CN107835697A - 细胞结构体及细胞结构体的制造方法 - Google Patents

细胞结构体及细胞结构体的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够在短时间内制造，并且具有规定以上的大小的细胞结构体及上述细胞结构体的制造方法。根据本发明，提供一种细胞结构体，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物及两种以上的细胞，且在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，其中，两种以上的细胞包含选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞。

Description

细胞结构体及细胞结构体的制造方法
技术领域
本发明涉及一种细胞结构体及细胞结构体的制造方法。
背景技术
目前，实现陷入功能障碍或功能不全的生物组织、器官的再生的再生医疗的实用化正在发展中。再生医疗为使用细胞、脚手架及生长因子这三因子将无法仅靠生物所具有的自然治愈能力恢复的生物组织再次制作成与原来的组织相同的形态或功能的新医疗技术。近年来，逐渐实现使用细胞的治疗。例如，可列举使用了自体细胞的培养表皮、使用了自体软骨细胞的软骨治疗、使用了间充质干细胞的骨再生治疗、使用了成肌细胞的心肌细胞片治疗、基于角膜上皮片的角膜再生治疗及神经再生治疗等。这些新治疗与以往的基于人造物的替代医疗(例如，人造骨填补剂和透明质酸注射等)不同，实现生物组织的修复、再生，且得到较高的治疗效果。实际上，使用了自体细胞的培养表皮和培養软骨等产品已经上市。
专利文献1中记载有一种细胞结构体，该细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和细胞，且在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。专利文献1中所记载的细胞结构体中，能够从外部向细胞结构体的内部传递营养，且具有充分的厚度，并且细胞在结构体中均匀存在。专利文献1的实施例中，使用由重组明胶或天然明胶原材料组成的高分子嵌段物证实高细胞生存活性。并且，专利文献2中记载有一种细胞移植用细胞结构体，该细胞移植用细胞结构体包含具有生物相容性的高分子嵌段物和至少一种细胞，且在上述多个细胞之间的间隙配置有多个上述高分子嵌段物。而且，专利文献3中记载有一种细胞移植用细胞结构体，该细胞移植用细胞结构体包含不含有戊二醛的生物相容性高分子嵌段物和至少一种细胞，且在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，其中，生物相容性高分子嵌段物的振实密度为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下，或者高分子嵌段物的二维截面像中的截面积的平方根÷周围长度值为0.01以上且0.13以下。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2011/108517号
专利文献2：日本特开2014-12114号公报
专利文献3：国际公开WO2014/133081号
发明内容
发明要解决的技术课题
当制造专利文献1～3中所记载的细胞结构体时，有时期待根据所使用的细胞的种类进一步缩短构建所希望大小的细胞结构体的时间，或期待形成更低的立体形状细胞结构体。本发明的课题在于能够在短时间内制造，并且具有规定以上的大小的细胞结构体。而且，本发明应解决的课题在于提供上述细胞结构体的制造方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果，在包含生物相容性高分子嵌段物和细胞，且在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体中，通过作为上述细胞组合使用在细胞结构体的形成中相对花费时间的第一细胞和对基材的粘附力强且易形成细胞块的第二细胞，在短时间内成功制造了具有规定以上的大小的细胞结构体。本发明是基于这些见解而完成的。
即，根据本发明，可提供以下发明。
(1)一种细胞结构体，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和两种以上的细胞，且在多个上述细胞之间的间隙配置有多个上述生物相容性高分子嵌段物，其中，
上述两种以上的细胞包含选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞。
(2)根据(1)所述的细胞结构体，其中，
上述第一细胞与上述第二细胞的细胞数的比率为9:1～1:99。
(3)根据(1)或(2)所述的细胞结构体，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物的大小为10μm以上且300μm以下。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的细胞结构体，其中，
厚度或直径为400μm以上且3cm以下。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的细胞结构体，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物的振实密度为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的细胞结构体，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物中，交联有生物相容性高分子。
(7)根据(6)所述的细胞结构体，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物的交联度为2以上，并且上述生物相容性高分子嵌段物的吸水率为300％以上。
(8)根据(1)至(7)中任一项所述的细胞结构体，其中，
上述生物相容性高分子嵌段物为通过对含有生物相容性高分子的固体物质进行粉碎而得到的生物相容性高分子嵌段物。
(9)根据(8)所述的细胞结构体，其中，
上述固体物质为对含有生物相容性高分子的水溶液进行冷冻干燥而得到的固体物质。
(10)根据(1)至(9)中任一项所述的细胞结构体，其中，
每一个细胞含有0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
(11)根据(1)至(10)中任一项所述的细胞结构体，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
(12)根据(11)所述的细胞结构体，其中，
重组明胶由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
(13)根据(11)或(12)所述的细胞结构体，其中，
重组明胶为如下中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由具有与序列号1中所记载的氨基酸序列80％以上相同序列的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
(14)根据(1)至(13)中任一项所述的细胞结构体，其中，
上述第一细胞为血管内皮细胞或肝细胞，上述第二细胞为成纤维细胞、平滑肌细胞或间充质干细胞。
(15)一种细胞结构体的制造方法，该细胞结构体为(1)至(14)中任一项所述的细胞结构体，该制造方法包括对生物相容性高分子嵌段物与含有两种以上的细胞的培养液的混合物进行孵育，其中，
上述两种以上的细胞包含选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞。
(16)根据(15)所述的方法，其中，
上述含有两种以上的细胞的培养液中的上述第一细胞与上述第二细胞的细胞数的比率为9:1～1:99。
发明效果
本发明的细胞结构体能够在短时间内制造，并且具有规定以上的大小。并且，根据本发明的细胞结构体的制造方法，能够在短时间内制造具有规定以上的大小的细胞结构体。
附图说明
图1表示实施例的条件A的液温分布。
图2表示实施例的条件B的液温分布。
图3表示实施例的条件C的液温分布。
图4表示HepG2细胞(人肝癌来源细胞)和hMSC(人骨髓来源间充质干细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图5表示HepG2细胞(人肝癌来源细胞)和hMSC(人骨髓来源间充质干细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图6表示HepG2细胞(人肝癌来源细胞)和NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图7表示HepG2细胞(人肝癌来源细胞)和NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图8表示HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)和hMSC(人骨髓来源间充质干细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图9表示HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)和hMSC(人骨髓来源间充质干细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图10表示HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)和NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图11表示HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)和NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)的镶嵌细胞块的形成。
