CN104717987A - 工程化的三维结缔组织构建体及其制备方法 - Google Patents

工程化的三维结缔组织构建体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了包含结缔组织细胞的工程化的、活的三维结缔组织构建体。在一些实施方案中，该结缔组织细胞源自多能细胞，如间充质干细胞/基质细胞。在一些实施方案中，这些细胞彼此凝聚。在一些实施方案中，已将多能细胞暴露于一种或多种分化信号以提供活的三维结缔组织构建体。在一些实施方案中，该构建体在使用时基本上不含预形成的支架。本文还公开了用于移植的植入物、用于体外实验的结缔组织构建体阵列，及它们的制备方法。

Description

工程化的三维结缔组织构建体及其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年6月19日提交的美国申请序列号61/661,768的权益，并且是2013年3月13日提交的美国申请序列号13/801,780的继续申请，二者均通过引用整体并入本文。
背景技术
医疗行业面临着许多紧迫的问题。截至2012年6月，有114,636名患者因需要器官移植而在器官分享联合网络(United Network forOrgan Sharing，UNOS)上登记。根据UNOS，在2012年1月至3月之间，只进行了6,838例移植。与进行的移植相比，每年有更多的患者加入UNOS名单，导致等待移植的患者人数净增长。
此外，一种新的药物化合物的研发成本约为18亿美元。参见Paul等(2010).How to improve R&D productivity:the pharmaceutical industry'sgrand challenge，Nature Reviews Drug Discovery 9(3)：203-214。药物发现是发现和/或设计药物的过程。药物发现的过程通常至少包括以下步骤：确认候选物、合成、表征、筛选和分析治疗效果。虽然在技术上和对生物系统的了解上有所进展，但药物发现仍旧是一个冗长、昂贵且低效的过程，且新治疗剂发现率较低。
发明内容
在一方面，本文公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体，其包含：彼此凝聚以提供活的三维结缔组织构建体的结缔组织构建细胞；其中该构建体基本不含预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体在使用时基本不含预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。在一些实施方案中，该结缔组织细胞包含在体外源自多能细胞的结缔组织细胞。在一些实施方案中，该多能细胞包含以下一种或多种：组织特异性祖细胞、间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在其他实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物骨髓。在又一些实施方案中，该多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在构建体的制造之前将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在构建体的制造期间将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在构建体的制造之后将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该构建体是生物打印的。在进一步的实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对于生物打印的适用性。在一些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在一些实施方案中，所述构建体进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、干细胞/祖细胞、免疫细胞。在一些实施方案中，该构建体基本上是片、块(patch)、环、管、立方体、多面体或球体的形式。在一些实施方案中，该构建体基本上是模拟天然人类结缔组织在体内的形状或架构的形状的形式。在一些实施方案中，该构建体用于植入受试者的损伤、病变或退化部位。在一些实施方案中，该构建体进一步包含一种或多种离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在进一步的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。
在另一方面，本文公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体的阵列，每种构建体均通过包括以下步骤的过程来制造：将多能细胞暴露于一种或多种分化信号以提供活的三维结缔组织构建体；其中每种结缔组织构建体基本不含预形成的支架；其中每种结缔组织构建体均在培养物中保持。在一些实施方案中，每种构建体在使用时基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，每种构建体均是不受神经支配的。在一些实施方案中，所述多能细胞包含以下一种或多种：组织特异性祖细胞、间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在其他实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物骨髓。在又一些实施方案中，该多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在构建体的制造之前将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在构建体的制造期间将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在构建体的制造之后将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，每种构建体均是生物打印的。在一些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在一些实施方案中，所述构建体进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：内皮细胞、成纤维细胞、干细胞/祖细胞、周细胞、卫星细胞或血管细胞。在一些实施方案中，一种或多种结缔组织构建体是包含一种或多种结缔组织的复合组织构建体。在进一步的实施方案中，一种或多种结缔组织构建体是包含结缔组织和非结缔组织的复合组织构建体。在更进一步的实施方案中，一种或多种结缔组织构建体是包含骨组织和非结缔组织的复合组织构建体。在一些实施方案中，所述阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，该阵列用于以下一种或多种：药物发现、药物检测、毒理学检测、疾病建模、三维生物学研究和细胞筛选。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或物理信号，或它们的组合。在一些实施方案中，一种或多种构建体进一步包含一种或多种离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在进一步的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。
在另一方面，本文公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，其包括：孵育包含已沉积到支持体上并暴露于一种或多种分化信号的多能细胞的生物墨水，从而允许该生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天。在一些实施方案中，该多能细胞包含以下一种或多种：间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在其他实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物骨髓。在又一些实施方案中，该多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在将生物墨水沉积到支持体上之前约1-21天至将生物墨水沉积到支持体上之后约1-21天之间的一个或多个时间间隔时，将结缔组织细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，生物墨水通过生物打印而沉积。在一些实施方案中，所述构建体在使用时基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。在一些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在一些实施方案中，生物墨水进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、干细胞/祖细胞、免疫细胞。在一些实施方案中，生物墨水进一步包含挤出化合物。在一种实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或物理信号，或它们的组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括沉积一种或多种离散的填料体的步骤，每种填料体均包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在进一步的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过将构建体在空间上限制在生物相容性表面之上或之内而将多个活的三维结缔组织构建体组装为阵列的步骤。在一些实施方案中，该构建体适合于植入受试者的损伤、病变或退化部位。
在另一方面，本文公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法包括以下步骤：制备包含多能细胞的生物墨水；将生物墨水沉积到支持体上；并孵育生物墨水以允许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天；条件是将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该多能细胞包含下列一种或多种：间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。在一些实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。在其他实施方案中，该多能细胞源自哺乳动物骨髓。在又一些实施方案中，该多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在将生物墨水沉积到支持体上之前约1-21天至将生物墨水沉积到支持体上之后约1-21天之间的一个或更多时间间隔时，将结缔组织细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该生物墨水通过生物打印而沉积。在一些实施方案中，所述构建体在使用时基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是不受神经支配的。在一些实施方案中，所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、干细胞/祖细胞、免疫细胞。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含挤出化合物。在一种实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或物理信号，或它们的组合。在一种实施方案中，该方法进一步包括沉积一种或多种离散的填料体的步骤，每种填料体均包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在进一步的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过将构建体在空间上限制在生物相容性表面之上或之内而将多个活的三维结缔组织构建体组装为阵列的步骤。在一些实施方案中，该构建体适合于植入受试者的损伤、病变或退化部位。
附图说明
在所附权利要求书中详细阐明了本发明的新颖特征。通过参考以下对其中利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的发明详述和附图，将会获得对本发明特征和优点的更好的理解，附图中：
图1示出了干细胞分化的非限制性示例性时程；在这种情况下，分化的时程表明分化前、围分化(peri-differentiation)、分化后阶段，其中干细胞与成骨分化培养基相接触而被孵育。
图2A是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的图像；在这种情况下，示出了在分化培养基中培养的生物打印的MSC构建体的原位碱性磷酸酶染色。该图证明了暴露于分化培养基的构建体中碱性磷酸酶的表达。
图2B是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的图像；在这种情况下，示出了在基础MSC培养基中培养的生物打印的MSC构建体的原位碱性磷酸酶染色。在暴露于基础MSC培养基的构建体中未观察到碱性磷酸酶的表达。
图2C是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的20x显微照片；在这种情况下，生物打印的MSC构建体在打印后立即在分化培养基中培养并使用茜素红S进行染色以识别钙沉积物。
图2D是示出了生物打印的MSC构建体的非限制性实例的20x显微照片；在这种情况下，生物打印的MSC构建体在打印后立即在基础MSC培养基中培养并使用茜素红S进行染色。在暴露于基础MSC培养基的构建体中未观察到钙沉积物。
图3是在生物打印后在分化培养基中孵育5天后，福尔马林固定、石蜡包埋的MSC构建体的组织切片免疫荧光染色的非限制性显微照片，检测骨桥蛋白的表达，其指示MSC分化和骨生成。
图4A和4B是示出了含有间充质干细胞的构建体的20x显微照片，该构建体是生物打印的并在成骨分化培养基或仅在基础间充质干细胞培养基中培养的。利用生物打印的构建体的组织学碱性磷酸酶染色来检测成骨细胞活性。图4A显示在仅暴露于基础间充质干细胞培养基的构建体中没有或几乎没有碱性磷酸酶的表达。而图4B显示了在暴露于成骨分化培养基的构建体中碱性磷酸酶的表达。
发明详述
在2008年初，有75,834人登记需要肾脏；在该年年底，这个数字已经增长到80,972。当年进行了16,546例肾脏移植，但该名单中增加了33,005名新的患者。UNOS登记需要肾脏的患者在2008年的移植率为20％。等待名单中的患者的死亡率为7％。此外，许多个体患有移植并不是其当前的医疗模式的慢性退行性疾病。因此，活的功能性结缔组织(骨、腱、韧带等)将具有巨大的临床价值。对促进再生医学和组织工程技术应用于缓解对可植入组织和器官的迫切需求的材料、工具和技术存在需求。更具体地说，对适用于创伤修复、组织修复、组织增大、器官修复和器官置换的可植入组织和器官存在需求。同样重要的是，对能大大增加创新的、成本有效的新药的数量和质量而不造成不可持续的研究和开发成本的材料、工具和技术存在需求。
先前的模型集中在通过将细胞接种到三维支架材料上来提供工程化的组织构建体，该三维支架材料是预形成的并且成形为适应预期应用。接种到支架材料上的细胞曾经是原代细胞、细胞系、工程化细胞和/或干细胞/祖细胞。当利用多能干细胞或祖细胞时，它们或者在接种到三维支架材料上之前在二维单层培养中经历分化程序，或者首先被接种到支架材料上并随后在原位或在体外经历分化程序以产生期望的组织。就细胞产率、细胞在构建体内进行终末分化所需的时间以及所得三维结构的总细胞性而言，传统方法既费力又低效。
本发明涉及再生医学和组织工程学领域。更具体地说，本发明涉及活的三维结缔组织构建体、其阵列和制造方法。结缔组织构建体可用作可植入/治疗装置，或作为用于体外实验(即，药物开发、化合物筛选、毒理学和疾病建模)的阵列化组织构建体。
