本発明により初めて見出された知見であり、従来からは全く予想できない意外なことである。
本発明が達成されたことによって、その結果から考えると、生体親和性高分子ブロックは、がん細胞と間葉系細胞の生着に寄与すると同時に、がん細胞と間葉系細胞の間に適度なスペースを供与することによって、間質形成するための場を上手く提供できているのではないかと考えられた。間質形成するための場が提供されることによって、間葉系細胞とがん細胞だけでは生まれてこなかった間質組織が形成されていったと考察することができる。
(1)生体親和性高分子ブロック
(1−1)生体性親和性高分子
生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、及びMPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的にはリコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、1.「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で現わされる、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、及びHAV配列)ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成セラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてFmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基)を使用するFmoc基合成法、並びにアミノ基の保護としてBoc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基)を使用するBoc基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記の(1−3)リコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「1/IOB」値は、0から1.0が好ましい。より好ましくは、0から0.6であり、さらに好ましくは0から0.4である。IOBとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173(1954)、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725(1957)、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82(1981)等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン(CH4)とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値(OV)、無機性値(IV)を求め、この値を、有機性値をX軸、無機性値をY軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるIOBとは、有機概念図における有機性値(OV)に対する無機性値(IV)の比、すなわち「無機性値(IV)/有機性値(OV)」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」(甲田善生等著、三共出版、2008)を参照されたい。本明細書中では、IOBの逆数をとった「1/IOB」値で親疎水性を表している。「1/IOB」値が小さい(0に近づく)程、親水性であることを表す表記である。
本発明で用いる高分子の「1/IOB」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity(GRAVY)値で表される親疎水性指標において、0.3以下、マイナス9.0以上であることが好ましく、0.0以下、マイナス7.0以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity(GRAVY)値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のGRAVY値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
(1−2)架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素(株)製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業(株)製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子(Factor XIIIa、Haematologic Technologies, Inc.社)などが挙げられる。
架橋(例えば、熱架橋)を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−100℃〜500℃であり、より好ましくは0℃〜300℃であり、更に好ましくは50℃〜300℃であり、更に好ましくは100℃〜250℃であり、更に好ましくは120℃〜200℃である。但し、T〔ケルビン:K〕=t〔セルシウス度:℃〕+273.15である。
(1−3)リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に2配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症(BSE)などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは2000以上100000以下(2kDa以上100kDa以下)であり、より好ましくは2500以上95000以下(2.5kDa以上95kDa以下)であり、さらに好ましくは5000以上90000以下(5kDa以上90kDa以下)であり、最も好ましくは10000以上90000以下(10kDa以上90kDa以下)である。
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Gly−X−Y において、Glyはグリシンを表し、X及びYは、任意のアミノ酸(好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸)を表す。コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約3分の1を占め、アミノ酸配列では3個に1個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。X及びYで表されるアミノ酸はイミノ酸(プロリン、オキシプロリン)が多く含まれ、全体の10%〜45%を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の80%以上、更に好ましくは95%以上、最も好ましくは99%以上のアミノ酸が、Gly−X−Yの繰り返し構造である。
