CN107033383B

CN107033383B - 制造生物亲和性高分子的多孔体的方法

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Publication number: CN107033383B
Application number: CN201610811538.XA
Authority: CN
Inventors: 中村健太郎; 岩泽玲子; 三好隼人; 山口雄大; 伏见英生
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: CN107033383A; EP2962703A1; CN105025940A; JP2017121504A; EP2962703A4; US20180361020A1; EP2962703B1; JP6130903B2; JP6506326B2; CN105025940B; JPWO2014133081A1; WO2014133081A1; US20150352252A1

Abstract

本发明的课题在于提供一种不含有戊二醛那样的具有细胞毒性的物质、且抑制结构体中的移植后的细胞坏死(即，细胞存活率优异)的细胞移植用细胞结构体。根据本发明，提供一种细胞移植用细胞结构体，其为含有不含戊二醛的生物亲和性高分子块和至少一种细胞、且在多个细胞间的间隙内配置有多个生物亲和性高分子块的细胞移植用细胞结构体，所述生物亲和性高分子块的振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者所述高分子块的二维截面像的截面积的平方根÷周长的值为0.01以上且0.13以下。

Description

制造生物亲和性高分子的多孔体的方法

本申请是分案申请，其母案申请的申请号：201480011005.2，申请日：2014.2.27，发明名称：细胞移植用细胞结构体、生物亲和性高分子块及它们的制造方法

技术领域

本发明涉及细胞移植用细胞结构体、生物亲和性高分子块以及它们的制造方法。详细而言，本发明涉及在移植后可以抑制细胞坏死的细胞移植用细胞结构体、其制造中使用的生物亲和性高分子块、以及它们的制造方法。

背景技术

目前，使陷入功能障碍、功能衰竭的生物体组织、器官实现再生的再生医疗的实用化得到发展。再生医疗是使用细胞、支架及生长因子这三种因子重新作出仅通过生物体所具有的自然痊愈能力无法恢复的生物体组织并使其具有与原来的组织相同的形态、功能的新的医疗技术。近年来，使用细胞的治疗逐渐得到实现。例如，可以列举使用自体细胞的培养表皮、使用自体软骨细胞的软骨治疗、使用间充质干细胞的骨再生治疗、使用成肌细胞的心肌细胞片治疗、利用角膜上皮片的角膜再生治疗及神经再生治疗等。这些新的治疗不同于以往的利用人造物的替代医疗(例如，人造骨修复剂、透明质酸注射等)，可实现生物组织的修复、再生，能够得到高治疗效果。实际上，使用自体细胞的培养表皮、培养软骨等产品已在市售。

例如，在使用细胞片的心肌的再生中，为了再生具有厚度的组织，认为需要细胞片的多层结构体。近年来，冈野等人开发了使用温度响应性培养皿的细胞片。由于细胞片不需要胰蛋白酶等的酶处理，因此可保持细胞与细胞的结合及粘附蛋白(非专利文献1至6)。这种细胞片制造技术可期待对心肌组织的再生有用(非专利文献7)。另外，为了在细胞片中形成血管网，冈野等人进行了一并引入有血管内皮细胞的细胞片的开发(非专利文献8)。

此外，专利文献1中记载了一种细胞三维结构体，其通过将具有生物亲和性的高分子块和细胞三维配置为嵌合状来制造。该细胞三维结构体中，能够从外部向细胞三维结构体的内部进行营养输送，具有充分的厚度，并且细胞在结构体中均匀地存在。另外，专利文献1的实施例中，使用包含重组明胶、天然明胶材料的高分子块证实了高细胞存活活性。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2011/108517号公报

非专利文献

非专利文献1：Shimizu,T.等,Circ.Res.90,e40-48(2002)

非专利文献2：Kushida,A.等,J.Biomed.Mater.Res.51,216-223(2000)

非专利文献3：Kushida,A.等,J.Biomed.Mater.Res.45,355-362(1999)

非专利文献4：Shimizu,T.,Yamato,M.,Kikuchi,A.&Okano,T.,Tissue Eng.7,141-151(2001)

非专利文献5：Shimizu,T等,J.Biomed.Mater.Res.60,110-117(2002)

非专利文献6：Harimoto,M.等,J.Biomed.Mater.Res.62,464-470(2002)

非专利文献7：Shimizu,T.,Yamato,M.,Kikuchi,A.&Okano,T.,Biomaterials 24,2309-2316(2003)

非专利文献8：Inflammation and Regeneration vol.25No.3 2005,p158-159.第26次日本炎症-再生医学会、“炎症学と再生医学の融合を目指して”、冈野光夫

发明内容

发明所要解决的课题

专利文献1的实施例记载的细胞结构体的高分子块中，为了进行高分子的交联，使用了对人体的毒性强的戊二醛。这种使用戊二醛制造而成的细胞结构体对人体的毒性令人担忧，因此，为保险起见，无法用于细胞移植治疗。因此，尚未提供不含有戊二醛这样的具有人体毒性的物质、且能够抑制移植后的细胞坏死的细胞结构体，期望满足这些条件的适合于细胞移植治疗用途的细胞结构体。

本发明的课题在于提供不含有戊二醛这样的具有细胞毒性的物质、且抑制结构体中的移植后的细胞坏死(即，细胞存活率优异)的细胞移植用细胞结构体。此外，本发明的课题还在于提供适合制造上述细胞移植用细胞结构体的生物亲和性高分子块。此外，本发明所要解决的课题还在于提供上述细胞移植用细胞结构体的制造方法、以及上述生物亲和性高分子块的制造方法。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在通过使用不含戊二醛的生物亲和性高分子块和至少一种细胞、并在多个细胞间的间隙内配置多个生物亲和性高分子块来制造细胞移植用细胞结构体时，通过使用振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者二维截面像的截面积的平方根÷周长的值为0.01以上且0.13以下的生物亲和性高分子块，能够提供解决了上述课题的细胞移植用细胞结构体，从而完成了本发明。

即，根据本发明，提供一种细胞移植用细胞结构体，其为含有不含戊二醛的生物亲和性高分子块和至少一种细胞、且在多个细胞间的间隙内配置有多个生物亲和性高分子块的细胞移植用细胞结构体，上述生物亲和性高分子块的振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述高分子块的二维截面像的截面积的平方根÷周长的值为0.01以上且0.13以下。

此外，根据本发明，提供一种生物亲和性高分子块，其为不含有戊二醛的生物亲和性高分子块，振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者二维截面像的截面积的平方根÷周长的值为0.01以上且0.13以下。

优选一个生物亲和性高分子块的大小为20μm以上且200μm以下。

优选一个生物亲和性高分子块的大小为50μm以上且120μm以下。

优选生物亲和性高分子利用热、紫外线或酶进行了交联。

优选生物亲和性高分子块的交联度为6以上，且上述生物亲和性高分子块的吸水率为300％以上。

优选生物亲和性高分子块为通过将生物亲和性高分子的多孔体粉碎而得到的生物亲和性高分子块。

优选生物亲和性高分子的多孔体通过包括下述步骤的方法制造而成，

(a)将生物亲和性高分子的溶液通过冻结处理进行冻结的步骤，该冻结处理中，溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冻结状态下为“溶剂熔点-3℃”以下；和

(b)将上述步骤(a)中得到的冻结后的生物亲和性高分子进行冷冻干燥的步骤。

优选步骤(a)中，通过下述冻结处理进行冻结，该冻结处理中，溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冻结状态下为“溶剂熔点-7℃“以下。

优选生物亲和性高分子的多孔体具有下述(a)和(b)所述的特性。

(a)具有81％以上且99.99％以下的孔隙率。

(b)尺寸为20～200μm的孔隙所占的空间占有率为85％以上。

优选细胞移植用细胞结构体的厚度或直径为400μm以上且3cm以下。

优选细胞移植用细胞结构体中，相对于一个细胞含有0.0000001μg以上且1μg以下的生物亲和性高分子块。

优选生物亲和性高分子为明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、基因工程合成人纤连蛋白(ProNectin)、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、重组人纤连蛋白片段(RetroNectin)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素或壳聚糖。

优选生物亲和性高分子为重组明胶。

优选重组明胶由式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示，

(式中，A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列，n个X各自独立地表示任意一种氨基酸，n个Y各自独立地表示任意一种氨基酸，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数。需要说明的是，n个Gly-X-Y各自可以相同也可以不同)。

优选重组明胶具有(1)序列号1记载的氨基酸序列、或(2)与序列号1记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性、且具有生物亲和性的氨基酸序列。

优选细胞移植用细胞结构体含有血管发生因子。

优选细胞为选自由多潜能细胞、成体干细胞、祖细胞和成熟细胞组成的组中的细胞。

优选细胞仅为非血管系细胞。

优选细胞含有非血管系细胞和血管系细胞这两者。

优选细胞移植用细胞结构体中，在细胞结构体中具有中心部的血管系细胞的面积大于周边部的血管系细胞的面积的区域。

优选细胞移植用细胞结构体具有中心部的血管系细胞的比例相对于血管系细胞的总面积为60％～100％的区域。

优选细胞移植用细胞结构体具有细胞结构体的中心部的血管系细胞密度为1.0×10^-4个细胞/μm³以上的区域。

优选在细胞移植用细胞结构体的内部形成有血管。

本发明的生物亲和性高分子块优选为了制造本发明的细胞移植用细胞结构体而使用。

根据本发明，还提供一种用于制造本发明的细胞移植用细胞结构体的试剂，其含有本发明的生物亲和性高分子块。

根据本发明，还提供一种用于制造本发明的细胞移植用细胞结构体的方法，其包括将本发明的生物亲和性高分子块与至少一种细胞混合的步骤。

根据本发明，还提供一种制造生物亲和性高分子的多孔体的方法，其包括：

(a)将生物亲和性高分子的溶液通过冻结处理进行冻结的步骤，该冻结处理中，溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冻结状态下为“溶剂熔点-3℃“以下；和

优选步骤(a)中，通过下述冻结处理进行冻结，该冻结处理中，溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冻结状态下为“溶剂熔点-7℃”以下。

发明效果

本发明的细胞移植用细胞结构体不含有戊二醛这样的具有细胞毒性的物质，由此，能够用于细胞移植治疗，并且可抑制结构体中的移植后的细胞坏死，细胞存活率优异。

附图说明

图1示出了体外ATP分析中的不同块的差异。

图2示出了使用本发明的块或比较用块的hMSC嵌合细胞块中的细胞的存活状态的差异(2周后)。

图3示出了本发明的块群中的移植细胞的存活状态。该图示出了hMSC嵌合细胞块中的存活和块尺寸所带来的差异。

图4示出了移植2周后的hMSC嵌合细胞块中的血管形成。

图5示出了移植2周后的hMSC+hECFC嵌合细胞块中的血管形成。

图6示出了多孔体中的各孔隙尺寸的空间占有率。

图7示出了CBE3多孔体的HE截面图像、孔形状和内部最高液温。

图8示出了搁板温度-40℃(玻璃板2.2mm)下的内部最高液温的时间变化。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

