JP6854904B2 - 血管新生剤およびその製造方法 - Google Patents
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Description
(1)(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む血管新生剤。
(2)上記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、(1)に記載の血管新生剤。
(3)上記免疫隔離膜が、ポリマーを含む多孔質膜である、(1)または(2)に記載の血管新生剤。
(5)上記多孔質膜の厚みが10μm〜250μmである、(3)または(4)に記載の血管新生剤。
(6)上記多孔質膜が、孔径が最小となる層状の緻密部位を内部に有し、上記緻密部位から上記多孔質膜の少なくとも一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している、(3)から(5)の何れか一に記載の血管新生剤。
(8)上記多孔質膜の最小孔径と最大孔径との比が3.0〜20.0である、(3)から(7)の何れか一に記載の血管新生剤。
(9)上記多孔質膜が少なくとも一種のポリスルホンおよびポリビニルピロリドンを含む、(3)から(8)の何れか一に記載の血管新生剤。
(11)上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが20μm以上200μm以下である、(10)に記載の血管新生剤。
(12)上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、(10)または(11)に記載の血管新生剤。
(14)上記細胞構造体が、細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む、(10)から(13)の何れか一に記載の血管新生剤。
(15) 間葉系幹細胞を免疫隔離膜で内包する工程を含む、(1)から(14)の何れか一に記載の血管新生剤の製造方法。
(16)(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスを、血管新生を必要とする対象者に移植する工程を含む、血管新生方法。
(17) 血管新生のための処置において使用するための細胞移植用デバイスであって、(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイス。
(18) 血管新生剤の製造のための、(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスの使用。
本発明の血管新生剤は、(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む。
本発明で使用する細胞は、間葉系幹細胞(MSC)である。間葉系幹細胞の由来は特に限定されないが、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪由来間葉系幹細胞がより好ましい。なお、間葉系幹細胞とは間葉系組織に存在する体性幹細胞をいい、間葉系組織に属する細胞への分化能を有する。間葉系組織とは、骨、軟骨、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、心臓等の組織をいう。
本発明において使用する細胞は、そのまま使用してもよいが、細胞構造体として使用してもよい。本明細書で言う細胞構造体とは、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも1個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊(モザイク状になっている細胞塊)と称する場合もある。
(1−1)生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびMPC(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド(例えば、以下に説明するゼラチン等)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー(PLGA)、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質(フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン)や細胞接着配列(アミノ酸一文字表記で表される、RGD配列、LDV配列、REDV配列、YIGSR配列、PDSGR配列、RYVVLPR配列、LGTIPG配列、RNIAEIIKDI配列、IKVAV配列、LRE配列、DGEA配列、およびHAV配列)ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類(例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど)による架橋、縮合剤(カルボジイミド、シアナミドなど)による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なGly−X−Yで示される配列(XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す)の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のGly−X−Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に2配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、米国特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
この最少アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質1分子中に好ましくは3〜50個であり、さらに好ましくは4〜30個であり、特に好ましくは5〜20個であり、最も好ましくは12個である。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるペプチド;
