JP2017121504A - 細胞移植用細胞構造体、生体親和性高分子ブロック及びそれらの製造方法 - Google Patents
細胞移植用細胞構造体、生体親和性高分子ブロック及びそれらの製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が10mg/cm3以上500mg/cm3以下であるか、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が0.01以上0.13以下である、細胞移植用細胞構造体。
【選択図】なし
Description
好ましくは、生体親和性高分子ブロック一つの大きさが50μm以上120μm以下である。
好ましくは、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている。
好ましくは、生体親和性高分子ブロックの架橋度が6以上であり、かつ前記生体親和性高分子ブロックの吸水率が300%以上である。
好ましくは、生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックである。
(a)生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温(内部最高液温)が未凍結状態で「溶媒融点−3℃」以下となる凍結処理により凍結する工程;及び
(b)前記工程(a)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程:
を含む方法により製造されたものである。
好ましくは、工程(a)において、溶液内で最も液温の高い部分の液温(内部最高液温)が未凍結状態で「溶媒融点−7℃」以下となる凍結処理により凍結する。
(a)81%以上99.99%以下の空孔率を有する。
(b)サイズが20〜200μmである空孔が占める空間占有率が85%以上である。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む。
好ましくは、生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである。
式:A−[(Gly−X−Y)n]m−B
(式中、Aは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Bは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、n個のXはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、n個のYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、nは3〜100の整数を示し、mは2〜10の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。)で示される。
好ましくは、リコンビナントゼラチンが、(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列、又は(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する。
好ましくは、細胞は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞のみである。
好ましくは、細胞は、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、60%〜100%である領域を有する。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体は、細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が、1.0×10-4cells/μm3以上である領域を有する。
好ましくは、細胞移植用細胞構造体の内部において血管形成されている。
本発明によればさらに、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することを含む、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造する方法が提供される。
(a)生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温(内部最高液温)が未凍結状態で「溶媒融点−3℃」以下となる凍結処理により凍結する工程;及び
(b)前記工程(a)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程:
を含む、生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法が提供される。
本発明の細胞移植用細胞構造体は、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が10mg/cm3以上500mg/cm3以下であるか、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が0.01以上0.13以下である、細胞移植用細胞構造体である。
(1−1)生体性親和性高分子
本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性材料で構成されることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、および、MPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)の群から選択される少なくとも1つの材料である。生分解性材料としては、具体的にはポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、および、キトサンの群から選択される少なくとも1つの材料である。上記の中でも、ポリペプチドが特に好ましい。尚、これら高分子材料には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよく、具体的な方法としては1.「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で現わされる、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、及びHAV配列)ペプチドによるコーティング」、2.「基材表面のアミノ化、カチオン化」、3.「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法が利用され得る。
