JP5658659B2 - シルクフィブロイン多孔質体の製造方法 - Google Patents
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Description
これら多孔質体を構成する生体由来物質としては、セルロースやキチン等の糖類、コラーゲン、ケラチン、シルクフィブロイン等のタンパク質群が知られている。
シルクフィブロインは、衣類用途以外に、手術用縫合糸として長く使用されてきた実績があり、現在では食品や化粧品の添加物としても利用され、人体に対する安全性にも問題がないことから上記した多孔質体の利用分野に十分利用可能である。
上記したシルクフィブロイン多孔質体の作製手法と比較すると、確実で簡便な手法が報告されている(特許文献4;非特許文献1)。シルクフィブロイン水溶液に対して少量の有機溶媒を添加した後に、一定時間冷凍して融解することによってシルクフィブロイン多孔質体が得られる手法である。この手法では、少量使用した有機溶媒も超純水による洗浄工程による除去から残留有機溶媒もほぼなくなり、さらには、得られた含水状態の多孔質体は、それまでに報告されていたものよりも強度が高く形態安定性に優れている。
そこで、本発明は、すぐれた力学的特性を有するシルクフィブロイン多孔質体を製造する方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結させ、次いで融解することにより、多孔質体を得るシルクフィブロイン多孔質体の製造方法を提供するものである。
また、本発明の製造方法においては、融解後に得られた多孔質体を純水中に浸漬して、又は凍結乾燥により前記脂肪族カルボン酸を除去する工程をさらに有することが好ましい。
本発明のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法において、シルクフィブロインの濃度は、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液中で0.1〜40質量%であることが好ましく、0.5〜20質量%であることがより好ましく、1.0〜12質量%であることがさらに好ましい。この範囲内に設定することで、十分な強度を持った多孔質体を効率的に製造することができる。
本発明において用いられる脂肪族カルボン酸としては、たとえば、炭素数1〜6の飽和または不飽和のモノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸を好ましく用いることができ、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、乳酸、アクリル酸、2−ブテン酸、3−ブテン酸等が挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、単独あるいは2種以上組み合わせて使用することができる。
シルクフィブロイン水溶液に添加する脂肪族カルボン酸の量は、シルクフィブロイン溶液中で0.01〜18.0質量%であることが好ましく、0.1〜5.0質量%であることがより好ましい。この範囲内に設定することで、十分な強度を持った多孔質体を製造することができる。
凍結温度としては、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン水溶液が凍結する温度であれば特に制限されないが、−1〜−40℃程度が好ましく、−5〜−40℃程度がより好ましく、−10〜−30℃がさらに好ましい。
凍結時間としては、脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン水溶液が十分に凍結し、かつ凍結状態を一定時間保持できるよう、2時間以上であることが好ましく、4時間以上であることがさらに好ましい。
その後に、凍結したシルクフィブロイン溶液を、融解することによってシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。融解の方法としては、特に制限はなく、自然融解や恒温槽での保管等が挙げられる。
また、シルクフィブロイン多孔質体製造後に、水分濃度を調整する方法としては、例えば、シルクフィブロイン多孔質体を乾燥して水分を蒸発させる方法が挙げられる。乾燥の方法としては、自然乾燥、凍結乾燥、加熱乾燥などが挙げられるが、乾燥時の収縮が抑えられるという観点からは、凍結乾燥が好ましい。多孔質体を凍結乾燥等により乾燥することによって、脂肪族カルボン酸と水分を同時に除去することが可能である。
本発明の製造方法により得られる多孔質体中の細孔の大きさ(細孔直径)は、通常、10〜300μmである。また、多孔質体を凍結乾燥することにより、シルクフィブロイン多孔質体の乾燥品を得ることができる。
本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、すぐれた力学的特性を有する。すなわち、特許文献4において使用されている有機溶媒であるメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、グリセロール、ジメチルスルフォキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ピリジン、アセトン、アセトニトリルを用いた多孔質体よりも大きな引張り強度を有し、また、相対的に大きな伸びを有する。
また、本発明の製造方法により得られるフィブロイン多孔質体は、吸水量を変えることでその重さを制御することができ、かつ安全性にも問題がないことから、例えば、内視鏡観察下で切除された生体組織を牽引するための重りとして、好適に使用し得る。
その他、本発明の製造方法により得られるフィブロイン多孔質体は、強度・吸水性が高く、かつ安全性にも問題がないことから、創傷被覆材や薬剤徐放担体、止血スポンジ等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体、浄水用途・環境分野における微生物や細菌等の住処になる支持体などに好適に使用することができる。
(シルクフィブロイン溶液の調製)
シルクフィブロイン溶液は、フィブロイン粉末(KBセーレン社製、商品名:「SilkpowderIM」)を9M臭化リチウム水溶液に溶解し、遠心分離で不溶物を除去したのち、超純水に対して透析を繰り返すことによって得た。得られたシルクフィブロイン溶液を透析チューブ中で風乾し濃縮した。この濃縮液に蟻酸水溶液を添加し、シルクフィブロイン濃度が5質量%、蟻酸濃度が2質量%であるシルクフィブロイン溶液を調製した。
(シルクフィブロイン多孔質体の製造)
このシルクフィブロイン溶液をアルミ板で作製した型(内側サイズ;80mm×40mm×4mm)に流し込み、低温恒温槽(EYELA社製NCB−3300)に入れて凍結保存した。
(凍結条件)
凍結は、予め−5℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して2時間保持し、その後、冷却速度3℃/hで槽内が−20℃になるまで、5時間かけて冷却した後、−20℃で5時間保持した。
凍結した試料を自然解凍で室温に戻した後、型から取り出し、超純水に浸漬し、超純水を1日2回、3日間交換することによって、使用した蟻酸を除去した。
含水率(%)=(Wa−Wb)×100/Wa