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;または
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列と80%以上(さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド;
の何れかである。
%配列同一性=[(同一残基数)/(アラインメント長)]×100
2つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、BLAST((Basic Local Alignment Search Tool))プログラム(J.Mol.Biol.215:403−410,1990)等を使用して決定することができる。
本発明においては、上記した生体親和性高分子からなるブロック(塊)を使用することができる。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状(顆粒)、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状(顆粒)の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
(式2)は、生体親和性高分子ブロック1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wは生体親和性高分子ブロック質量(mg)を示す。)
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
吸水率=(w2−w1−w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物(生体親和性高分子の多孔質体など)を、粉砕機(ニューパワーミルなど)を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物(多孔質体など)は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
(a)溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が2.5℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
(b)工程(a)で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
(c)工程(b)で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。
細胞構造体は、上記した複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種の複数個の細胞とを含み、複数個の上記細胞の隙間に、少なくとも1個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に3次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に3次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞3次元構造体が形成され、物質透過能を有することとなる。
細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック(生体親和性高分子からなる塊)と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。なお、交互とは、完全な交互を意味するものではなく、例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞とが混合された状態を意味する。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックからなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
本明細書において、免疫隔離膜は免疫隔離のために用いられる膜を意味する。
免疫隔離は免疫拒絶反応の防止方法である。一般的には、免疫隔離は移植の際のレシピエントの免疫拒絶反応を防止する方法の一つである。ここで、免疫拒絶反応は、移植される細胞構造体に対するレシピエントの拒絶反応である。免疫隔離により、レシピエントの免疫拒絶反応から細胞構造体が隔離される。免疫拒絶反応としては、細胞性免疫応答によるものおよび液性免疫応答によるものが挙げられる。
免疫隔離膜は、用途に応じ、免疫グロブリン(IgMまたはIgG等)および補体のような高分子量タンパク質の透過を阻止することが好ましく、インスリンなどの比較的低分子量の生理活性物質を透過させることが好ましい。
(多孔質膜の構造)
多孔質膜は複数の孔を有する膜をいう。孔は例えば膜断面の走査型電子顕微鏡(SEM)撮影画像または透過型電子顕微鏡(TEM)撮影画像で確認することができる。
多孔質膜の厚みは、特に限定されないが、10μm〜500μmであることが好ましく、10μm〜300μmであることがより好ましく、10μm〜250μmであることがさらに好ましい。
膜の表面とは主表面(膜の面積を示すおもて面または裏面)を意味し、膜の端の厚み方向の面を意味するものではない。多孔質膜の表面は他の層との界面であってもよい。なお、免疫隔離膜において、多孔質膜は孔径または孔径分布(厚み方向での孔径の差異)などについて全面積において一様の構造を有していることが好ましい。
厚み方向で孔径が連続的に増加する多孔質膜の構造は、例えば後述する製造方法により実現することができる。
膜のいずれかの表面にもっとも近い区分においては、平均孔径が0.05μm超25μm以下であることが好ましく、0.08μm超23μm以下であることがより好ましく、0.5μm超21μm以下であることがさらに好ましい。また、膜のいずれかの表面にもっとも近い区分の平均孔径の緻密部の平均孔径との比は、1.2以上20以下であることが好ましく、1.5以上15以下であることがより好ましく、2以上13以下であることがさらに好ましい。