在某些实施方案中，本文公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体，其包含：彼此凝聚以提供活的三维结缔组织构建体的结缔组织细胞；其中该构建体基本上不含预形成的支架。
在某些实施方案中，本文还公开了工程化的、活的三维结缔组织构建体阵列，每种构建体均通过包括以下步骤的过程来制造：将多能细胞暴露于一种或多种分化信号以提供活的三维结缔组织构建体；其中每种构建体基本上均不含预形成的支架；其中每种结缔组织均在培养物中保持。
在某些实施方案中，本文还公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法包括：孵育包含已沉积在支持体上并暴露于一种或多种分化信号的多能细胞的生物墨水，从而允许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天。
在某些实施方案中，本文还公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法包括以下步骤：制备包含多能细胞的生物墨水；将生物墨水沉积到支持体上；并孵育生物墨水以允许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天；条件是将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
某些定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指代，除非上下文另有明确规定。本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有说明。
如本文中使用的，“阵列”是指一种科学工具，其包括多个空间排布的元件的关联(association)，以允许在一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或兼具两者。
如本文中使用的，“分析(assay)”是指测试或测量物质(例如化学品、分子、生物化学品、蛋白质、激素或药物等)在有机或生物样品(例如细胞聚集体、组织、器官、生物体等)中的存在或活性的程序。
如本文中使用的，“生物相容性的(biocompatible)”是指对细胞造成伤害或毒性的风险有限。如在说明书和权利要求书中所呈现的，“生物相容性多孔容器”和“生物相容性膜”对哺乳动物细胞造成伤害或毒性的风险有限，但该定义并未延伸到隐含了这些生物相容性元件可以被体内植入到哺乳动物体中。
如本文中使用的，“生物打印”是指：经由与自动化的、计算机辅助的三维原型装置(例如生物打印机)相匹配的方法，利用细胞(例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体、多细胞体等)的三维精确沉积。
如本文中使用的，“凝聚(cohere)”、“凝聚的(cohered)”和“凝聚(cohesion)”是指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。这些术语可以与“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。
如本文中使用的，“多能细胞”是指能够经历分化成为两种或更多种细胞类型的细胞。多能细胞包括，例如，间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。
如本文中使用的，“间充质干细胞/基质细胞”是指多能细胞的具体类型，其潜在地分化成多种细胞类型并表现出本文中进一步描述的性质和特征。在一些实施方案中，术语“间充质干细胞”和“间充质基质细胞”可与“间充质干细胞/基质细胞”互换使用。
如本文中使用的，“支架”是指：合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层和脱细胞的组织；以及任何下述其他类型的预形成的支架：其对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是重要的，并且不能在不损坏/破坏组织和/或器官的情况下从该组织和/或器官中除去。因此，术语“无支架的(scaffoldless)”意在隐含了在使用时，支架不是工程化组织整体的一部分，或者已经被除去或者作为工程化组织的惰性组分而保留。“无支架的(Scaffoldless)”可以与“不含支架的(scaffold-free)”和“不含预形成的支架的”互换使用。
如本文中使用的，“受试者”是指可为人、非人的动物、任意哺乳动物或任意脊椎动物的任意个体。该术语可以与“患者”、“接受者”和“供体”互换。
如本文中使用的，“组织”是指细胞的聚集体。组织的实例包括但不限于：结缔组织(例如，网形结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、外胚层组织、内胚层组织或中胚层组织。
组织工程化
组织工程化是一个跨学科的领域，其应用并结合了工程学和生命科学的原理进行生物替代品的开发，该生物替代品通过器官的增大(augmentation)、修复或替换来恢复、保持或改善组织功能。经典组织工程学的基本方法是将活细胞接种到生物相容且最终可生物降解的环境(例如支架)中，随后在生物反应器中培养该构建体，以使得初始细胞群体可进一步扩充和成熟，以在植入后生成目标组织。采用模拟该生物细胞外基质(ECM)的适当支架，发育中的组织在体外和体内成熟之后可获取所需器官的形式和功能。然而，由于控制细胞在整个支架上的分布和空间布置的能力有限，达到足够高的细胞密度并具有类似于天然组织的架构是具有挑战性的。这些限制可导致组织或器官具有较差的机械性能和/或不足的功能。在支架的生物降解性、残留聚合物的夹杂和制造工艺的工业规模化方面，存在额外的挑战。已经尝试了无支架的方法。目前的无支架方法受到数种限制：
·复杂的几何形状(例如多层结构，其中各层包含不同的细胞类型或包含在空间上受限制的特定细胞区室)可能需要将细胞类型在特定的架构中进行明确的、高分辨率的放置，以便可再现地获得类似于天然组织的结果。
·规模和几何形状受到扩散和/或营养供给需要功能性血管网络的限制。
·组织的存活力可受到限制材料的损害，该限制材料限制了扩散并限制细胞获得营养物。
在某些实施方案中，本文公开了工程化组织、工程化结缔组织构建体、其阵列以及制造方法。本文公开的组织工程化方法具有下列优点：
·它们能使用大量复杂的三维拓扑学产生包含细胞的组织和/或器官。
·它们通过利用发育生物学的原理来模拟天然组织形成过程的环境条件。
·它们与自动化制造手段相匹配，并且是可规模化的。
生物打印使得能够改善生成包含细胞的可植入组织的方法，所述可植入组织可用于组织修复、组织增大和组织替换。生物打印进一步使得能够改善生成微小规模组织类似物(包括对体外分析有用的那些)的方法。
生物打印
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)及其阵列的至少一种组分是生物打印的。在进一步的实施方案中，工程化组织整个是生物打印的。在更进一步的实施方案中，生物打印的构建体是采用使用了快速原型技术的方法制成的，该快速原型技术是基于通过三维递送装置(例如生物打印机)将细胞和任选的限制材料向生物相容性表面(例如由水凝胶和/或多孔膜构成的)上进行三维、自动化、计算机辅助的沉积，该细胞包括细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或糊料、细胞浓缩物、多细胞体(例如圆柱体、球形体、带形体等)(统称为“生物墨水”)。如本文中使用的，在一些实施方案中，在用于指代组织和/或器官时，术语“工程化的”是指：根据计算机脚本，通过计算机辅助的装置(例如生物打印机)，将细胞、细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或糊料、细胞浓缩物、多细胞聚集体(例如，生物墨水)和它们的层放置以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本例如是一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在更进一步的实施方案中，通过细胞或生物墨水的打印后融合来形成三维组织结构，这类似于早期形态发生中的自组装现象。
尽管有许多方法可以用来将细胞、生物墨水(例如，多细胞体)和/或它们的层布置在生物相容性表面上以产生三维结构(包括手动放置)，但通过自动化的、计算机辅助的仪器(例如生物打印机)来放置是有利的。采用这种技术递送细胞或多细胞体的优点包括：快速、精确和可再现地放置细胞或生物墨水(例如，多细胞体)以产生构建体，该构建体表现出具有各种组成的细胞、生物墨水(例如，多细胞体)和/或它们的层的计划的或预先确定的取向或图案。优点还包括确定的高细胞密度，同时使细胞破坏减至最小。
在一些实施方案中，生物打印方法是连续的和/或基本连续的。连续生物打印方法的非限制性实例是：经由连接到生物墨水储存器的分配末端(例如，注射器、毛细管等)从生物打印机分配生物墨水。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是按功能单元的重复图案(pattern)分配生物墨水。在各个实施方案中，重复功能单元具有任何适宜的几何形状，包括例如：圆形、正方形、矩形、三角形、多边形和不规则的几何形状。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的一个重复图案包括一个层，相邻地生物打印(例如堆叠)多个层以形成工程化组织或器官。在各个实施方案中，相邻地生物打印(例如堆叠)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化组织或器官。
在一些实施方案中，生物打印的功能单元以棋盘格状图案重复。“棋盘格状图案”是没有重叠和间隙而填充平面的图形平面。连续和/或棋盘格状生物打印的优点可包括提高的生物打印组织的生产率。另一个非限制性的潜在优点可以是不需要将生物打印机与先前沉积的生物墨水元件对准。连续生物打印还可有利于(任选地使用注射器机构)从大型生物墨水储存器打印较大的组织。
连续生物打印中的方法可包括：独立地或相对于彼此优化和/或平衡多个参数，诸如打印高度、泵速、机器人速度或其组合。在一个实例中，用于沉积的生物打印机头速度为3mm/s，第一层的分配高度为0.5mm，而后面每个层的分配高度增加0.4mm。在一些实施方案中，该分配高度与生物打印机分配末端的直径基本相等。不受限制地，适宜的和/或最佳的分配距离不会导致材料变平或附着到分配针上。在各个实施方案中，生物打印机分配末端具有约20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000μm或更大的内径，包括其中的增量。在各个实施方案中，生物打印机的生物墨水储存器具有约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容积，包括其中的增量。当系统中的残余压力积累较低时，该泵速可以是适宜的和/或最佳的。有利的泵速可取决于储存器的横截面积与分配针之间的比例，该比例越大，则需要越低的泵速。在一些实施方案中，适宜的和/或最佳的打印速度使得能够沉积均匀的线，而不影响材料的机械完整性。
本文中公开的发明包括商业方法。在一些实施方案中，本文中公开的技术和方法的速度和可扩展性用来设计、构建和操作工业和/或商业设施，该设施用于生产供植入的工程化组织和/或器官，或者用于生成基于细胞的工具以供研究和开发，例如体外分析。在进一步的实施方案中，工程化组织和/或器官及其阵列作为例如用于创伤修复、组织修复、组织增大、器官修复和器官置换的可植入组织被生产、储存、分发、上市、宣传并销售。在更进一步的实施方案中，工程化组织和/或器官及其阵列作为例如用于生物分析和高通量药物筛选的细胞阵列(例如，微阵列或芯片)、组织阵列(例如，微阵列或芯片)和试剂盒而被生产、储存、分发、上市、宣传并销售。在其他实施方案中，生产工程化组织和/或器官及其阵列并用其进行作为服务的生物分析和/或药物筛选。
包括结缔组织构建体的工程化组织
在一些实施方案中，本文公开了活的三维组织构建体，其包含：彼此凝聚的结缔组织细胞；其中该构建体基本上不含预形成的支架。在进一步的实施方案中，该构建体在制造时和/或在使用时基本上不含预形成的支架。在一些实施方案中，该组织是结缔组织构建体。因此，在一些实施方案中，本文还公开了活的三维结缔组织构建体，其包含：彼此凝聚以提供活的三维结缔组织构建体的结缔组织细胞；其中该构建体在使用时基本上不含预形成的支架。在一些实施方案中，该结缔组织细胞源自多能细胞，例如间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和/或胚胎干细胞。
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织)是生物打印的(本文所述的方法)。在进一步的实施方案中，该组织在打印时和/或在使用时基本上不含任何如本文进一步描述的预形成的支架。在一些实施方案中，作为通过组织工程化技术(包括生物打印)制造的结果，本发明的组织进一步区别于作为生物体的一部分在体内发育的组织。在一些实施方案中，本文所述的工程化组织的特征在于与作为生物体的一部分在体内发育的组织之间存在结构和架构的差异。作为非限制性的实例，在一些实施方案中，本文所述的工程化组织是不受神经支配的或缺乏功能性神经系统的。作为进一步的非限制性实例，在一些实施方案中，本文所述的工程化组织缺乏功能性免疫系统。作为进一步的非限制性实例，在一些实施方案中，本文所述的工程化组织缺乏血液成分。
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织)包含任何类型的哺乳动物细胞。在各个进一步的实施方案中，该组织(包括结缔组织)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种细胞类型。在一些实施方案中，该组织包含干细胞。在进一步的实施方案中，该组织包含多能细胞，如间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和/或胚胎干细胞。
在一些实施方案中，一些或全部多能细胞(例如，间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞、胚胎干细胞等)在组织的制造时是未分化且多能的。在进一步的实施方案中，一些或全部多能细胞在组织制造时在一定程度上部分地向一种或多种组织特异性表型分化，该表型与例如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞一致。在进一步的实施方案中，一些或全部多能细胞在组织制造时完全分化为一种或多种组织特异性表型，该表型与例如骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞一致。
在一些实施方案中，已将多能细胞(例如，间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞、胚胎干细胞等)暴露于一种或多种分化信号以提供活的三维结缔组织构建体。在各个实施方案中，在沉积生物墨水以形成组织构建体之前、期间或之后的一个或多个时间间隔时，已将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在使用细胞制备生物墨水前，已将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在使用生物墨水制造组织前，已将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在使用生物墨水制造组织后，将多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
在其他实施方案中，所述组织进一步包括，例如，哺乳动物内皮细胞和/或哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织)的细胞彼此“凝聚”或“粘附”。在进一步的实施方案中，“凝聚”和“粘附”是指将细胞和生物墨水(例如，多细胞聚集体、多细胞体，等等)和/或它们的层结合的细胞-细胞粘附性质。