图12表示HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)和BdSMC(正常人膀胱平滑肌细胞)的镶嵌细胞块的形成。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明涉及一种细胞结构体，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和两种以上的细胞，且在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，其中，两种以上的细胞包含选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞。另外，在本说明书中，有时将本发明的细胞结构体称为镶嵌细胞块(呈镶嵌状的细胞块)。
本发明中，第一细胞为在细胞结构体的形成中相对花费时间的细胞，第二细胞为对基材的粘附力强且易形成细胞块的细胞。本发明中，通过对第一细胞组合使用第二细胞，与仅使用第一细胞来制造细胞结构体的情况相比，能够在短时间内制造具有规定以上的大小的细胞结构体。
“能够在短时间内制造具有规定以上的大小的细胞结构体”是指，通过对第一细胞组合使用第二细胞，与仅使用第一细胞来制造细胞结构体的情况相比，能够在短时间内制造具有规定以上的大小的细胞结构体，关于“规定以上的大小”及“短时间”无具体限定。作为“能够在短时间内制造具有规定以上的大小的细胞结构体”的一例，是指使用2×104个细胞和0.02mg的生物相容性高分子嵌段物在细胞非粘性U字底96孔板的一个孔中制造直径1mm左右的球体时，能够在一天(24小时)以内形成从上部观察呈直径1.5mm以内的大小的细胞结构体的程度，但上述实验条件为一例，本发明的范围并不限定于该条件。
如上述通过组合使用第一细胞与第二细胞，与仅使用第一细胞来制造细胞结构体的情况相比，能够在短时间内制造具有规定以上的大小的细胞结构体的情况为本发明初次发现的知识，且为在以往完全无法预想的意外情况。
从本发明的结构进行考察，由于是在细胞-细胞之间的相互作用的强度、细胞-基材之间的相互作用的强度的基础上，在细胞-细胞之间的相互作用中也容易被层叠化的细胞等原因，因此认为该第一细胞与第二细胞可进行分类。认为作为第二细胞而被分类的细胞群在上述三个观点上均优异，因此在由第一细胞形成细胞结构体的基础上，发挥第一细胞彼此之间及第一细胞与基材之间的粘合剂的作用。即，认为第二细胞发挥强力胶的作用，且通过增强细胞结构体形成中所需要的粘合力，成功地加速了作为聚集体的细胞结构体形成。
(1)生物相容性高分子嵌段物
(1-1)生物亲和性高分子
生物亲和性是指，与生物接触时，不会引起如长期且慢性炎症反应等明显的不良反应。若本发明中所使用的生物相容性高分子对生物具有相容性，则对于是否在生物内被降解并无特别限定，优选为生物降解性高分子。作为非生物降解性性材料，具体而言，可列举聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯、不锈钢、钛、硅及MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)等。作为生物降解性性材料，具体而言，可列举重组肽或化学合成肽等多肽(例如，以下进行说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。上述中，尤其优选重组肽。可以将这些生物相容性高分子设计成提高细胞粘合性。具体而言，能够使用“基于对基材表面的细胞粘合基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白)或细胞粘合序列(以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽的涂层”、“基材表面的氨基酸化、阳离子化”或“基材表面的等离子体处理、基于电晕放电的亲水处理”等方法。
若包含重组肽或化学合成肽的多肽的种类具有生物相容性，则并无特别限定，例如优选明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、Pronectin、层粘连蛋白、肌腱蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白，最优选为明胶、胶原蛋白、去端肽胶原蛋白。作为本发明中所使用的明胶，优选为天然明胶、重组明胶或化学合成明胶，更优选为重组明胶。在此所述的天然明胶是指由天然来源的胶原蛋白制成的明胶。
化学合成肽或化学合成明胶是指人工合成的肽或明胶。明胶等肽的合成可以是固相合成，也可以是液相合成，优选为固相合成。本领域技术人员熟知肽的固相合成，例如可列举作为氨基的保护而使用Fmoc基(Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基：芴-甲氧基-羰基)的Fmoc基合成法、以及作为氨基的保护而使用Boc基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基：叔丁基氧基羰基)的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式能够套用本说明书中后述的(1-3)重组明胶中所记载的内容。
关于重组明胶，在本说明书中进行后述。
本发明中所使用的生物相容性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选0～1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB为基于由藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机示意图的亲疏水性的指标，其详细内容例如在“Pharmaceutical Bulletin：药学通报”，vol.2,2,pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11,10,pp.719-725(1957)、“Fragrance Journal”，vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的来源设为甲烷(CH4)，且将其他化合物均视为甲烷的衍生物来将其碳原子数、取代基、转变部、环等分别设定为规定数值，相加其分数来求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值标绘在以有机性值作为X轴，以无机性值作为Y轴的图上。有机示意图中的IOB是指，有机示意图中的无机性值(IV)相对于有机性值(OV)之比、即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机示意图的详细内容，可参考“新版有机示意图-基础与应用”(甲田善生等编著，三共出版、2008)。本说明书中，以取IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲疏水性。标注为“1/IOB”值越小(接近0)，越表示亲水性。
通过将本发明中所使用的高分子的1/IOB”值设为上述范围，亲水性高，并且吸水性变高，因此有效地作用于营养成分的保持。
当本发明中所使用的生物相容性高分子为多肽时，由Grand average ofhydropathicity(亲水性平均值)(GRAVY)值表示的亲疏水性指标中，优选为0.3以下且负9.0以上，更优选为0.0以下且负7.0以上。Grand average of hydropathicity(GRAVY)值能够通过“Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,AppelR.D.,Bairoch A.；Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASyServer；(In)John M.Walker(ed)：The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“Gasteiger E.,Gattiker A.,Hoogland C.,Ivanyi I.,AppelR.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledgeand analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).”的方法而得到。
通过将本发明中所使用的高分子的GRAVY值设为上述范围，亲水性高，并且吸水性变高，因此有效地作用于营养成分的保持。
(1-2)交联
本发明中所使用的生物相容性高分子可以被交联，也可以不被交联，但优选被交联。通过使用被交联的生物相容性高分子，可得到防止在培养基中培养时及移植到生物时瞬间降解的效果。作为通常的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳二亚胺、氰胺等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键、离子性相互作用等，本发明中也能够使用上述交联方法。作为本发明中所使用的交联方法，更优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。
当进行基于酶的交联时，作为酶，若具有高分子材料之间的交联作用，则并无特别限制，优选谷氨酰胺转氨酶及漆酶谷氨酰胺转氨酶，最优选使用谷氨酰胺转氨酶来进行交联。作为用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的蛋白质的具体例，若为具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并无特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以是哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶，也可以是微生物来源的谷氨酰胺转氨酶，具体而言，可列举AJINOMOTO CO.,INC.制ACTIVA系列、作为试剂而出售的哺乳类来源的谷氨酰胺转氨酶、例如，Oriental Yeast Co.,ltd.制、Upstate USA Inc.制、Biodesign International制等豚鼠肝脏来源谷氨酰胺转氨酶、山羊来源谷氨酰胺转氨酶、兔子来源谷氨酰胺转氨酶等、人来源凝血因子(Factor XIIIa，Haematologic Technologies,Inc.)等。