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが1:1で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が10〜40%であり、好ましくは20〜30%である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が5%以上20%未満、好ましくは10%未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか1アミノ酸、好ましくは2以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている(例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Vol.9、No.7(1990年)527頁)。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に2以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、及びHAV配列の配列が好ましい。さらに好ましくはRGD配列、YIGSR配列、PDSGR配列、LGTIPG配列、IKVAV配列及びHAV配列、特に好ましくはRGD配列である。RGD配列のうち、好ましくはERGD配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン(GAG)の産生を向上させることができる。
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるRGD配列の配置としては、RGD間のアミノ酸数が0〜100の間、好ましくは25〜60の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質1分子中3〜50個が好ましく、さらに好ましくは4〜30個、特に好ましくは5〜20個である。最も好ましくは12個である。
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するRGDモチーフの割合は少なくとも0.4%であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが350以上のアミノ酸を含む場合、350のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも1つのRGDモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するRGDモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも0.6%であり、更に好ましくは少なくとも0.8%であり、更に好ましくは少なくとも1.0%であり、更に好ましくは少なくとも1.2%であり、最も好ましくは少なくとも1.5%である。リコンビナントペプチド内のRGDモチーフの数は、250のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも4、更に好ましくは6、更に好ましくは8、更に好ましくは12以上16以下である。RGDモチーフの0.4%という割合は、250のアミノ酸あたり、少なくとも1つのRGD配列に対応する。RGDモチーフの数は整数であるので、0.4%の特徴を満たすには、251のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも2つのRGD配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、250のアミノ酸あたり、少なくとも2つのRGD配列を含み、より好ましくは250のアミノ酸あたり、少なくとも3つのRGD配列を含み、さらに好ましくは250のアミノ酸あたり、少なくとも4つのRGD配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも4つのRGDモチーフ、好ましくは6つ、より好ましくは8つ、さらに好ましくは12以上16以下のRGDモチーフを含む。
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式1:A−[(Gly−X−Y)nm−Bで示されるものである。n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。mは好ましくは2〜10の整数を示し、より好ましくは3〜5の整数を示す。nは3〜100の整数が好ましく、15〜70の整数がさらに好ましく、50〜65の整数が最も好ましい。Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、 式:Gly−Ala−Pro−[(Gly−X−Y)633−Gly(式中、63個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、63個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、63個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示されるものである。
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはI型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは5〜10であり、より好ましくは6〜10であり、さらに好ましくは7〜9.5である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法(Maxey,C.R.(1976;Phitogr.Gelatin 2,Editor Cox,P.J.Academic,London,Engl.参照)に記載されたように、1質量%ゼラチン溶液をカチオン及びアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのpHを測定することで実施することができる。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである
「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「1若しくは数個」とは、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個を意味する。
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばEP1014176A2号公報、米国特許第6992172号公報、国際公開WO2004/85473号、国際公開WO2008/103041号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
(1−4)生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック(塊)を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状(顆粒)の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは1μm以上700μm以下であり、より好ましくは10μm以上700μm以下であり、さらに好ましくは10μm以上300μm以下であり、さらに好ましくは20μm以上200μm以下であり、さらに好ましくは20μm以上150μm以下であり、特に好ましくは53μm以上106μm以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、180μmのふるいにかけ、通過したブロックを106μmのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、106〜180μmの大きさのブロックとすることができる。次に、106μmのふるいにかけ、通過したブロックを53μmのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、53〜106μmの大きさのブロックとすることができる。次に、53μmのふるいにかけ、通過したブロックを25μmのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、25〜53μmの大きさのブロックとすることができる。