本发明的细胞移植用细胞结构体为含有不含戊二醛的生物亲和性高分子块和至少一种细胞、且在多个细胞间的间隙内配置有多个生物亲和性高分子块的细胞移植用细胞结构体，上述生物亲和性高分子块的振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述高分子块的二维截面像的截面积的平方根÷周长的值为0.01以上且0.13以下。

(1)生物亲和性高分子块

(1-1)生物亲和性高分子

本发明中使用的生物亲和性高分子只要对生物体具有亲和性，则对于是否在生物体内分解没有特别限定，但优选由生物分解性材料构成。作为非生物分解性材料，具体而言为选自聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、不锈钢、钛、有机硅和MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)的组中的至少一种材料。作为生物分解性材料，具体而言为选自多肽(例如，以下说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素和壳聚糖的组中的至少一种材料。上述中，特别优选多肽。需要说明的是，这些高分子材料可以进行了用于提高细胞粘附性的设计，作为具体的方法，可以利用如下方法：1.“利用细胞粘附基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白)、细胞粘附序列(利用氨基酸单字母表示法表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽对基材表面进行包覆”、2.“基材表面的氨基化、阳离子化”、3.“利用等离子体处理、电晕放电对基材表面进行亲水性处理”。

关于多肽的种类，只要具有生物亲和性则没有特别限定，例如，优选为明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、基因工程合成人纤连蛋白、层粘连蛋白、肌腱蛋白、纤维蛋白、丝心蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、重组人纤连蛋白片段，最优选为明胶、胶原蛋白、去端胶原蛋白(atelocollagen)。作为本发明中使用的明胶，优选天然明胶或重组明胶。进一步优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指利用来自于天然的胶原蛋白制作的明胶。关于重组明胶，在本说明书中如后所述。

本发明中使用的生物亲和性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选为0～1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB是以藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图为基础的亲疏水性的指标，其详细内容例如在“Pharmaceutical Bulletin”,vol.2,2,pp.163-173(1954)；“化学的领域”vol.11,10,pp.719-725(1957)；“FRAGRANCEJOURNAL”,vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简言之，是将甲烷(CH₄)作为所有有机化合物的根源，将其他化合物全部视为甲烷的衍生物，对其碳原子数、取代基、修饰部、环等分别设定一定的数值，将其得分相加，求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，将该值绘制在以有机性值为X轴、无机性值为Y轴的图上而得到的图。有机概念图中的IOB是指有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)之比、即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容，请参照《新版有机概念图-基础与应用》(甲田善生等著、三共出版、2008)。本说明书中，使用取IOB的倒数而得到的“1/IOB”值来表示亲疏水性。“1/IOB”值越小(越接近于0)，表示越为亲水性。

通过使本发明中使用的高分子的“1/IOB”值为上述范围，亲水性升高，且吸水性升高，因此，推测其对营养成分的保持产生有效作用，结果，有助于本发明的细胞三维结构体(嵌合细胞块)中的细胞的稳定化、易存活性。

在本发明中使用的生物亲和性高分子为多肽的情况下，对于以总平均亲水性(Grand average of hydropathicity，GRAVY)值表示的亲疏水性指标而言，优选为0.3以下且-9.0以上，进一步优选为0.0以下且-7.0以上。总平均亲水性(GRAVY)值可以通过“Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed):The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“Gasteiger E.,Gattiker A.,Hoogland C.,Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis.；Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003).”的方法得到。

通过使本发明中使用的高分子的GRAVY值为上述范围，亲水性升高，且吸水性升高，因此，推测其对营养成分的保持产生有效作用，结果，有助于本发明的细胞三维结构体(嵌合细胞块；形成嵌合状的细胞块)中的细胞的稳定化、易存活性。

(1-2)交联

本发明中使用的生物亲和性高分子可以进行了交联，也可以未进行交联，但优选进行了交联。作为一般的交联方法，已知有热交联、利用醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、利用缩合剂(碳二亚胺、氨基氰等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键、离子性相互作用等，本发明中使用不使用戊二醛的交联方法。本发明中，优选使用不使用醛类或缩合剂的交联方法。作为本发明中使用的交联方法，进一步优选为热交联、紫外线交联或酶交联，特别优选为热交联。

在利用酶进行交联的情况下，作为酶，只要具有高分子材料间的交联作用则没有特别限定，可以优选使用转谷氨酰胺酶和漆酶、最优选使用转谷氨酰胺酶进行交联。作为使用转谷氨酰胺酶进行酶交联的蛋白质的具体例，只要是具有赖氨酸残基和谷氨酰胺残基的蛋白质，则没有特别限制。转谷氨酰胺酶可以来源于哺乳类，也可以来源于微生物，具体而言，可以列举味之素株式会社制造的Activa系列；以试剂形式销售的来源于哺乳类的转谷氨酰胺酶，例如东方酵母工业株式会社、Upstate USA Inc.、Biodesign International等制造的来源于豚鼠肝脏的转谷氨酰胺酶、来源于山羊的转谷氨酰胺酶、来源于兔的转谷氨酰胺酶等；来源于人的凝血因子(XIIIa因子、Haematologic Technologies,Inc.)等。

关于进行不使用交联剂的交联(例如，热交联)时的反应温度，只要能够交联则没有特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，进一步优选为120℃～200℃。

(1-3)重组明胶

本发明涉及的重组明胶是指利用基因重组技术制作的具有类似于明胶的氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。本发明中可以使用的重组明胶优选具有特征性地见于胶原蛋白的由Gly-X-Y表示的序列(X和Y各自独立地表示任意一种氨基酸)的重复(多个Gly-X-Y各自可以相同也可以不同)。优选在一分子中含有2个序列以上的细胞粘附信号。作为本发明中使用的重组明胶，可以使用具有来源于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶，例如可以使用EP1014176、US6992172、WO2004/85473、WO2008/103041等记载的重组明胶，但并不限定于这些。作为本发明中使用的重组明胶，优选为下述方式的重组明胶。

本发明中使用的重组明胶具有天然明胶本来的性能，因此生物适合性优异，且由于其并非天然来源，因此不存在牛海绵状脑病(BSE)等的担忧，非感染性优异。另外，本发明中使用的重组明胶比天然明胶更均匀，且序列是确定的，因此，在强度、分解性方面，也可以通过后述的交联等而偏差小地进行精密设计。

重组明胶的分子量优选为2kDa以上且100kDa以下。更优选为2.5kDa以上且95kDa以下。更优选为5kDa以上且90kDa以下。最优选为10kDa以上且90kDa以下。

重组明胶具有特征性地见于胶原蛋白的由Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，多个Gly-X-Y各自可以相同也可以不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X和Y表示任意的氨基酸(优选为甘氨酸以外的任意氨基酸)。特征性地见于胶原蛋白的GXY序列是明胶/胶原蛋白的氨基酸组成和序列中的、与其他蛋白质相比非常特异的部分结构。该部分中，甘氨酸约占全体的三分之一，在氨基酸序列中在每3个氨基酸中重复出现1个甘氨酸。甘氨酸是最简单的氨基酸，对分子链配置的约束也少，大大有助于凝胶化时的螺旋结构的再生。由X、Y表示的氨基酸多含有亚氨酸(脯氨酸、羟脯氨酸)，优选占全体的10％～45％。优选其序列的80％以上、更优选95％以上、最优选99％以上的氨基酸为GXY的重复结构。

通常的明胶中，极性氨基酸中的带有电荷的极性氨基酸与无电荷的极性氨基酸以1:1的比例存在。在此，极性氨基酸具体是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、精氨酸，其中，极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。本发明中使用的重组肽中，构成的全部氨基酸中的极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，优选该极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例为5％以上且小于20％，优选小于10％。此外，优选在序列中不含有丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、半胱氨酸中的任意一种氨基酸、优选两种以上的氨基酸。

通常，在多肽中，已知有作为细胞粘附信号起作用的最小氨基酸序列(例如，株式会社永井出版发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中使用的重组明胶优选在一分子中具有2个以上这样的细胞粘附信号。作为具体的序列，从所粘附的细胞的种类多的观点出发，优选为由氨基酸单字母表示法表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列，进一步优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，特别优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产生量。例如，在使用间充质干细胞作为细胞的软骨分化的情况下，能够提高糖胺聚糖(GAG)的产生。

作为本发明中使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD间的氨基酸数在0～100之间、优选在25～60之间不均一。

从细胞粘附、增殖性的观点出发，该最小氨基酸序列的含量在1分子蛋白质中优选为3～50个，进一步优选为4～30个，特别优选为5～20个。最优选为12个。

本发明中使用的重组明胶中，RGD基序相对于氨基酸总数的比例优选为至少0.4％，在重组明胶含有350个以上氨基酸的情况下，优选350个氨基酸的各段(stretch)含有至少1个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选为至少0.6％，更优选为至少0.8％，更优选为至少1.0％，更优选为至少1.2％，最优选为至少1.5％。重组肽内的RGD基序的数量在每250个氨基酸中优选至少为4，更优选为6，更优选为8，更优选为12以上且16以下。RGD基序的0.4％这样的比例对应于每250个氨基酸中至少存在1个RGD序列。由于RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸构成的明胶必须至少含有2个RGD序列。优选本发明的重组明胶在每250个氨基酸中至少含有2个RGD序列，更优选在每250个氨基酸中至少含有3个RGD序列，进一步优选在每250个氨基酸中至少含有4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的进一步的方式，含有至少4个RGD基序，优选含有6个、更优选含有8个、进一步优选含有12个以上且16个以下的RGD基序。

另外，重组明胶可以部分发生了水解。

优选本发明中使用的重组明胶由式：A-[(Gly-X-Y)_n]_m-B表示。n个X各自独立地表示任意一种氨基酸，n个Y各自独立地表示任意一种氨基酸。作为m，优选为2～10，优选为3～5。N优选为3～100，进一步优选为15～70，最优选为50～65。A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列，n个X各自独立地表示任意一种氨基酸，n个Y各自独立地表示任意一种氨基酸。

更优选本发明中使用的重组明胶由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)₆₃]₃-Gly(式中，63个X各自独立地表示任意一种氨基酸，63个Y各自独立地表示任意一种氨基酸。需要说明的是，63个Gly-X-Y各自可以相同也可以不同)表示。

重复单元优选结合天然存在的胶原蛋白的多个序列单元。在此所述的天然存在的胶原蛋白只要是天然存在的胶原蛋白，则可以为任意一种胶原蛋白，但优选为I型、II型、III型、IV型和V型。更优选为I型、II型、III型。根据另一方式，该胶原蛋白的来源优选为人、牛、猪、小鼠、大鼠。更优选为人。