多孔質膜は、少なくとも一方の表面において、式(I)および式(II)を満たすことが好ましい。
B/A ≦ 0.7 (I)
A ≧ 0.015 (II)
式中、Aは膜の表面におけるC元素(炭素原子)に対するN元素(窒素原子)の比率を示し、Bは同じ表面から30nmの深さにおけるC元素に対するN元素の比率を示す。
式(II)は多孔質膜の少なくとも一方の表面に一定量以上のN元素が存在することを示すものであり、式(I)は多孔質膜中のN元素が表面30nm未満に偏在していることを示しているものである。N元素は窒素含有ポリマーに由来することが好ましい。さらに、窒素含有ポリマーはポリビニルピロリドンであることが好ましい。
多孔質膜は、いずれか一方のみの表面が、式(I)および式(II)を満たしていてもよく、または両表面が式(I)および式(II)を満たしていてもよいが、両表面が式(I)および式(II)を満たしていることが好ましい。いずれか一方のみの表面が式(I)および式(II)を満たす場合、その表面は、後述の移植用チャンバーにおいて、内側であっても、または外側であってもよいが、内側であることが好ましい。また、いずれか一方のみの表面が式(I)および式(II)を満たす場合、式(I)および式(II)を満たす表面は表面Xであることが好ましい。
Aは0.050以上であることが好ましく、0.080以上であることがより好ましい。また、Aは0.20以下であればよく、0.15以下であることが好ましく、0.10以下であることがより好ましい。
Bは0.001〜0.10であればよく、0.002〜0.08であることが好ましく、0.003〜0.07であることがより好ましい。
多孔質膜はポリマーを含む。多孔質膜は本質的にポリマーから構成されていることが好ましい。
多孔質膜を形成するポリマーは生体適合性であることが好ましい。ここで、「生体適合性」とは、無毒性、非アレルギー誘発性を含む意味であるが、ポリマーが生体内において被包化される性質を含むものではない。
ポリマーは数平均分子量(Mn)が1,000〜10,000,000であるものが好ましく、5,000〜1,000,000であるものがより好ましい。
これらのうち、ポリスルホン、セルロースアシレートが好ましく、ポリスルホンがより好ましい。
上記添加剤としては、食塩、塩化リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、塩化亜鉛等の無機酸の金属塩、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム等の有機酸の金属塩、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の高分子、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド等の高分子電解質、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルメチルタウリン酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤等を挙げることができる。添加剤は多孔質構造のための膨潤剤として作用していてもよい。
多孔質膜の製造方法は、上述の構造の多孔質膜が形成できる限り、特に限定されず、通常のポリマー膜形成方法をいずれも用いることができる。ポリマー膜形成方法としては延伸法および流延法などが挙げられる。
例えば、流延法においては、製膜原液に用いる溶媒の種類および量や流延後の乾燥方法を調節することにより上述の構造を有する多孔質膜を作製することができる。
(1)ポリマー、必要に応じて添加剤、および必要に応じて溶媒を含む製膜原液を溶解状態で支持体上に流延する。
(2)流延された液膜の表面に調温湿風を当てる。
(3)調温湿風を当てた後に得られる膜を凝固液に浸漬する。
(4)必要に応じて支持体を剥離する。
緻密部位の平均孔径および位置は、調温湿風中に含まれる水分濃度、調温湿風を当てる時間によって制御することができる。なお、緻密部位の平均孔径は、製膜原液中の含有水分量によっても制御することができる。
多孔質膜の製造方法については、特開平4−349927号公報、特公平4−68966号公報、特開平04−351645号公報、特開2010−235808号公報等を参照することができる。
免疫隔離膜は多孔質膜以外の他の層を含んでいてもよい。他の層としては、ハイドロゲル膜が挙げられる。ハイドロゲル膜は、生体適合性であるものが好ましく、例としては、アルギン酸ゲル膜、アガロースゲル膜、ポリイソプロピルアクリルアミド膜、セルロースを含む膜、セルロース誘導体(例えばメチルセルロース)を含む膜、ポリビニルアルコール膜などが挙げられる。ハイドロゲル膜としては、アルギン酸ゲル膜が好ましい。アルギン酸ゲル膜の具体例としては、アルギン酸-ポリ−L−リジン−アルギン酸のポリイオンコンプレックス膜を挙げることができる。
本発明の血管新生剤は、間葉系幹細胞を免疫隔離膜で内包する工程を含む方法によって製造することができる。
本発明の血管新生剤は、間葉系幹細胞および免疫隔離膜を含む。血管新生剤においては、免疫隔離膜に間葉系幹細胞が内包されている。
血管新生剤において、間葉系幹細胞(または間葉系幹細胞の細胞構造体)は1種のみ含まれていてもよく、2種以上含まれていてもよい。
血管新生剤の移植回数は、1回だけ移植してもよいし、必要に応じ2回以上の移植を行うこともできる。
本発明によれば、(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスを、血管新生を必要とする対象者に移植する工程を含む、血管新生方法が提供される。
本発明によれば、血管新生のための処置において使用するための細胞移植用デバイスであって、(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスが提供される。
本発明によれば、血管新生剤の製造のための、(A)間葉系幹細胞、および(B)上記間葉系幹細胞を内包する免疫隔離膜、を含む細胞移植用デバイスの使用が提供される。