(1−5)生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物(生体親和性高分子の多孔質体など)を、粉砕機(ニューパワーミルなど)を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物(多孔質体など)は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
(a)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(b)工程(a)で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、及び
(c)工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができる。
生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下(好ましくは2.3℃以下、より好ましくは2.1℃以下)、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、0℃以上であればよく、例えば0.1℃以上、0.5℃以上、0.8℃以上、又は0.9℃以上でもよい。
工程(a)の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材(好ましくは、テフロン(登録商標))を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
好ましくは、工程(a)において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、より好ましくは2.3℃以下であり、さらに好ましくは2.1℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の1秒前〜10秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
好ましくは、工程(a)において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−5℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−5℃以下かつ溶媒融点−20℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−6℃以下かつ溶媒融点−16℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
工程(b)においては、工程(a)で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程(b)にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、3℃から30℃低い温度であり、より好ましくは、5℃から25℃低い温度であり、更に好ましくは、10℃から20℃低い温度である。
工程(c)においては、工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温(20℃)で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
本発明では好ましくは、上記工程(c)で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
(2)細胞
本発明の細胞構造体は、少なくともがん細胞および間葉系細胞とを含む。
がん細胞が由来するがんの具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器がん、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、尿管腫瘍、胆嚢がん、胆管がん、胆道がん、乳がん、肝臓がん、膵臓がん、睾丸腫瘍、上顎がん、舌がん、口唇がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、卵巣がん、子宮がん、前立腺がん、甲状腺がん、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚がん、基底細胞がん、皮膚付属器がん、皮膚転移がんなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。がん細胞の一例としては、膵臓がん細胞が挙げられる。
本発明で用いるがん細胞は、株化されたがん細胞、又は株化されていないがん細胞のいずれでもよいが、好ましくは、株化されたがん細胞である。
株化されたがん細胞とは、生体より採取した細胞であって、適切な培養条件下で培養した場合にほぼ無限に増殖することができる状態の細胞である。ここでいう適切な培養条件とは、各細胞に応じた温度、栄養分、増殖因子、付着面などが提供される条件を言う。株化されていないがん細胞としては、生体から採取した組織や細胞を最初に播種して培養した細胞である初代培養細胞が挙げられる。
本発明で用いるがん細胞の種類は、1種類でも2種類以上でもよく、好ましくは1又は2種類、さらに好ましくは1種類である。
間葉系細胞とは、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、腱細胞、脂肪細胞、毛乳頭細胞、歯髄細胞などの結合組織の細胞、並びに上記の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。具体的には、繊維芽細胞、毛乳頭細胞、脂肪細胞、歯髄細胞などが挙げられる。間葉系細胞の存在する組織としては、骨、軟骨、筋肉、腱、脂肪組織、毛乳頭、歯髄などが挙げられる。間葉系細胞は、さらに血管、肝臓又は膵臓などの実質臓器の内部や周囲、並びに骨髄や臍帯の中にも存在する。骨髄中には、多くの結合組織細胞への多分化能を有した細胞として間葉系幹細胞が存在する。本発明においては好ましくは、間葉系幹細胞を使用することができる。間葉系細胞は、動物から目的とする組織を摘出し、分離培養を行うことにより得ることができる。
本発明で用いる間葉系細胞の種類は、1種類でも2種類以上でもよく、好ましくは1又は2種類、さらに好ましくは1種類である。
本発明の細胞構造体におけるがん細胞と間葉系細胞との細胞数の比率は、特に限定されないが、好ましくは10:1〜1:10であり、より好ましくは5:1〜1:5であり、さらに好ましくは2:1〜1:2である。
本発明の細胞構造体は、がん細胞および間葉系細胞以外に、その他の細胞を含んでいてもよい。その他の細胞としては、血管内皮細胞、胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、間質細胞、線維芽細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞などが挙げられるが、特に限定されない。