本发明中使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。

优选重组明胶未进行去氨基化。

优选重组明胶不具有端肽。

优选重组明胶为利用编码天然胶原蛋白的核酸制备而成的实质上为纯的胶原蛋白用材料。

作为本发明中使用的重组明胶，特别优选为具有如下序列的重组明胶，

(1)序列号1记载的氨基酸序列；或

(2)与序列号1记载的氨基酸序列具有80％以上(进一步优选为90％以上、最优选为95％以上)的同源性、且具有生物亲和性的氨基酸序列。

本发明中使用的重组明胶可以利用本领域技术人员公知的基因重组技术来制造，例如可以依照EP1014176A2、US6992172、WO2004-85473、WO2008/103041等记载的方法来制造。具体而言，获得编码规定的重组明胶的氨基酸序列的基因，将该基因整合到表达载体中，制作重组表达载体，将该载体导入适当的宿主中，制作转化体。将所得到的转化体在适当的培养基中培养，由此产生重组明胶，因此从培养物中回收所产生的重组明胶，由此能够制备本发明中使用的重组明胶。

(1-4)生物亲和性高分子块

本发明中，使用含有上述生物亲和性高分子的块。

本发明中的生物亲和性高分子块的形状没有特别限定，其满足振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述生物亲和性高分子块的二维截面像的截面积的平方根÷周长的值为0.01以上且0.13以下中的一个以上的条件。

本发明中的生物亲和性高分子块的振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下，优选为20mg/cm³以上且400mg/cm³以下，更优选为40mg/cm³以上且220mg/cm³以下，进一步优选为50mg/cm³以上且150mg/cm³以下。

振实密度是表示在一定的体积内能够密实地填充多少数量的块的值，值越小，可知越无法密实地填充，即块的结构越复杂。认为生物亲和性高分子块的振实密度表示生物亲和性高分子块的表面结构的复杂性、以及将生物亲和性高分子块集聚为集合体时所形成的空隙的量。振实密度越小，高分子块间的空隙越多，细胞的成活区域越多。另外，通过不使振实密度过小，能够在细胞彼此之间适度地存在生物亲和性高分子块，在形成细胞移植用细胞结构体时能够将营养成分送达该结构体内部，因此认为限制在上述范围内是适当的。

本说明书中所述的振实密度可以如下测定。准备用于测定的(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状，容量0.616cm³)容器(以下记载为盖)。首先，仅测定盖的质量。然后，在盖上安装漏斗，从漏斗倒入块使得块存留在盖内。装入足够量的块之后，将盖部分在桌子等硬处叩击200次，取下漏斗，用药铲摊平。在该盖中满满摊平的状态下测定质量。由该质量与盖单独的质量之差计算出块单独的质量，除以盖的体积，由此可以求出振实密度。

本发明中的一个生物亲和性高分子块的大小优选为20μm以上且200μm以下。更优选为20μm以上且120μm以下，进一步优选为50μm以上且120μm以下。

优选生物亲和性高分子块的振实密度为10mg/cm³以上且400mg/cm³以下，并且一个高分子块的大小为20μm以上且120μm以下。

本发明中的生物亲和性高分子块的“截面积的平方根÷周长”为0.01以上且0.13以下，优选为0.02以上且0.12以下，更优选为0.03以上且0.115以下，进一步优选为0.05以上且0.09以下。

认为生物亲和性高分子块的“截面积的平方根÷周长”与振实密度同样地表示生物亲和性高分子块的表面结构的复杂性、以及将高分子块集聚为集合体时所形成的空隙的量。“截面积的平方根÷周长”越小，生物亲和性高分子块间的空隙越多，细胞的成活区域越多。另外，通过不使其过小，能够在细胞彼此之间适度地存在生物亲和性高分子块，在形成细胞移植用细胞结构体时能够将营养成分送达该结构体内部，因此认为限制为上述范围是适当的。

生物亲和性高分子块的二维截面像的“面积的平方根÷周长”可以通过制作生物亲和性高分子块的截面标本、并确认截面结构来求出。例如，首先，以薄切标本(例如HE染色标本)的方式准备生物亲和性高分子块的截面结构。此时，可以仅观察生物亲和性高分子块的截面结构，也可以形成包含生物亲和性高分子块和细胞的细胞结构体来观察截面结构。对于一个生物亲和性高分子块，求出其截面积和周长，然后，计算出“截面积的平方根÷周长”。在10处以上的多处测量上述值，求出它们的平均值，由此可以得到“截面积的平方根÷周长”。

本发明中的一个生物亲和性高分子块的大小没有特别限定，优选为20μm以上且200μm以下，更优选为50μm以上且120μm以下。通过使一个生物亲和性高分子块的大小在上述范围内，能够实现更优异的细胞存活率。需要说明的是，一个生物亲和性高分子块的大小不是指多个生物亲和性高分子块的大小的平均值在上述范围内，而是指将多个生物亲和性高分子块过筛而得到的各个生物亲和性高分子块的尺寸。

本发明中的生物亲和性高分子块的交联度没有特别限定，优选为6以上，进一步优选为6以上且30以下，进一步优选为6以上且25以下，特别优选为8以上且22以下。

高分子块的交联度(每一分子的交联数)的测定方法没有特别限定，例如，可以通过后述实施例记载的TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法来测定。具体而言，可以分别制备将高分子块、NaHCO₃水溶液和TNBS水溶液混合、在37℃下反应3小时后使反应停止而得到的样品、以及将高分子块、NaHCO₃水溶液和TNBS水溶液混合后立即停止反应而得到的空白，测定用纯水稀释后的样品和空白的吸光度(345nm)，由下述(式1)和(式2)计算出交联度(每一分子的交联数)。

(式1)(As-Ab)/14600×V/w

(式1)表示每1g高分子块的赖氨酸量(摩尔当量)。

(式中，As表示样品吸光度、Ab表示空白吸光度、V表示反应液量(g)、w表示高分子块质量(mg))。

(式2)1-(样品(式1)/未交联的高分子(式1))×34

(式2)表示每一分子的交联数。

本发明中的生物亲和性高分子块的吸水率没有特别限定，优选为300％以上，更优选为400％以上，进一步优选为500％以上，特别优选为700％以上，最优选为800％以上。需要说明的是，吸水率的上限没有特别限定，但通常为4000％以下或2000％以下。

生物亲和性高分子块的吸水率的测定方法没有特别限定，例如，可以通过后述实施例记载的方法来测定。具体而言，可以在25℃下在3cm×3cm的尼龙网制的袋中填充约15mg的生物亲和性高分子块，在离子交换水中溶胀2小时后，风干10分钟，在各阶段测定质量，根据(式3)求出吸水率。

(式3)

吸水率＝(w2-w1-w0)/w0

(式中，w0表示吸水前的材料的质量、w1表示吸水后的空袋的质量、w2表示包括吸水后的材料在内的袋整体的质量)。

(1-5)生物亲和性高分子块的制造方法

关于生物亲和性高分子块的制造方法，只要能够得到满足上述(1-4)记载的条件的生物亲和性高分子块，则没有特别限定，例如，可以通过将生物亲和性高分子的多孔体使用粉碎机(New Power Mill等)进行粉碎来得到满足上述(1-4)记载的条件的生物亲和性高分子块。

在准备优选为1mm见方的材料作为本发明中的“多孔体”的情况下，可以使用如下材料：该材料的主体内部具有多个“10μm以上且500μm以下的孔隙”，并且在其主体中孔隙所占的体积为50％以上。这些材料中，上述内部的孔隙可以互相连通，也可以有一部分或全部孔隙开口于材料表面。

在制造生物亲和性高分子的多孔体时，通过包括溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冻结状态下为“溶剂熔点-3℃”以下的冻结步骤，使所形成的冰为球状。通过经过该步骤对该冰进行干燥，得到具有球状的各向同性的孔隙(球孔)的多孔体。在不包括溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冻结状态下为“溶剂熔点-3℃”以上的冻结步骤的情况下进行冻结，由此所形成的冰为柱状/平板状。经过该步骤对该冰进行干燥时，得到具有在一个轴或两个轴上长的柱状或平板状的孔隙(柱孔/平板孔)的多孔体。

本发明中，多孔体所具有的孔隙的形状相较于柱孔/平板孔更优选为球孔，另外，孔隙中球孔所占的比例进一步优选为50％以上。

本发明中，可以优选通过包括下述步骤的方法来制造生物亲和性高分子的多孔体，

这是因为，根据上述步骤，能够使孔隙中球孔所占的比例为50％以上。

更优选上述步骤(a)中，可以通过下述冻结处理进行冻结，该冻结处理中，溶液内液温最高的部分的液温(内部最高液温)在未冻结状态下为“溶剂熔点-7℃”以下。这是因为，根据该步骤，能够使孔隙中球孔所占的比例为80％以上。

多孔体所具有的孔隙的平均孔隙尺寸由该多孔体的截面结构观察而得到。首先，以薄切标本(例如HE染色标本)的方式准备多孔体的截面结构。然后，对于由高分子形成的壁中的清楚的突起部，与最接近的突起部连接，使孔隙清楚化。测量这样得到的划分后的各孔隙的孔隙面积，然后，计算出将该面积进行圆换算时的圆直径。将所得到的圆直径作为孔隙尺寸，可以将20个以上的平均值作为平均孔隙尺寸。

本说明书中的某一孔隙尺寸的空间占有率是指，具有某一孔隙尺寸的孔隙在多孔体中占有多大的体积这样的比例。具体而言，可以通过根据二维截面图像用某一孔隙尺寸的孔隙所占的面积除以总面积而以比例的形式求出。另外，作为所使用的截面图像，可以利用实际尺寸为1.5mm大的截面图像。

多孔体的孔隙尺寸20μm～200μm所占的空间占有率优选为83％以上且100％以下，更优选为85％以上且100％以下，进一步优选为90％以上且100％以下，特别优选为95％以上且100％以下。

多孔体的孔隙尺寸30μm～150μm所占的空间占有率优选为60％以上且100％以下，更优选为70％以上且100％以下，进一步优选为80％以上且100％以下，特别优选为90％以上且100％以下。

多孔体的孔隙尺寸20μm～200μm所占的空间占有率以及多孔体的孔隙尺寸30μm～150μm所占的空间占有率表示，多孔体中的孔隙尺寸分布限制在规定的范围内。即，在使通过将该多孔体粉碎而得到的高分子块为尺寸20μm～200μm大的高分子块时，该孔隙尺寸为接近于一个高分子块尺寸的尺寸，结果，在该孔隙尺寸的比例多的多孔体中，粉碎后的高分子块的结构变得复杂，结果导致振实密度、“截面积的平方根÷周长”减小。