进行交联(例如，热交联)时的反应温度只要能够进行交联，则并无特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，进一步优选为120℃～200℃。
(1-3)重组明胶
本发明中所述的重组明胶是指，通过基因重组技术制成的类似明胶的具有氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。本发明中能够使用的重组明胶优选具有对胶原蛋白由特征性Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种)的重复。其中，多个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。优选在一分子中含有两个序列以上的细胞粘合信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有来源于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如，能够使用EP1014176、US专利6992172号、国际公开WO2004/85473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但并不限定于此。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的重组明胶为以下形态的重组明胶。
重组明胶因天然明胶本来的性能而生物相容性优异，并且因非天然来源而不存在牛海绵状脑病(BSE)等忧患，从而非感染性优异。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀，且序列已确定，因此在强度及降解性方面也能够通过交联等而模糊较少且精密设计。
重组明胶的分子量并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选具有对胶原蛋白由特征性Gly-X-Y表示的序列的重复。其中，多个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以彼此不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选为除甘氨酸以外的任意氨基酸)。对胶原蛋白由特征性Gly-X-Y表示的序列为与明胶-胶原蛋白的氨基酸组成及序列中的其他蛋白质相比非常特殊的部分结构。在该部分，甘氨酸占整体的约3分之1，在氨基酸序列按三个重复一个。甘氨酸为最简单的氨基酸，对分子链的配置的束缚也较少，且在凝胶化时大大有助于螺旋结构的再生。由X及Y表示的氨基酸含有较多的亚氨基酸(脯氨酸、氧脯氨酸)，优选占整体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上，更优选95％以上，最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
通常的明胶中，极性氨基酸中的带电荷的氨基酸与无电荷的氨基酸以1:1存在。在此，极性氨基酸具体指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，其中极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。本发明中所使用的重组明胶中，构成的所有的氨基酸中的极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，优选上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例为5％以上且小于20％，优选为小于10％。而且，优选在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一个氨基酸，优选不包含两个以上的氨基酸。
通常多肽中，已知作为细胞粘合信号而作动的最小氨基酸序列(例如，NagaiShoten Co.,Ltd.发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一分子中具有两个以上的这些细胞粘合信号。作为具体的序列，从粘合的细胞的种类多的方面考虑，优选以氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。更优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘合信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产量。例如，作为细胞，在使用了间充质干细胞的软骨分化的情况下，能够提高糖胺聚糖(GAG)的产生。
作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间，优选在25～60之间并不均匀。
关于该最小氨基酸序列的含量，从细胞粘合、增生的观点考虑，在蛋白质1分子中优选为3～50个，更优选为4～30个，尤其优选为5～20个。最优选为12个。
本发明中所使用的重组明胶中，优选RGD基序相对于氨基酸总数的比例至少为0.4％。当重组明胶包含350以上的氨基酸时，优选350个氨基酸的各段至少包含一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例进一步优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，进一步优选至少为1.0％，进一步优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。重组肽内的RGD基序的数量在每250个氨基酸优选至少为4个，进一步优选为6个，进一步优选为8个，进一步优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％的比例对应于在每250的氨基酸为至少一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶应至少包含两个RGD序列。优选本发明的重组明胶在每250个氨基酸至少包含两个RGD序列，更优选在每250个氨基酸至少包含三个RGD序列，进一步优选在每250个氨基酸包含至少4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的又一方式，包含至少4个RGD基序，优选包含6个，更优选包含8个，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以部分水解。
优选本发明中所使用的重组明胶由式1：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种。m优表示2～10的整数，更优选表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，更优选为15～70的整数，最优选为50～65的整数。A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。
更优选本发明中所使用的重组明胶由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。)表示。
优选重复单元与多个天然存在的胶原蛋白的序列单元结合。在此所述的天然存在的胶原蛋白只要是天然存在的，则并无限制，优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原蛋白。更优选为I型、II型或III型胶原蛋白。根据另一方式，上述胶原蛋白的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选为人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测定，如等电点电泳法(Maxey,C.R.(参考1976；Phitogr.Gelatin 2,Editor Cox,P.J.Academic,London,Engl.))中所记载，能够通过对将1质量％明胶溶液通入阳离子及阴离子交换树脂的混晶柱之后的pH进行测定来实施。
优选重组明胶没有被脱氨化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶为由对氨基酸序列进行编码的核酸制备的实质上纯多肽。
作为本发明中所使用的重组明胶，尤其优选如下中的任一个：
(1)由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
(3)由具有与序列号1中所记载的氨基酸序列80％以上(更优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)相同序列的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
“缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“一个或多个”是指，优选1～20个，更优选1～10个，进一步优选1～5个，尤其优选1～3个。
关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术而制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/85473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，将其安装于表达载体来制作重组表达载体，并将其导入适当的宿主来形成转化体。通过使用适当的培养基对所得到的转化体进行培养而产生重组明胶，因此能够通过回收从培养物产生的重组明胶来制备本发明中所使用的重组明胶。
(1-4)生物相容性高分子嵌段物