ある細胞が、上記した所定の細胞であるかどうかの確認は、対象細胞が、各細胞の機能を有するかどうかを確認することにより行うことができ、あるいは対象細胞が、各細胞に特異的なマーカーを発現するかどうかを確認することによっても行うことができるが、特に限定されない。
上記した本発明で使用する各細胞は、各用語の最も広義の範囲を意味するものとし、生体から採取した細胞、生体から採取した細胞に操作(遺伝子導入操作など)を施した細胞、並びに他の細胞からの転換により得られる細胞(例えば、iPS細胞から分化誘導された細胞)などのいずれでもよい。
使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。
(3)細胞構造体
本発明においては、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞および間葉系細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に3次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能となる。さらに、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に3次元に配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体が形成され、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能となる。
本発明の細胞構造体においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が1〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、10μm以上1000μm以下であり、好ましくは10μm以上100μm以下であり、より好ましくは10μm以上50μm以下である。
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能とすることを意味するものである。
本発明の細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、215μm以上であることが好ましく、400μm以上がさらに好ましく、730μm以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては3cm以下が好ましく、2cm以下がより好ましく、1cm以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、400μm以上3cm以下、より好ましくは500μm以上2cm以下、更に好ましくは720μm以上1cm以下である。細胞構造体の厚さ又は直径を上記の範囲内とすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達がより良好になる。
本発明の細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Aを選択した際に、その点Aを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Aとする。細胞構造体中でその線分Aが最長となる点Aを選択し、その際の線分Aの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
本発明の細胞構造体は、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が0.0000001μg以上1μg以下であることが好ましく、さらに好ましくは0.000001μg以上0.1μg以下、より好ましくは0.00001μg以上0.01μg以下、最も好ましくは0.00002μg以上0.006μg以下である。細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、細胞をより均一に存在させることができる。下限を上記範囲とすることにより、所望の用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
(4)細胞構造体の製造方法
本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞および間葉系細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、上記細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、細胞と生体親和性高分子ブロックとを混合する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと、がん細胞および間葉系細胞を含有する培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。がん細胞および間葉系細胞を含有する培養液におけるがん細胞と間葉系細胞との細胞数の比率は特に限定されないが、好ましくは10:1〜1:10であり、より好ましくは5:1〜1:5であり、さらに好ましくは2:1〜1:2である。
本発明においては、例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックとをモザイク状に配置することができる。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックとからなる細胞構造体の形成を促進又は制御することが好ましい。
用いられる容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、U字型、V字型であることが好ましい。
上記の方法で得られた細胞構造体(モザイク細胞塊)は、例えば、
(a)別々に調製した細胞構造体(モザイク細胞塊)同士を融合させる、又は
(b)分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造してもよい。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
別々に調製した細胞構造体同士を融合させる場合には、例えば、複数個の生体親和性高分子ブロックと複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部又は全部に、一又は複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させることができる。上記(a)に記載の通り本発明の細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体も、本発明の範囲内である。
本発明の細胞構造体の製造方法にかかる「生体親和性高分子ブロック(種類、大きさ等)」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体(大きさ等)」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
上記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径は好ましくは10μm以上1cm以下であり、より好ましくは10μm以上2000μm以下、更に好ましくは15μm以上1500μm以下、最も好ましくは、20μm以上1300μm以下である。融合後の厚さ又は直径は好ましくは400μm以上3cm以下であり、より好ましくは500μm以上2cm以下であり、更に好ましくは720μm以上1cm以下である。