关于孔隙的形状，求出各孔隙的长轴和短轴，由此计算出“长轴÷短轴”。将“长轴÷短轴”为1以上且2以下的情况作为球孔，将3以上的情况作为柱孔/平板孔。

本发明中的多孔体的孔隙率可以使用松密度(ρ)和真密度(ρc)通过孔隙率(P)＝1-ρ/ρc(％)来求出。松密度(ρ)可以由干燥质量和体积算出，真密度(ρc)可以通过哈伯德(Hubbard)型比重瓶法求出。本发明中的高分子多孔体的孔隙率优选为81％以上且99.99％以下，更优选为95.01％以上且99.9％以下。

(1-6)生物亲和性高分子块的用途

如本说明书中后文所述，通过将本发明的生物亲和性高分子块与至少一种细胞混合，能够制造本发明的细胞移植用细胞结构体。即，本发明的生物亲和性高分子块作为用于制造本发明的细胞移植用细胞结构体的试剂有用。

(2)细胞

本发明中使用的细胞只要能够实现本发明的细胞结构体的目的、即实施细胞移植，则可以使用任意的细胞，其种类没有特别限定。另外，所使用的细胞可以为一种，也可以将多种细胞组合使用。另外，作为所使用的细胞，优选为动物细胞，更优选为脊椎动物来源的细胞，特别优选为人来源的细胞。脊椎动物来源的细胞(特别是人来源的细胞)的种类可以为多潜能细胞、成体干细胞、祖细胞或成熟细胞中的任意一种。作为多潜能细胞，例如可以使用ES细胞、GS细胞或iPS细胞。作为成体干细胞，例如可以使用间充质干细胞(MSC)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、骨髄来源细胞、心肌干细胞、脂肪来源干细胞或神经干细胞。作为祖细胞及成熟细胞，例如可以使用皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、脾脏、口腔内、角膜、骨髄、脐带血、羊膜或头发来源的细胞。作为人来源的细胞，例如可以使用ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、成骨祖细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、成心肌细胞、神经细胞、肝细胞、β细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、骨髄来源细胞或造血干细胞。另外，细胞的来源可以为自体细胞或异体细胞中的任意一种。

例如，对于重症心力衰竭、重度心肌梗塞等心脏疾病，可以适当使用由自体和异体摘取的心肌细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、骨骼肌来源细胞(特别是卫星细胞)、骨髄细胞(特别是分化为心肌样细胞的骨髄细胞)等。此外，对于其他器官，也可以适当选择移植细胞。例如，可以列举神经祖细胞或可分化为神经细胞的细胞向脑缺血、脑梗塞部位的移植、血管内皮细胞或可分化为血管内皮细胞的细胞向心肌梗塞部位、骨骼肌缺血部位的移植等。

另外，可以列举在针对糖尿病性器官损害的细胞移植中使用的细胞。例如，可以列举针对肾脏、胰腺、末梢神经、眼、四肢的血运障碍等疾病进行了各种研究的细胞移植治疗法用的细胞。即，进行了在胰岛素分泌能力降低的胰腺中移植胰岛素分泌细胞的尝试、针对四肢的血运障碍的骨髄来源细胞的移植等的研究，可以使用这样的细胞。

另外，如本说明书中后文所述，本发明中，也可以使用血管系细胞。本说明书中，血管系细胞是指与血管形成相关的细胞，是构成血管和血液的细胞及能够分化为该细胞的祖细胞、成体干细胞。在此，血管系细胞中不包括ES细胞、GS细胞或iPS细胞等多潜能细胞以及间充质干细胞(MSC)这样的不会自然分化为构成血管和血液的细胞的细胞。作为血管系细胞，优选为构成血管的细胞。脊椎动物来源的细胞(特别是人来源的细胞)中，构成血管的细胞可以优选列举血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。血管内皮细胞包括静脉内皮细胞和动脉内皮细胞的任意一种。作为血管内皮细胞的祖细胞，可以使用血管内皮祖细胞。优选为血管内皮细胞和血管内皮祖细胞。构成血液的细胞可以使用血细胞，可以使用淋巴细胞、中性粒细胞等白细胞、单核细胞、作为它们的干细胞的造血干细胞。

本说明书中，非血管系细胞是指上述血管系以外的细胞。例如，可以使用ES细胞、iPS细胞、间充质干细胞(MSC)、心肌干细胞、心肌细胞、成纤维细胞、成肌细胞、软骨细胞、成肌细胞、肝细胞或神经细胞。可以优选使用间充质干细胞(MSC)、软骨细胞、成肌细胞、心肌干细胞、心肌细胞、肝细胞或iPS细胞。更优选为间充质干细胞(MSC)、心肌干细胞、心肌细胞或成肌细胞。

(3)细胞结构体

本发明中，通过使用上述的生物亲和性高分子块和上述的细胞，在多个细胞间的间隙内将多个该高分子块三维配置为嵌合状，能够具有适合用于细胞移植的厚度，并且，通过将生物亲和性高分子块与细胞三维配置为嵌合状，形成在结构体中均匀存在细胞的细胞三维结构体，能够将营养从外部送达细胞三维结构体的内部。由此，使用本发明的细胞移植用细胞结构体进行细胞移植时，可抑制移植后的细胞的坏死，从而能够进行移植。需要说明的是，在此所述的“坏死的抑制”是指与不移植本发明的细胞结构体而仅移植细胞的情况相比坏死的程度低。

本发明的细胞移植用细胞结构体中，在多个细胞间的间隙内配置有多个高分子块，在此，“细胞间的间隙”不需要为由构成的细胞封闭的空间，只要被细胞夹持即可。需要说明的是，不需要在所有细胞间存在间隙，也可以存在细胞彼此接触的部位。夹有高分子块的细胞间的间隙的距离、即选择某一细胞与存在于距该细胞距离最短处的细胞时的间隙距离没有特别限制，但优选为高分子块的大小，适当的距离也为高分子块的适当大小的范围。

另外，本发明所涉及的高分子块采用被细胞夹持的构成，但不需要在所有高分子块间存在细胞，也可以存在高分子块彼此接触的部位。夹有细胞的高分子块间的距离、即选择高分子块与存在于距该高分子块距离最短处的高分子块时的距离没有特别限制，但优选为1个～数个所使用的细胞集聚时的细胞块的大小，例如为10μm以上且1000μm以下，优选为10μm以上且100μm以下，更优选为10μm以上且50μm以下。

需要说明的是，本说明书中，使用了“在结构体中均匀存在细胞的细胞三维结构体”等“均匀存在”这样的表现，但并不意味着完全的均匀，是指可实现本发明的作用效果，即能够将营养从外部送达细胞三维结构体的内部、防止移植后细胞的坏死。

本发明的细胞移植用细胞结构体的厚度或直径可以设定为所期望的厚度，但作为下限，优选为215μm以上，进一步优选为400μm以上，最优选为730μm以上。厚度或直径的上限没有特别限定，作为使用上的通常的范围，优选为3cm以下，更优选为2cm以下，进一步优选为1cm以下。另外，作为细胞结构体的厚度或直径的范围，优选为400μm以上且3cm以下，更优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。

本发明的细胞移植用细胞结构体中，优选由高分子块形成的区域与由细胞形成的区域配置为嵌合状。需要说明的是，本说明书中的“细胞结构体的厚度或直径”表示如下含义。选择细胞结构体中的某一点A时，将从该点A通过的直线中按照与细胞结构体外界的距离最短的方式将细胞结构体截断的线段的长度作为线段A。选择细胞结构体中该线段A最长的点A，将此时的线段A的长度作为“细胞结构体的厚度或直径”。

另外，在使用本发明的细胞结构体作为后述的本发明的细胞移植用细胞结构体的制造方法中的融合前的细胞结构体、或第二高分子块添加前的细胞结构体的情况下，作为细胞结构体的厚度或直径的范围，优选为10μm以上且1cm以下，更优选为10μm以上且2000μm以下，进一步优选为15μm以上且1500μm以下，最优选为20μm以上且1300μm以下。

本发明的细胞移植用细胞结构体中，细胞与高分子块的比率没有特别限定，优选相对于一个细胞含有的高分子块的比率为0.0000001μg以上且1μg以下，进一步优选为0.000001μg以上且0.1μg以下，更优选为0.00001μg以上且0.01μg以下，最优选为0.00002μg以上且0.006μg以下。通过设定为上述范围，能够使细胞更均匀地存在。另外，通过使下限为上述范围，能够在用于上述用途时发挥细胞的效果，通过使上限为上述范围，能够将任意存在的高分子块中的成分供给至细胞。在此，高分子块中的成分没有特别限制，可以列举后述的培养基中含有的成分。

另外，本发明的细胞移植用细胞结构体可以含有血管发生因子。在此，作为血管发生因子，可以优选列举碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)等。含有血管发生因子的细胞移植用细胞结构体的制造方法没有特别限制，例如，可以通过使用浸渗有血管发生因子的高分子块来制造。从促进血管新生的观点等出发，优选本发明的细胞移植用细胞结构体含有血管发生因子。

作为本发明的细胞移植用细胞集合体的一例，为由非血管系细胞和血管系细胞构成的细胞移植用细胞集合体，其满足下述条件中的至少一个条件，

(a)具有细胞集合体的中心部的血管系细胞的面积大于周边部的血管系细胞的面积的区域；和

(b)具有中心部的血管系细胞密度为1.0×10^-4个细胞/μm³以上的区域。

本发明的细胞移植用细胞集合体优选满足上述(a)和(b)这两个条件，还优选具有上述中心部的血管系细胞的比例相对于血管系细胞的总面积为60％～100％的区域。

本发明的细胞移植用细胞结构体还可以适当使用含有非血管系细胞的细胞结构体。另外，构成本发明的细胞移植用细胞结构体的细胞还可以适当使用仅为非血管系细胞的细胞。利用仅含有非血管系细胞作为细胞的本发明的细胞移植用细胞结构体，在移植后，能够在移植部位形成血管。另外，在构成本发明的细胞移植用细胞结构体的细胞为两种以上、且包含非血管系细胞和血管系细胞这两者的情况下，与仅由非血管系细胞构成的情况相比，能够更好地进行血管形成，因此优选。

此外，在构成本发明的细胞移植用细胞结构体的细胞为两种以上、且具有细胞结构体的中心部的血管系细胞的面积大于周边部的血管系细胞的面积的区域的情况下，能够进一步进行血管形成，因此进一步优选。在此，具有细胞结构体的中心部的血管系细胞的面积大于周边部的血管系细胞的面积的区域具体是指，制作任意的2μm的薄切标本时，存在具有上述区域的标本。在此，细胞结构体的中心部是指从中心至细胞结构体的表面为止的距离中的、从中心至80％距离为止的区域，细胞结构体的周边部是指从距中心的距离为80％的部位至结构体表面为止的区域。需要说明的是，细胞结构体的中心部如下确定。