上記した各種用途において、好ましい態様は、前述と同様である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
リコンビナントペプチド(リコンビナントゼラチン)として以下のCBE3を用意した(国際公開WO2008/103041号公報に記載)。
CBE3:
分子量:51.6kD
構造: GAP[(GXY)63]3G
アミノ酸数:571個
RGD配列:12個
イミノ酸含量:33%
ほぼ100%のアミノ酸がGXYの繰り返し構造である。CBE3のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。CBE3はERGD配列を有している。
等電点:9.34
GRAVY値:−0.682
1/IOB値:0.323
アミノ酸配列(配列表の配列番号1)(国際公開WO2008/103041号公報の配列番号3と同じ。但し末尾のXは「P」に修正)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ3mm、直径51mm、側面厚さ8mm、高さ25mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は8mmのPTFEで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も3mmのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は43mmになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
厚さ1mm、直径47mmのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は1mmのアルミで閉鎖されており、底面(平板の円形状)も1mmのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚1mmのテフロン(登録商標)を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は45mmになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に2.2mmの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
PTFE厚・円筒形容器またはアルミ硝子板・円筒形容器にCBE3水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機(TF5−85ATNNN:宝製作所)内で冷却棚板を用いて底面からCBE3水溶液を冷却した。この際の容器、CBE3水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
アルミ・硝子板・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量4mL。
棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
PTFE厚・円筒形容器、CBE3水溶液の最終濃度4質量%、水溶液量10mL。棚板温度の設定は、−10℃になるまで冷却し、−10℃で1時間、その後−20℃で2時間、さらに−40℃で3時間、最後に−50℃で1時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−20℃設定に戻してから−20℃で24時間の真空乾燥を行い、24時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を20℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる(1.9×105Pa)まで、さらに20℃で48時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
条件A〜条件Cのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温(非冷却面液温)として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温(冷却面液温)として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図1〜図3の通りとなった。
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.1℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.2℃
凝固熱発生直前の温度差:1.1℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.0℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:0.1℃
凝固熱発生直前の温度差:0.9℃
非冷却面液温が融点(0℃)になった時の温度差:1.8℃
−10℃から−20℃へ下げる直前の温度差:1.1℃
凝固熱発生直前の温度差:2.1℃
参考例2で得られた条件Aおよび条件BのCBE3多孔質体をニューパワーミル(大阪ケミカル、ニューパワーミルPM−2005)で粉砕した。粉砕は、最大回転数で1分間×5回、計5分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、25〜53μm、53〜106μm、106〜180μmの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下160℃で熱架橋(架橋時間は8時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間の6種類を実施した)を施して、生体親和性高分子ブロック(CBE3ブロック)を得た。