上記した生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を製造する方法としては、具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部又は全部に、一又は複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする方法を挙げることができる。ここで、「生体親和性高分子ブロック(種類、大きさ等)」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体(大きさ等)」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
融合させたい細胞構造体同士は、0以上50μm以下の距離に設置することが好ましく、より好ましくは、0以上20μm以下、更に好ましくは0以上5μm以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合させることが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。
本発明の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、400μm以上3cm以下、より好ましくは500μm以上2cm以下、更に好ましくは720μm以上1cm以下である。
細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックの添加するペースは、使用する細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと細胞が細胞構造体の外側へと移動し、細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、細胞の割合が多くなる箇所ができ、細胞の均一性が低くなるため、使用する細胞の増殖速度を考慮し、選択する。
(5)非ヒトモデル動物及びその製造方法
本発明の細胞構造体は、非ヒトモデル動物の製造のために非ヒト動物に移植することができる。本発明の細胞構造体からなる、非ヒトモデル動物の製造のために移植物は、本発明に包含される。さらに本発明によれば、上記した本発明の細胞構造体を移植物として有する、がん疾患に対する非ヒトモデル動物が提供される。
がん疾患に対する非ヒトモデル動物とは、がんを有するモデル動物を意味する。
がん疾患は、好ましくはヒトがん疾患である。
がん疾患としては、「がん細胞が由来するがんの具体例」として、本明細書中上記したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細胞構造体を構成する生体親和性高分子ブロック、がん細胞及び間葉系細胞、並びに好ましい範囲は、本明細書中上記した通りである。
非ヒトモデル動物における細胞構造体の移植部位は特に限定されないが、例えば、皮下、腹腔内、又は器官又は組織(好ましくは、移植するがん細胞が由来する器官又は組織)などが挙げられ、好ましくは皮下である。
細胞構造体を移植する動物としては、非ヒト動物であれば特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物の中では、マウス、ラット、ウサギ又はハムスターなどのげっ歯類が、取り扱いが容易さの観点から好ましい。
また、非ヒト動物としては、免疫力が低下している動物、または免疫不全動物が好ましい。免疫力が低下している非ヒト動物は、細胞構造体が生着可能な程度に免疫力が低下した動物であればよい。例えば、ヌードマウス、ヌードラット、SCID(severe combined immunodeficiency;重度複合免疫不全症)マウス、NOD(non-obese diabetic:非肥満糖尿病)−SCIDマウス、ALY(遺伝性リンパ節欠損)マウスなどの免疫不全動物を挙げることができ、市販品を使用することもできる。免疫力を低下させるために、非ヒト動物にX線などの放射線を照射してもよい。用意する非ヒト動物は例えばマウス又はラットの場合には、4〜12週齢のものを使用することができる。非ヒト動物は、免疫力低下の度合いに応じて、感染を防御した環境下で飼育することができる。感染防御の目的で、非ヒト動物に抗生剤を投与してもよい。
本発明によれば、上記した本発明の細胞構造体を、非ヒト動物に移植することを含む、がん疾患に対する非ヒトモデル動物の製造方法が提供される。
細胞構造体の移植方法としては、切開、注射、内視鏡などが使用可能である。
細胞構造体は、培地(例えば、Lonza社のMSCGM BulletKitTM等)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などに懸濁させた状態で、移植部位に移植することができる。
細胞構造体は、非ヒト動物1匹当たり1〜1000個、好ましくは1〜100個を移植することができる。
本発明の細胞構造体は、がん細胞を含むことから、本発明の細胞構造体を非ヒト動物に移植することによって、上記非ヒト動物にがんを形成することができる。
本発明の非ヒトモデル動物は、がん治療薬の開発、がん治療効果の検証、がん治療による副作用の検証、がんを検出及びイメジングする試薬の開発などに有用である。
(6)被験物質の評価方法
本発明によれば、上記した本発明の非ヒトモデル動物に被験物質を投与することを含む、被験物質の評価方法が提供される。被験物質として、抗がん剤などのがん治療薬の候補物質を使用する場合には、がん治療薬をスクリーニングすることができる。
本発明による被験物質の評価方法は好ましくは、本発明の非ヒトモデル動物に被験物質を投与する工程;及び上記非ヒトモデル動物におけるがんの病態を評価する工程を含む。
被験物質は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、有機低分子化合物などの化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、核酸、糖質、脂質、細胞抽出物、細胞培養上清、植物抽出物、微生物産生物等が挙げられる。化合物、ペプチド、タンパク質、抗体はそれぞれのライブラリーを使用することもできる。例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー又は抗体ライブラリーなどを使用することができる。
被験物質の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口的投与としては、例えば、静脈内、動脈内又は筋肉内等の全身投与、あるいは局所投与等が挙げられる。被験物質の投与量、投与間隔、投与開始時期、及び投与期間は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、投与対象の非ヒト動物の種類、被験物質の種類等に応じて適宜選択することができる。
非ヒトモデル動物におけるがんの病態を評価する工程においては、がん(腫瘍)を縮小、又はがん(腫瘍)の増大を抑制できる被験物質を、がん治療薬の候補物質として選択することができる。がん(腫瘍)の縮小、又はがん(腫瘍)の増大の抑制は、がん(腫瘍)の大きさ(体積など)を測定することにより評価することができる。あるいは、非ヒトモデル動物におけるがんの病態を評価する工程においては、がんに起因する症状、又はがん関連マーカーの数値を指標にしてもよい。