在从细胞结构体的中心通过的任意截面中，沿着该截面的外延使半径为X的圆的中心移动一周，求出将移动的圆与截面的重复部分除去后的部分的面积为上述截面的截面积的64％的半径X。使该半径为X的圆的中心移动一周，以将移动的圆与截面的重复部分除去后的部分作为细胞结构体的中心部。此时，最优选截面积最大的截面。需要说明的是，细胞结构体的中心是指，在截面积最大的截面中，沿着该截面的外延使半径为Y的圆的中心移动一周，求出将移动的圆与截面的重复部分除去后的部分确定于一点的半径Y。使该半径Y的圆的中心移动一周，以将移动的圆与截面的重复部分除去后得到的一点作为细胞结构体的中心。在不确定于一点而成为线段的情况下、或者在存在多个该线段的情况下，以将各线段的长度两等分的点作为中心。

具体而言，优选具有中心部的血管系细胞的比例相对于血管系细胞的总面积为60％～100％的区域，更优选上述比例为65％～100％，进一步优选为80％～100％，进一步优选为90％～100％。需要说明的是，在此，具有中心部的血管系细胞的比例相对于血管系细胞的总面积为60％～100％的区域具体是指，在制作任意的2μm的薄切标本时，存在具有该比例的区域的标本。通过为该范围，能够进一步促进血管形成。

需要说明的是，关于中心部的血管系细胞的比例，例如，也可以通过如下方法来算出：在制作薄切标本时，对作为测定对象的血管系细胞进行染色，使用图像处理软件ImageJ，求出中心部的色浓度(强度)的平均值，计算出中心部的面积×强度，进一步求出整体的色浓度(强度)的平均值，计算出整体的面积×强度，求出中心部的面积×强度相对于整体的面积×强度的比例，由此算出中心部的血管系细胞的比例。在此，对血管系细胞进行染色的方法可以适当使用公知的染色方法，例如，在使用人血管内皮祖细胞(hECFC)作为细胞的情况下，可以使用CD31抗体。

另外，优选具有细胞结构体的中心部的血管系细胞密度为1.0×10^-4个细胞/μm³以上的区域，更优选在细胞结构体的整个中心部达到上述细胞密度。需要说明的是，在此，具有1.0×10^-4个细胞/μm³以上的区域具体是指，在制作任意的2μm的薄切标本时，存在具有该密度的区域的标本。上述细胞密度更优选为1.0×10^-4～1.0×10^-3个细胞/μm³，进一步优选为1.0×10^-4～2.0×10^-4个细胞/μm³，进一步优选为1.1×10^-4～1.8×10^-4个细胞/μm³，进一步优选为1.4×10^-4～1.8×10^-4个细胞/μm³。通过为该范围，能够进一步促进血管形成。

在此，中心部的血管系细胞密度可以通过实际计数薄切标本的细胞数、并用细胞数除以体积来求出。在此所述的中心部如下确定。在上述的中心部沿垂直方向切取薄切标本的厚度的量而得到的部分。细胞密度的求法如下：例如，将上述对作为测定对象的血管系细胞进行了染色的薄切标本与对细胞核进行了染色的薄切标本重叠，计数重叠的细胞核的数量，由此可以算出中心部的血管系细胞数，体积通过使用ImageJ求出中心部的面积、并乘以该薄切标本的厚度来求出。

需要说明的是，本发明的细胞移植用细胞结构体中，也包括使用细胞为两种以上、且含有非血管系细胞和血管系细胞这两者的本发明的细胞移植用细胞结构体进行了血管形成的情况。另外，在此，“细胞为两种以上、且含有非血管系细胞和血管系细胞这两者的本发明的细胞移植用细胞结构体”的优选范围与上述同样。构建血管的方法例如可以列举如下方法：在将血管部分掏空为隧道状的凝胶材料上贴附混合有血管系细胞的细胞片，在隧道中流通培养液的同时进行培养。另外，也可以通过在细胞片之间以夹心状夹入血管系细胞来构建血管。

(4)细胞移植用细胞结构体的制造方法

本发明的细胞移植用细胞结构体可以通过将本发明的生物亲和性高分子块与至少一种细胞混合来制造。更具体而言，本发明的细胞结构体可以通过将生物亲和性高分子块(由生物亲和性高分子形成的块)与细胞交替配置来制造。制造方法没有特别限定，优选为在形成高分子块后接种细胞的方法。具体而言，可以通过对生物亲和性高分子块与含有细胞的培养液的混合物进行孵育来制造本发明的细胞结构体。例如，在容器中，在保持于容器内的液体中，将细胞和预先制作的生物亲和性高分子块配置为嵌合状。优选通过使用自然凝聚、自然落下、离心、搅拌作为配置的手段来促进、控制由细胞和生物亲和性基材形成的嵌合状的排列形成。

作为所使用的容器，优选由细胞低粘附性材料、细胞非粘附性材料构成的容器，更优选为由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯构成的容器。容器底面的形状优选为平底型、U字型、V字型。

通过上述方法得到的嵌合状细胞结构体例如可以通过下述方法制造成所期望大小的细胞结构体，

(a)使分别制备的嵌合状细胞块彼此融合；或者

(b)在分化培养基或增殖培养基中增容；等。

融合的方法、增容的方法没有特别限定。

例如，在对生物亲和性高分子块与含有细胞的培养液的混合物进行孵育的步骤中，可以通过将培养基更换为分化培养基或增殖培养基来使细胞结构体增容。优选在对生物亲和性高分子块与含有细胞的培养液的混合物进行孵育的步骤中，可以通过进一步添加生物亲和性高分子块来制造所期望大小的在细胞结构体中均匀存在细胞的细胞结构体。

作为使上述分别制备的嵌合状细胞块彼此融合的方法，具体而言为如下的细胞结构体的制造方法，该制造方法包括使多个细胞结构体融合的步骤，该细胞结构体含有多个生物亲和性高分子块和多个细胞，且在由上述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部内配置有一个或多个上述生物亲和性高分子块。

本发明的细胞结构体的制造方法所涉及的“生物亲和性高分子块(种类、大小等)”、“细胞”、“细胞间的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与高分子块的比率”等的优选范围与本说明书中的上述同样。

另外，优选上述融合前的各细胞结构体的厚度或直径为10μm以上且1cm以下，上述融合后的厚度或直径为400μm以上且3cm以下。在此，作为上述融合前的各细胞结构体的厚度或直径，更优选为10μm以上且2000μm以下，进一步优选为15μm以上且1500μm以下，最优选为20μm以上且1300μm以下，另外，作为上述融合后的厚度或直径的范围，更优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。

上述的通过进一步添加生物亲和性高分子块来制造所期望大小的细胞结构体的方法具体而言为如下的细胞结构体的制造方法，该制造方法包括如下步骤：在含有多个第一生物亲和性高分子块和多个细胞、且在由该多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部内配置有一个或多个上述生物亲和性高分子块的细胞结构体中进一步添加第二生物亲和性高分子块，并进行孵育。在此，“生物亲和性高分子块(种类、大小等)”、“细胞”、“细胞间的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与高分子块的比率”等的优选范围与本说明书中的上述同样。

在此，优选将想使其融合的细胞结构体之间设置为0μm以上且50μm以下的距离，更优选为0μm以上且20μm以下、进一步优选为0μm以上且5μm以下的距离。使细胞结构体彼此融合时，认为通过细胞的增殖、伸展，细胞或细胞所产生的基质发挥粘附剂的作用，从而使其接合，通过设定为上述范围，细胞结构体彼此的粘附变得容易。

作为通过本发明的细胞结构体的制造方法得到的细胞结构体的厚度或直径的范围，优选为400μm以上且3cm以下，更优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。

在细胞结构体中进一步添加第二生物亲和性高分子块并进行孵育时，第二生物亲和性高分子块的添加速度优选配合所使用的细胞的增殖速度来适当选择。具体而言，添加第二生物亲和性高分子块的速度快时，细胞向细胞结构体的外侧移动，细胞的均匀性降低，添加的速度慢时，形成细胞的比例增多的部位，细胞的均匀性降低，因此，要考虑所使用的细胞的增殖速度来选择。

作为含有非血管系细胞和血管系细胞这两者时的细胞结构体的制造方法，例如可以优选列举下述(a)～(c)的制造方法。

(a)为具有在使用非血管系细胞通过上述方法形成细胞结构体后、添加血管系细胞和生物亲和性高分子块的步骤的制造方法。在此，“添加血管系细胞和高生物亲和性分子块的步骤”包括上述的使制备的嵌合状细胞块彼此融合的方法、和在分化培养基或增殖培养基中增容的方法中的每一种方法。通过该方法，能够制造(i)在细胞结构体的中心部非血管系细胞的面积比血管系细胞更多、在周边部血管系细胞的面积比非血管系细胞更大的细胞结构体、(ii)细胞结构体的中心部的非血管系细胞的面积比周边部的非血管系细胞的面积大的细胞移植用细胞结构体、(iii)细胞结构体的中心部的血管系细胞的面积比周边部的血管系细胞的面积小的细胞移植用细胞结构体。

(b)为具有在使用血管系细胞通过上述方法形成细胞结构体后、添加非血管系细胞和生物亲和性高分子块的步骤的制造方法。在此，“添加非血管系细胞和生物亲和性高分子块的步骤”包括上述的使制备的嵌合状细胞块彼此融合的方法、和在分化培养基或增殖培养基中增容的方法中的每一种方法。通过该方法，能够制造(i)在细胞结构体的中心部血管系细胞的面积比非血管系细胞更大、在周边部非血管系细胞的面积比血管系细胞更大的细胞结构体、(ii)细胞结构体的中心部的血管系细胞的面积比周边部的血管系细胞的面积大的细胞移植用细胞结构体、(iii)细胞结构体的中心部的非血管系细胞的面积比周边部的非血管系细胞的面积小的细胞移植用细胞结构体。

(c)为实质上同时使用非血管系细胞和血管系细胞、通过上述方法形成细胞结构体的制造方法。通过该方法，能够制造在细胞结构体的任一部位非血管系细胞和血管系细胞中的任意一种都不会显著偏在的细胞结构体。

从移植后在移植部位形成血管的观点出发，优选为在细胞结构体的中心部血管系细胞的面积比非血管系细胞大、在周边部非血管系细胞的面积比血管系细胞大的细胞结构体；以及中心部的血管系细胞的面积比周边部的血管系细胞的面积大的细胞移植用细胞结构体，通过形成该细胞结构体，能够进一步促进血管形成。此外，该细胞结构体中，存在于中心部的细胞数越多，越能够进一步促进血管形成。