本发明中，使用由上述生物相容性高分子组成的嵌段物(块)。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状并无特别限定。例如，为无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状、多孔状、纤维状、纺锤状、扁平状及片状，优选无规则形、球状、粒状(颗粒)、粉状及多孔状。无规则形表示表面形状不均匀的形状，例如表示具有如岩石那样的凹凸的物体。另外，上述形状的例示并不是分别独立的，例如有时作为粒状(颗粒)的下位概念的一例而成为无规则形。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的形状如上述那样并无特别限定，振实密度优选为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下，更优选为20mg/cm3以上且400mg/cm3以下，进一步优选为40mg/cm3以上且220mg/cm3以下，尤其优选为50mg/cm3以上且150mg/cm3以下。
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，且值越小，则越无法紧密地填充，即可知嵌段物的结构复杂。认为生物相容性高分子嵌段物的振实密度表示生物相容性高分子嵌段物的表面结构的复杂性及作为聚集体而聚集了生物相容性高分子嵌段物时形成的空隙的量。振实密度越小，高分子嵌段物之间的空隙越大，细胞的移植区域越大。并且，认为由于不会过小而能够在细胞彼此之间适当地存在生物相容性高分子嵌段物，且作为细胞结构体时能够向相同结构体内部传递营养成分，因此优选抑制在上述范围内。
本说明书中所述的振实密度能够如下那样测定。为了测定而准备(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的容器(以下，记载为帽部)。首先，仅测定帽部的质量。然后，向帽部贴合容器，并以嵌段物滞留于帽部的方式从容器流入。添加充分量的嵌段物之后，在桌子等较硬的部位对帽部部分敲击200次来卸下容器，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽部的状态下测定质量。通过从仅帽部的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽部的体积而能够求出振实密度。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的交联度并无特别限定，优选为2以上，进一步优选为2以上且30以下，进一步优选为4以上且25以下，尤其优选为4以上且22以下。
高分子嵌段物的交联度(每一1分子的交联数)的测定方法并无特别限定，例如能够通过后述实施例中所记载的TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法来测定。具体而言，对将高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合而在37℃下反应3小时之后停止反应的样品和刚将高分子嵌段物、NaHCO3水溶液及TNBS水溶液进行混合之后停止反应的空白培养基(blank)进行制备，并分别测定用纯水进行稀释的样品及空白培养基的吸光度(345nm)，从而能够从以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g高分子嵌段物的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示高分子嵌段物质量(mg)。)
(式3)1-(样品(式2)/未交联的高分子(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
本发明中的生物相容性高分子嵌段物的吸水率并无特别限定，优选300％以上，更优选400％以上，进一步优选500％以上，尤其优选700％以上，最优选800％以上。另外，吸水率的上限并无特别限定，通常为4000％以下或2000％以下。
生物相容性高分子嵌段物的吸水率的测定方法并无特别限定，例如能够通过后述实施例中所记载的方法进行测定。具体而言，在25℃下于3cm×3cm的尼龙网孔制的袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，在离子交换水中膨润两小时之后，风干10分钟，在每一阶段测定质量，从而能够根据(式4)来求出吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中，w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋的质量，w2表示包括吸水后的材料的袋整体的质量。)
本发明中的一个生物相容性高分子嵌段物的大小并无特别限定，优选为1μm以上且700μm以下，更优选为10μm以上且700μm以下，进一步优选为10μm以上且300μm以下，进一步优选为20μm以上且200μm以下，进一步优选为20μm以上且150μm以下，尤其优选为53μm以上且106μm以下。通过将一个生物相容性高分子嵌段物的大小设定在上述范围内，能够良好地从外部向细胞结构体的内部传递营养成分。另外，一个生物相容性高分子嵌段物的大小并不是指多个生物相容性高分子嵌段物的大小的平均值在上述范围内，而是指对多个生物相容性高分子嵌段物进行过筛而得到的每一个的生物相容性高分子嵌段物的尺寸。
一个嵌段物的大小能够由对嵌段物进行区分时所使用的筛子的大小来定义。例如，能够将用180μm的筛子进行过筛，并用106μm的筛子对所通过的嵌段物过筛时残留于筛子上的嵌段物设为106～180μm大小的嵌段物。接着，能够将用106μm的筛子进行过筛，并用53μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物设为53～106μm大小的嵌段物。接着，能够将用53μm的筛子进行过筛，并用25μm的筛子对所通过的嵌段物进行过筛时残留于筛子上的嵌段物设为25～53μm大小的嵌段物。
(1-5)生物相容性高分子嵌段物的制造方法
生物相容性高分子嵌段物的制造方法并无特别限定，例如使用粉碎机(新动力磨机等)对含有生物相容性高分子的固体物质(生物相容性高分子的多孔体等)进行粉碎，由此能够得到生物相容性高分子嵌段物。含有生物相容性高分子的固体物质(多孔体等)例如能够通过对含有生物相容性高分子的水溶液进行冷冻干燥来得到。
如上述，能够通过对含有生物相容性高分子的固体物质进行粉碎来制造表面形状不均匀的无规则形生物相容性高分子嵌段物。
作为生物相容性高分子的多孔体的制造方法的一例，能够列举如下方法，该方法包括：
工序(a)，在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，并且在溶液内液温最高的部分的温度为溶剂的融点以下，将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态；
工序(b)，对在工序(a)中所得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻；及
工序(c)，对在工序(b)中所得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥。
将生物相容性高分子的溶液冷却至未冷冻状态时，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下(优选2.3℃以下，更优选2.1℃以下)，即通过减小温度差，所得到的多孔质孔的大小偏差得以减少。另外，液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差的下限并无特别限定，0℃以上即可，例如可以是0.1℃以上、0.5℃以上、0.8℃以上或0.9℃以上。
关于工序(a)的冷却，例如优选经由导热率比水低的原材料(优选特氟龙(注册商标))进行冷却，能够将在溶液内液温最高的部分假设为最远离冷却侧的部分，且能够将在溶液内液温最低的部分假设为冷却面的液温。
优选在工序(a)中，在即将产生凝固热之前的、在溶液内液温最高的部分的温度与在溶液内液温最低的部分的温度之差为2.5℃以下，更优选为2.3℃以下，进一步优选为2.1℃以下。其中，“即将产生凝固热之前的温度差”是指，产生凝固热时的1秒钟前～10秒钟前之间温度差变最大时的温度差。
优选在工序(a)中，在溶液内液温最低的部分的温度为溶剂融点-5℃以下，更优选为溶剂融点-5℃以下且溶剂融点-20℃以上，进一步优选溶剂融点-6℃以下且溶剂融点-16℃以上。另外，溶剂融点的溶剂为生物相容性高分子的溶液的溶剂。
在工序(b)中，对在工序(a)得到的生物相容性高分子的溶液进行冷冻。在工序(b)用于冷冻的冷却温度并无特别限制，还取决于进行冷却的机器，但优选为比在溶液内液温最低的部分的温度低3℃～30℃的温度，更优选为低5℃～25℃的温度，更优选为低10℃～20℃的温度。
在工序(c)中，对在工序(b)得到的已冷冻的生物相容性高分子进行冷冻干燥。冷冻干燥能够通过常规方法进行，例如能够通过在比溶剂的融点低的温度下进行真空干燥，进而在室温(20℃)下进行真空干燥来进行冷冻干燥。
本发明中，优选能够通过对在上述工序(c)得到的多孔体进行粉碎来制造生物相容性高分子嵌段物。
(2)细胞
本发明的细胞结构体包含两种以上的细胞。本发明中，使用选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚性干(ES)细胞、人工多能性干(iPS)细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干(MSC)细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞。
用作第一细胞的细胞可以是一种，也可以是两种以上，优选一～三种，更优选一种或两种，进一步优选一种。
用作第二细胞的细胞可以是一种，也可以是两种以上，优选一～三种，更优选一种或两种，进一步优选一种。
优选第一细胞为血管内皮细胞或肝细胞，且第二细胞为成纤维细胞、平滑肌细胞或间充质干细胞。并且，作为关于第一细胞的优选的又一例，为选自包括筋细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚性干(ES)细胞、人工多能性干(iPS)细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种细胞。
尤其作为优选的组合，第一细胞为肝细胞，第二细胞为成纤维细胞或间充质干细胞。