在各个实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)为任意合适的尺寸。在一些实施方案中，生物打印的组织(包括结缔组织构建体)的尺寸随时间而变化。在进一步的实施方案中，在生物打印后，由于例如细胞迁移、细胞死亡、细胞间相互作用、压缩或其他形式的收缩，生物打印的组织收缩或缩小。在其他实施方案中，在生物打印后，由于例如细胞迁移、细胞生长和繁殖、细胞成熟或其他形式的扩展，生物打印的组织生长或扩展。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)的物理尺寸受到营养物(包括氧)向构建体内部扩散的能力的限制。在各个实施方案中，在生物打印时，该工程化组织(包括结缔组织构建体)在其最小维度上为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μm，包括其中的增量。在各个实施方案中，在生物打印时，该工程化组织(包括结缔组织构建体)在其最小维度上为至少约0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75或5.0mm，包括其中的增量。在进一步的实施方案中，在生物打印时，该工程化组织(包括结缔组织构建体)在其最小维度上为约50μm至约500μm。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)的物理维度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500mm宽，包括其中的增量。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)的物理维度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500mm长，包括其中的增量。
在各个实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)为任意合适的形状。在一些实施方案中，选择形状以模拟特定的天然组织或器官。在进一步的实施方案中，选择形状以模拟特定的病理学、状况或疾病状态。在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)具有基本上为平面的形状。在进一步的实施方案中，平面组织具有任何适宜的平面几何形状，作为非限制性的示例，包括正方形、矩形、多边形、圆形、椭圆形或不规则形状。在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)具有基本上为片或块的形状。在一些实施方案中，该工程化组织具有基本上为管、环、圆盘或囊的形状。在进一步的实施方案中，囊是卷起的(rolled)片或管，带有一个闭合端。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)在一侧或多侧被生物相容性材料在空间上所限。在进一步的实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)附着在表面上。在进一步的实施方案中，该工程化组织附着在生物相容性表面上。在更进一步的实施方案中，如本文所述，通过附着将多个组织关联到表面上并空间排布，以形成阵列。在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)经受机械或生物机械力。在进一步的实施方案中，施加可溶性、机械或生物机械力用来促进组织的分化、成熟和发育和/或促进组织内的细胞的迁移、分化或增殖。
细胞
在一些实施方案中，本文公开了包含一种或多种类型的哺乳动物细胞的工程化结缔组织。在一些实施方案中，该组织包含结缔组织细胞。在一些实施方案中，该结缔组织细胞源自多能细胞。在进一步的实施方案中，该结缔组织细胞源自间充质干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，该结缔组织细胞源自诱导的多潜能干细胞。在进一步的实施方案中，该结缔组织细胞源自胚胎干细胞。在更进一步的实施方案中，该组织包含人多能细胞。在更进一步的实施方案中，该组织包含人间充质干细胞/基质细胞。在更进一步的实施方案中，该组织包含人诱导的多潜能干细胞。在更进一步的实施方案中，该组织包含人胚胎干细胞。
在一些实施方案中，本文还公开了包含多能细胞的活的三维组织构建体，其中多能细胞已暴露于一种或多种分化信号以产生结缔组织细胞或结缔组织相关细胞。在进一步的实施方案中，该组织进一步包含，例如，哺乳动物内皮细胞和/或哺乳动物成纤维细胞。
在一些实施方案中，工程化组织包含未分化细胞。在进一步的实施方案中，“未分化细胞”是不具有或已失去确定的组织特异性特性的细胞，例如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞或内皮细胞的组织特异性性状。在一些实施方案中，未分化细胞包括干细胞。在一些实施方案中，“干细胞”是显示出潜能和自我更新的细胞。干细胞包括但不限于全能细胞、多潜能细胞、多能细胞、寡能细胞、单能细胞和祖细胞。干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导的多潜能干细胞。在其他实施方案中，该细胞是分化细胞和未分化细胞的混合物。在一些实施方案中，工程化组织包含间充质干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，“间充质干细胞/基质细胞”是有潜在地分化为许多细胞类型并表现出本文进一步描述的性质和特征的多能细胞。在更进一步的实施方案中，术语“间充质基质细胞”可与“间充质干细胞/基质细胞”互换使用。
在一些实施方案中，间充质干细胞/基质细胞是具有多谱系间充质分化潜能的人类细胞，该潜能包括分化成成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞具有使用标准体外组织培养分化条件分化成成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的潜能。在一些实施方案中，间充质干细胞/基质细胞显示出可识别的表面抗原表达模式。在进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞表达表面抗原CD105(也称为内皮糖蛋白)、CD73(也称为胞外5’核苷酸酶)和CD90(也称为Thy-1)。在一些实施方案中，间充质干细胞/基质细胞缺乏对于可能存在于间充质干细胞培养物中的其他细胞具有特异性的表面抗原的表达。在进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞缺乏CD45(泛白细胞标记)、CD34(存在于原始造血祖细胞和内皮细胞上)、CD14和CD11b(主要在单核细胞和巨噬细胞上表达)、CD79a和CD19(B细胞的标记)以及HLA-DR的表达。在一些实施方案中，当使用组织培养瓶保持在标准培养条件下时，间充质干细胞/基质细胞显示出对塑料的粘附。在一些实施方案中，间充质干细胞/基质细胞是满足国际细胞治疗协会(ISCT)指导方针的人类细胞，该指导方针提供了“间充质干细胞”最被广泛接受的定义。参见Dominici,M.等人.Minimal criteria fordefining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Societyfor Cellular Therapy position statement.Cytotherapy(2006)Vol.8,No.4,315-317。
在一些实施方案中，合适的多能细胞(例如，干细胞)源自组织，作为非限制性的实例，包括脂肪组织、骨髓、羊水和脐带组织。在进一步的实施方案中，一些或全部干细胞源自于哺乳动物脂肪抽吸物。在一些实施方案中，合适的干细胞是源自哺乳动物脂肪组织或骨髓的间充质干细胞/基质细胞。在其他实施方案中，一些或全部间充质干细胞/基质细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在其他实施方案中，间充质干细胞/基质细胞所源自的非脂肪、非骨髓组织来源选自：血液、尿液、泌尿系统组织(膀胱、输尿管、尿道等)、肾、肺、肝、胃、肠、气管、食道、胰脏、皮肤、口腔黏膜、牙组织(牙齿、牙髓等)、软骨、骨、脑、神经、胎盘、肌肉组织、网膜、间皮、腹膜、鼻道内层或生殖系统组织(子宫、输卵管等)。
在一些实施方案中，工程化组织包含一种或多种类型的分化细胞。在进一步的实施方案中，“分化细胞”是在分离时具有组织特异性表型的细胞，该表型与例如平滑肌细胞、成纤维细胞或内皮细胞一致，其中组织特异性表型(或展示该表型的潜能)从分离时至使用时得到维持。
在一些实施方案中，任何哺乳动物细胞均适合于进一步包括在该工程化组织及其阵列中。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，该哺乳动物细胞是：收缩或肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞和软骨细胞的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化细胞(例如胚细胞、干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞和它们的组合。在包括超过一种细胞类型的实施方案中，所述细胞类型以多种合适的比例存在，其实例如本文所述。
在一个实施方案中，所述组织包含内皮细胞。在另一个实施方案中，该组织包含成纤维细胞。在另一个实施方案中，该组织包含内皮细胞和成纤维细胞。在一些实施方案中，该内皮细胞是人类内皮细胞。在一些实施方案中，合适的内皮细胞起源于组织，作为非限制性的实例，该组织包括：血液、血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，所述成纤维细胞为人类成纤维细胞。在一些实施方案中，适宜的成纤维细胞为非血管的成纤维细胞，例如皮肤成纤维细胞。在其他实施方案中，适宜的成纤维细胞源自血管外膜。在一些实施方案中，一些或所有的细胞源自哺乳动物脂肪抽吸物。在进一步的实施方案中，一些或所有的细胞是由哺乳动物脂肪抽吸物的基质血管组分培养的。
在各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标来选择、配置、处理或调整细胞的细胞类型和/或来源。在一些实施方案中，选择、配置、处理或调整一种或多种特定的细胞类型，以促进对特定疾病或状况的研究。在一些实施方案中，选择、配置、处理或调整一种或多种特定的细胞类型，以促进对特定受试者的疾病或状况的研究。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自两个或更多个不同的人类供体。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的哺乳动物受试者。在更进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的人类受试者。
培养细胞的方法
在本发明的工程化组织中使用的细胞类型可以以本领域已知的任何方式培养。细胞和组织培养方法是本领域已知的，并且例如描述在Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures；Freshney(1987),Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Techniques中，对于这些信息通过引用将其内容并入本文。在Doyle,A.,Griffiths,J.B.,Newell,D.G.,(编)Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures,Wiley(1998)中也描述了可与本发明一起使用的普通哺乳动物细胞培养技术、细胞系和细胞培养系统，对于这些信息通过引用将其内容并入本文。
适合于培养中的哺乳动物细胞的生长条件是本领域公知的。细胞培养基通常包含必需营养物和任选的附加成分，例如生长因子、盐、矿物质、维生素等，它们可根据所培养的细胞类型而选择。可选择特定的成分来加强细胞生长、分化和特定蛋白质的分泌等。通常，标准的生长培养基包括Dulbecco改良Eagle培养基，低葡萄糖(DMEM)，其含有110mg/L丙酮酸盐和谷氨酰胺，补充有10-20％的胎牛血清(FBS)、牛血清或人血清并且100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素是适当的，如同本领域技术人员公知的各种其他标准培养基。优选地，细胞在无菌条件下、在1-21％O2和优选3-5％CO2的气氛中、在接近或处于细胞来源动物体温的温度下培养。例如，人类细胞优选在约37℃下培养。关于间充质干细胞/基质细胞，合适的培养基包括在补充有L-谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM中含有5-10％(v：v)胎牛血清的基础培养基。任选地，间充质干细胞/基质细胞在氧张力小于21％氧气(相当于大气氧张力)的条件下培养和扩充。在一些实施方案中，细胞在3-5％氧气条件下培养。
细胞也可使用细胞分化剂来培养，以诱导细胞沿着所需线路分化。例如，在一些实施方案中，干细胞与分化培养基相接触地孵育以产生一系列的细胞类型。许多类型的分化培养基是合适的。在各个实施方案中，干细胞与分化培养基相接触地孵育，作为非限制性的实例，该分化培养基包括成骨分化培养基、成软骨分化培养基、成脂分化培养基、神经分化培养基、心肌细胞分化培养基和肠细胞分化培养基(例如，肠上皮)。关于间充质干细胞/基质细胞，在一些实施方案中，该细胞与分化培养基相接触地孵育，作为非限制性的实例，该分化培养基包括成骨分化培养基、成软骨分化培养基或成脂分化培养基。
此外，细胞可与生长因子、细胞因子等一起培养。在一些实施方案中，术语“生长因子”是指蛋白质、多肽或多肽的复合物，包括细胞因子，它们是由细胞产生的，并且可影响其自身和/或多种相邻的或远处的其他细胞。一般而言，生长因子或者发育性地或者响应于众多生理学或环境刺激影响特定类型的细胞的生长和/或分化。一些但不是全部生长因子是激素。示例性的生长因子是胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF，包括碱性FGF(bFGF))、血小板衍生生长因子(PDGF，包括PDGF-AA和PDGF-AB)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β，包括TGFβ1和TGFβ3)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8等。除了其他地方外，在Molecular Cell Biology,ScientificAmerican Books,Darnell等人编,1986；Principles of Tissue Engineering,第二版,Lanza等人编,Academic Press,2000中讨论了生长因子。本领域技术人员将会理解：在本文描述的条件培养基中的任何及所有培养衍生的生长因子都在本发明的范围内。
生物墨水和多细胞聚集体
在某些实施方案中，本文公开了包含生物打印的细胞的组织(包括结缔组织构建体)、其阵列和方法。在一些实施方案中，通过从生物打印机沉积或挤出生物墨水来对细胞进行生物打印。在一些实施方案中，“生物墨水”包括包含多个细胞的液体、半固体或固体组合物。
在一些实施方案中，生物墨水包含液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞浓缩物。在一些实施方案中，生物墨水包含半固体或固体的多细胞聚集体或多细胞体。在进一步的实施方案中，通过如下步骤产生生物墨水：1)以预先确定的比例，将多个细胞或细胞聚集体与生物相容性液体或凝胶混合，以形成生物墨水；和2)使该生物墨水致密化，以产生具有所需细胞密度和粘度的生物墨水。在一些实施方案中，通过离心作用、切向流过滤(“TFF”)或其组合来实现生物墨水的致密化。在一些实施方案中，生物墨水的致密化产生了可挤出的组合物，从而允许形成多细胞聚集体或多细胞体。在一些实施方案中，“可挤出的”意指能够通过被迫(例如在压力下)穿过喷嘴或孔口(例如，一个或多个洞或管)而成形。在一些实施方案中，生物墨水的致密化是由细胞生长到合适的密度而引起的。该生物墨水所需的细胞密度会随着所使用的细胞和要产生的组织或器官而变化。在一些实施方案中，该生物墨水的细胞是凝聚和/或粘附的。在一些实施方案中，“凝聚(cohere)”、“凝聚的(cohered)”和“凝聚(cohesion)”是指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。在一些实施方案中，该术语可以与“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。在一些实施方案中，该生物墨水另外包含支持材料、细胞培养基、细胞外基质(或其组分)、细胞粘着剂、细胞死亡抑制剂、抗凋亡剂、抗氧化剂、挤出化合物和它们的组合。