出于同样的理由，优选具有在利用血管系细胞形成细胞结构体后、添加非血管系细胞和生物亲和性高分子块的步骤的制造方法。并且，进一步优选使血管系细胞数增多。

(5)细胞移植用细胞结构体的用途

本发明的细胞移植用细胞结构体例如可以用于在重症心力衰竭、重度心肌梗塞等心脏疾病、脑缺血/脑梗塞等疾病部位进行细胞移植的目的。另外，也可以用于糖尿病性的肾脏、胰腺、末梢神经、眼、四肢的血运障碍等疾病。作为移植方法，可以使用切开、注射、内窥镜。本发明的细胞结构体不同于细胞片这样的细胞移植物，能够使结构体的尺寸小，因此，可以实施利用注射进行移植这样的低创伤的移植方法。

另外，根据本发明，提供一种细胞移植方法。本发明的细胞移植方法的特征在于，使用上述的本发明的细胞移植用细胞结构体。细胞移植用细胞结构体的优选范围与上述同样。

通过以下的实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于实施例。

实施例

[实施例1]重组肽(重组明胶)

作为重组肽(重组明胶)，准备如下记载的CBE(记载于WO2008-103041)。

CBE3

分子量：51.6kD

结构：GAP[(GXY)₆₃]₃G

氨基酸数：571个

RGD序列：12个

亚氨酸含量：33％

几乎100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不含有丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。

等电点：9.34、GRAVY值：-0.682、1/IOB值：0.323

氨基酸序列(序列表的序列号1)(与WO2008/103041号公报的序列号3相同。但是，末尾的X修正为“P”)

GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G

[实施例2]重组肽多孔体(高分子多孔体)的制作

准备厚度1mm、直径47mm的铝制圆筒杯状容器。将圆筒杯的曲面作为侧面时，侧面由1mm的铝封闭，底面(平板的圆形状)也由1mm的铝封闭。另一方面，顶面形成开放的形状。另外，仅在侧面的内部均匀地铺设厚度为1mm的特氟龙(注册商标)，结果圆筒杯的内径为45mm。以下，将该容器称为圆筒形容器。

制备CBE3水溶液，将该CBE3水溶液倒入圆筒形容器中。在冷冻库内使用冷却搁板从底面对CBE3水溶液进行冷却。此时，按照如下记载准备冷却搁板的温度、夹在搁板与圆筒形容器之间的隔热板(玻璃板)的厚度、所装入的CBE3水溶液的最终浓度及水溶液量。

(1)搁板温度-40℃、玻璃板的厚度2.2mm、CBE3水溶液的最终浓度12％、水溶液量4mL。

(2)搁板温度-60℃、玻璃板的厚度2.2mm、CBE3水溶液的最终浓度7.5％、水溶液量4mL。

(3)搁板温度-40℃、玻璃板的厚度2.2mm、CBE3水溶液的最终浓度4.0％、水溶液量4mL。

将这样得到的冻结CBE3块进行冷冻干燥，得到CBE3多孔体。

[比较例1]重组肽单纯冻结多孔体的制作

在50℃下将2000mg的CBE3溶解于18mL的超纯水中，制作20mL终浓度10％的CBE3溶液。将该CBE3溶液薄薄地拉伸，制作约4mm厚的薄板状的凝胶。关于容器，在白色的板安装硅框架(约5cm×约10cm)，用力地按压硅框架以消除空气的间隙，然后向该框架内倒入上述CBE3溶液(50℃)。倒入溶液后，移动至4℃，使其进行约1小时的凝胶化，确认凝固后，移动至-80℃，使凝胶冻结3小时。冻结后，使用冷冻干燥机(EYELA、FDU-1000)进行冷冻干燥。需要说明的是，此时得到的冷冻干燥体为多孔体，平均孔尺寸为57.35μm。以下，将其称为单纯冻结多孔体。

[实施例3]重组肽多孔体的孔隙尺寸和空间占有率的评价

对于实施例2中得到的CBE3多孔体和比较例1中得到的单纯冻结多孔体，实施多孔的孔隙尺寸和空间占有率的评价。将所得到的多孔体在160℃下进行20小时的热交联，使其不溶化后，以足够的时间在生理盐水中溶胀。然后，使用切片机制作冻结组织切片，制作HE(苏木精-伊红)染色标本。由标本准备实尺度为1.5mm大的截面像，测定各孔隙面积，然后，算出将该面积进行圆换算时的圆直径，作为孔隙尺寸。将20个以上该孔隙的平均值作为平均孔隙尺寸。其结果，(1)为66.39μm、(2)为63.17μm、(3)为56.36μm。

基于所算出的孔隙尺寸，利用上述中使用的二维截面图像，用某一孔隙尺寸的孔隙所占的面积除以总面积，由此以比例的形式求出空间占有率。其结果，在实施例2中得到的CBE多孔体中，就20μm～200μm的孔隙的空间占有率而言，(1)为100％、(2)为99.9％、(3)为99.9％。就30μm～150μm的孔隙的空间占有率而言，(1)为94.2％、(2)为97.9％、(3)为99.3％。

另一方面，比较例1中得到的单纯冻结多孔体中，孔隙的尺寸存在显著偏差，存在大尺寸聚集的部位和小尺寸聚集的部位。在大尺寸的部位，20μm～200μm的孔隙的空间占有率为74.3％，30μm～150μm的孔隙的空间占有率为55.8％。在小尺寸集中的部位，20μm～200μm的孔隙的空间占有率为82.8％，30μm～150μm的孔隙的空间占有率为57.2％。由于大尺寸的部位和小尺寸的部位各混合存在一半，因此，20μm～200μm的孔隙的空间占有率为78.6％，30μm～150μm的孔隙的空间占有率为56.5％(图6)。

[实施例4]重组肽多孔体的孔隙率测定

对实施例2中得到的CBE3多孔体，测定孔隙率。测定时，测定松密度(ρ)和真密度(ρc)，求出孔隙率(P＝1-ρ/ρc(％))。CBE3多孔体的松密度(ρ)由干燥质量和体积算出。真密度(ρc)通过哈伯德(Hubbard)型比重瓶法求出。作为样品数(N)＝4的结果可知，(3)的多孔体中松密度为0.05g/cm³、真密度为1.23g/cm³、孔隙率为96％(CV值为8％)。另外可知，(1)、(2)中的孔隙率分别为87％(CV值为10％)、92％(CV值为7％)。

[实施例5]重组肽块的制作(多孔体的粉碎和交联)

将实施例2中得到的(1)、(2)、(3)的CBE3多孔体用New Power Mill(大阪化学、NewPower Mill PM-2005)粉碎。粉碎通过以最大转速1分钟×5次、总计5分钟的粉碎来进行。对于所得到的粉碎物，使用不锈钢制的筛进行尺寸分级，得到25～53μm、53～106μm、106μm～180μm的CBE3块。然后，在减压下在160℃实施热交联(交联时间实施24小时、48小时、56小时、60小时、72小时、84小时、96小时、120小时、288小时这9种)，得到试样。以下，将(1)的53～106μm称为“12％中”、将(2)的25～53μm称为“7.5％小”、将(2)的53～106μm称为“7.5％中”、将(2)的106～180μm称为“7.5％大”、将(3)的53～106μm称为“4％中”。

[比较例2]重组肽的GA(戊二醛)交联μ块的制作

作为专利文献5记载的使用戊二醛的比较例，使用重组肽CBE3作为基材，制作不定形的GA交联μ块。将1000mg的CBE3溶解于9448μL的超纯水中，添加1N HCl 152μL后，添加400μL 25％戊二醛使得终浓度为1.0％，在50℃下反应3小时，制作交联凝胶。将该交联凝胶浸渍到1L的0.2M甘氨酸溶液中，在40℃振荡2小时。然后，将交联凝胶在5L的超纯水中进行1小时的振荡清洗，置换为新的超纯水，再次清洗1小时，重复上述操作，总计清洗6次。将清洗后的交联凝胶在-80℃冻结5小时后，使用冷冻干燥机(EYELA、FDU-1000)进行冷冻干燥。将所得到的冷冻干燥体使用New Power Mill(大阪化学、New Power MillPM-2005)粉碎。粉碎通过以最大转速1分钟×5次、总计5分钟的粉碎来进行。对于所得到的粉碎物，使用不锈钢制的筛进行尺寸分级，得到25～53μm的CBE3-GA交联μ块。

[比较例3]比较用重组肽块的制作

作为比较例，按照如下记载制作在通过从现有技术(专利文献5)类推而来的不含戊二醛的步骤制作时形成的比较用重组肽块。使用重组肽CBE3作为基材来制作块。将比较例1中得到的单纯冻结多孔体使用New Power Mill(大阪化学、New Power MillPM-2005)进行粉碎。粉碎通过以最大转速1分钟×5次、总计5分钟的粉碎来进行。对于所得到的粉碎物，使用不锈钢制的筛进行尺寸分级，得到25～53μm的CBE3块。将其放入160℃的烘箱，进行72小时热交联。

[实施例6]重组肽块的振实密度测定

振实密度是表示在一定的体积内能够密实地填充多少数量的块的值，值越小，可以说越无法密实地填充，即块的结构越复杂。振实密度如下测定。首先，准备在漏斗前端带有盖(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状，容量0.616cm³)的用具，仅测定盖的质量。然后，将盖安装到漏斗上，从漏斗倒入块使得块存留在盖内。装入足够量的块之后，将盖部分在桌子等硬处叩击200次，取下漏斗，用药铲摊平。在该盖中满满摊平的状态下测定质量。由该质量与盖单独的质量之差计算出块单独的质量，除以盖的体积，由此求出振实密度。

结果，比较例3的块为524mg/cm³。

另一方面，对于实施例5的块而言，“12％中”为372mg/cm³、“7.5％小”为213mg/cm³、“7.5％中”为189mg/cm³、“7.5％大”为163mg/cm³、“4％中”为98mg/cm³。可知，实施例5的块由于结构的复杂性，振实密度相对于比较例3的块减小。

[实施例7]重组肽块的二维截面图像的“面积的平方根÷周长”的计算

作为表示块的复杂性的指标，求出块的“面积的平方根”与“周长”的关系。即，块的“面积的平方根÷周长”的值越小，可以说越复杂。该值使用图像分析软件算出。首先，准备可看出块的形状的图像。具体而言，本实施例中，使用将在水中充分溶胀的块群用切片机制成冻结切片、并进行了HE(苏木精-伊红))染色的标本。在块之外存在细胞等的情况下，使用photoshop利用自动选择工具仅提取出制剂，使得图像上仅有块。将该图像使用Imagej求出块的面积和周长，算出“面积的平方根÷周长”的值。但是，将10μm以下的块除去。

结果，比较例3的块为0.139。

另一方面，对于实施例5的块而言，“12％中”为0.112、“7.5％小”为0.083、“7.5％中”为0.082、“7.5％大”为0.071、“4％中”为0.061。可知实施例5的块由于结构的复杂性，“面积的平方根÷周长”的值相对于比较例3的块减小，另外，还可知上述值与振实密度存在相关。

[实施例8]重组肽块的交联度测定

算出实施例5和比较例3中交联的块的交联度(每一分子的交联数)。测定使用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法。