将上述各细胞设为表示各术语的最广泛的范围，且可以是从生物采集的细胞、对从生物采集的细胞实施操作(基因导入操作等)的细胞及通过从其他细胞的转换而得到的细胞(例如，从iPS细胞分化衍生的心肌细胞及神经细胞等)等中的任一个。
一细胞(以下，称为对象细胞)是否为上述规定的细胞的确认能够通过确认对象细胞是否具有各细胞的功能来进行，或者能够通过确认对象细胞是否对各细胞显示特异标记来进行，并无特别限定。
作为所使用的细胞，优选为动物细胞，更优选为脊椎动物来源细胞，尤其优选为人来源细胞。并且，细胞的来源可以是自体细胞或异体细胞中的任一个。
例如，重症心力衰竭、重度心肌梗塞等心臓疾病中，能够优选地使用从自体及异体摘取的心肌细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等。能够进行对脑缺血、脑梗塞部位的神经细胞的移植或对心肌梗塞部位、骨骼肌缺血部位的血管内皮细胞的移植。并且，可列举在对糖尿病性的器官障碍的细胞移植中所使用的细胞。例如，可列举对肾、胰腺、末梢神经、眼、四肢血行障碍等疾病进行各种研究的细胞移植治疗法用细胞。例如，对降低了胰岛素分泌能力的胰腺移植胰岛细胞的尝试进行了研究，并能够使用这种细胞。在其他器官中，也能够作为上述第一细胞及第二细胞而适当选择移植细胞。
本发明中，选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚性干(ES)细胞、人工多能性干(iPS)细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞为在细胞结构体的形成中需要时间的细胞。选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干(MSC)细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞为能够高速形成细胞结构体的细胞。本发明中，通过组合使用上述第一细胞与上述第二细胞，能够在短时间内形成具有规定以上的大小的细胞结构体。
本发明的细胞结构体中的第一细胞与第二细胞的细胞数的比率并无特别限定，优选为9:1～1:99，更优选为9:1～2:8，进一步优选为8:2～2:8。
(3)细胞结构体
本发明中，使用生物相容性高分子嵌段物和两种以上的细胞，在多个细胞之间的间隙以镶嵌状三维配置多个生物相容性高分子嵌段物，从而能够具有适合细胞移植的厚度。而且，通过将生物相容性高分子嵌段物与细胞以镶嵌状三维配置，能够形成细胞均匀存在于结构体中的细胞结构体，且从外部向细胞结构体的内部传递营养。
本发明的细胞结构体中，在多个细胞之间的间隙配置有多个生物相容性高分子嵌段物，在此“细胞之间的间隙”无需为被所构成的细胞封闭的空间，而被细胞夹持即可。另外，无需在所有的细胞之间存在间隙，可以存在细胞彼此接触的部位。隔着生物相容性高分子嵌段物的细胞之间的间隙的距离、即选择一细胞与存在于与该细胞最短距离内的细胞时的间隙距离并无特别限制，优选为生物相容性高分子嵌段物的大小，优选的距离也为生物相容性高分子嵌段物的优选的大小范围。
并且，生物相容性高分子嵌段物成为被细胞夹持的构成，但无需在所有的生物相容性高分子嵌段物之间存在细胞，也可以存在生物相容性高分子嵌段物彼此接触的部位。隔着细胞的生物相容性高分子嵌段物之间的距离、即选择生物相容性高分子嵌段物和存在于与该生物相容性高分子嵌段物最短距离内的生物相容性高分子嵌段物时的距离并无特别限制，优选为所使用的细胞聚集1～数个时的细胞的块的大小，例如为10μm以上且1000μm以下，优选为10μm以上且100μm以下，更优选为10μm以上且50μm以下。
另外，本说明书中，使用“细胞均匀存在于结构体中的细胞结构体”等“均匀存在”这一表达方式，但并不是指完全均匀，而指能够从外部向细胞结构体的内部传递营养。
本发明的细胞结构体的厚度或直径能够设为所希望的厚度，作为下限，优选为215μm以上，更优选为400μm以上，最优选为730μm以上。厚度或直径的上限并无特别限定，作为使用上的通常的范围优选3cm以下，更优选2cm以下，进一步优选1cm以下。并且，作为细胞结构体的厚度或直径的范围，优选400μm以上且3cm以下，更优选500μm以上2cm以下、进一步优选720μm以上且1cm以下。通过将细胞结构体的厚度或直径设为上述范围内，从外部向细胞结构体传递营养的情况变更良好。
本发明的细胞结构体中，优选由生物相容性高分子嵌段物组成的区域和由细胞组成的区域被配置成镶嵌状。另外，本说明书中的“细胞结构体的厚度或直径”表示如下。选择了细胞结构体中的某一点A时，在通过该点A的直线内，将以距离细胞结构体外界的距离变最短的方式对细胞结构体进行分断的线段的长度设为线段A。在细胞结构体中选择该线段A成为最长的点A，并将此时的线段A的长度设为“细胞结构体的厚度或直径”。
本发明的细胞结构体中，细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率并无特别限定，优选每一个细胞的生物相容性高分子嵌段物的比率为0.0000001μg以上且1μg以下，进一步优选为0.000001μg以上且0.1μg以下，更优选为0.00001μg以上且0.01μg以下，最优选为0.00002μg以上且0.006μg以下。通过将细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率设为上述范围，能够使细胞更加均匀的存在。通过将下限设为上述范围，能够发挥在所希望的用途中使用时的细胞的效果，通过将上限设为上述范围，能够向细胞供给任意存在的生物相容性高分子嵌段物中的成分。在此，生物相容性高分子嵌段物中的成分并无特别限制，可列举后述的培养基中所含有的成分。
(4)细胞结构体的制造方法
本发明的细胞结构体能够通过对生物相容性高分子嵌段物和两种以上的细胞进行混合来制造。更具体而言，本发明的细胞结构体能够通过将生物相容性高分子嵌段物与上述细胞交替配置来制造。制造方法并无特别限定，优选在形成生物相容性高分子嵌段物之后，将细胞与生物相容性高分子嵌段物进行混合的方法。具体而言，通过对生物相容性高分子嵌段物与含有两种以上的细胞的培养液的混合物进行孵育，能够制造本发明的细胞结构体。作为两种以上的细胞，能够使用本说明书中上述的细胞。并且，上述含有两种以上的细胞的培养液中的第一细胞与第二细胞的细胞数的比率并无特别限定，优选为9:1～1:99，更优选为9:1～2:8，进一步优选为8:2～2:8。
本发明中，例如在容器中，能够在保持于容器的液体中，将细胞与预先制作的生物相容性高分子嵌段物配置成镶嵌状。作为配置方法，优选通过利用自然凝聚、自然落下、离心、搅拌来促进或控制由细胞和生物相容性高分子嵌段物组成的细胞结构体的形成。
作为所使用的容器，优选由细胞低粘合性材料或细胞非粘合性材料组成的容器，更优选由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯组成的容器。优选容器底面的形状为平底型、U字型、V字型。
通过上述方法得到的细胞结构体(镶嵌细胞块)例如可以通过如下等方法来制造所希望大小的细胞结构体，
(a)使分别制备的细胞结构体(镶嵌细胞块)彼此融合或
(b)在分化培养基或增长培养基下增量。
融合方法、增量方法并无特别限定。
例如，在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵育的工序中，通过将培养基交换为分化培养基或增长培养基，能够对细胞结构体进行增量。优选在对生物相容性高分子嵌段物与细胞含有培养液的混合物进行孵育的工序中，通过进一步添加生物相容性高分子嵌段物，能够制造规定大小的细胞结构体，且细胞均匀存在于细胞结构体中的细胞结构体。
使分别制备的细胞结构体彼此融合时，例如包含多个生物相容性高分子嵌段物和多个细胞，且能够使在由上述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一或多个上述生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体融合多个。如上述(a)中所记载，通过使本发明的细胞结构体的多个融合而得到的细胞结构体也在本发明的范围内。
本发明的细胞结构体的制造方法所涉及的“生物相容性高分子嵌段物(种类、大小等)”、“细胞”、“细胞之间的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率”等优选的范围与本说明书中上述的内容相同。
上述融合前的各细胞结构体的厚度或直径优选为10μm以上且1cm以下，更优选为10μm以上且2000μm以下，进一步优选为15μm以上且1500μm以下，最优选为20μm以上且1300μm以下。融合后的厚度或直径优选为400μm以上且3cm以下，更优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。
通过进一步添加上述生物相容性高分子嵌段物，作为制造所希望大小的细胞结构体的方法，具体而言，能够列举包含多个第一生物相容性高分子嵌段物和多个细胞，且对在由上述多个细胞形成的多个间隙的一部分或全部配置有一个或多个上述生物相容性高分子嵌段物的细胞结构体进一步添加第二生物相容性高分子嵌段物来进行孵育的方法。在此，“生物相容性高分子嵌段物(种类、大小等)”、“细胞”、“细胞之间的间隙”、“所得到的细胞结构体(大小等)”、“细胞与生物相容性高分子嵌段物的比率”等优选范围与本说明书中上述的内容相同。
欲融合的细胞结构体彼此优选设置在0以上且50μm以下的距离内，更优选为0以上且20μm以下，进一步优选为0以上且5μm以下的距离。使细胞结构体彼此融合时，认为通过细胞的增长、伸展而细胞或产生细胞的基质发挥粘合剂的作用，由此接合，通过设为上述范围，细胞结构体彼此的粘合变轻松。
作为通过本发明的细胞结构体的制造方法得到的细胞结构体的厚度或直径范围，优选为400μm以上且3cm以下，更优选为500μm以上且2cm以下，进一步优选为720μm以上且1cm以下。
优选对细胞结构体进一步添加第二生物相容性高分子嵌段物来进行孵育时的添加第二生物相容性高分子嵌段物的进度对应于所使用的细胞的增长速度而适当选择。具体而言，若添加第二生物相容性高分子嵌段物的进度早则细胞向细胞结构体的外侧移动，且细胞的均匀性降低，若添加进度慢，则形成细胞的比例变多的部位，且细胞的均匀性减少，因此考虑所使用的细胞的增长速度来进行选择。
(5)细胞结构体的用途