本発明で用いる高分子のGRAVY値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明の細胞3次元構造体(モザイク細胞塊;モザイク状になっている細胞塊)における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られているが、本発明ではグルタルアルデヒドを使用しない架橋方法を使用する。本発明では好ましくは、アルデヒド類又は縮合剤を使用しない架橋方法を使用する。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
本発明にかかるリコンビナントゼラチンとは遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列(X及びYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい(複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい)。好ましくは、細胞接着シグナルを一分子中に2配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができ、例えばEP1014176、US6992172、WO2004/85473、WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン用材料である。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列;又は
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上)の相同性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列;
を有するリコンビナントゼラチンである。
本発明では、上記した生体親和性高分子を含有するブロック(塊)を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではないが、タップ密度が10mg/cm3以上500mg/cm3以下であること、又は前記生体親和性高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が0.01以上0.13以下であることの何れか1以上の条件を充足するものである。
(式1)は、高分子ブロック1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wは高分子ブロック質量(mg)を示す。)
(式2)は、1分子あたりの架橋数を示す。
吸水率=(w2−w1−w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、上記(1−4)に記載した条件を満たす生体親和性高分子ブロックが得られる限りは特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕機(ニューパワーミルなど)を用いて粉砕することにより、上記(1−4)に記載した条件を満たす生体親和性高分子ブロックを得ることができる。
(a)生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温(内部最高液温)が未凍結状態で「溶媒融点−3℃」以下となる凍結処理により凍結する工程;及び
(b)前記工程(a)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程:
を含む方法により、生体親和性高分子の多孔質体を製造することができる。上記工程によれば、空孔の内、球孔の占める割合が50%以上とすることができるからである。
多孔質体の空孔サイズ30μm〜150μmが占める空間占有率は、好ましくは60%以上100%以下であり、より好ましくは70%以上100%以下、さらに好ましくは80%以上100%以下、特に好ましくは90%以上100%以下である。
本明細書中後記の通り、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造することができる。即ち、本発明の生体親和性高分子ブロックは、本発明の細胞移植用細胞構造体を製造するための試薬として有用である。
本発明で用いる細胞は、本発明の細胞構造体の目的である、細胞移植を行えるものであれば任意の細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する細胞は1種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞(特に、ヒト由来細胞)の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、ES細胞、GS細胞、又はiPS細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞(MSC)、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ES細胞、iPS細胞、MSC、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の該高分子ブロックをモザイク状に3次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能であり、かつ、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に3次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞3次元構造体を形成され、外部から細胞3次元構造体の内部への栄養送達を可能となる。これにより、本発明の細胞移植用細胞構造体を用いて、細胞移植を行うと、移植された細胞の壊死を抑制し、移植が可能となる。なお、ここでいう「壊死の抑制」とは、本発明の細胞構造体とせず、細胞のみを移植した場合と比較して、壊死の程度が低いことを意味する。
(a)細胞集合体の中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有すること、および
(b)中心部の血管系の細胞密度が、1.0×10-4cells/μm3以上である領域を有すること、
のうち少なくとも一方の要件を満たすものである。
本発明の細胞移植用細胞集合体は、前記(a)および(b)の両方の要件を満たすことが好ましく、前記中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、60%〜100%である領域を有することも好ましい。