<样品制备>

在玻璃瓶中添加样品约10mg、4％NaHCO₃水溶液1mL、1％的TNBS水溶液2mL，在37℃振荡3小时。然后，加入10mL的37％盐酸和5mL的纯水后，在37℃静置16小时以上，作为样品。

<空白制备>

在玻璃瓶中添加样品约10mg、4％NaHCO₃水溶液1mL、1％TNBS水溶液2mL，之后立即加入37％盐酸3mL，在37℃振荡3小时。然后，加入7mL的37％盐酸和5mL的纯水后，在37℃静置16小时以上，作为空白。

测定用纯水稀释10倍的样品和空白的吸光度(345nm)，由下述(式1)和(式2)算出交联度(每一分子的交联数)。

(式1)(As-Ab)/14600×V/w

(式1)表示每1g重组肽的赖氨酸量(摩尔当量)。

(式中，As表示样品吸光度、Ab表示空白吸光度、V表示反应液量(g)、w表示重组肽质量(mg))

(式2)1-(样品(式1)/未交联重组肽(式1))×34

(式2)表示每一分子的交联数。

结果，对于实施例5的块而言，“12％中”在48小时交联时交联度为12，“7.5％小”、“7.5％中”和“7.5％大”在24小时交联时交联度为8，“4％中”在48小时交联时交联度为9。另外，“7.5％中”在288小时交联时为22。另一方面，比较例3的块在72小时交联时为16。

[实施例9]重组肽块的吸水率测定

算出实施例5和比较例3中制作的块的吸水率。

25℃下，在3cm×3cm的尼龙网制的袋中填充约15mg的块，在离子交换水中溶胀2小时后，风干10分钟。在各阶段测定质量，根据(式3)求出吸水率。

(式3)

吸水率＝(w2-w1-w0)/w0

(式中，w0表示吸水前的材料的质量、w1表示吸水后的空袋的质量、w2表示包括吸水后的材料在内的袋整体的质量)

结果，对于实施例5的块而言，“12％中”为304％、“7.5％小”为819％、“7.5％中”为892％、“7.5％大”为892％、“4％中”为901％。另一方面，比较例3的块为280％。

[实施例10]使用重组肽块的嵌合细胞块的制作(hMSC)

将人骨髄来源的间充质干细胞(hMSC)使用增殖培养基(宝生物：MSCGMBulletKit^TM)调节成10万个细胞/mL，以0.1mg/mL加入实施例5中制作的CBE3块后，将200μL接种到Sumilon Cell-Tight X96U板(住友电木、底为U字型)中，使用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分钟)，静置24小时，制作直径约1mm的球状的、由CBE3块和hMSC细胞构成的嵌合细胞块(相对于一个细胞为0.001μg的块)。需要说明的是，由于在U字型的板中进行制作，因此，该嵌合细胞块为球状。另外，对于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均与上述同样制作。

[比较例4]使用比较用重组肽块的嵌合细胞块的制作(hMSC)

将人骨髄来源的间充质干细胞(hMSC)使用增殖培养基(宝生物：MSCGMBulletKit^TM)调节为10万个细胞/mL，以0.1mg/mL加入比较例3中制作的CBE3块后，将200μL接种到Sumilon Cell-Tight X96U板(住友电木、底为U字型)中，使用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分钟)，静置24小时，制作直径约1mm的球状的、由CBE3块和hMSC细胞构成的嵌合细胞块(相对于一个细胞为0.001μg的块)。需要说明的是，由于在U字型的板进行制作，因此该嵌合细胞块为球状。

[比较例5]使用重组肽GA交联μ块的嵌合细胞块的制作(hMSC)

如下制作比较用的含有戊二醛的嵌合细胞块。将人骨髄来源的间充质干细胞(hMSC)使用增殖培养基(宝生物：MSCGM BulletKit^TM)调节为10万个细胞/mL，以0.1mg/mL加入比较例2中制作的GA交联μ块后，将200μL接种到Sumilon Cell-Tight X96U板(住友电木、底为U字型)中，使用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分钟)，静置24小时，制作直径约1mm的球状的、由GA交联μ块和hMSC细胞构成的嵌合细胞块(相对于一个细胞为0.001μg的块)。需要说明的是，由于在U字型的板中进行制作，因此该嵌合细胞块为球状。

[实施例11]使用重组肽块的嵌合细胞块的制作(hMSC+hECFC)

将人血管内皮祖细胞(hECFC)使用增殖培养基(Lonza：EGM-2+ECFC血清补充剂)调节为10万个细胞/mL，以0.05mg/mL加入实施例5中制作的CBE3块后，将200μL接种到SumilonCell-Tight X96U板中，使用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分钟)，静置24小时，制作扁平状的由ECFC和CBE3块构成的嵌合细胞块。然后，除去培养基，将人骨髄来源的间充质干细胞(hMSC)使用增殖培养基(宝生物：MSCGM BulletKit^TM)调节为10万个细胞/mL，以达到0.1mg/mL的方式加入实施例5中制作的CBE3块后，将存在有hECFC嵌合细胞块的200μL接种到Sumilon Cell-Tight X96U板中，使用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分钟)，静置24小时，制作直径约1mm的球状的、由hMSC、hECFC和CBE3块构成的嵌合细胞块。另外，对于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均与上述同样地制作。

[实施例12]使用重组肽块的嵌合细胞块(hMSC)的融合

将实施例10中制作的第二天的嵌合细胞块(使用本发明的CBE3块)5个并列在Sumilon Cell-Tight X96U板中，进行24小时培养。结果可知，在嵌合细胞块彼此之间，排列在外周部的细胞发生了结合，由此使嵌合细胞块自然地融合。另外，对于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均与上述同样地制作。

[实施例13]使用重组肽块的嵌合细胞块(hMSC+hECFC)的融合

将实施例11中制作的第二天的嵌合细胞块(使用本发明的CBE3块)5个并列在Sumilon Cell-Tight X96U板中，进行24小时培养。结果可知，在嵌合细胞块彼此之间，排列在外周部的细胞发生了结合，由此使嵌合细胞块自然地融合。另外，对于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均与上述同样地制作。

[比较例6]使用比较用重组肽块的嵌合细胞块(hMSC)的融合

将比较例4中制作的第二天的嵌合细胞块(来源于比较用的CBE3块)5个并列在Sumilon Cell-Tight X96U板中，进行24小时培养。结果可知，在嵌合细胞块彼此之间，排列在外周部的细胞发生了结合，由此使嵌合细胞块自然地融合。

[比较例7]使用重组肽GA交联μ块的嵌合细胞块(hMSC)的融合

将比较例5中制作的第二天的嵌合细胞块(来源于GA交联μ块)5个并列在SumilonCell-Tight X96U板中，进行24小时培养。结果可知，在嵌合细胞块彼此之间，排列在外周部的细胞发生了结合，由此使嵌合细胞块自然地融合。

[实施例14]体外ATP分析

对各嵌合细胞块中的细胞所产生、保持的ATP(三磷酸腺苷)量进行定量。ATP已知为全体生物的能量源，通过对ATP合成量、保持量进行定量，能够获知细胞的代谢活性的状态、活动状态。测定使用CellTiter-Glo(Promega公司)。对于实施例10和比较例4、比较例5中制作的嵌合细胞块，均在第7天使用CellTiter-Glo对各嵌合细胞块中的ATP量进行定量。结果，与使用GA交联μ块的嵌合细胞块相比，使用比较用的CBE3块的嵌合细胞块得到ATP量少的结果。另一方面可知，使用本发明的CBE3块的嵌合细胞块的ATP量比使用GA交联μ块的嵌合细胞块的ATP量多。本发明的CBE3块在“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”的情况下均同样地得到产生了比使用GA交联μ块的嵌合细胞块多的ATP的结果(图1)。即可知，使用具有复杂结构的本发明的CBE3块的嵌合细胞块的内部细胞的存活状态更良好。

[实施例15]使用重组肽块的巨大嵌合细胞块的制作

如实施例12所示，将1mm的嵌合细胞块进行融合，能够制作巨大的嵌合细胞块，但能够一次性地制作巨大的嵌合细胞块时可使操作简化。在此，在实施了细胞非粘附加工的Sumilon Cell-Tight的9cm培养皿中加入使用增殖培养基(宝生物：MSCGM BulletKit^TM)调节为1.5％的琼脂糖(Agarose S)溶液50mL。此时，将1cm见方的棒状硅以在琼脂糖溶液中浸渍约5mm的方式固定，在琼脂糖凝固后，去除硅，制作成在琼脂糖中形成有1cm见方的凹陷的容器。向其中加入适量增殖培养基，以不使凝胶干燥的方式保存。去除培养基，将实施例5中制作的块中具有代表性的“7.5％中”16mg与250万个细胞的人骨髄来源的间充质干细胞(hMSC)的悬浊物添加到凹陷中，然后轻轻加入25mL的增殖培养基。培养1天后，可以制作出1cm见方、厚度2-3mm的巨大嵌合细胞块。将其转移至装有25mL增殖培养基的Sumilon Cell-Tight的9cm培养皿中，进一步培养2天后，转移至装有25mL增殖培养基的旋转烧瓶中进行搅拌培养，制作培养7天后的嵌合细胞块的截面的HE染色标本。结果，确认到在培养7天后内部的细胞仍存活。由此可知，通过将细胞与块混合并倒入模具中进行培养，能够制作巨大的嵌合细胞块。另外，该方法可用于GA交联μ块、比较用块及本发明的块中的任意一种，不依赖于块的种类。

[实施例16]使用重组肽块的嵌合细胞块的移植

小鼠使用NOD/SCID(Charles River)的雄性、4～6周龄的小鼠。在麻醉下将小鼠腹部的体毛除去，在上腹部的皮下形成切口，从切口插入剪刀，将皮肤从肌肉剥离后，用镊子捞取实施例12、实施例13、比较例6和比较例7中制作的嵌合细胞块，移植到距切口约1.5cm的靠近下腹部的皮下，将皮肤的切口部缝合。

[实施例17]使用重组肽块的嵌合细胞块的采集

在自移植起1周后和2周后进行解剖。剥离腹部的皮肤，切取约1cm²的正方形大小的附着有嵌合细胞块的皮肤。在嵌合细胞块也附着在腹部的肌肉上的情况下，与肌肉一起采集下来。

[实施例18]标本分析

对附着有嵌合细胞块的皮肤片和移植前的嵌合细胞块制作组织切片。将皮肤浸渍到4％多聚甲醛中，进行福尔马林固定。然后，用石蜡包埋，制作包含嵌合细胞块的皮肤的组织切片。切片进行HE染色(苏木精-伊红染色)。