本发明的细胞结构体能够用于细胞移植。具体而言，本发明的细胞结构体例如能够以对重症心力衰竭、重度心肌梗塞等心臓疾病、脑缺血/脑梗塞等疾患部位移植细胞的目的而使用。并且，还能够对糖尿病性的肾、胰腺、肝、末梢神经、眼、四肢血行障碍等疾病使用。
作为移植方法，能够使用切开、注射、内窥镜等。本发明的细胞结构体与所谓的细胞片的细胞移植物不同，且能够减小结构体的尺寸，因此能够进行所谓的基于注射的移植的微创移植方法。
并且，根据本发明，提供一种包括将本发明的细胞结构体移植到需要细胞移植的患者的工序的细胞移植方法。本发明的细胞移植方法中，使用上述本发明的细胞结构体。细胞结构体的优选的范围与上述相同。
而且，根据本发明，提供一种用于制造细胞移植治疗剂的本发明的细胞结构体的使用。根据本发明，优选细胞结构体的优选范围与上述相同。
而且，根据本发明，提供一种包含本发明的细胞结构体的细胞移植治疗剂。根据本发明，细胞结构体的优选范围与上述相同。
通过以下实施例对本发明进行具体地说明，但本发明并不限定于实施例。
实施例
[实施例1]重组肽(重组明胶)
作为重组肽(重组明胶)准备了以下CBE3(记载于国际公开WO2008/103041号公报中)。
CBE3：
分子量：51.6kD
结构：GAP[(GXY)63]3G
氨基酸数：571个
RGD序列：12个
亚氨基酸含量：33％
大致100％的氨基酸为GXY的重复结构。CBE3的氨基酸序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323
氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。但将末尾的X修正为“P”)
GAP
(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[实施例2]重组肽多孔体的制作
[PTFE厚/圆筒形容器]
准备了底面厚度3mm、直径51mm、侧面厚度8mm、高度25mm的聚四氟乙烯(PTFE)制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被8mm的PTFE密封，且底面(平板的圆形)也被3mm的PTFE密封。另一方面，上面呈打开的形状。从而，圆筒杯的内径成为43mm。以下，将该容器称为PTFE厚/圆筒形容器。
[铝合金玻璃板/圆筒形容器]
准备了厚度1mm、直径47mm的铝合金制圆筒杯状容器。圆筒杯中，将曲面设为侧面时，侧面被1mm的铝合金密封，且底面(平板圆形)也被1mm的铝合金密封。另一方面，上面呈打开的形状。并且，仅在侧面的内部均匀地铺满壁厚1mm的特氟龙(注册商标)，其结果，圆筒杯的内径成为45mm。并且，该容器的底面呈在铝合金的外侧接合2.2mm的玻璃板的状态。以下，将该容器称为铝合金玻璃/圆筒形容器。
[温度差小的冷冻工序及干燥工序]
将CBE3水溶液流入PTFE厚/圆筒形容器、铝合金玻璃板/圆筒形容器，并在真空冷冻干燥机(TF5-85ATNNN：TAKARA.Co.Ltd)内使用冷却搁板从底面冷却了CBE3水溶液。此时的容器、CBE3水溶液的最终浓度、液量及搁板温度的设定的组合按照如下所述进行了准备。
条件A：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时，然后在-20℃下进行2小时，进而在-40℃下进行3小时，最后在-50℃下进行了1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行24小时的真空干燥，在24小时之后直接持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
条件B：
铝合金/玻璃板/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量4mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时，然后在-20℃下进行2小时，进而在-40℃下进行3小时，最后在-50℃下进行1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行24小时的真空干燥，在24小时之后直接持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
条件C：
PTFE厚/圆筒形容器、CBE3水溶液的最终浓度4质量％、水溶液量10mL。关于搁板温度的设定，冷却至-10℃，在-10℃下进行1小时，然后在-20℃下进行2小时，进而在-40℃下进行3小时，最后在-50℃下进行1小时冷冻。本冷冻产品在此之后将搁板温度返回设定到-20℃而在-20℃下进行24小时的真空干燥，在24小时之后直接持续进行真空干燥的状态下将搁板温度上升至20℃，直至真空度充分降低(1.9×105Pa)为止，进一步在20℃下实施48小时的真空干燥之后，从真空冷冻干燥机取出。由此得到了多孔体。
[各冷冻工序中的温度测定]
关于条件A～条件C的每一个，作为在溶液内最远离冷却侧的部位的液温(非冷却面液温)测定了容器内的圆中心部的水表面液温，并且，作为在溶液内最接近冷却侧的液温(冷却面液温)测定了容器内的底部的液温。
其结果，各自的温度与其温度差的分布成为如图1～图3。
从图1、图2、图3可知，在条件A、条件B、条件C下，液温在搁板温度-10℃设定区间(降低到-20℃之前)低于作为融点的0℃，并且其状态处于不会引起冷冻(未冷冻/过于冷却)状态。并且，在该状态下，冷却面液温与非冷却面液温的温度差为2.5℃以下。另外，本说明书中，“温度差”是指“非冷却面液温”-“冷却面液温”。然后，搁板温度进一步降低到-20℃，由此确认到液温向0℃附近急速上升的时刻，在此可知产生凝固热而开始冷冻。并且，确认到在该时刻实际上开始形成冰。然后，温度在0℃附近经过一定时间。在此，成为存在水与冰的混合物的状态。最后，温度从0℃再次开始下降，此时，液体部分消失而成为冰。从而，所测定的温度成为冰内部的固态温度，即并非液温。
以下，关于条件A、条件B、条件C，记载非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差、将搁板温度从-10℃降低至-20℃紧前的温度差及产生凝固热紧前的温度差。另外，本发明中所述的“紧前的温度差”表示能够在活动(产生凝固热等)的1秒钟前～20秒钟前的期间检测出的温度差内的最高温度。
条件A
非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差：1.1℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：0.2℃
产生凝固热紧前的温度差：1.1℃
条件B
非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差：1.0℃
从-10℃降低之-20℃紧前的温度差：0.1℃
产生凝固热紧前的温度差：0.9℃
条件C
非冷却面液温成为融点(0℃)时的温度差：1.8℃
从-10℃降低至-20℃紧前的温度差：1.1℃
产生凝固热紧前的温度差：2.1℃
[实施例3]生物相容性高分子嵌段物的制作(多孔体的粉碎和交联)
利用新动力磨机(OSAKA CHEMICAL Co.,Ltd.，新动力磨机PM-2005)粉碎了在实施例2中得到的条件A及条件B的CBE3多孔体。关于粉碎，以最大转速1分钟×5次，合计进行了5分钟的粉碎。对所得到的粉碎物，利用不锈钢制筛区分尺寸，从而得到了25～53μm、53～106μm、106～180μm的未交联嵌段物。然后，在减压下在160℃下实施热交联(实施了交联时间为8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时这六种)来得到了生物相容性高分子嵌段物(CBE3嵌段物)。
以下，将实施了48小时交联的条件A的多孔体来源嵌段物称为E，将实施了48小时交联的条件B的多孔体来源嵌段物称为F。E及F为由通过温差小的冷冻工序制造的多孔体制成的温差小的嵌段物。另外，未发现交联时间的不同在本申请的评价中影响性能，因此以下以实施了48小时交联的嵌段物为代表而使用。并且，在E及F中未发现性能差异。以下，还将在实施例3中得到的生物相容性高分子嵌段物称为“花瓣状嵌段物”。以下的实施例4～7中，使用了在条件A、尺寸53～106μm、交联时间48小时下制作的生物相容性高分子嵌段物。
[实施例4]生物相容性高分子嵌段物的振实密度测定
振实密度为表示能够向某一体积紧密地填充多少嵌段物的值，且值越小，则越无法紧密地填充，即可以说嵌段物的结构复杂。如下测定了振实密度。首先，准备在容器的前端带帽部(直径6mm、长度21.8mm的圆筒状：容量0.616cm3)的容器，并仅测定了帽部的质量。然后，向容器贴合帽部，并以嵌段物残留于帽部的方式从容器流入。添加充分量的嵌段物之后，在桌子等较硬的部位对帽部部分敲击200次来卸下容器，并用刮刀刮平。在刮平并装满该帽部的状态下测定质量。通过从仅帽部的质量之差计算仅嵌段物的质量，并除以帽部的体积而能够求出振实密度。
其结果，实施例3的生物相容性高分子嵌段物的振实密度为98mg/cm3。
[实施例5]生物相容性高分子嵌段物的交联度测定
计算出在实施例3中交联的嵌段物的交联度(每一分子的交联数)。测定利用了TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法。
＜样品制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(10mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上来作为样品。
＜空白培养基制备＞
向玻璃小瓶添加样品(约10mg)、4质量％的NaHCO3水溶液(1mL)及1质量％的TNBS水溶液(2mL)，紧接着加入37质量％的盐酸(3mL)，在37℃下将混合物摇晃了3小时。然后，加入37质量％的盐酸(7mL)及纯水(5mL)之后，在37℃下将混合物静置16小时以上来作为空白培养基。
对用纯水稀释了10倍的样品及空白培养基的吸光度(345nm)进行测定，并从以下(式2)及(式3)计算出交联度(每一分子的交联数)。
(式2)(As-Ab)/14600×V/w
(式2)表示每1g重组肽的赖氨酸量(摩尔当量)。
(式中，As表示样品吸光度，Ab表示空白培养基吸光度，V表示反应液量(g)，w表示重组肽质量(mg)。)