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ(直径6mm、長さ21.8mmの円筒状:容量0.616cm3)が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を200回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
その結果、参考例3の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は98mg/cm3であった。
参考例3で架橋したブロックの架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。測定はTNBS(2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸)法を用いた。
<サンプル調製>
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)および1質量%のTNBS水溶液(2mL)を添加し、混合物を37℃で3時間振とうさせた。その後、37質量%塩酸(10mL)および純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、サンプルとした。
ガラスバイアルに、サンプル(約10mg)、4質量%NaHCO3水溶液(1mL)および1質量%TNBS水溶液(2mL)を添加し、直後に37質量%塩酸(3mL)を加え、混合物を37℃で3時間振とうした。その後、37質量%塩酸(7mL)および純水(5mL)を加えた後、混合物を37℃で16時間以上静置し、ブランクとした。
純水で10倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度(345nm)を測定し、以下の(式2)、および(式3)から架橋度(1分子当たりの架橋数)を算出した。
(式2)は、リコンビナントペプチド1g当たりのリジン量(モル等量)を示す。
(式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量(g)、wはリコンビナントペプチド質量(mg)を示す。)
(式3)は、1分子あたりの架橋数を示す。
参考例3で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
25℃において、3cm×3cmのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約15mgを充填し、2時間イオン交換水中で膨潤させた後、10分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、(式4)に従って、吸水率を求めた。
吸水率=(w2−w1−w0)/w0
(式中、w0は、吸水前の材料の質量、w1は吸水後の空袋の質量、w2は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。)
マウス脂肪由来間葉系幹細胞(mADSC)を10%FBS(ウシ胎児血清)含有のD−MEM培地(ダルベッコ改変イーグル培地)に懸濁し、そこに参考例3で作製した生体親和性高分子ブロック(53−106μm)を加えて、最終的にmADSC(1.2×108cells)と生体親和性高分子ブロック(0.25mg)が4mLの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の35mmディッシュであるEZSPHERE(登録商標)ディッシュType903(スフェロイドウェル口径800μm、スフェロイドウェル深さ300μm、スフェロイドウェル数〜約1,200ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。AGCテクノグラス製)に播種した。上記ディッシュをCO2インキュベーターで37℃で48時間静置することで、約1,200個の均一な細胞構造体を取得した。
<多孔質膜の作製>
ポリスルホン(ソルベイ社製P3500)15質量部、ポリビニルピロリドン(日本触媒社製K−30)15質量部、塩化リチウム1質量部、および水2質量部をN-メチル-2-ピロリドン67質量部に溶解して製膜原液を得た。この製膜原液をPET(ポリエチレンテレフタレート)フィルム表面に乾燥厚み50μmとなるようなウェット膜厚で流延した。上記流延した液膜表面に30℃、相対湿度80%RHに調節した空気を2m/秒で5秒間当てた。その後直ちに水を満たした65℃の凝固液槽に浸漬した。PETフィルムを剥離して多孔質膜を得た。その後、80℃のジエチレングリコール浴に120秒間つけ、その後純水で洗浄し、乾燥厚み50μmの多孔質膜を得た。この多孔質膜を免疫隔離膜とした。
バブルポイントは、パームポロメータ(西華産業製 CFE−1200AEX)を用いた細孔径分布測定試験において、GALWICK(Porous Materials,Inc社製)に完全に濡らした膜のサンプルに対して空気圧を5cm3/分で増大させて評価した。
参考例8の多孔質膜のバブルポイントは0.58kg/cm2であった。
多孔質膜の厚みを膜断面のSEM撮影写真を用いて測定した。
多孔質膜の厚み方向の孔径の比較を、膜断面のSEM撮影写真を膜の厚み方向に20分割したときの19本の分割線における孔径の比較により行なった。分割線と交差するまたは接する孔を連続して50個以上選択し、それぞれの孔径を測定し、平均値を算出して平均孔径とする。ここで、孔径は、選択された孔が分割線と交差する部分の長さではなく、膜断面のSEM撮影写真からデジタイザーで孔をなぞり面積を算出し、得られた面積を真円の面積として算出される直径を用いる。このとき、孔が大きく、50個以上選択できない分割線については、膜断面を得るSEM撮影写真の視野を広げて50個測定するものとする。得られた平均孔径を分割線ごとで比較することにより膜の厚み方向の孔径の比較を行なった。そのとき最も小さな平均孔径を緻密部位の平均孔径とした。
(式)膜厚×[(最小孔径×1.3倍以内の孔径となる分割線の数)÷19]
多孔質膜の厚み:55μm
緻密部位の平均孔径(多孔質膜の最小孔径の平均値):0.8μm
多孔質膜の最小孔径と最大孔径の比:7.5
緻密部位の厚み:10.5μm