また、非ヒトモデル動物におけるがんの病態の評価は、被験物質を投与しない非ヒトモデル動物を陰性対照として、評価することができる。
上記のようにして選択された被験物質は、がん治療薬の候補となりうる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
[実施例1]リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)633
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[実施例2] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ3mm、直径51mm、側面厚さ8mm、高さ25mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は8mmのPTFEで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も3mmのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は43mmになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に2.2mmの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
[温度差の小さい凍結工程、及び乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にCBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、及び棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
条件A:
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。 棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件B:
アルミ・硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。 棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件C:
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量10mL。 棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
[各凍結工程での温度測定]
条件A〜条件Cのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図1〜図3の通りとなった。
図1、図2、図3から条件A、条件B、条件Cでは棚板温度−10℃設定区間(−20℃に下げる前)において液温が融点である0℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない(未凍結・過冷却)状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が2.5℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」−「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を−20℃へ更に下げていくことによって、液温が0℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は0℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後0℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
以下に、条件A、条件B、条件Cについて、非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差、棚板温度を−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント(凝固熱発生等)の1秒前〜20秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。
条件A
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.1℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.2℃
凝固熱発生直前の温度差:1.1℃
条件B
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.0℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.1℃
凝固熱発生直前の温度差:0.9℃
条件C
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:1.1℃
凝固熱発生直前の温度差:2.1℃
[実施例3] 生体親和性高分子ブロックの作製(多孔質体の粉砕と架橋)
実施例2で得られた条件A及び条件BのCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm、53〜106μm、106〜180μmの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は8時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間の6種類を実施した)を施して、生体親和性高分子ブロック(CBE3ブロック)を得た。
以下、48時間架橋を施した条件Aの多孔質体由来ブロックをE、48時間架橋を施した条件Bの多孔質体由来ブロックをFと称する。E及びFは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、48時間架橋したものを代表として使用した。また、E及びFでは性能に差が見られなかった。以下、実施例3で得られた生体親和性高分子ブロックを「花弁状ブロック」とも称する。以下の実施例では、条件A、サイズ53〜106μm、架橋時間48時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。
[実施例4]細胞構造体の作製(hMSCとCapan-1)
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC:human mesenchymal stem cell、Lonza社より購入)が終濃度4x105cells/mL、及び株化されたヒト膵・腺がん細胞(Capan-1、ATCCより購入)が終濃度4x105cells/mLとなるように、MSCGM BulletKitTM培地(会社名:Lonza Japan、製品名MSCGMTM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKitTM)で調整した細胞懸濁液を用意し、25μLずつ混和した。その細胞懸濁液に実施例3で作製した生体親和性高分子ブロック(サイズ53〜106μm)を0.1mg/mLとなるように添加した。得られた混合物200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mm又は直径1.3mm程度の球状の、生体親和性高分子ブロックとCapan-1とhMSCからなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。得られたモザイク細胞塊16個を96Uプレートの1ウェルに集め、更に24時間静置しモザイク細胞塊が集合した組織を調製した。