(式3)1-(样品(式2)/未交联重组肽(式2))×34
(式3)表示每一分子的交联数。
其结果，实施例3的生物相容性高分子嵌段物的交联度为4.2。
[实施例6]生物相容性高分子嵌段物的吸水率测定
计算出在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物的吸水率。
在25℃下，在3cm×3cm的尼龙网孔制袋中，填充约15mg的生物相容性高分子嵌段物，并使其在2小时的离子交换中膨润之后，风干了10分钟。在每个阶段测定质量，并根据(式4)求出了吸水率。
(式4)
吸水率＝(w2-w1-w0)/w0
(式中，w0表示吸水前的材料的质量，w1表示吸水后的空袋的质量，w2表示吸水后的包含材料的袋整体的质量。)
其结果，实施例3的嵌段物的吸水率为786％。
[实施例7]由多种细胞组成的细胞结构体(镶嵌细胞块)的制作
以成为下述表1中所记载的比率的方式，将在培养基中对第一细胞与第二细胞进行混合而成的细胞悬浮液在培养基中调整成细胞的合计浓度成为1×105cells/mL。作为培养基，使用了第二细胞培养用培养基，但即使在第一细胞培养的培养基中进行，所得到的结论也没有改变。MSC用培养基使用了Lonza公司的MSCGM BulletKitTM。NHDF用培养基使用了Lonza公司的FGMTM-2BulletKitTM。BdSMC用培养基使用了Lonza公司的SmGMTM-2BulletKitTM。HUVEC用培养基使用了Lonza公司的EGMTM-2or EGMTM BulletKitTM。
以成为0.1mg/mL的方式向上述细胞悬浮液添加了在实施例3中制作的生物相容性高分子嵌段物(53-106μm)。将在上述中得到的混合物200μL播种到SUMILONCELLTIGHT X96U微孔板(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.，底为U字型)，用台式微孔板离心机进行离心(600g、5分钟)，并静置29小时，由此制作了由花瓣状嵌段物和两种细胞组成的镶嵌细胞块(每一细胞为0.001μg的生物相容性高分子嵌段物)。从U字底阱上观察了该29小时的经时变化。由于从上观察，因此在形成球状镶嵌细胞块的过程中，从上看到的细胞块的面积逐渐变小(进一步立体化)。从上观察该经时变化并将所拍摄的照片示于图4、图6、图8、图10及图12。测定该细胞块的面积，将进行了圆换算时的直径设为纵轴，将经过时间设为横轴的图表示于图5、图7、图9、图11及图12。
照片的圆形越变小，表示镶嵌细胞块的形成越快速进行。图表中，纵轴的直径越快速变小，表示镶嵌细胞块的形成越快速进行。
作为镶嵌细胞块形成快速进行的指标，还能够考虑将在29小时(hr)以内从上部观看时是否在1.5mm直径内，或者是否能够从仅制作了第一细胞的尺寸形成小0.5mm以上的尺寸的情况作为指标。
另外，在本实施例中制作的镶嵌细胞块的直径均为1.0mm以上且3.0mm以下。
另外，若考虑在本实施例中所使用的细胞的增长速度，则1小时至29小时为止的培养后的镶嵌细胞块中的第一细胞与第二细胞的细胞数的比率分别与细胞悬浮液中的第一细胞与第二细胞的细胞数的比率(表1中所记载的比率)实质上相等。
在图4及图5中，作为第一细胞使用HepG2细胞(人肝癌来源细胞)，作为第二细胞使用hMSC(人骨髓来源间充质干细胞)来形成镶嵌细胞块的情况下，与HepG2细胞单独(100％)形成的情况相比，通过混合10％的hMSC观察到镶嵌细胞块的形成的加速。并且，通过将hMSC的细胞数的比率增加20％、30％，进一步加速了镶嵌细胞块的形成。另一方面，即使将hMSC的细胞数的比率增加至40％、50％左右，与上述比率为30％的情况相比，未发现镶嵌细胞块的形成明显加速，且还得知在该细胞的组合中添加30％左右的hMSC也未得到充分的加速。
图6及图7中，作为第一细胞使用HepG2细胞，作为第二细胞使用NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)来形成镶嵌细胞块的情况下，与HepG2细胞单独(100％)形成的情况相比，通过混合10％的NHDF观察到镶嵌细胞块的形成的加速。并且，还得知通过将NHDF的细胞数的比率增加至10％、20％、30％、40％、50％，镶嵌细胞块的形成的加速得以增加。得知在该细胞的组合中越添加NHDF，则镶嵌细胞块的形成的加速越增加。
图8及图9中，观察到与HUVEC细胞单独(100％)形成时相比，作为第一细胞而使用HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)，且作为第二细胞而使用hMSC来形成镶嵌细胞块时，通过将hMSC混合10％而镶嵌细胞块的形成得以加速。
图10及图11中，观察到与HUVEC细胞单独(100％)形成的情况相比，作为第一细胞而使用HUVEC细胞，且作为第二细胞而使用NHDF(正常人皮肤成纤维细胞)来形成镶嵌细胞块时，通过将NHDF混合10％或20％以上而镶嵌细胞块的形成得以加速。
图12中，观察到与HUVEC细胞单独(100％)形成的情况相比，作为第一细胞而使用HUVEC细胞，且作为第二细胞而使用BdSMC(正常人膀胱平滑肌细胞)来形成镶嵌细胞块时，通过将BdSMC混合20％而镶嵌细胞块的形成得以加速。
如上述，明确了通过对单独的镶嵌细胞块形成较慢的细胞添加某种细胞，预想之外地能够对包含高分子嵌段物的状态下的镶嵌细胞块形成进行加速。
表1
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 细胞结构体及细胞结构体的制造方法
<130> 16F00478
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 571
<212> PRT
<213> Recombinant
<400> 1
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly
1 5 10 15
Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
50 55 60
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro
85 90 95
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
100 105 110
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
115 120 125
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro
130 135 140
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly
145 150 155 160
Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala
165 170 175
Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro
180 185 190
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly
195 200 205
Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp
210 215 220
Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
225 230 235 240
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
245 250 255
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg
275 280 285
Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly
290 295 300
Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu
305 310 315 320
Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro
325 330 335
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
340 345 350
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro
370 375 380
Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly
385 390 395 400
Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro
405 410 415
Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro
420 425 430
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
435 440 445
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
450 455 460
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala
465 470 475 480
Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
485 490 495
Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro
500 505 510
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
515 520 525
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
530 535 540