在各个实施方案中，所述细胞是任何合适的细胞。在进一步的各个实施方案中，所述细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞包括干细胞。在进一步的实施方案中，该干细胞是人类干细胞。在一些实施方案中，所述细胞包括间充质干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞是人类间充质干细胞/基质细胞。在一些实施方案中，本文所公开的方法中使用的细胞类型依赖于所产生的构建体或组织的类型。在一些实施方案中，所述生物墨水包含一种细胞类型。在一些实施方案中，所述生物墨水包含超过一种细胞类型。
细胞培养基
在一些实施方案中，所述生物墨水包含细胞培养基。该细胞培养基是任何合适的培养基。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，合适的细胞培养基包括：Dulbecco磷酸盐缓冲盐水、Earle平衡盐、Hanks平衡盐、Tyrode盐、Alsever溶液、Gey平衡盐溶液、Kreb's-Henseleit改良缓冲系、Kreb's-Ringer碳酸氢盐缓冲系、Puck盐水、Dulbecco改良Eagle培养基、Dulbecco改良Eagle培养基/营养F-12Ham、营养混合物F-10Ham(Ham's F-10)、培养基199、基本必需培养基Eagle、RPMI-1640培养基、Ames培养基、BGJb培养基(Fitton-Jackson改良)、Click培养基、CMRL-1066培养基、Fischer培养基、Glascow基本必需培养基(GMEM)、Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)、L-15培养基(Leibovitz)、McCoy 5A改良培养基、NCTC培养基、Swim S-77培养基、Waymouth培养基、William培养基E或它们的组合。在一些实施方案中，该细胞培养基得到改良或补充。在一些实施方案中，该细胞培养基进一步包含白蛋白、硒、转铁蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因子、激素、抗生素、脂质、脂质载体、环糊精或其组合。在一些实施方案中，该细胞培养基是干细胞分化培养基。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，该干细胞分化培养基是成骨分化培养基、成软骨分化培养基或成脂分化培养基。
细胞外基质
在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含细胞外基质或其衍生物的一种或多种组分。在一些实施方案中，“细胞外基质”包括由细胞产生并从细胞中转运到细胞外隙内的蛋白质，在细胞外隙中它们可作为支持体将组织保持在一起、提供拉伸强度和/或促进细胞信号传导。细胞外基质组分的实例包括但不限于：胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸盐、弹性蛋白和蛋白聚糖。例如，多细胞聚集体可含有多种ECM蛋白质(例如，明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或蛋白聚糖)。可将ECM组分或ECM组分的衍生物加入到用于形成多细胞聚集体的细胞糊中。加入到细胞糊中的ECM组分或ECM组分的衍生物可从人类或动物源纯化，或者通过本领域已知的重组方法产生。或者，该ECM组分或ECM组分的衍生物可由伸长细胞体中的细胞自然分泌，或者可通过任何本领域已知的合适方法对用于形成该伸长细胞体的细胞进行遗传操作，以改变一种或多种ECM组分或ECM组分的衍生物和/或一种或多种细胞粘附分子或细胞-基底粘附分子(例如，选择素、整合素、免疫球蛋白和粘附素)的表达水平。ECM组分或ECM组分的衍生物可促进细胞在多细胞聚集体中的凝聚。例如，可将明胶和/或纤维蛋白原适当地加入到细胞糊中，该糊料用于形成多细胞聚集体。随后可通过加入凝血酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。
在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含促进细胞粘附的试剂。
在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含抑制细胞死亡(例如，坏死、凋亡或自体吞噬)的试剂。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抗凋亡剂。抑制细胞死亡的试剂包括但不限于：小分子、抗体、肽、肽体或它们的组合。在一些实施方案中，抑制细胞死亡的试剂选自：抗-TNF剂、抑制白细胞介素活性的试剂、抑制干扰素活性的试剂、抑制GCSF(粒细胞集落刺激因子)活性的试剂、抑制巨噬细胞炎性蛋白活性的试剂、抑制TGF-B(转化生长因子B)活性的试剂、抑制MMP(基质金属蛋白酶)活性的试剂、抑制胱天蛋白酶活性的试剂、抑制MAPK/JNK信号级联活性的试剂、抑制Src激酶活性的试剂、抑制JAK(Janus激酶)活性的试剂或它们的组合。在一些实施方案中，该生物墨水包含抗氧化剂。
挤出化合物
在一些实施方案中，所述生物墨水进一步包含挤出化合物(即，改变生物墨水的挤出性质的化合物)。挤出化合物的实例包括但不限于：凝胶、水凝胶、表面活性剂多元醇(例如Pluronic F-127或PF-127)、热响应性聚合物、紫外线响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、细胞外基质组分(及其衍生物)、明胶、胶原、肽水凝胶、其他生物相容性天然或合成聚合物、纳米纤维和自组装的纳米纤维。
凝胶，有时被称作胶状物，已经以各种方式进行了定义。例如，《美国药典》将凝胶定义为由小无机粒子组成的悬浮液或被液体互相渗透的大有机分子组成的半固体体系。凝胶包括单相或两相体系。单相凝胶由均匀分布在整个液体中的有机大分子组成，其分布方式使得在分散的大分子和液体之间不存在明显的边界。某些单相凝胶是由合成大分子(例如卡波姆)或由天然树胶(例如西黄蓍胶)制备的。在一些实施方案中，单相凝胶通常是水性的，但是也可以利用醇和油来制备。两相凝胶由小离散粒子的网络组成。
凝胶也可被分类为亲水的或疏水的。在某些实施方案中，疏水凝胶的基质由液体石蜡与聚乙烯，或用胶态二氧化硅胶凝的脂肪油，或铝或锌皂组成。相反，亲水凝胶的基质一般由水、甘油或用合适的胶凝剂(例如，西黄蓍胶、淀粉、纤维素衍生物、羧基乙烯基聚合物和硅酸镁铝)胶凝的丙二醇组成。在某些实施方案中，本文中公开的组合物或装置的流变学是假塑性、塑性、触变性或膨胀性的。
适宜的水凝胶包括衍生自胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合的水凝胶。在其他实施方案中，适宜的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，适宜的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的水凝胶。在多个具体实施方案中，限制材料选自：水凝胶、NovoGelTM、琼脂糖、藻酸盐、明胶、MatrigelTM、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝、肽水凝胶或它们的组合。
在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热可逆的凝胶(也称为热响应性凝胶或热凝胶)。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在室温下不是液体。在具体实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃和约40℃，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约10℃至约25℃。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型和其他添加剂等)在室温下不是液体。在具体的实施方案中，本文所述的生物墨水的胶凝温度(Tgel)为约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃和约40℃，包括其中的增量。在某些实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel为约10℃至约25℃。
当引入水溶液中时，由聚氧化丙烯和聚氧化乙烯组成的聚合物形成热可逆的凝胶。在可被保持在生物打印机设备中的温度下，这些聚合物具有从液态变为凝胶态的能力。该液态至凝胶态的相变取决于聚合物的浓度和溶液中的成分。
泊洛沙姆407(Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物组成的非离子表面活性剂。其他泊洛沙姆包括188(F-68级)、237(F-87级)、338(F-108级)。泊洛沙姆的水溶液在酸、碱和金属离子的存在下是稳定的。PF-127是通式E106P70E106的可商购的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，具有13000的平均摩尔质量。该聚合物可采用增强聚合物的胶凝性质的合适的方法进一步纯化。它含有大约70％的氧化乙烯，这解释了它的亲水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列中的一种。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被认为是合适的挤出化合物。
在一些实施方案中，通过任何所述的手段来测量本文中提出的水凝胶和生物墨水的粘度。例如，在一些实施方案中，采用LVDV-II+CP ConePlate粘度计和Cone Spindle CPE-40来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在其他实施方案中，采用Brookfield(轴和杯)粘度计来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在一些实施方案中，本文中提及的粘度范围是在室温下测量的。在其他实施方案中，本文中提及的粘度范围是在体温下(例如，在健康人的平均体温下)测量的。
在进一步的实施方案中，该水凝胶和/或生物墨水的特征在于具有约500至1,000,000厘泊、约750至1,000,000厘泊、约1000至1,000,000厘泊、约1000至400,000厘泊、约2000至100,000厘泊、约3000至50,000厘泊、约4000至25,000厘泊、约5000至20,000厘泊或约6000至15,000厘泊的粘度。
在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞和适合于连续生物打印的挤出化合物。在具体实施方案中，该生物墨水具有约1500mPa·s的粘度。Pluronic F-127和细胞材料的混合物可适合于连续生物打印。这样的生物墨水可通过以下步骤制备：通过在冷(4℃)磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续混合48小时溶解Pluronic F-127粉末至30％(w/v)。Pluronic F-127也可溶解在水中。可采用标准无菌细胞培养技术培养和扩充细胞。例如可将该细胞在200g下沉淀，并重悬浮在30％Pluronic F-127中，并抽吸到附着在生物打印机上的储存器中，可使之在该储存器中在约10℃至约25℃的胶凝温度下凝固。在生物打印之前生物墨水的胶凝是任选的。生物墨水，包括包含Pluronic F-127的生物墨水，可作为液体来分配。
在各个实施方案中，Pluronic F-127的浓度可以是具有合适的粘度和/或细胞毒性的任意值。Pluronic F-127的合适的浓度也可以能够在生物打印时支撑重量同时保持其形状。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约30％至约40％，或者约30％至约35％。
在一些实施方案中，在使用之前除去生物墨水的非细胞组分(例如，挤出化合物等)。在进一步的实施方案中，非细胞组分例如是：水凝胶、表面活性剂多元醇、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原或其他生物相容性天然或合成聚合物。在更进一步的实施方案中，通过物理、化学或酶手段除去非细胞组分。在一些实施方案中，在使用时，一部分非细胞组分仍与细胞组分相关联。
在一些实施方案中，预处理细胞，以增加细胞相互作用。例如，为了在生物墨水成形之前增强细胞-细胞相互作用，可在离心之后在离心管内孵育细胞。
示例性的细胞比例
在一些实施方案中，所述生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含间充质干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，该生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含间充质干细胞/基质细胞和一种或多种其他细胞类型。在更进一步的实施方案中，该生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含间充质干细胞/基质细胞和内皮细胞、成纤维细胞，或内皮细胞和成纤维细胞两者。
在一些实施方案中，使用任何合适的间充质干细胞/基质细胞与其他细胞类型的比例制备生物墨水。例如，在一些实施方案中，使用约5：1至约20：1的间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例制备生物墨水。在多个进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约5：1、约6：1、约7：1、约8：1、约9：1、约10：1、约11：1、约12：1、约13：1、约14：1、约15：1、约16：1、约17：1、约18：1、约19：1或约20：1，包括其中的增量。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约9：1。
进一步举例来说，在一些实施方案中，使用约5：1至约20：1的间充质干细胞/基质细胞与成纤维细胞的比例制备生物墨水。在多个进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与成纤维细胞的比例为约5：1、约6：1、约7：1、约8：1、约9：1、约10：1、约11：1、约12：1、约13：1、约14：1、约15：1、约16：1、约17：1、约18：1、约19：1或约20：1，包括其中的增量。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与成纤维细胞的比例为约9：1。
细胞的自分选
在一些实施方案中，用于形成构建体或组织的多细胞聚集体包含将要包括在工程化组织中的所有细胞类型(例如，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等)；在这样的实例中，每种细胞类型迁移到合适的位置(例如，在成熟期间)，以形成工程化组织，如结缔组织构建体。在其他实施方案中，用于形成结构的多细胞聚集体包含比将要包括在工程化组织中的所有细胞类型要少的细胞类型。在一些实施方案中，每种类型的细胞均匀分布在多细胞聚集体中，或组织的区域或层中。在其他实施方案中，每种类型的细胞定位在多细胞聚集体内的特定区域或组织的层或区域内。
分化信号