本発明の細胞移植用細胞構造体は、本発明の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック(生体親和性高分子からなる塊)と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
(a)別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる、又は
(b)分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
(a)は非血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「血管系の細胞および高生体親和性分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多く、周辺部では、非血管系の細胞と比較して、血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より多い細胞移植用細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より少ない細胞移植用細胞構造体、を製造することが可能となる。
(b)は血管系の細胞を用いて前述の方法で細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法である。ここで、「非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程」とは、前述した、調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法、および、分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる方法、いずれも含むものである。この方法により、(i)細胞構造体の中心部では、非血管系の細胞と比較して、管系の細胞の面積が多く、周辺部では、血管系の細胞と比較して、非血管系の細胞の面積が多い細胞構造体、(ii)細胞構造体の、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い細胞移植用細胞構造体、(iii) 細胞構造体の、中心部の非血管系の細胞の面積が、周辺部の非血管系の細胞の面積より少ない細胞移植用細胞構造体、を製造することが可能となる。
(c)は、非血管系の細胞および血管系の細胞を実質的に同時に使用し、前述の方法で細胞構造体を形成させる製造方法である。この方法では、細胞構造体のいずれの部位も、非血管系の細胞および血管系の細胞のいずれかが、大きく偏在することのない細胞構造体を製造することが可能となる。
同様の理由で、血管系の細胞により細胞構造体を形成した後、非血管系の細胞および生体親和性高分子ブロックを加える工程を有する製造方法が好ましい。そして、血管系の細胞数を多くすることがさらに好ましい。
本発明の細胞移植用細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることが出来る。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の細胞構造体は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下記載のCBEを用意した(WO2008-103041に記載)。
CBE3
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34、GRAVY値:-0.682、1/IOB値:0.323
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
「ア」 棚板温度-40℃、硝子板の厚さ2.2mm、CBE3水溶液の最終濃度12%、水溶液量4mL。
「イ」 棚板温度-60℃、硝子板の厚さ2.2mm、CBE3水溶液の最終濃度7.5%、水溶液量4mL。
「ウ」 棚板温度-40℃、硝子板の厚さ2.2mm、CBE3水溶液の最終濃度4.0%、水溶液量4mL。
50℃で、2000mgのCBE3を18mLの超純水に溶解し、終濃度10%のCBE3溶液を20mL作製する。そのCBE3溶液を薄く伸ばして4mm厚程度の薄い板状のゲルを作製した。容器については、白い板に、シリコン枠(5cm×10cm程度)をつけて、空気の隙間がないようにしっかりとシリコン枠を押し付けてから、その枠内へ上記のCBE3溶液(50℃)を流し込んだ。液を流し込んだら、4℃へ移して約1時間ゲル化させ、固まっていることを確認した後、−80℃へ移して、ゲルを3時間凍結させた。凍結後、凍結乾燥機(EYELA、FDU−1000)で凍結乾燥を行った。尚、この時に得られた凍結乾燥体は多孔質体ではあり、平均ポアサイズが57.35μmとなっていた。以後、これを単純凍結多孔質体と呼称する。
実施例2で得られたCBE3多孔質体および比較例1で得られた単純凍結多孔質体について、多孔質の空孔サイズと空間占有率の評価を実施した。得られた多孔質体を160℃で20時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤した。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、HE(ヘマトキシリン・エオシン)染色標本を作製した。 標本から実スケール1.5mm大の断面像を用意し、個々の空孔面積を計測し、その後、当該面積を円換算した場合の円直径を算出し、空孔サイズとした。この空孔の20ヶ以上の平均値を平均空孔サイズとした。その結果、「ア」は66.39μm、「イ」は63.17μm、「ウ」は56.36μmであった。
実施例2で得られたCBE3多孔質体について、空孔率を測定した。測定に当たっては、嵩密度(ρ)と真密度(ρc)を測定し、空孔率(P = 1−ρ/ρc(%))を求めた。CBE3多孔質体の嵩密度(ρ)は、乾燥質量と体積から算出した。真密度(ρc)は、ハバード型形の比重瓶法により求めた。サンプル数(N)=4の結果として、「ウ」の多孔質体では嵩密度が0.05g/cm3、真密度が1.23g/cm3、空孔率96%(CV値は8%)であることが明らかになった。また、「ア」、「イ」ではそれぞれ空孔率が87%(CV値は10%)、92%(CV値は7%)であることが分かった。
実施例2で得られた「ア」、「イ」、「ウ」のCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm、53〜106μm、106μm〜180μmのCBE3ブロックを得た。 その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は24時間、48時間、56時間、60時間、72時間、84時間、96時間、120時間、288時間の9種類を実施した)を施して、試料を得た。以下、「ア」の53〜106μmを「12%中」、「イ」の25〜53μmを「7.5%小」、「イ」の53〜106μmを「7.5%中」、「イ」の106〜180μmを「7.5%大」、「ウ」の53〜106μmを「4%中」と呼ぶ。