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
545 550 555 560
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
565 570
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 2
Arg Glu Asp Val
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 3
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 4
Pro Asp Ser Gly Arg
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 5
Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 6
Leu Gly Thr Ile Pro Gly
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 7
Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 8
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 9
Asp Gly Glu Ala
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: adhesive sequence
<400> 10
Glu Arg Gly Asp
1
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.(修改后)一种细胞结构体的制造方法，所述细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和两种以上的细胞，且在多个所述细胞之间的间隙配置有多个所述生物相容性高分子嵌段物，其中，
所述两种以上的细胞包含选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞，
所述细胞结构体的制造方法包括对所述生物相容性高分子嵌段物与所述含有两种以上的细胞的培养液的混合物进行孵育。
2.(修改后)根据权利要求1所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述第一细胞与所述第二细胞的细胞数的比率为9:1～1:99。
3.(修改后)根据权利要求1或2所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物的大小为10μm以上且300μm以下。
4.(修改后)根据权利要求1至3中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，
厚度或直径为400μm以上且3cm以下。
5.(修改后)根据权利要求1至4中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物的振实密度为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下。
6.(修改后)根据权利要求1至5中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物中，交联有生物相容性高分子。
7.(修改后)根据权利要求6所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物的交联度为2以上，并且所述生物相容性高分子嵌段物的吸水率为300％以上。
8.(修改后)根据权利要求1至7中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物为通过对含有生物相容性高分子的固体物质进行粉碎而得到的生物相容性高分子嵌段物。
9.(修改后)根据权利要求8所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述固体物质为对含有生物相容性高分子的水溶液进行冷冻干燥而得到的固体物质。
10.(修改后)根据权利要求1至9中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，
每一个细胞含有0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
11.(修改后)根据权利要求1至10中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
12.(修改后)根据权利要求11所述的细胞结构体的制造方法，其中，
重组明胶由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
13.(修改后)根据权利要求11或12所述的细胞结构体的制造方法，其中，
重组明胶为如下中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
14.(修改后)根据权利要求1至13中任一项所述的细胞结构体的制造方法，其中，
所述第一细胞为血管内皮细胞或肝细胞，所述第二细胞为成纤维细胞、平滑肌细胞或间充质干细胞。
15.(删除)
16.(删除)

Claims (16)

1.一种细胞结构体，该细胞结构体包含生物相容性高分子嵌段物和两种以上的细胞，且在多个所述细胞之间的间隙配置有多个所述生物相容性高分子嵌段物，其中，
所述两种以上的细胞包含选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞结构体，其中，
所述第一细胞与所述第二细胞的细胞数的比率为9:1～1:99。
3.根据权利要求1或2所述的细胞结构体，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物的大小为10μm以上且300μm以下。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞结构体，其中，
厚度或直径为400μm以上且3cm以下。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞结构体，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物的振实密度为10mg/cm3以上且500mg/cm3以下。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞结构体，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物中，交联有生物相容性高分子。
7.根据权利要求6所述的细胞结构体，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物的交联度为2以上，并且所述生物相容性高分子嵌段物的吸水率为300％以上。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞结构体，其中，
所述生物相容性高分子嵌段物为通过对含有生物相容性高分子的固体物质进行粉碎而得到的生物相容性高分子嵌段物。
9.根据权利要求8所述的细胞结构体，其中，
所述固体物质为对含有生物相容性高分子的水溶液进行冷冻干燥而得到的固体物质。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞结构体，其中，
每一个细胞含有0.0000001μg以上且1μg以下的生物相容性高分子嵌段物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的细胞结构体，其中，
生物相容性高分子为重组明胶。
12.根据权利要求11所述的细胞结构体，其中，
重组明胶由下述式表示，
式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B
式中，A表示任意氨基酸或氨基酸序列，B表示任意氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数，另外，n个Gly-X-Y可以彼此相同，也可以不同。
13.根据权利要求11或12所述的细胞结构体，其中，
重组明胶为如下中的任一个：
由序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
由序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、替换或添加有一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽；或
由与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列组成，并且具有生物相容性的肽。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞结构体，其中，
所述第一细胞为血管内皮细胞或肝细胞，所述第二细胞为成纤维细胞、平滑肌细胞或间充质干细胞。
15.一种细胞结构体的制造方法，该细胞结构体为权利要求1至14中任一项所述的细胞结构体，该制造方法包括对生物相容性高分子嵌段物与含有两种以上的细胞的培养液的混合物进行孵育，其中，
所述两种以上的细胞包含选自包括血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、角膜上皮细胞及视网膜色素上皮细胞的组中的至少一种第一细胞和选自包括间充质细胞、基质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞、脂肪来源干细胞及脐带来源干细胞的组中的至少一种第二细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，
所述含有两种以上的细胞的培养液中的所述第一细胞与所述第二细胞的细胞数的比率为9:1～1:99。
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