また、比較例として、生体親和性高分子ブロックを添加しないで細胞塊(hMSCとCapan-1)を作製した。
生体親和性高分子ブロックを添加したモザイク細胞塊と、生体親和性高分子ブロックを添加しない細胞塊を調製した4日後に,10質量%中性ホルマリン緩衝液にて固定し、ヘマトキシリン・エオジン染色にて細胞塊を顕微鏡観察した。結果を図4に示す。
生体親和性高分子ブロックを添加しない場合、細胞塊内部ではhMSCの壊死が観察され、相対的にCapan-1細胞が多く見られた。残ったhMSCは未分化なままであり、線維芽細胞への分化は弱かった。
生体親和性高分子ブロックを添加した場合、細胞塊内部でもhMSCは壊死せず、Capan-1細胞とほぼ1:1の割合で生存していた。hMSCは不完全ながら線維芽細胞への分化が観察された。
[実施例5]モザイク細胞塊及び細胞塊の移植(動物モデルでの評価)
麻酔下のNOD−SCID(非肥満糖尿病−重度複合免疫不全症)マウス 6週齢メスの皮下に、スパーテル(PPミクロスパーテル アズワン #1-9404-01)を用いて、実施例4で作製したモザイク細胞塊(生体親和性高分子ブロックを添加したもの)又は細胞塊(生体親和性高分子ブロックを添加しないもの)を移入後、挿入部を縫合した。
移植7日後に,麻酔下にて放血と殺を実施し,モザイク細胞塊又は細胞塊を確認した。周辺の皮下組織ごと採取し、10質量%中性ホルマリン緩衝液にて固定し,定法によりヘマトキシリン・エオジン染色標本を作製後,顕微鏡観察した。結果を図5に示す。
モザイク細胞塊を移植した場合、花弁状ブロックと考えられる好塩基性構造物の間隙に,線維芽細胞と線維状組織が認められた。線維状組織は比較的豊富で,Capan-1膵がん細胞由来の細胞が島状に存在する間質細胞に富んだ組織形態を示す腫瘍であった(図5の右図)。
細胞塊を移植した場合、hMSC由来と考えられる間葉系組織の中に,Capan-1由来と考えられる腺管構造を呈した細胞が島状に存在していた。モザイク細胞塊を移植したものに比し,線維状組織は乏しかった (図5の左図)。
上記の通り、Capan-1とhMSCをモザイク細胞塊にして移植した場合に、in vivoで豊富な線維化・間質形成が認められ、ヒト膵臓がんの病態に近いモデルを構築することができた。

Claims (20)

  1. 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞を含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、細胞構造体が間葉系細胞を含み、非ヒトモデル動物の作製のために非ヒト動物に移植される細胞構造体。
  2. 前記がん細胞が株化されたがん細胞である、請求項に記載の細胞構造体。
  3. 前記がん細胞が、膵臓がん細胞である、請求項1又は2に記載の細胞構造体。
  4. 前記間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、請求項1からの何れか一項に記載の細胞構造体。
  5. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項1からの何れか一項に記載の細胞構造体。
  6. 生体親和性高分子が、下記式で示される、請求項1からの何れか一項に記載の細胞構造体。
    式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
    式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  7. 生体親和性高分子が、
    配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
    配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;又は
    配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
    の何れかである、請求項1からの何れか一項に記載の細胞構造体。
  8. 生体親和性高分子ブロックと、少なくともがん細胞を含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を移植物として有する、がん疾患に対する非ヒトモデル動物であって、細胞構造体が間葉系細胞を含む、非ヒトモデル動物。
  9. 生体親和性高分子ブロックがシート状のもの以外である、請求項に記載の非ヒトモデル動物。
  10. 生体親和性高分子ブロックが不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状、多孔質状、繊維状、又は紡錘状である 請求項8又は9に記載の非ヒトモデル動物。
  11. 生体親和性高分子ブロック一つの大きさが、1μm以上700μm以下である 請求項8から10の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  12. 生体親和性高分子が、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドである、請求項8〜11の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  13. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項8〜12の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  14. 前記がん細胞が株化されたがん細胞である、請求項8〜13の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  15. 前記がん細胞が、膵臓がん細胞であり、前記がん疾患が膵臓がんである、請求項8〜14の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  16. 前記間葉系細胞が、間葉系幹細胞である、請求項8〜15の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  17. 細胞構造体の移植部位が皮下である、請求項8〜16の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  18. 免疫力が低下しているか、または免疫不全である、請求項8〜17の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物。
  19. 請求項1からの何れか一項に記載の細胞構造体を、非ヒト動物に移植することを含む、がん疾患に対する非ヒトモデル動物の製造方法。
  20. 請求項8から18の何れか一項に記載の非ヒトモデル動物に被験物質を投与することを含む、被験物質の評価方法。
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