特許文献1に記載されているグルタルアルデヒドを使用する比較例として、基材としてリコンビナントペプチドCBE3を用いて、不定形のGA架橋μブロックを作製した。1000mgのCBE3を9448μLの超純水に溶解し、1N HClを152μL添加後、終濃度1.0%となるように、25%グルタルアルデヒドを400μL添加し、50℃で3時間反応させ、架橋ゲルを作製した。この架橋ゲルを、1Lの0.2Mグリシン溶液へ浸漬し、40℃2時間振とうさせた。その後、架橋ゲルを、5Lの超純水中で1時間振とう洗浄、超純水を新しい物へ置換し、再び洗浄1時間、を繰り返し、計6回洗浄した。洗浄後の架橋ゲルを、−80℃で5時間凍結させた後、凍結乾燥機(EYELA、FDU−1000)で凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥体を、ニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μmのCBE3・GA架橋μブロックを得た。
比較例として、従来技術(特許文献1)から類推されるグルタルアルデヒドを含まない工程で作製した場合にできる比較用リコンビナントペプチドブロックを、以下に記載の通り作製した。基材としてリコンビナントペプチドCBE3を用いてブロックを作製した。比較例1で得られた単純凍結多孔質体を、ニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μmのCBE3ブロックを得た。それを160℃のオーブンに入れ、72時間熱架橋した。
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。 タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ(直径6mm、長さ21.8mmの円筒状:容量0.616cm3)が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を200回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
一方、実施例5のブロックは「12%中」が372mg/cm3、「7.5%小」が213mg/cm3、「7.5%中」が189mg/cm3、「7.5%大」が163mg/cm3、「4%中」が98mg/cm3であった。実施例5のブロックでは、構造の複雑性に由来して、比較例3のブロックに対して、タップ密度は小さくなることが分かった。
ブロックの複雑性を示す指標として、ブロックの「面積の平方根」と「周囲長」の関係を求めた。すなわち、ブロックの「面積の平方根÷周囲長」の値が小さい方がより複雑であると言える。この値は、画像解析ソフトを用いて算出した。まず、ブロックの形が分かる画像を用意した。具体的に、本実施例では、水で良く膨潤させたブロック群を、ミクロトームで凍結切片にし、HE(ヘマトキシリン・エオシン))染色した標本を用いた。ブロック以外に細胞などが存在する場合は、photoshopで、自動選択ツールで製剤のみを抽出し、画像上にブロックのみとなるようにする。その画像を、Imagejを用いて、ブロックの面積と周囲長を求め、「面積の平方根÷周囲長」の値を算出した。ただし、10μm以下のブロックは除いた。
一方、実施例5のブロックは、「12%中」が0.112、「7.5%小」が0.083、「7.5%中」が0.082、「7.5%大」が0.071、「4%中」が0.061であった。実施例5のブロックでは、構造の複雑性に由来して、比較例3のブロックに対して、「面積の平方根÷周囲長」の値は小さくなり、また、タップ密度と相関があることも分かった。
実施例5および比較例3で架橋したブロックの架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。測定はTNBS(2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸)法を用いた。
<サンプル調製>
ガラスバイアルにサンプルを約10mg、4%NaHCO3水溶液を1mL、1%のTNBS水溶液を2mL添加し、37℃で3時間振とうさせた。その後、10mLの37%塩酸及び5mLの純水を加えた後、37℃で16時間以上静置し、サンプルとした。
ガラスバイアルにサンプルを約10mg、4%NaHCO3水溶液を1mL、1%TNBS水溶液を2mL添加し、直後に37%塩酸3mLを加え、37℃で3時間振とうさせた。その後、7mLの37%塩酸及び5mLの純水を加えた後、37℃で16時間以上静置し、ブランクとした。
(式1)は、リコンビナントペプチド1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wはリコンビナントペプチド質量(mg)を示す。)
(式2)は、1分子あたりの架橋数を示す。
実施例5および比較例3で作製したブロックの吸水率を算出した。
25℃において、3cm×3cmのナイロンメッシュ製の袋の中に、ブロックを約15mgを充填し、2時間イオン交換水中で膨潤させた後、10分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、(式3)に従って、吸水率を求めた。
吸水率=(w2−w1−w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、実施例5で作製したCBE3ブロックを0.1mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mm程度の球状の、CBE3ブロックとhMSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。また、これは「12%中」、「7.5%小」、「7.5%中」、「7.5%大」、「4%中」のいずれも上記と同様に作成できた。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、比較例3で作製したCBE3ブロックを0.1mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mm程度の球状の、CBE3ブロックとhMSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。