在一些实施方案中，本文公开了包含彼此凝聚的结缔组织细胞的工程化组织及其阵列，其中该结缔组织细胞源自多能细胞。本文还公开了包含彼此凝聚的多能细胞的工程化组织及其阵列，其中该多能细胞已暴露于一种或多种分化信号。在各个实施方案中，多能细胞已暴露于，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种或更多种分化信号。
分化信号的类型
在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械或物理信号，包括它们的组合。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，机械、生物机械或物理信号包括拉伸、弯曲、压缩、增加的大气压、由流体流动引起的剪切力以及它们的组合。
在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括化学或生物化学信号，包括它们的组合。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，化学或生物化学信号包括暴露于营养物、激素、生长因子或化学剂。
在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括在分化培养基中的孵育。在进一步的实施方案中，分化培养基支持、促进和/或触发干细胞的体外培养物向一种或多种特定表型的分化。在更进一步的实施方案中，分化培养基支持、促进和/或触发间充质干细胞/基质细胞的体外培养物通过骨生成、软骨生成和/或脂肪生成向一种或多种结缔组织表型的分化。
向一种或多种分化信号的暴露具有宽范围的适宜的持续时间。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多种分化信号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60秒或更多秒，包括其中的增量。在各种实施方案中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多种分化信号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分钟或更多分钟，包括其中的增量。在各种进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多种分化信号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更多小时，包括其中的增量。在各种进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，干细胞暴露于一种或多种分化信号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天，包括其中的增量。
暴露于分化信号的时期
与工程化组织构建体的制造相关的许多时期适合于多能细胞(例如，干细胞)向一种或多种分化信号的暴露。在一些实施方案中，在组织构建体的制造之前，干细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在生物墨水产生之前或细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体之前(例如，沉积前)，将细胞暴露于细胞培养物中的一种或多种分化信号。在更进一步的实施方案中，沉积前暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体之前约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天。在一些实施方案中，沉积前暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体之前约5天至约21天。在一些实施方案中，沉积前暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体之前约5天至约0天。
在一些实施方案中，在组织构建体制造时附近和/或在制造期间将干细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在产生生物墨水时附近和/或在此期间将细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体时附近和/或在此期间(例如，围沉积(peri-deposition))将细胞暴露于一种或多种分化信号。在更进一步的实施方案中，围沉积暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更多小时内。在更进一步的实施方案中，围沉积暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天内。在一些实施方案中，围沉积暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体的约5天内。在一些实施方案中，沉积前暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体的约2天内。
在一些实施方案中，在组织构建体的制造后将干细胞暴露于一种或多种分化信号。在进一步的实施方案中，在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体后(例如沉积后)，将细胞暴露于培养物中的一种或多种分化信号。在更进一步的实施方案中，沉积后暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体后的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天。在一些实施方案中，沉积后暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体后的约1天到约21天。在一些实施方案中，沉积后暴露于一种或多种分化信号是在细胞/生物墨水沉积以形成组织构建体后的约5天到约0天。
在一些实施方案中，生物墨水和/或结缔组织构建体中的间充质干细胞/基质细胞的一些部分是以向在哺乳动物结缔组织中存在的细胞类型(作为非限制性的实例，包括骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞)的部分或完全分化为特征的。在各种实施方案中，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、98、99或100％的间充质干细胞/基质细胞展现出一定程度的分化。
参照图1，在特定实施方案中，多种时期适合于间充质干细胞/基质细胞向成骨分化培养基的暴露。在本实施方案中，相对于通过细胞沉积(例如经由生物打印机的)对组织构建体的制造定义了3个合适的时期。此外，在本实施方案中，间充质干细胞/基质细胞任选地在沉积前、围沉积和/或沉积后暴露于成骨分化培养基。在这种情况下，沉积前时期从沉积前5天延伸至沉积当天；围沉积时期从沉积前2天延伸至沉积后3天；而沉积后时期从沉积当天延伸至沉积后5天。
在一些实施方案中，本文公开了包含彼此凝聚的间充质干细胞/基质细胞的工程化结缔组织构建体及其阵列，其中该间充质干细胞/基质细胞已暴露于一种或多种分化信号，以提供活的三维结缔组织构建体。
在一些实施方案中，作为非限制性的实例，所述结缔组织为骨、软骨、腱、韧带以及它们的组合。在一些实施方案中，该结缔组织是复合组织，包括，例如，骨、软骨、腱、韧带和它们的组合以及非结缔组织。在进一步的实施方案中，软骨和骨可以在层状组织中组合以形成供关节修复使用的结缔组织。在进一步的实施方案中，工程化结缔组织构建体可以设计成与可植入的医疗装置或假体相容，以强化该装置或假体的移植或功能。在一些实施方案中，韧带可以被工程化成在一个或两个末端上包括类骨样组织，以帮助手术递送或移植，或强化递送后的功能。在更进一步的实施方案中，肌腱可以被工程化为在一个末端上具有类骨样组织和/或在相对末端上具有肌肉组织，以帮助手术递送或移植，或强化递送后的功能。
分化的评估
多种技术和方法适用于评估多能细胞(例如，干细胞)向特定组织表型的分化。在一些实施方案中，利用显微镜检查和染色通过识别特定化学物质、细胞表面抗原、细胞器、细胞结构和/或细胞群体来评估分化。关于对间充质干细胞/基质细胞向结缔组织表型的分化的评估，在一些实施方案中，利用茜素红S(对钙晶体进行染色)和/或Von Kossa(对磷酸钙沉积物进行染色)来识别和任选地量化骨生成。进一步举例来说，升高的碱性磷酸酶水平表明活性骨形成的发生，因为这种酶是成骨细胞活性的副产物；因此，在一些实施方案中，利用碱性磷酸酶染色来检测向骨表型的分化。在一些实施方案中，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)通过识别特定化学物质、细胞表面抗原、细胞器、细胞结构和/或细胞群体来评估分化。关于对间充质干细胞/基质细胞向结缔组织表型的分化的评估，在一些实施方案中，利用针对骨桥蛋白的ELISA(在成骨细胞中表达的细胞外结构蛋白质)识别并任选地量化骨生成。
参照图2A和2B，在一个特定的实施方案中，生物打印含有间充质干细胞的构建体，并将其在成骨分化培养基或仅基础间充质干细胞培养基中培养。利用生物打印的构建体的原位碱性磷酸酶染色来检测成骨细胞活性。图2A说明了在暴露于成骨分化培养基的构建体中的碱性磷酸酶的表达。而图2B说明了在仅暴露于基础间充质干细胞培养基的构建体中没有或几乎没有碱性磷酸酶的表达。
参照图2C和2D，在一个特定的实施方案中，生物打印含有间充质干细胞的构建体，并在打印后立即将其在成骨分化培养基或仅基础间充质干细胞培养基中培养。钙沉积物通过茜素红S染色来识别。图2C说明了在暴露于成骨分化培养基的构建体中的钙沉积。而图2D说明了在仅暴露于基础间充质干细胞培养基的构建体中不存在或几乎不存在钙。
参照图3，在一个特定的实施方案中，培养间充质干细胞/基质细胞并用其产生生物墨水，生物打印该生物墨水以形成组织构建体。打印后在分化培养基中孵育5天后，对所得组织进行组织切片、福尔马林固定和石蜡包埋。对构建体进行针对骨桥蛋白表达的免疫荧光染色。示出的反应指示了间充质干细胞的分化和骨生成。
参照图4A和4B，在一个特定的实施方案中，生物打印含有间充质干细胞的构建体，并将其在成骨分化培养基或仅基础间充质干细胞培养基中培养。利用生物打印的构建体的组织学碱性磷酸酶染色来检测成骨细胞的活性。图4A说明了在仅暴露于基础间充质干细胞培养基的构建体中没有或几乎没有碱性磷酸酶的表达。而图4B示出了在暴露于成骨分化培养基的构建体中碱性磷酸酶的表达。
预形成的支架
在一些实施方案中，本文公开了工程化组织，包括结缔组织构建体，及其阵列，其不含或基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，“支架”是指：合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层和脱细胞的组织；以及任何其他类型的预形成的支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是重要的，并且不从该组织和/或器官中除去。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)及其阵列，不利用任何预形成的支架，例如，来形成该组织、该组织的任何层或者形成该组织的形状。作为非限制性的实例，本发明的工程化组织不利用任何预形成的合成支架(例如聚合物支架)、预形成的细胞外基质层或任何其他类型的预形成的支架。在一些实施方案中，该工程化组织基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，该组织的细胞组分含有可检测到的但是痕量或微量的支架，例如，小于总组成的2.0％、小于总组成的1.0％、小于总组成的0.5％或小于总组成的0.1％。在更进一步的实施方案中，痕量或微量的支架不足以影响该组织或其阵列的长期行为或者妨碍其主要生物功能。在另外的实施方案中，在打印之后，通过物理、化学或酶方法除去支架组分，从而产生不含或基本不含支架组分的工程化组织。
在一些实施方案中，本文公开的不含或基本不含预形成的支架的工程化组织，与用某些其他组织工程方法开发的那些组织形成鲜明对比，在这些其他组织工程方法中，例如，首先形成支架材料，然后将细胞接种到支架上，随后细胞增殖，以填充并呈现支架的形状。在一个方面，本文中描述的生物打印方法允许产生活的且有用的组织，该组织基本不含预形成的支架。在另一方面，在一些实施方案中，利用限制材料使将本发明的细胞保持为所期望的三维形状。该限制材料至少在以下事实上与支架是不同的：该限制材料是暂时的和/或可从细胞和/或组织除去。
阵列
在一些实施方案中，本文公开了包括结缔组织构建体在内的工程化组织的阵列。在一些实施方案中，“阵列”是一种科学工具，其包括多个空间排布的元件的关联，以允许在一个样品上进行多个试验、在多个样品上进行一个或多个试验或兼具两者。在一些实施方案中，该阵列适用于或相容于筛选方法和装置，包括与高通量筛选相关的那些方法和装置。在进一步的实施方案中，阵列允许同时进行多个试验。在进一步的实施方案中，阵列允许同时检测多个样品。在一些实施方案中，该阵列为细胞微阵列。在进一步的实施方案中，细胞微阵列为允许在固体支持体表面上对活细胞进行多重探询的实验室工具。在其他实施方案中，该阵列为组织微阵列。在进一步的实施方案中，组织微阵列包括组装成阵列的多个单独的组织或组织样品，以允许进行多个生物化学的、代谢的、分子的或组织学的分析。
在一些实施方案中，该工程化组织(包括结缔组织构建体)各自存在于生物相容性多孔容器的孔中。在一些实施方案中，每个组织被放入孔中。在其他的实施方案中，每个组织被生物打印入孔中。在进一步的实施方案中，该孔被包被。在各个进一步的实施方案中，该孔用如下物质中的一种或多种包被：生物相容性水凝胶、一种或多种蛋白质、一种或多种化学品、一种或多种肽、一种或多种抗体和一种或多种生长因子，包括它们的组合。在一些实施方案中，该孔用NovoGelTM包被。在其他实施方案中，该孔用琼脂糖包被。在一些实施方案中，每个组织存在于生物相容性多孔容器的孔内的多孔生物相容性膜上。
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)在一侧或多侧被生物相容性表面所限。在进一步的实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)通过在一侧或多侧被生物相容性表面所限而保持于阵列配置中。在更进一步的实施方案中，该组织在1、2、3、4个或更多侧被生物相容性表面所限。在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)在一侧或多侧附着至生物相容性表面。
在一些实施方案中，该生物相容性表面为任何对该组织或与该组织接触的生物体不产生显著伤害或毒性风险的表面。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面为任何适合于传统组织培养方法的表面。作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括：经处理的塑料、膜、多孔膜、涂覆的膜、涂覆的塑料、金属、涂覆的金属、玻璃和涂覆的玻璃，其中合适的涂层包括水凝胶、ECM成分、化学品、蛋白质等。
在一些实施方案中，工程化组织在一侧或多侧上向生物相容性表面的附着有助于使该组织经受机械或生物机械力。在进一步的实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)经受机械或生物机械力。在各个实施方案中，工程化组织在1、2、3、4个或更多个侧经受机械或生物机械力。
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)的阵列包括两个或更多个元件的关联。在各个实施方案中，该阵列包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500个元件(包括其中的增量)的关联。在进一步的实施方案中，每个元件包括一个或多个细胞、多细胞聚集体、组织、器官或它们的组合。
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)的阵列包括以预先确定的图案空间排布的多个元件。在进一步的实施方案中，该图案为元件的任何合适的空间排布。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，图案排布包括二维网格、三维网格、一条或多条线、弧或圆、一系列的行或列等等。在进一步的实施方案中，针对与高通量生物学分析或筛选方法或装置的兼容性而选择该图案。