将移植了实施例12的“7.5％中”、比较例6和比较例7的2周后的HE标本示于图2。图2记载的存活率表示全部细胞数(活细胞数+死细胞数)中的活细胞数的比例。

可知，与使用比较例7的GA交联μ块的嵌合细胞块(图2的A：活细胞数100个；存活率80％)相比，使用比较例6的块的嵌合细胞块(图2的B：活细胞数37个；存活率45％)中活细胞少。另一方面可知，使用实施例12的本发明的块(“7.5％中”)的嵌合细胞块(图2的C：活细胞数116个；存活率84％)与使用比较例6的块的嵌合细胞块(图2的B：活细胞数37个；存活率45％)相比，活细胞多，存活良好。该结果与实施例14中的体外分析的结果也一致，可知，通过采用本发明的块，能够使移植后的细胞的存活良好。

另外，将本发明的块群中的移植细胞的存活状态示于图3。图3记载的存活率表示全部细胞数(活细胞数+死细胞数)中的活细胞数的比例。

106～180μm尺寸的“7.5％大”的存活率为57％，“7.5％小”的存活率为62％，“7.5％中”的存活率为84％，“4％中”的存活率为82％。即可知，在本发明的块群中，与106～180μm尺寸的“7.5％大”相比，“7.5％小”、“7.5％中”、“4％中”的细胞的存活更良好(图3)。另外，由最上面的移植结果可知，“7.5％中”和“4％中”比“7.5％小”的移植细胞的存活更良好(图3)。即可知，具有高分子块的振实密度或高分子块的二维截面像的截面积的平方根÷周长的值在规定范围内的结构是很重要的，其中，移植后的细胞存活按照“53～106μm”>“25～53μm”>“106～180μm”的顺序变得良好。

另外，将移植了使用该53～106μm大小的本发明的块的实施例12的嵌合细胞块时的移植2周后的HE标本示于图4。另外，对图4中的血管数进行测量的结果为63条/mm²。如图4所示，还可知在嵌合细胞块内部诱生了血管。

此外，将移植了实施例13中使用具有代表性的“7.5％中”的含有血管系细胞的嵌合细胞块时的移植2周后的HE标本示于图5。对图5中的血管数进行测量的结果为180条/mm²。与移植了实施例12的情况相比，如图5所示可知，在移植了实施例13的含有血管系细胞的嵌合细胞块的情况下，在嵌合细胞块内部形成了更多的血管。

[实施例19]hMSC+hECFC嵌合细胞块中的ECFC的比例和浓度的计算

对于实施例11中使用具有代表性的“7.5％中”的嵌合细胞块，将切片使用利用DAB显色的试剂盒(DACO LSAB2试剂盒UNIVERSAL K0673DACO LSAB2试剂盒/HRP(DAB)兔/小鼠一次抗体两用)对hECFC染色用的CD31抗体(EPT抗CD31/PECAM-1)进行免疫染色。使用图像处理软件ImageJ、利用CD31抗体的染色方法，求出中心部的hECFC(血管系细胞)的面积的比例。需要说明的是，在此所述的“中心部”如上定义。

结果，实施例11的代表性的“7.5％中”嵌合细胞块的中心部的hECFC(血管系细胞)的面积的比例为99％。

进而，对实施例11的代表性的“7.5％中”嵌合细胞块，将上述利用CD31抗体的染色与HE染色(苏木精·伊红染色)重叠，由此算出中心部存在的hECFC的细胞密度。中心部的血管系细胞密度可以通过实际计数薄切标本的细胞数、并用细胞数除以体积来求出。首先，使用Photoshop将上述两张图像重叠，计数与利用CD31抗体的染色重叠的HE染色的细胞核的数量，算出细胞数。另一方面，体积通过使用ImageJ求出中心部的面积、并乘以该薄切标本的厚度即2μm来求出。

结果，实施例11的代表性的“7.5％中”嵌合细胞块的中心部的hECFC(血管系细胞)的细胞数为2.58×10^-4个细胞/μm³。

[实施例20]重组肽多孔体(高分子多孔体)的制作

使CBE3的最终浓度为7.5质量％，制备重组肽水溶液，将该重组肽水溶液倒入圆筒形容器中。在冷冻库内使用冷却搁板从底面对重组肽水溶液进行冷却。此时，通过改变冷却搁板的温度、夹在搁板与圆筒形容器之间的隔热板(玻璃板)的厚度、所装入的重组肽水溶液量来改变液温的冷却过程。搁板温度为-40℃、-60℃和-80℃，玻璃板为0.7mm、1.1mm和2.2mm，重组肽水溶液量为4mL、12mL和16mL，实施它们的组合。

另外，各水溶液从底面进行冷却，因此圆中心部的水表面温度最难以冷却。因此，该部分达到溶液内温度最高的液温，从而测定该部分的液温(以下，将该部分的液温称为内部最高液温)。

结果，在搁板温度为-40℃、玻璃板为2.2mm的情况下，为如下状态：直至内部最高液温达到-9.2℃之前，温度未开始上升，内部最高液温在未冻结状态下取“溶剂熔点-3℃”以下的液温(图8)。经过该状态后，在-9.2℃温度开始上升，可知产生了凝固热(图8)。另外还可以确认，在该时机实际已经开始形成冰。然后，温度在0℃附近经过一定时间。在此，成为存在水与冰的混合物的状态。最后，温度从0℃再次开始下降，此时，液体部分消失而成为冰(图8)。测定的温度为冰内部的固体温度。即，并不是液温。由此可见，如果观察产生凝固热的瞬间的内部最高液温，则可知在内部最高液温在未冻结状态下经过“溶剂熔点-3℃”后是否发生了冻结。

对产生该凝固热的瞬间的未冻结状态下的内部最高液温的6种组合进行测定，如下所示。

A搁板温度-40℃、玻璃板2.2mm、液量4mL时为-9.2℃

B搁板温度-40℃、玻璃板1.1mm、液量4mL时为-8.3℃

C搁板温度-40℃、玻璃板0.7mm、液量4mL时为-2.2℃

D搁板温度-60℃、玻璃板2.2mm、液量4mL时为-7.2℃

需要说明的是，在此所述的D为实施例2中所述的(2)。

E搁板温度-80℃、玻璃板2.2mm、液量4mL时为-3.9℃

F搁板温度-80℃、玻璃板1.1mm、液量4mL时为-3.1℃

G搁板温度-80℃、玻璃板0.7mm、液量4mL时为5.8℃

H搁板温度-40℃、玻璃板2.2mm、液量12mL时为-6.5℃

I搁板温度-40℃、玻璃板2.2mm、液量16mL时为-2.4℃

由此可知，A、B、D、E、F、H是利用在未冻结状态下内部最高液温取“溶剂熔点-3℃”以下的液温的冻结步骤的制造法(内部最高液温≤“溶剂熔点-3℃”的冻结重组肽块)。

另外，C、G、I是利用在未冻结状态下内部最高液温未取“溶剂熔点-3℃”以下的液温的冻结步骤的制造法(内部最高液温>“溶剂熔点-3℃”的冻结重组肽块)。

将这样得到的冻结重组肽块进行冷冻干燥，得到CBE3多孔体。将得自A、B、D、E、F、H的称为“内部最高液温≤‘溶剂熔点-3℃’的CBE3多孔体”，将得自C、G、I的称为“内部最高液温≤‘溶剂熔点-3℃’的CBE3多孔体”。

[实施例21]

对实施例20中得到的CBE3多孔体，实施多孔的孔隙尺寸和孔隙形状的评价。对所得到的多孔体实施160℃、20小时的热交联，使其不溶化后，以充分的时间在生理盐水中溶胀。然后，使用切片机制作冻结组织切片，制作HE(苏木精-伊红))染色标本。

将所得到的标本的中心部分的图像示于图7(内部最高液温>“溶剂熔点-3℃”和内部最高液温≤“溶剂熔点-3℃”)。结果，内部最高液温>“溶剂熔点-3℃”(C、G、I)时，孔隙的80％以上为柱孔/平板孔，球孔为20％以下。另一方面，内部最高液温≤“溶剂熔点-3℃”(A、B、D、E、F、H)时，孔隙的50％以上为球孔。另外，该内部最高液温≤“溶剂熔点-7℃”(A、B、D)时，孔隙的80％以上为球孔，几乎全部由球孔构成。由此可知，为了使多孔体的孔隙形状为球孔，在未冻结状态下内部最高液温取“溶剂熔点-3℃”以下很重要，通过进一步为“溶剂熔点-7℃”以下，能够使孔隙的形状几乎全部为球孔。

A～I的孔隙形状及平均孔尺寸如下所示。

A：球孔100％、62.74μm

B：球孔100％、65.36μm

C：柱孔/平板孔90％、79.19μm

D：球孔100％、63.17μm

E：球孔70％、69.44μm

F：球孔50％、53.98μm

G：柱孔/平板孔90％、79.48μm

H：球孔80％、76.58μm

I：柱孔/平板孔90％、79.65μm

[实施例22]重组肽块的制作(多孔体的粉碎和交联)

将实施例21中得到的CBE3多孔体使用New Power Mill(大阪化学、New PowerMillPM-2005)进行粉碎。粉碎通过最大转速下1分钟×5次、总计5分钟的粉碎来进行。对所得到的粉碎物，使用不锈钢制的筛进行尺寸分级，得到25～53μm和53～106μm的重组肽块。然后，在减压下在160℃实施72小时的热交联，得到试样。这些试样满足振实密度为10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述高分子块的二维截面像的截面积的平方根÷周长的值为0.01以上且0.13以下。对于使用这些试样与实施例10和实施例12同样制作的嵌合细胞块而言，不区分A～I，在与实施例14同样的体外分析、以及通过与实施例16～18相同的评价得到的动物体内的移植结果中，均显示出高于比较用块的性能(细胞的高存活率)。但是，如果来看这些试样在A～I的条件下的性能差，则产生了轻微的差异，A、B、D的性能最高，其次为E、F、H，然后为C、G、I。即，这表明多孔体的孔隙形状可以产生性能差。实施例18中，作为代表性的结果，对D(实施例2中所述的(2))进行了详细记述。

Claims

1.一种制造生物亲和性高分子的多孔体的方法，其包括：

(a)将生物亲和性高分子的溶液倒入容器中，在冷冻库内使用冷却搁板从底面对生物亲和性高分子的溶液进行冷却，通过改变冷却搁板的温度、夹在搁板与容器之间的隔热板的厚度、所装入的生物亲和性高分子的溶液的量来改变液温的冷却过程，以使溶液内液温最高的部分的液温即内部最高液温在未冻结状态为“溶剂熔点-3℃”以下的方式，进行冻结的步骤；和

(b)将所述步骤(a)中得到的冻结后的生物亲和性高分子进行冷冻干燥的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其中，

所述步骤(a)中，通过下述冻结处理进行冻结，该冻结处理中，溶液内液温最高的部分的液温即内部最高液温在未冻结状态下为“溶剂熔点-7℃”以下。