比較用のグルタルアルデヒドを含むモザイク細胞塊を以下の通り作成した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、比較例2で作製したGA架橋μブロックを0.1mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレート(住友ベークライト、底がU字型)に播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mm程度の球状の、GA架橋μブロックとhMSC細胞からなるモザイク細胞塊を作製した(細胞1個当たり0.001μgのブロック)。なお、U字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は、球状であった。
ヒト血管内皮前駆細胞(hECFC)を増殖培地(Lonza:EGM−2+ECFC serum supplement)にて10万cells/mLに調整し、実施例5で作製したCBE3ブロックを0.05mg/mLとなるように加えた後、200μLをスミロンセルタイトX96Uプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、扁平状の、ECFCとCBE3ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。その後、培地を除去し、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)にて10万cells/mLに調整し、実施例5で作製したCBE3ブロックを0.1mg/mLとなるように加えた後、hECFCモザイク細胞塊がある200μLをスミロンセルタイトX96Uプレートに播種し、卓上プレート遠心機で遠心(600g、5分)し、24時間静置し、直径1mm程度の球状の、hMSCとhECFCとCBE3ブロックからなるモザイク細胞塊を作製した。また、これは「12%中」、「7.5%小」、「7.5%中」、「7.5%大」、「4%中」のいずれも上記と同様に作成できた。
実施例10で作製した2日目のモザイク細胞塊(本発明のCBE3ブロックを使用)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これは「12%中」、「7.5%小」、「7.5%中」、「7.5%大」、「4%中」のいずれも上記と同様に作成できた。
実施例11で作製した2日目のモザイク細胞塊(本発明のCBE3ブロックを使用)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。また、これは「12%中」、「7.5%小」、「7.5%中」、「7.5%大」、「4%中」のいずれも上記と同様に作成できた。
比較例4で作製した2日目のモザイク細胞塊(比較用のCBE3ブロック由来)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。
比較例5で作製した2日目のモザイク細胞塊(GA架橋μブロック由来)5個をスミロンセルタイトX96Uプレート中で並べ、24時間培養を行った。その結果、モザイク細胞塊同士の間を、外周部に配された細胞が結合させることで、モザイク細胞塊が自然に融合することが明らかになった。
各モザイク細胞塊中の細胞が産生・保持しているATP(アデノシン三リン酸)量を定量した。ATPは生物全般のエネルギー源として知られ、ATP合成量・保持量を定量することで、細胞の代謝活性の状態、活動状態を知ることができる。測定には、CellTiter−Glo(Promega社)を用いた。実施例10および比較例4、比較例5で作製したモザイク細胞塊について、ともにDay7のもので、CellTiter−Gloを用いて、各モザイク細胞塊中のATP量を定量した。その結果、GA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊に比べ、比較用のCBE3ブロックを用いたモザイク細胞塊では、ATP量が少ない結果となった。一方、本発明のCBE3ブロックを用いたモザイク細胞塊は、GA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊よりもATP量が多いことが分かった。これは本発明のCBE3ブロックが、「12%中」、「7.5%小」、「7.5%中」、「7.5%大」、「4%中」いずれの場合においても、同様に、GA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊よりも多くのATPを産生している結果となった(図1)。つまり、複雑な構造を持つ本発明のCBE3ブロックを用いたモザイク細胞塊の方が、内部の細胞の生存状態が良好であることが明らかになった。
実施例12のように1mmのモザイク細胞塊を融合して、巨大なモザイク細胞塊を作製することは可能であるが、一度に巨大なモザイク細胞塊を作製できる方が、操作を簡便化できる。ここで、細胞の接着しない加工を施したスミロンセルタイトの9cmシャーレに、を増殖培地(タカラバイオ:MSCGM BulletKitTM)で1.5%アガロース(Agarose S)溶液を50mL入れた。その際、1cm四方の棒状にしたシリコンを5mm程度アガロース溶液中に浸るように固定し、アガロースが固まった後、シリコンを取り除き、アガロース中に1cm四方の窪みができた容器を作成した。そこに増殖培地を適量入れ、ゲルが乾かないように保存した。培地を取り除き、実施例5で作製したブロックの内、代表的な「7.5%中」16mgと、250万cellsのヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)の懸濁物を窪みに入れ、その後静かに25mLの増殖培地を添加した。1日培養後、1cm四方、厚さ2−3mmの巨大モザイク細胞塊を作製できた。これを、25mLの増殖培地を入れたスミロンセルタイトの9cmシャーレに移し、さらに2日培養後、25mLの増殖培地を入れたスピナーフラスコに移して攪拌培養し、培養7日後のモザイク細胞塊の断面のHE染色標本を作製した。その結果、培養7日後でも内部の細胞が生存していることを確認した。このように、細胞とブロックを混合し、型に流して培養することで、巨大なモザイク細胞塊を作製可能であることが明らかになった。また、この方法は、GA架橋μブロック、比較用ブロック及び本発明のブロックの何れでも可能であり、ブロックの種類に依存しない。
マウスはNOD/SCID(チャールズリバー)のオス、4〜6週齢のものを用いた。麻酔下でマウス腹部の体毛を除去し、上腹部の皮下に切れ込みを入れ、切れ込みからはさみを差し込み、皮膚を筋肉からはがした後、実施例12、実施例13、比較例6、及び比較例7で作成したモザイク細胞塊をピンセットですくい、切れ込みから1.5cmほど下腹部寄りの皮下に移植し、皮膚の切れ込み部を縫合した。