在各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标，选择用于制造阵列中的一种或多种组织的细胞的细胞类型和/或来源。在进一步的各个实施方案中，基于特定的研究目的或目标，选择阵列中的特定组织。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种特定的工程化组织，以促进对特定疾病或状况的研究。在一些实施方案中，在阵列中包括一种或多种特定的工程化组织，以促进对特定受试者的疾病或状况的研究。在进一步的实施方案中，用源自两个或更多个不同人类供体的一种或多种细胞类型来产生该阵列中的一种或多种特定的工程化组织。在一些实施方案中，阵列中的每种组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是基本相似的。在其他实施方案中，阵列中的一种或多种组织在细胞类型、细胞来源、细胞层、细胞比例、构建方法、尺寸、形状等方面是独特的。在各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300种或更多种组织是独特的。在其他各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的组织是独特的。
在一些实施方案中，阵列中的一种或多种组织代表人体内的一种或多种特定的组织。在进一步的实施方案中，阵列中的一种或多种个体组织代表人体组织，作为非限制性的实例，该人体组织包括：血管或淋巴管、肌肉、子宫、神经、粘膜、间皮、网膜、角膜、皮肤、肝、肾、心脏、气管、肺、骨、骨髓、脂肪、结缔组织、膀胱、乳腺、胰脏、脾、脑、食道、胃、肠、结肠、直肠、卵巢、前列腺、内胚层、中胚层和外胚层。在一个实施方案中，选择阵列中的组织，以代表受试者中的所有主要的组织类型。
在一些实施方案中，阵列中的每种组织被独立地在培养物中保持。在进一步的实施方案中，阵列中每种组织的培养条件为使得它们与其他组织分离，并且不能交换培养基或在培养基中可溶的因子。在其他实施方案中，该阵列中的两种或更多种个体组织交换可溶性因子。在进一步的实施方案中，阵列中的两种或更多种个体组织的培养条件为使得它们与其他组织交换培养基或在培养基中可溶的因子。在各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300种或更多种组织交换培养基和/或可溶性因子。在其他各个实施方案中，阵列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的组织交换培养基和/或可溶性因子。
体外分析
在一些实施方案中，本文公开的工程化组织(包括结缔组织构建体)和阵列用于体外分析。在一些实施方案中，“分析”是指检测或测量物质(例如化学品、分子、生物化学品、药物等)在有机或生物样品(例如细胞聚集体、组织、器官、生物体等)中的存在或活性的过程。在进一步的实施方案中，分析包括定性分析和定量分析。在更进一步的实施方案中，定量分析测量样品中物质的量。
在各个实施方案中，作为非限制性的实例，工程化组织(包括结缔组织构建体)和阵列用于分析以检测或测量如下的一种或多种：分子结合(包括放射性配体结合)、分子摄取、活性(例如，酶活性和受体活性等)、基因表达、蛋白质表达、受体激动作用、受体拮抗、细胞信号传导、细胞凋亡、化学敏感性、转染、细胞迁移、趋化性、细胞活力、细胞增殖、安全性、有效性、代谢、毒性和滥用责任。
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)及其阵列用于免疫测定。在进一步的实施方案中，免疫测定是竞争性免疫测定或非竞争性免疫测定。在竞争性免疫测定中，例如，样品中的抗原与标记抗原竞争结合抗体，随后测量结合到抗体位点的标记抗原的量。在非竞争性免疫测定(也称作“夹心法分析”)中，例如，样品中的抗原结合到抗体位点；接着，标记的抗体与该抗原结合，并且随后测量在该位点上的标记抗体的量。
在一些实施方案中，工程化组织(包括结缔组织构建体)及其阵列用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。在进一步的实施方案中，ELISA是用于检测抗体或抗原在样品中的存在的生物化学技术。在ELISA中，例如，使用了至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。进一步举例来说，将具有未知量的抗原的样品非特异性地(通过吸附到表面上)或特异性地(在“夹心”ELISA中，通过对同样抗原具有特异性的另一种抗体进行捕获)固定在固体支持体(例如，聚苯乙烯微量滴定板)上。再进一步举例来说，在抗原固定之后，加入检测抗体，与抗原形成复合物。该检测抗体例如可与酶共价连接，或者其自身可通过经生物缀合连接到酶的第二抗体来检测。
例如，在一些实施方案中，细胞、多细胞聚集体或组织的阵列、微阵列或芯片用于药物筛选或药物发现。在进一步的实施方案中，组织的阵列、微阵列或芯片用作用于药物筛选或药物发现的试剂盒的一部分。在一些实施方案中，每个结缔组织构建体存在于生物相容性多孔容器的孔中，其中该容器适配于一个或多个自动化药物筛选程序和/或装置。在进一步的实施方案中，自动化药物筛选程序和/或装置包括计算机或机器人辅助的任何合适的程序或装置。
在进一步的实施方案中，用于药物筛选分析或药物发现分析的阵列用于研究或开发潜在可用于任何治疗领域的药物。在更进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，合适的治疗领域包括：传染病、血液病、肿瘤、儿科、心脏病、中枢神经系统疾病、神经病、肠胃病、肝脏病、泌尿科、不育症、眼科、肾脏、矫形外科、疼痛控制、精神病、肺、疫苗、创伤愈合、生理学、药理学、皮肤病、基因治疗、毒理学和免疫。
方法
在一些实施方案中，本文公开了构建组织(包括结缔组织构建体)的方法，该方法包括以下步骤：制备包含结缔组织细胞(任选地源自间充质干细胞/基质细胞)的生物墨水；将该生物墨水沉积到支持体上；并孵育该生物墨水，以允许该生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天。在一些实施方案中，本文还公开了构建组织(包括结缔组织构建体)的方法，该方法包括以下步骤：制备包含间充质干细胞/基质细胞的生物墨水；将该生物墨水沉积到支持体上；并孵育该生物墨水，以允许该生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天。在一些实施方案中，在将生物墨水沉积至支持体上之前约1-21天至将生物墨水沉积至支持体上之后约1-21天之间的一个或多个时间间隔时，将间充质干细胞/基质细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该方法利用生物打印。在进一步的实施方案中，该方法产生包括结缔组织构建体在内的工程化组织，其在使用时不含或基本上不含任何预形成的支架。
制备生物墨水
在一些实施方案中，该方法涉及制备包含一种或多种类型的哺乳动物细胞的生物墨水。在进一步的实施方案中，该方法涉及制备包含结缔组织细胞的生物墨水。在进一步的实施方案中，该方法涉及制备包含结缔组织细胞的生物墨水，其中该结缔组织细胞源自间充质干细胞/基质细胞。在一些实施方案中，该方法涉及制备生物墨水，该生物墨水进一步包含间充质干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，该方法涉及制备包含间充质干细胞/基质细胞的生物墨水，其中该间充质干细胞/基质细胞已暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该方法涉及制备进一步包含内皮细胞和/或成纤维细胞的生物墨水。
存在多种制备具有本文所述特性的生物墨水的方式。在一些实施方案中，从含有多个活细胞或具有所需细胞密度和粘性的细胞糊制造生物墨水。在进一步的实施方案中，将该细胞糊成形为所需的形状和通过成熟(例如孵育)形成的多细胞体。在具体实施方案中，通过将包含多个活细胞的细胞糊成形为伸长形状(例如圆柱体)来产生伸长的多细胞体。在进一步的实施方案中，将细胞糊在受控环境中孵育，以使细胞彼此粘附和/或凝聚，以形成伸长的多细胞体。在另一个具体实施方案中，通过在将细胞糊保持为三维形状的装置中，将包含多个活细胞的细胞糊成形来制备多细胞体。在进一步的实施方案中，将细胞糊在受控环境中孵育，同时将其保持为三维形状充分的时间，以在平表面上产生具有足以支撑其自身的凝聚力的体。
在各个实施方案中，通过如下步骤来提供细胞糊：(A)将(一种或多种细胞类型的)细胞或细胞聚集体与生物相容性凝胶或液体(例如细胞培养基)混合(例如，以预先确定的比例)，以产生细胞悬浮液；和(B)将该细胞悬浮液致密化，以产生具有所需细胞密度和粘度的细胞糊。在各个实施方案中，通过多种方法来实现致密化，例如通过将由细胞培养物获得的特定细胞悬浮液浓缩，以获得所需的细胞浓度(密度)、粘度和细胞糊所需的稠度。在具体的实施方案中，将来自细胞培养物的相对较稀的细胞悬浮液离心设定的时间，以获得允许在模具中成形的沉淀物中的细胞浓度。切向流过滤(“TFF”)是细胞浓缩或致密化的另一种合适的方法。在一些实施方案中，将化合物与细胞悬浮液合并，以提供所需的挤出性质。作为非限制的实例，合适的化合物包括：表面活性剂多元醇、胶原、水凝胶、MatrigelTM、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶、纤维蛋白原等。
在一些实施方案中，通过将多个活细胞与组织培养基混合并使活细胞致密化(例如通过离心)来产生细胞糊。任选地通过如下步骤来包括一种或多种ECM组分(或ECM组分的衍生物)：将细胞沉淀物重悬浮在一种或多种含有ECM组分(或ECM组分的衍生物)的生理学可接受的缓冲液中，并将所得细胞悬浮液再次离心以形成细胞糊。
在一些实施方案中，进一步加工所需的细胞糊的细胞密度可随着细胞类型而变化。在进一步的实施方案中，细胞之间的相互作用决定了细胞糊的性质，并且不同的细胞类型在细胞密度与细胞-细胞相互作用之间将具有不同的关系。在更进一步的实施方案中，在细胞糊成形之前可预处理该细胞，以增加细胞相互作用。例如，为了在细胞糊成形之前增强细胞-细胞相互作用，可在离心之后在离心管内孵育细胞。
在各个实施方案中，采用多种方法来使细胞糊成形。例如，在特定实施方案中，将细胞糊手工模塑或压制(例如，在浓缩/致密化之后)，以获得所需的形状。进一步举例来说，将细胞糊吸收(例如，抽吸)到仪器如微量吸液管(例如，毛细吸管)中，这使细胞糊成形，以符合该仪器的内表面。微量吸液管(例如毛细吸管)的横截面形状可选地是圆形的、正方形的、矩形的、三角形的或其他非圆形的横截面形状。在一些实施方案中，通过将细胞糊沉积到预形成的模具如塑料模具、金属模具或凝胶模具中，使细胞糊成形。在一些实施方案中，采用离心浇铸或连续浇铸来使细胞糊成形。
在一些实施方案中，单独的或与伸长细胞体组合的基本为球形的多细胞聚集体也适合于建造本文中所述的组织，包括结缔组织构建体。可通过多种方法生成球形多细胞聚集体，该方法包括但不限于：细胞自组装、使用模具和悬滴法。在进一步的实施方案中，产生基本为球形的多细胞聚集体的方法包括以下步骤：1)提供具有所需细胞密度和粘度的、含有多个预先选择的细胞或细胞聚集体的细胞糊；2)将该细胞糊处理成圆柱形状；3)将圆柱体切割成相等的片段；4)将该片段在旋转摇床上放置过夜；和5)通过成熟形成基本为球形的多细胞聚集体。
在一些实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞糊从成形装置(例如，毛细吸管)转移到允许向细胞供应营养物和/或氧的第二成形装置(例如，模具)，同时它们在第二成形装置中保持额外的成熟时间。允许向细胞供应营养物和氧的合适的成形装置的一个例子是用于产生多个多细胞聚集体(例如，基本相同的多细胞聚集体)的模具。进一步举例来说，这样的模具包括由抵抗细胞向基质中迁移或向内生长并且抵抗细胞向基质粘附的材料制成的生物相容性基质。在各个实施方案中，该基质可适当地由(PTFE)、不锈钢、琼脂糖、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如琼脂糖凝胶或其他水凝胶)和类似的材料制成。在一些实施方案中，模具还适当地配置为允许向细胞糊供应组织培养基(例如，通过将组织培养基分配到模具的顶部上)。
因此，在使用第二成形装置的实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞糊从第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到第二成形装置(例如，模具)。在进一步的实施方案中，可将部分粘附和/或凝聚的细胞糊通过第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到模具的凹槽中。在更进一步的实施方案中，在成熟期(其中模具与保留于其中的细胞糊一起在受控环境中孵育，以使细胞糊中的细胞进一步彼此粘附和/或凝聚，以形成多细胞聚集体)之后，细胞的凝聚力将足够强大，从而允许用工具(例如，毛细吸管)拾取所得的多细胞聚集体。在更进一步的实施方案中，该毛细吸管适宜地是生物打印机或类似设备的打印头的一部分，其可以操作，以自动地将多细胞聚集体放置在三维构建体中。
在一些实施方案中，多细胞聚集体的横截面形状和尺寸基本对应于第一成形装置和任选的用于制备该多细胞聚集体的第二成形装置的横截面形状和尺寸，并且本领域技术人员将能够选择具有适当横截面形状、横截面积、直径和长度的适当的成形装置，其适合于产生具有以上讨论的横截面形状、横截面积、直径和长度的多细胞聚集体。
在一些实施方案中，生物打印的方法是连续的和/或基本上连续的。连续生物打印方法的一个非限制性实例是通过连接到生物墨水储器的分配尖端(例如，针、毛细管等)从生物打印机分配生物墨水。在一些实施方案中，将细胞糊装入储器中并直接生物打印至具有限定形状的容器或支持体内。在进一步的实施方案中，该容器或支持体使得能够在沉积后约15分钟至约6小时内形成生物墨水。在进一步的实施方案中，该容器或支持体既适合于形成生物墨水又适合于形成三维组织。在进一步的实施方案中，该容器或支持体与三维组织在制造后的体外维持和成熟是相容的。在一些实施方案中，将一种或多种细胞糊以限定的图案直接生物打印至容器或支持体内。在一些实施方案中，将多种生物墨水以特定的图案沉积，从而在组织的各层中在x轴和y轴上产生特定的平面几何形状。在更进一步的实施方案中，利用第一生物墨水经由分配的一系列线或边界产生几何学的或用户定义的图案，并且利用另外不同的生物墨水作为由第一生物墨水产生的边界内的填充物。在更进一步的实施方案中，边界可以由两种或更多种不同的生物墨水产生，并且使用两种或更多种不同的生物墨水作为该图案的边界内的填充物。所得的组织是类似于染绘玻璃窗的镶嵌的或区室化的组织，其由边界(例如，框架)和填充物(例如，窗格)组成。在进一步的实施方案中，可将多个层添加至第一层的顶部，各个层包含与第一层相同的几何形状或与第一层不同的几何形状。
将生物墨水沉积到支持体上
许多方法适合于将生物墨水沉积到支持体上，以产生所需的三维结构。例如，在一些实施方案中，将多细胞聚集体手动放置而使其彼此接触，通过从移液管、喷嘴或针挤出而沉积在适当的位置，或者通过自动化的计算机辅助装置如生物打印机来放置。
如本文所述，在各个实施方案中，生物墨水包含具有许多合适的形状和尺寸的多细胞聚集体。在一些实施方案中，多细胞聚集体是伸长的，其具有数种合适的横截面形状中的任一种，作为非限制性的实例，所述横截面形状包括圆形、椭圆形、正方形、三角形、多边形和不规则形状。在进一步的实施方案中，多细胞聚集体是伸长的，并且是圆柱体的形式。在一些实施方案中，伸长的多细胞聚集体具有类似的长度和/或直径。在其他实施方案中，伸长的多细胞聚集体具有不同的长度和/或直径。在一些实施方案中，多细胞聚集体基本上是球形的。在一些实施方案中，工程化组织(例如，结缔组织构建体等)包括基本为球形的、尺寸基本上类似的多细胞聚集体。在其他实施方案中，工程化组织(例如，结缔组织构建体等)包括基本为球形的、不同尺寸的多细胞聚集体。在一些实施方案中，不同形状和尺寸的工程化组织(例如，结缔组织构建体等)是通过排布各种形状和尺寸的多细胞体而形成的。