実施例1において、蟻酸に代えて、酢酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図2に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、プロピオン酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図3に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、酪酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図4に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、コハク酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図5に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、乳酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図6に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、アクリル酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図7に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、2−ブテン酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図8に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、3−ブテン酸を用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図9に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、メタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図10に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、エタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図11に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、イソプロパノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図12に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、ブタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図13に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、t−ブタノールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図14に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、グリセロールを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図15に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、DMSOを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図16に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、DMFを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図17に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、ピリジンを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図18に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、アセトニトリルを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図19に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて、アセトンを用いたこと以外は同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。その力学的特性の評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図20に示す。
特許文献2の実施例8では、シルクフィブロイン水溶液に酢酸溶液を加えてゲル状物を析出させ、得られたゲルを凍結乾燥して多孔質体を得ている。その記載の通りの追試ではゲルを生成しなかったが、下記条件でゲル状物及び多孔質体を得た。
まず、5%シルクフィブロイン水溶液50mLにpH2.65酢酸溶液を130mL加え(この段階でpH3.0)、得られた溶液を5℃で40時間静置したところ、ゲルが生成した。得られたゲルを遠心分離して、上澄み液を除去した後に、−30℃で3時間凍結後、凍結乾燥を50時間行ったところ、多孔質体が得られた。その多孔質体の力学的特性評価結果を表1に示す。また、得られた多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図21に示す。
また、図1によると、実施例1で作製したシルクフィブロイン多孔質体は、比較的薄い壁と数十μmの空孔からなる多孔質構造である。実施例2〜9で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面(図2〜9)についても、ほぼ同様の走査型電子顕微鏡写真を得た。
なお、比較例のシルクフィブロイン多孔質体の断面(図10〜20)も同様の多孔質構造を有するものと、層状構造的なものとがあったが、それら構造と力学的特性との相関は認められなかった。また、比較例12では、明確な多孔質構造を確認することはできなかった。
実施例1〜9で作製したシルクフィブロイン多孔質体の含水率は、比較例1〜11で作製した多孔質体の含水率とほぼ同じであり、94%〜96%の範囲にあることが分かった。なお、比較例12で作製した多孔質体は、非常に脆く、含水率を算出することはできなかった。
なお、上記実施例で得られたシルクフィブロイン多孔質体を培養床として用いて、光合成細菌を培養したところ、細菌の増殖が確認された。
実施例1において、蟻酸に代えて酢酸を用い、アルミ板で作製した型を内側サイズ80mm×40mm×10mmとし、凍結条件を以下としたこと以外は実施例1と同様にして、フィブロイン多孔質体を得た。なお、得られた多孔質体は、実施例1に記載と同様の方法で酢酸を除去した。
(凍結条件)
凍結は、予め−1℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して0.5時間保持し、その後冷却速度3℃/hで槽内が−20℃になるまで、6時間20分かけて冷却した後、−20℃で5時間保持した。凍結した試料を自然解凍で室温に戻した後、型から取り出すことによってフィブロイン多孔質体を得た。該フィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持したものとなった。
該フィブロイン多孔質体について、以下の方法で25%圧縮硬さを測定した。
(圧縮試験による25%圧縮硬さの測定)