解剖は移植から1週後及び2週後に行った。腹部の皮膚をはがし、モザイク細胞塊が付着した皮膚を、約1平方cmの正方形の大きさに切り取った。モザイク細胞塊が腹部の筋肉にも付着している場合は、筋肉と共に採取した。
モザイク細胞塊が付着した皮膚片および、移植前のモザイク細胞塊について組織切片を作製した。皮膚を4%パラホルムアルデヒドに浸漬し、ホルマリン固定を行った。その後、パラフィンで包埋し、モザイク細胞塊を含む皮膚の組織切片を作製した。切片はHE染色(ヘマトキシリン・エオシン染色)を行った。
比較例7のGA架橋μブロックを用いたモザイク細胞塊(図2のA:生細胞数100個:生存率80%)に比べ、比較例6のブロックを用いたモザイク細胞塊(図2のB:生細胞数37個:生存率45%)では、生細胞が少ないことが分かる。一方、実施例12の本発明のブロック(「7.5%中」)を用いたモザイク細胞塊(図2のC:生細胞数116個:生存率84%)は、比較例6のブロックを用いたモザイク細胞塊(図2のB:生細胞数37個:生存率45%)に比べて、生細胞が多く、生存が良好であることが分かった。この結果は、実施例14でのin vitroアッセイの結果とも一致し、本発明のブロックを採用することによって、移植した細胞の生存を良くすることが可能であることが分かった。
106〜180μmサイズの「7.5%大」の生存率は57%であり、「7.5%小」の生存率は62%であり、「7.5%中」の生存率は84%であり、「4%中」の生存率は82%であった。即ち、本発明のブロック群内間では、106〜180μmサイズの「7.5%大」よりも、「7.5%小」、「7.5%中」、「4%中」が更に細胞の生存が良くなることが分かった(図3)。また、最上の移植結果をもたらすものとしては、「7.5%中」と「4%中」が、「7.5%小」よりも、移植細胞の生存が良いことも分かった(図3)。即ち、高分子ブロックのタップ密度又は高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が所定の範囲内となるような構造を有することが重要であり、中でも、「53〜106μm」>「25〜53μm」>「106〜180μm」という順で移植後の細胞生存が良くなることも分かった。
実施例11の内、代表的な「7.5%中」を用いたモザイク細胞塊は、切片をhECFC染色用にCD31抗体(EPT Anti CD31/PECAM-1)にDAB発色を用いたキット(ダコLSAB2キット ユニバーサル K0673 ダコLSAB2キット/HRP(DAB) ウサギ・マウス一次抗体両用)による免疫染色を行った。画像処理ソフトImageJ、CD31抗体による染色方法を使用し、中心部のhECFC(血管系の細胞)の面積の割合を求めた。なお、ここでいう「中心部」とは前記定義したものである。
その結果、実施例11の代表的な「7.5%中」モザイク細胞塊の中心部のhECFC(血管系の細胞)の面積の割合は99%であった。
その結果、実施例11の代表的な「7.5%中」モザイク細胞塊の中心部のhECFC(血管系の細胞)の細胞数は2.58×10-4cells/μm3であった。
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。
A 棚板温度-40℃で硝子板2.2mm、液量4mLは、−9.2℃
B 棚板温度-40℃で硝子板1.1mm、液量4mLは、−8.3℃
C 棚板温度-40℃で硝子板0.7mm、液量4mLは、−2.2℃
D 棚板温度-60℃で硝子板2.2mm、液量4mLは、−7.2℃
尚、ここでいうDが実施例2でいうところの「イ」である。
E 棚板温度-80℃で硝子板2.2mm、液量4mLは、−3.9℃
F 棚板温度-80℃で硝子板1.1mm、液量4mLは、−3.1℃
G 棚板温度-80℃で硝子板0.7mm、液量4mLは、 5.8℃
H 棚板温度-40℃で硝子板2.2mm、液量12mLは、−6.5℃
I 棚板温度-40℃で硝子板2.2mm、液量16mLは、−2.4℃
また、C,G,Iが未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−3℃」以下の液温をとらない凍結工程による製造法である。(内部最高液温>「溶媒融点−3℃」の凍結リコンビナントペプチドブロック)
実施例20で得られたCBE3多孔質体について、多孔質の空孔サイズと空孔形状の評価を実施した。得られた多孔質体を160℃、20時間の熱架橋を施し、不溶化したのち、十分時間、生理食塩水で膨潤。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、HE(ヘマトキシリン・エオシン))染色標本を作製した。
得られた標本の中心部分の画像を図7(内部最高液温>「溶媒融点−3℃」、と、内部最高液温≦「溶媒融点−3℃」)に示した。その結果、内部最高液温>「溶媒融点−3℃」(C,G,I)では、空孔は80%以上が柱/平板孔となり、球孔は20%以下であった。一方、内部最高液温≦「溶媒融点−3℃」(A,B,D,E,F,H)では、空孔は50%以上が球孔となっていた。また、この内部最高液温≦「溶媒融点−7℃」(A,B,D)では、空孔は80%以上が球孔となっており、ほぼ全てが球孔で構成されていた。これにより、多孔質体の空孔形状を球孔にするには、未凍結状態で内部最高液温が「溶媒融点−3℃」以下となることが重要で、更に「溶媒融点−7℃」以下とすることで、空孔の形状をほぼ全て球孔にすることができることが分かった。
A:球孔100%、62.74μm
B:球孔100%、65.36μm
C:柱/平板孔90%、79.19μm
D:球孔100%、63.17μm
E:球孔70%、69.44μm
F:球孔50%、53.98μm
G:柱/平板孔90%、79.48μm
H:球孔80%、76.58μm
I:柱/平板孔90%、79.65μm
実施例21で得られたCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm及び53〜106μmのリコンビナントペプチドブロックを得た。その後、減圧下160℃で72時間、熱架橋を施して、試料を得た。これらの試料は、タップ密度が10mg/cm3以上500mg/cm3以下であること、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が0.01以上0.13以下であることを充足するものであった。これらの試料を使用して実施例10及び実施例12と同じようにして作製したモザイク細胞塊ではA〜Iによらず、実施例14と同じin vitroアッセイ、並びに実施例16〜18と同じ評価による動物への移植結果において、いずれも、比較用ブロックよりも高い性能(細胞の高い生存率)を示した。ただ、これらのA〜Iの中で性能差を見ると僅かな差が生じており、A、B、Dが最も性能が高く、ついでE、F、H、その後にC、G、Iがくるという順番になっていた。つまり、これは多孔質体の空孔形状によって、性能差を生じうることを示している。実施例18では、代表的な結果としてD(実施例2でいうところの「イ」)について詳細に記述している。