在一些实施方案中，将凝聚的多细胞聚集体沉积到支持体上。在各个实施方案中，该支持体是任何合适的生物相容性表面。在更进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括聚合材料、多孔膜、塑料、玻璃、金属、水凝胶及其组合。在一些实施方案中，该支持体用生物相容性物质涂覆，作为非限制性的实例，该生物相容性物质包括水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体、生长因子或它们的组合。在一个实施方案中，该支持体涂覆有NovoGelTM。在另一个实施方案中，该支持体涂覆有琼脂糖。在一个实施方案中，将凝聚的多细胞聚集体放置在生物相容性多孔容器的孔中。
在一些实施方案中，一旦完成生物墨水的沉积，就将组织培养基倾倒在构建体的顶部。在进一步的实施方案中，组织培养基进入多细胞体之间的空间，以支持多细胞体中的细胞。
孵育生物墨水和/或组织构建体
在一些实施方案中，对沉积的生物墨水进行孵育。在进一步的实施方案中，孵育允许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体。在一些实施方案中，在细胞培养环境(例如，培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中，生物墨水凝聚以形成组织。在进一步的实施方案中，在具有适合于促进包括在生物墨水中的细胞类型生长的条件的环境中，生物墨水凝聚以形成组织。在一个实施方案中，在约37℃下，在含有约5％CO2的湿润气氛中，在含有促进粘附和/或凝聚的因子和/或离子的细胞培养基的存在下，孵育生物墨水/组织构建体。在其他实施方案中，将生物墨水/组织构建体保持在含有0.1％-21％O2的环境中。
在各个实施方案中，孵育具有任何合适的持续时间。在进一步的各个实施方案中，孵育的持续时间为约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或更多分钟，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，孵育的持续时间为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48或更多小时，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，孵育的持续时间为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，包括其中的增量。数种因素影响生物墨水凝聚以形成组织所需的时间，作为非限制性的实例，这包括细胞类型、细胞类型的比例、培养条件和添加剂(如生长因子)的存在。
用于提高工程化组织的存活力的额外步骤
在一些实施方案中，该方法进一步包括提高工程化组织的存活力的步骤。在进一步的实施方案中，这些步骤包括：通过限制材料的暂时或半永久性的网格，提供该组织与营养培养基之间的直接接触。在一些实施方案中，该组织被束缚在多孔或间隙材料中。该工程化组织的至少一些细胞直接接近营养物提高了该工程化组织的存活力。
在进一步的实施方案中，用于提高工程化组织的存活力的额外和任选的步骤包括：1)任选地在放置凝聚的多细胞聚集体之前，分配限制材料的基底层；2)任选地分配限制材料的周界；3)在限定的几何形状内生物打印该组织的细胞；和4)按照图案分配限制材料的伸长体(例如，圆柱体、带状体等)并覆盖初生组织，该图案在限制材料中引入间隙，例如网格、网孔或格子。
许多限制材料适用于本文描述的方法中。在一些实施方案中，水凝胶是示例性的限制材料，其具有一种或多种有利的性质，包括：非附着的、生物相容的、可挤出的、可生物打印的、非细胞的、具有合适的强度以及不溶于水性条件。在一些实施方案中，适宜的水凝胶是天然聚合物。在一个实施方案中，该限制材料包含NovoGelTM。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自表面活性剂多元醇(如PluronicF-127、胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、明胶、肽水凝胶、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖和它们的衍生物或组合)的水凝胶。在其他实施方案中，合适的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的那些水凝胶。在各个具体实施方案中，该限制材料选自：水凝胶、NovoGelTM、琼脂糖、藻酸盐、明胶、MatrigelTM、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基n-聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝或它们的组合。
在一些实施方案中，覆盖图案的间隙均匀地或基本均匀地围绕组织的表面分布。在其他实施方案中，该间隙不均匀地分布，从而使组织的细胞不均匀地暴露于营养物。在不均匀的实施方案中，可利用对营养物的差异获取来影响组织的一种或多种性质。例如，可能理想的是在生物打印的组织的一个表面上的细胞比在该生物打印的组织的另一表面上的细胞增殖更快。在一些实施方案中，任选地在不同的时间可改变该组织的各个部分对营养物的暴露，以影响该组织向期望的终点的发育。
在一些实施方案中，在任何合适的时间除去限制材料，包括但不限于：在生物打印之后立即(例如，在10分钟内)、在生物打印之后(例如，10分钟后)、在细胞基本上彼此凝聚之前、在细胞基本上彼此凝聚之后、在细胞产生细胞外基质之前、在细胞产生细胞外基质之后、临使用前，等等。在各个实施方案中，通过任何合适的方法除去限制材料。例如，在一些实施方案中，将限制材料切除、从细胞上扯下、消化或溶解。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是：这些实施方案仅仅是以示例的方式提供的。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下，现在将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。
各种非限制性的实施方案
在一些实施方案中，本文公开了活的三维结缔组织构建体，其包含：彼此凝聚以提供活的三维结缔组织构建体的结缔组织细胞；其中该构建体在使用时基本上不含预形成的支架。在一些实施方案中，该结缔组织细胞源自间充质干细胞/基质细胞。在进一步的实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自哺乳动物脂肪组织。在进一步的实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自哺乳动物骨髓。在其他实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在该构建体的制造之前，将间充质干细胞/基质细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在该构建体的制造期间，将间充质干细胞/基质细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在该构建体的制造之后，将间充质干细胞/基质细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该构建体是生物打印的。在进一步的实施方案中，该构建体进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善了细胞对生物打印的适用性。在一些实施方案中，该结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在一些实施方案中，该构建体还包含哺乳动物内皮细胞。在进一步的实施方案中，结缔组织细胞与内皮细胞的比例为约5：1至约20：1。在更进一步的实施方案中，结缔组织细胞与内皮细胞的比例为约9：1。在一些实施方案中，该构建体还包含哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，该构建体为片或块的形式。在一些实施方案中，该构建体还包含一种或多种离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在特定的实施方案中，每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。
在一些实施方案中，本文公开了包含彼此凝聚的间充质干细胞/基质细胞的活的三维结缔组织构建体，其中该间充质干细胞/基质细胞已暴露于一种或多种分化信号，以提供活的三维结缔组织构建体；其中该构建体基本上不含预形成的支架。在一些实施方案中，该构建体是生物打印的。在一些实施方案中，该构建体还包含挤出化合物，该挤出化合物改善细胞对生物打印的适用性。在一些实施方案中，该结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在进一步的实施方案中，该结缔组织是骨。在一些实施方案中，该构建体还包含哺乳动物内皮细胞。在进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约5：1至约20：1。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约9：1。在一些实施方案中，该构建体还包含哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自哺乳动物脂肪组织。在一些实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自哺乳动物骨髓。在其他实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，在该构建体的制造之前，将细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在该构建体的制造期间，将细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，在该构建体的制造之后，将细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该构建体是片或块的形式。在一些实施方案中，该构建体还包含一种或多种离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，该生物相容性材料基本上抵抗细胞的迁移和向内成长，其中，所述一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括在分化培养基中的孵育。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械或物理信号，或其组合。在一些实施方案中，间充质干细胞/基质细胞的一些部分的特征在于向在哺乳动物结缔组织中存在的细胞类型的部分或完全分化。
在一些实施方案中，本文公开了活的三维结缔组织构建体，其包含：间充质干细胞/基质细胞、成纤维细胞和内皮细胞，其中所述细胞彼此凝聚，其中在构建体制造前约1-21天至构建体制造后约1-21天之间的一个或多个时间间隔时，间充质干细胞/基质细胞已暴露于一种或多种分化培养基，以提供活的三维结缔组织构建体；其中该结缔组织构建体基本上不含预形成的支架。
在一些实施方案中，本文公开了活的三维结缔组织构建体，该构建体包含哺乳动物细胞，该构建体通过包括以下步骤的过程来制造：将间充质干细胞/基质细胞暴露于一种或多种分化信号，以提供活的三维结缔组织构建体，其中该构建体基本上由细胞材料组成并且可植入受试者中。在一些实施方案中，该细胞是生物打印的。在一些实施方案中，构建体基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在进一步的实施方案中，该结缔组织是骨。在一些实施方案中，该构建体用于植入受试者的损伤、病变或退化部位。在一些实施方案中，构建体还包含哺乳动物内皮细胞。在进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约5：1至约20：1。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约9：1。在一些实施方案中，构建体还包含哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，该构建体是包含一种或多种结缔组织的复合组织构建体。在进一步的实施方案中，该构建体是包含结缔组织和非结缔组织的复合组织构建体。在更进一步的实施方案中，该构建体是包含骨组织和非结缔组织的复合组织构建体。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括在分化培养基中的孵育。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械或物理信号，或其组合。
在一些实施方案中，本文公开了活的三维结缔组织构建体的阵列，每种构建体包含哺乳动物细胞，每种构建体通过包括以下步骤的过程来制造：将间充质干细胞/基质细胞暴露于一种或多种分化信号，以提供活的三维结缔组织构建体；其中每种结缔组织构建体在使用时基本上不含预形成的支架；其中每种结缔组织构建体在培养物中保持。在一些实施方案中，阵列中的每种构建体是生物打印的。在一些实施方案中，该结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在进一步的实施方案中，该结缔组织是骨。在一些实施方案中，阵列中的一种或多种结缔组织构建体进一步包含哺乳动物内皮细胞。在进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约5：1至约20：1。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约9：1。在一些实施方案中，阵列中的一种或多种结缔组织构建体进一步包含哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，阵列中的一种或多种结缔组织构建体是包含一种或多种结缔组织的复合组织构建体。在一些实施方案中，阵列中的一种或多种结缔组织构建体是包含结缔组织和非结缔组织的复合组织构建体。在进一步的实施方案中，阵列中的一种或多种结缔组织构建体是包含骨组织和非结缔组织的复合组织构建体。在一些实施方案中，阵列用于体外分析。在进一步的实施方案中，阵列用于选自以下的一种或多种：药物发现、药物检测、毒理学检测、疾病建模、三维生物学研究和细胞筛选。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括在分化培养基中的孵育。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械或物理信号，或其组合。
在一些实施方案中，本文公开了制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法包括以下步骤：制备包含间充质干细胞/基质细胞的生物墨水；将该生物墨水沉积到支持体上；孵育该生物墨水，以允许生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天；条件为在将生物墨水沉积至支持体上之前约1-21天至将生物墨水沉积至支持体上之后约1-21天之间的一个或多个时间间隔时，将间充质干细胞/基质细胞暴露于一种或多种分化信号。在一些实施方案中，该生物墨水是通过生物打印而沉积的。在一些实施方案中，该构建体基本上不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。在进一步的实施方案中，该结缔组织是骨。在一些实施方案中，该生物墨水还包含哺乳动物内皮细胞。在进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约5：1至约20：1。在更进一步的实施方案中，间充质干细胞/基质细胞与内皮细胞的比例为约9：1。在一些实施方案中，该生物墨水还包含哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，该生物墨水还包含挤出化合物。在一些实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自哺乳动物脂肪组织。在一些实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自哺乳动物骨髓。在其他实施方案中，该间充质干细胞/基质细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括在分化培养基中的孵育。在一些实施方案中，一种或多种分化信号包括机械、生物机械或物理信号，或其组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括沉积一种或多种离散的填料体的步骤，每种填料体包含生物相容性材料，该生物相容性材料基本上抵抗细胞的迁移和向内成长，其中，所述一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。在一些实施方案中，该方法进一步包括通过将构建体附着到生物相容性表面而将多个活的三维结缔组织构建体组装成阵列的步骤。在进一步的实施方案中，该生物相容性表面是多孔膜。