図5より、参考例8の多孔質膜は、分割線No.5〜8が緻密部位であり、本明細書の段落番号0097の定義から、分割線No.1〜5および分割線No.8〜19において、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。
参考例8で作製したポリスルホン多孔質膜を3cm×5cmに切り出した。製造時に空気を当てた側の面を内側にして2つ折りにした。
その後、富士インパルス社製茶袋シーラー(T−230K)を用い、3cm×2.5cmの長方形の長辺2辺および短辺1辺の3辺を、260℃に加熱した。なお温度は熱電対で測定した。その後Intramedicポリエチレンチューブ(PE200)の内側に金属棒を挿した状態で残った1辺に挿入し、その状態で同じシーラーを用いてそれぞれ、同じ温度で加熱した。その後、端部封止部の幅が1mmになるように周囲部をナイフで切断し、1cm×2cmとなるような細胞移植用デバイス(免疫隔離膜のみ)を作製した。作製方法を図6に示す。
ポリスルホン(ソルベイ社製P3500)15質量部、ポリビニルピロリドン(日本触媒社製K−30)15質量部、塩化リチウム1質量部、および水2質量部をN-メチル-2-ピロリドン67質量部に溶解して製膜原液を得た。この製膜原液をPETフィルム表面に乾燥厚み83μmとなるようなウェット膜厚で流延した。上記流延した液膜表面に30℃、相対湿度57%RHに調節した空気を2m/秒で5秒間当てた。その後直ちに水を満たした70℃の凝固液槽に浸漬した。PETフィルムを剥離して多孔質膜を得た。その後、80℃のジエチレングリコール浴に120秒間つけ、その後純水で洗浄し、多孔質膜を得た。この多孔質膜を免疫隔離膜とした。
参考例10の多孔質膜のバブルポイントは0.66kg/cm2であった。
多孔質膜の厚み:85μm
緻密部位の平均孔径(多孔質膜の最小孔径の平均値):0.73μm
多孔質膜の最小孔径と最大孔径の比:11.1
緻密部位の厚み:21.8μm
図8より、参考例10の多孔質膜は、分割線No.4〜8が緻密部位であり、本明細書の段落番号0097の定義から、分割線No.1〜4および分割線No.8〜19において、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。
多孔質膜として参考例8で作製したポリスルホン多孔質膜の代わりに参考例10で作製したポリスルホン多孔質膜を用いて、参考例9と同様に細胞移植用デバイスを作製した。
ポリスルホン(ソルベイ社製 P3500)18質量部、ポリビニルピロリドン(K−30)12質量部、塩化リチウム0.5質量部、水1質量部をN−メチル−2−ピロリドン68.5質量部に溶解して製膜原液を得た。この製膜原液をPETフィルム表面に乾燥厚み130μmとなるようなウェット膜厚で流延した。上記流延した液膜表面に30℃、相対湿度50%RHに調節した空気を2m/秒で5秒間当てた。その後直ちに水を満たした50℃の凝固液槽に浸漬した。PETフィルムを剥離して多孔質膜を得た。その後、80℃のジエチレングリコール浴に120秒間つけ、その後純水で洗浄し、多孔質膜を得た。この多孔質膜を免疫隔離膜とした。
参考例12の多孔質膜のバブルポイントは1.3kg/cm2であった。
多孔質膜の厚み:142μm
緻密部位の平均孔径(多孔質膜の最小孔径の平均値):0.45μm
多孔質膜の最小孔径と最大孔径の比:12.2
緻密部位の厚み:27.4μm
図10より、参考例12の多孔質膜は、分割線No.2〜5が緻密部位であり、本明細書の段落番号0097の定義から、分割線No.1〜2および分割線No.5〜19において、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。
多孔質膜として参考例8で作製したポリスルホン多孔質膜の代わりに参考例12で作製したポリスルホン多孔質膜を用いて、参考例9と同様に細胞移植用デバイス(免疫隔離膜のみ)を作製した。
参考例9、11および13で作製した細胞移植用デバイス(免疫隔離膜のみ)に参考例7で作製したmADSCの細胞構造体を1,600個封入し、注入部を封止して細胞移植用デバイス(血管新生剤)を完成させた。それらを、NOD/SCIDマウスの背部皮下に埋植し、2週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。2個体に移植した代表的な組織標本を図11に示した。その結果、間葉系幹細胞(MSC)の細胞構造体を含む細胞移植用デバイスでは、デバイス近傍に局所的に多数の新生血管が誘導されていることが分かった。
参考例7で作製したmADSCの細胞構造体のみをNOD/SCIDマウスの背部皮下に埋植し、2週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。2個体に移植した代表的な組織標本を図12に示した。その結果、間葉系幹細胞(mADSC)の細胞構造体のみでは、新生血管はランダムな部位に誘導された。
参考例9、11、13で作製した細胞移植用デバイスをNOD/SCIDマウスの背部皮下に埋植し、2週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。2個体に移植した代表的な組織標本を図13に示した。その結果、間葉系幹細胞(mADSC)の細胞構造体を含まない細胞移植用デバイスでは、新生血管の誘導は非常に少ないことが分かった。
実施例1および比較例1、2の結果について、視野当りの血管の総面積、および視野当りの血管本数で定量評価を行った。評価に当たっては4個体のデータを解析し、平均値と標準偏差を算出した。結果、「細胞構造体+細胞移植用デバイス」(実施例1)の移植結果では、デバイスの周囲において、視野当りの血管総面積が13,391±4,329μm2で、視野当りの血管本数が28.5±7.0本となった。一方で「細胞構造体のみ」(比較例1)の移植結果では、視野当りの血管総面積が1,571±1,264μm2で、視野当りの血管本数が8.0±3.2本となった。「細胞移植用デバイスのみ」(比較例2)の移植結果では、視野当りの血管総面積が3,519±3,826μm2で、視野当りの血管本数が8.5±7.1本となった。このことから、「細胞構造体+細胞移植用デバイス」では、「細胞構造体のみ」または「細胞移植用デバイスのみ」に比べて、デバイス周囲において顕著に多くの新生血管を誘導していることが定量的にも明らかとなった。図14〜17を参照。尚、統計学的解析についてもt検定により、血管総面積の評価結果、血管本数の評価結果いずれとも、「細胞構造体のみ」または「細胞移植用デバイスのみ」と「細胞構造体+細胞移植用デバイス」では有意な差のあることが分かった。(p<0.05)