Claims (21)
- グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が10mg/cm3以上500mg/cm3以下であるか、又は前記高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が0.01以上0.13以下であり、前記生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンであり、前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが20μm以上200μm以下であり、前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、細胞移植用細胞構造体。
- 前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが50μm以上120μm以下である、請求項1に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 前記生体親和性高分子ブロックの架橋度が6以上であり、かつ前記生体親和性高分子ブロックの吸水率が300%以上である、請求項1又は2に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 厚さ又は直径が400μm以上3cm以下である、請求項1から3の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項1から4の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 血管新生因子を含む、請求項1から5の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 前記細胞が、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞および成熟細胞からなる群から選択される細胞である、請求項1から6の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 前記細胞が、非血管系の細胞のみである、請求項1から7の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 前記細胞が、非血管系の細胞および血管系の細胞の両方を含む、請求項1から7の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 細胞構造体において、中心部の血管系の細胞の面積が、周辺部の血管系の細胞の面積より多い領域を有する、請求項9に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 前記中心部の血管系の細胞の割合が、血管系の細胞の全面積に対し、60%〜100%である領域を有する請求項10に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 細胞構造体の、中心部の血管系の細胞密度が、1.0×10-4cells/μm3以上である領域を有する、請求項9から11の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- 細胞移植用細胞構造体の内部において血管形成されている、請求項9から12の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体。
- グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックであって、タップ密度が10mg/cm3以上500mg/cm3以下であるか、又は二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が0.01以上0.13以下であり、前記生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンであり、前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが20μm以上200μm以下であり、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、生体親和性高分子ブロック。
- 前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが50μm以上120μm以下である、請求項14に記載の生体親和性高分子ブロック。
- 架橋度が6以上であり、かつ吸水率が300%以上である、請求項14又は15に記載の生体親和性高分子ブロック。
- 請求項1から13の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体を製造するために使用する、請求項14から16の何れか1項に記載の生体親和性高分子ブロック。
- 請求項14から17の何れか1項に記載の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項1から13の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体を製造するための試薬。
- 請求項14から17の何れか1項に記載の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することを含む、請求項1から13の何れか1項に記載の細胞移植用細胞構造体を製造する方法。
- (a)生体親和性高分子の溶液を、溶液内で最も液温の高い部分の液温(内部最高液温)が未凍結状態で「溶媒融点−3℃」以下となる凍結処理により凍結する工程;及び
(b)前記工程(a)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程:
を含む、生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法。 - 前記工程(a)において、溶液内で最も液温の高い部分の液温(内部最高液温)が未凍結状態で「溶媒融点−7℃」以下となる凍結処理により凍結する、請求項20に記載の方法。
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