实施例
下面的具体实施例应解释为仅是说明性的，而并非以任何方式限制公开内容的其他部分。无需进一步详尽说明，相信本领域技术人员基于本文的描述能够最大限度地利用本发明。
实施例1–MSC培养
使用在补充有L-谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM中含有5-10％(v：v)胎牛血清的基础培养基，在标准细胞培养条件下培养并扩充MSC。在一些情况下，MSC在低(3-5％)氧条件下培养。
实施例2–NovoGelTM溶液和模具
2％和4％(w/v)NovoGel TM 溶液的制备
将1g或2g(分别对应2％或4％)的NovoGelTM(Organovo,SanDiego,CA)溶解于50ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS；InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)中。简言之，将DPBS和NovoGelTM在恒定搅拌下在加热板上加热到85℃，直至NovoGelTM完全溶解。通过蒸汽灭菌法将NovoGelTM溶液在125℃下灭菌25分钟。只要温度维持在36.5℃以上，NovoGelTM溶液就保持于液相。低于这个温度会发生相变，NovoGelTM溶液的粘度增加，并且NovoGelTM形成固体凝胶。
NovoGel TM 模具的制备
采用适配10cm培养皿的模具，制造用于孵育生物墨水(细胞圆柱体的形式)的NovoGelTM模具。简言之，将模具使用70％乙醇溶液预灭菌，并使该模具经受紫外光45分钟。将灭菌的模具放在10cm培养皿(VWR International LLC,West Chester,PA)的上方，并牢固地附接。将这个组装体(模具+培养皿)垂直保持，并将45ml预热的无菌2％NovoGelTM溶液倒入模具与培养皿之间的间隙中。随后，将该组装体在室温下水平放置1小时，以使NovoGelTM完全胶凝。在胶凝以后，取出印制物，并用DPBS冲洗NovoGelTM模具两次。然后，向NovoGelTM模具添加17.5ml的HASMC培养基，用于孵育生物墨水。
实施例3–MSC-HAEC生物墨水的制造
为了制备生物墨水(混合的细胞圆柱体的形式)，单独收集MSC和HAEC，随后以预先确定的比例混合。简言之，从铺满的培养瓶中除去培养基，并用DPBS(1ml/5cm2生长面积)冲洗细胞。通过在胰蛋白酶(1ml/15cm2生长面积；Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)的存在下孵育10分钟，使细胞从培养瓶的表面上脱离。采用0.15％胰蛋白酶来分离MSC，而采用0.1％胰蛋白酶来分离HAEC。在孵育后，将合适的培养基加入到培养瓶中(2X体积，相对于胰蛋白酶体积)。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，随后完全除去上清液。将细胞沉淀物重悬浮于各自的培养基中，并利用血细胞计数器计数。将适当体积的MSC和HAEC合并，以产生含有10％HAEC和其余90％MSC(基于总细胞群体的％)的混合细胞悬浮液。将该混合细胞悬浮液在200g下离心5分钟，随后完全除去上清液。将混合细胞沉淀物重悬浮于6ml的MSC培养基中，并转移到20ml玻璃小瓶(VWR International LLC,West Chester,PA)中，随后在定轨摇床上以150rpm在37℃和5％CO2下孵育60分钟。这使得细胞彼此聚集，并开始细胞-细胞粘附。在孵育后，将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并在200g下离心5分钟。在除去上清液培养基之后，将该细胞沉淀物重悬浮于400μl的MSC培养基中，并用移液管上下吸取几次，以确保所有的细胞簇被打破。将细胞悬浮液转移到放置在15ml离心管中的0.5ml微量离心管(VWR International LLC,West Chester,PA)中，随后在2000g下离心4分钟，以形成高度致密并压紧的细胞沉淀物。将上清液培养基吸出，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(OD 1.5mm，ID 0.5mm，L 75mm；Drummond Scientific Co.,Broomall,PA)中，以产生长度为50mm的细胞圆柱体。在37℃和5％CO2下，将毛细管中的细胞糊在MSC培养基中孵育20分钟。随后，使用随毛细管提供的柱塞，将细胞圆柱体从毛细管中挤出到NovoGelTM模具(覆盖有MSC培养基)的凹槽中。将生物墨水在37℃和5％CO2下孵育24小时。
实施例4–通过与成骨分化培养基一起孵育的沉积前MSC分化
在用生物打印机沉积之前，连续5天，用1x成骨分化培养基(CombiCultTM培养基；Plasticell,Inc.,London,UK)处理培养的MSC。在第-1天，使用本文所述的方法，用MSC产生生物墨水。在第0天，生物打印该生物墨水以形成组织构建体。生物墨水融合后，评估构建体的细胞分化。
实施例5–结缔组织构建体的生物打印
利用NovoGen MMX BioprinterTM(Organovo,Inc.,San Diego,CA)使用生物墨水挤出机构来生物打印工程化的结缔组织构建体。该生物墨水由MSC和人主动脉内皮细胞(HAEC)以90％MSC：10％HAEC的比例组成。该构建体以5mm x 8mm片的形式直接生物打印到渗透性支持膜上。
实施例6–通过与成骨分化培养基一起孵育的围沉积MSC分化
根据以下实验方案，用成骨分化培养基处理培养的MSC：
1)无沉积前暴露；从第0天(沉积)开始并持续到沉积后3天或6天，暴露于1x成骨分化培养基。
2)在沉积前3天开始并持续到沉积后3天或6天，沉积前暴露于0.5x成骨分化培养基。
3)在沉积前3天开始并持续到沉积后3天或6天，沉积前暴露于1x成骨分化培养基。
生物墨水融合后，评估构建体的细胞分化。
实施例7–MSC分化的评估
针对结缔组织特异性分化程度，对包含暴露于成骨分化培养基的MSC的结缔组织构建体进行评估。对构建体进行切片，在福尔马林中固定，于石蜡中包埋，并进行茜素红S染色(对钙晶体进行染色)和VonKossa染色(对磷酸钙沉积物进行染色)，随后显微镜检查。该构建体还进行碱性磷酸酶染色和针对骨桥蛋白表达的ELISA。参见例如图2和图3。

Claims (56)

1.一种工程化的、活的三维结缔组织构建体，其包含：彼此凝聚以提供活的三维结缔组织构建体的结缔组织细胞；其中该构建体在使用时基本上不含预形成的支架。
2.如权利要求1所述的构建体，其中该构建体是不受神经支配的。
3.如权利要求1所述的构建体，其中所述结缔组织细胞包含在体外源自多能细胞的结缔组织细胞。
4.如权利要求3所述的构建体，其中所述多能细胞包含以下一种或多种：组织特异性祖细胞、间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。
5.如权利要求3所述的构建体，其中所述多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。
6.如权利要求3所述的构建体，其中所述多能细胞源自哺乳动物骨髓。
7.如权利要求3所述的构建体，其中所述多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。
8.如权利要求3所述的构建体，其中在该构建体的制造之前将所述多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
9.如权利要求3所述的构建体，其中在该构建体的制造期间将所述多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
10.如权利要求3所述的构建体，其中在该构建体的制造之后将所述多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
11.如权利要求1所述的构建体，其中该构建体是生物打印的。
12.如权利要求11所述的构建体，其进一步包含挤出化合物，该挤出化合物改善所述细胞对于生物打印的适用性。
13.如权利要求1所述的构建体，其中所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。
14.如权利要求1所述的构建体，其进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、干细胞/祖细胞、免疫细胞。
15.如权利要求1所述的构建体，其基本上是片、块、环、管、立方体、多面体或球体的形式。
16.如权利要求1所述的构建体，其基本上是模拟天然人类结缔组织在体内的形状或架构的形状的形式。
17.如权利要求1所述的构建体，其用于植入受试者的损伤、病变或退化部位。
18.如权利要求1所述的构建体，其进一步包含一种或多种离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中所述一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。
19.如权利要求18所述的构建体，其中每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。
20.工程化的、活的三维结缔组织构建体的阵列，每种构建体均通过包括以下步骤的过程来制造：将多能细胞暴露于一种或多种分化信号以提供活的三维结缔组织构建体；其中每种结缔组织构建体在使用时基本上不含预形成的支架；其中每种结缔组织构建体均在培养物中保持。
21.如权利要求20所述的阵列，其中每种构建体均是不受神经支配的。
22.如权利要求20所述的阵列，其中所述多能细胞包含以下一种或多种：组织特异性祖细胞、间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。
23.如权利要求20所述的阵列，其中所述多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。
24.如权利要求20所述的阵列，其中所述多能细胞源自哺乳动物骨髓。
25.如权利要求20所述的阵列，其中所述多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。
26.如权利要求20所述的阵列，其中在所述构建体的制造之前将所述多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
27.如权利要求20所述的阵列，其中在所述构建体的制造期间将所述多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
28.如权利要求20所述的阵列，其中在所述构建体的制造之后将所述多能细胞暴露于一种或多种分化信号。
29.如权利要求20所述的阵列，其中每种构建体均是生物打印的。
30.如权利要求20所述的阵列，其中所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。
31.如权利要求20所述的阵列，其中一种或多种结缔组织构建体进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：内皮细胞、成纤维细胞、干细胞/祖细胞、周细胞、卫星细胞或血管细胞。
32.如权利要求20所述的阵列，其中一种或多种结缔组织构建体是包含一种或多种结缔组织的复合组织构建体。
33.如权利要求32所述的阵列，其中一种或多种结缔组织构建体是包含结缔组织和非结缔组织的复合组织构建体。
34.如权利要求33所述的阵列，其中一种或多种结缔组织构建体是包含骨组织和非结缔组织的复合组织构建体。
35.如权利要求20所述的阵列，其用于体外分析。
36.如权利要求35所述的阵列，其用于以下一种或多种：药物发现、药物检测、毒理学检测、疾病建模、三维生物学研究和细胞筛选。
37.如权利要求20所述的阵列，其中所述一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或物理信号，或它们的组合。
38.如权利要求20所述的阵列，其中一种或多种构建体进一步包含一种或多种离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中所述一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。
39.如权利要求38所述的阵列，其中每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。
40.一种制造活的三维结缔组织构建体的方法，该方法包括：孵育包含已沉积到支持体上并暴露于一种或多种分化信号的多能细胞的生物墨水，从而允许该生物墨水凝聚并形成活的三维结缔组织构建体，其中所述孵育的持续时间为约1小时至约30天。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述多能细胞包含以下一种或多种：间充质干细胞/基质细胞、诱导的多潜能干细胞和胚胎干细胞。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述多能细胞源自哺乳动物脂肪组织。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述多能细胞源自哺乳动物骨髓。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述多能细胞源自非脂肪、非骨髓组织来源。
45.如权利要求40所述的方法，其中在将生物墨水沉积到支持体上之前约1-21天至将生物墨水沉积到支持体上之后约1-21天之间的一个或多个时间间隔时，将所述结缔组织细胞暴露于一种或多种分化信号。
46.如权利要求40所述的方法，其中所述生物墨水通过生物打印而沉积。
47.如权利要求40所述的方法，其中所述构建体在使用时基本上不含任何预形成的支架。
48.如权利要求40所述的方法，其中所述构建体是不受神经支配的。
49.如权利要求40所述的方法，其中所述结缔组织选自：骨、软骨、腱和韧带。
50.如权利要求40所述的方法，其中所述生物墨水进一步包含下列细胞类型中的一种或多种：血管细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、干细胞/祖细胞、免疫细胞。
51.如权利要求40所述的方法，其中所述生物墨水进一步包含挤出化合物。
52.如权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种分化信号包括机械、生物机械、可溶性或物理信号，或它们的组合。
53.如权利要求40所述的方法，其进一步包括沉积一种或多种离散的填料体，每种填料体包含生物相容性材料，其中所述一种或多种填料体在凝聚的细胞中创建间隙或空间。
54.如权利要求53所述的方法，其中每种填料体基本上抵抗细胞的迁移和向内生长。
55.如权利要求40所述的方法，其进一步包括通过将构建体在空间上限制在生物相容性表面之上或之内而将多个活的三维结缔组织构建体组装为阵列。
56.如权利要求40所述的方法，其中所述构建体适合于植入受试者的损伤、病变或退化部位。
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