参考例9で作製した細胞移植用デバイス(免疫隔離膜のみ)に参考例7で作製したmADSCの細胞構造体を1,600個封入し、注入部を封止して細胞移植用デバイスを完成させた。それらを、C57BL/6マウスの背部皮下に埋植し、2週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。尚、参考例9で作製した細胞移植用デバイスのみを移植した場合と比較した組織標本を図18に示した。その結果、細胞構造体を含む細胞移植用デバイスでは、C57BL/6マウスに移植した場合でも、細胞移植用デバイス(免疫隔離膜のみ)を移植した場合と比べて、デバイス近傍に多数の新生血管が誘導されることが分かった。
マウス脂肪由来間葉系幹細胞(mADSC)1.2×108cellsを10%FBS(ウシ胎児血清)含有のD−MEM培地(ダルベッコ改変イーグル培地)に4mLに懸濁された状態で、細胞非接着性の35mmディッシュであるEZSPHERE(登録商標)ディッシュType903(スフェロイドウェル口径800μm、スフェロイドウェル深さ300μm、スフェロイドウェル数〜約1,200ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。AGCテクノグラス製)に播種した。上記ディッシュをCO2インキュベーターで37℃で48時間静置することで、約1,200個の均一なスフェロイドを取得した。
参考例9で作製した細胞移植用デバイス(免疫隔離膜のみ)に参考例14で作製したmADSCのスフェロイドを1,600個封入し、注入部を封止して細胞移植用デバイス(血管新生剤)を完成させた。それらを、C57BL/6マウスの背部皮下に埋植し、2週経過後に移植部位の組織切片を作製し、組織学的な評価を実施した。2個体に移植した代表的な組織標本を図19に示した。その結果、間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞移植用デバイスでは、デバイス近傍に新生血管が誘導されることが分かった。
実施例4の結果について、視野当りの血管の総面積、および視野当りの血管本数で定量評価を行った。評価に当たっては4個体のデータを解析し、平均値と標準偏差を算出した。結果、「細胞+細胞移植用デバイス」(実施例4)の移植結果では、視野当りの血管総面積が5871±1053μm2で、視野当りの血管本数が16±5.6本となった。実施例2および実施例4の結果から、「細胞+細胞移植用デバイス」では「細胞移植用デバイスのみ」に比べて、多くの新生血管を誘導していることが明らかとなった(図20および図21を参照)。
Claims (15)
- (A)細胞構造体、および(B)前記細胞構造体を内包する免疫隔離膜、を含む血管新生剤であって、細胞構造体が、複数個の生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種の複数個の間葉系幹細胞とを含み、複数個の前記間葉系幹細胞の隙間に、少なくとも1個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体として、含まれている、血管新生剤。
- 前記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項1に記載の血管新生剤。
- 前記免疫隔離膜が、ポリマーを含む多孔質膜である、請求項1または2に記載の血管新生剤。
- 前記多孔質膜の最小孔径が0.02μm〜1.5μmである、請求項3に記載の血管新生剤。
- 前記多孔質膜の厚みが10μm〜250μmである、請求項3または4に記載の血管新生剤。
- 前記多孔質膜が、孔径が最小となる層状の緻密部位を内部に有し、前記緻密部位から前記多孔質膜の少なくとも一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している、請求項3から5の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 前記緻密部位の厚みが0.5μm〜30μmである、請求項6に記載の血管新生剤。
- 前記多孔質膜の最小孔径と最大孔径との比が3.0〜20.0である、請求項3から7の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 前記多孔質膜が少なくとも一種のポリスルホンおよびポリビニルピロリドンを含む、請求項3から8の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 多孔質膜が熱可塑性または熱硬化性のポリマーを含む、請求項3から9の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが20μm以上200μm以下である、請求項1から10の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項1から11の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 前記生体親和性高分子ブロックが不定形である、請求項1から12の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 前記細胞構造体が、細胞1個当り0.0000001μg以上1μg以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項1から13の何れか一項に記載の血管新生剤。
- 細胞構造体を免疫隔離膜で内包する工程を含む、請求項1から14の何れか一項に記載の血管新生剤の製造方法。
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