得られたフィブロイン多孔質体を純水中に1日静置し完全に吸水させた後、その硬さを圧縮試験機で測定した。圧縮試験機は、(株)島津製作所製EZ Testを、ロードセルは10Nと50Nのものを、ロードプレートは直径8mmのものを使用した。多孔質体を1mm/minの速度で初期厚さの25%圧縮し、その時かかっている荷重を読み取り25%圧縮硬さとした。25%圧縮硬さを図22及び表2に示す。
なお、測定結果は、作製した多孔質体の任意の5箇所、及び異なる日に作成した多孔質体の任意の5箇所、計10箇所について測定を行った平均値(±標準偏差)である。
また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図23に示す。
実施例10において、−1℃に維持した時間を0.5時間から5時間に変えたこと以外は実施例10と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図22及び表2に示す。
実施例10において、−1℃に維持した時間を0.5時間から10時間に変えたこと以外は実施例10と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図22及び表2に示す。また、該フィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図24に示す。
実施例10において、−1℃に維持した時間を0.5時間から50時間に変えたこと以外は実施例10と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図22及び表2に示す。
実施例10において、凍結条件を以下としたこと以外は実施例10と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図25及び表3に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図26に示す。
(凍結条件)
凍結は、予め−5℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して2時間保持し、その後冷却速度0.3℃/hで、槽内が−20℃になるまで、50時間かけて冷却した後、−20℃で5時間保持した。凍結した試料を自然解凍で室温に戻した後、型から取り出すことによってシルクフィブロイン多孔質体を得た。該シルクフィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持したものとなった。
実施例14において、−5℃から−20℃にかけての冷却速度を3℃/hに変えて、その冷却時間を5時間としたこと以外は実施例14と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図25及び表3に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図27に示す。
実施例14において、−5℃から−20℃にかけての冷却速度を6℃/hに変えて、その冷却時間を2.5時間としたこと以外は実施例14と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図25及び表3に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図28に示す。
実施例10において、凍結条件を以下としたこと以外は実施例10と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図29及び表4に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図30に示す。
(凍結条件)
凍結は、予め−1℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して2時間保持し、その後冷却速度3℃/hで、槽内が−20℃になるまで、6時間20分かけて冷却した後、すぐに8℃/hで昇温、融解させた。
実施例17において、槽内温度が−20℃になるまで冷却した後に−20℃で1時間保持した(−20℃に冷却後保持した時間を0時間から1時間に変えた)こと以外は実施例17と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図29及び表4に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図31に示す。
実施例17において、槽内温度が−20℃になるまで冷却した後に−20℃で5時間保持した(−20℃に冷却後保持した時間を0時間から5時間に変えた)こと以外は実施例17と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の25%圧縮硬さを図29及び表4に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図32に示す。
実施例1において、蟻酸に代えて酢酸を用い、アルミ板で作製した型を内側サイズ80mm×40mm×10mmとし、凍結条件を以下としたこと以外は実施例1と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。なお、得られた多孔質体は、実施例1に記載と同様の方法で酢酸を除去して、力学的特性を評価した。得られた多孔質体の引っ張り強度(最大破断強度)と最大破断ひずみ(伸び)を図33及び表5に示す(左側が最大破断強度、右側が最大破断ひずみ(伸び)を示す)。
なお、測定結果は、作製した多孔質体の任意の5箇所、及び異なる日に作成した多孔質体の任意の5箇所、計10箇所について測定を行った平均値(±標準偏差)である。
また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図34に示す。
(凍結条件)
凍結は、予め−1℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して2時間保持し、その後冷却速度3℃/hで、槽内が−20℃になるまで、6時間20分かけて冷却した後、−20℃を5時間保持した。
実施例20において、低温恒温槽を予め冷却しておく温度を−1℃から−3℃に変えた(−20℃までの冷却時間を5時間40分とした)こと以外は実施例20と同様にしてシルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の力学的特性を図33及び表5に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図35に示す。
実施例20において、低温恒温槽を予め冷却しておく温度を−1℃から−5℃に変えた(−20℃までの冷却時間を5時間とした)こと以外は実施例20と同様にしてシルクフィブロイン多孔質体を得た。得られた多孔質体の力学的特性を図33及び表5に示す。また、該シルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図36に示す。
また、創傷被覆材や薬剤徐放担体、止血スポンジ等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体、浄水用途・環境分野における微生物や細菌等の住処になる支持体など種々の産業に適用が可能である。
Claims (7)
- シルクフィブロイン水溶液に脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液をゲル化せずに凍結し、次いで融解することにより、多孔質体を得ることを特徴とするシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 融解後に得られた前記多孔質体を、純水中に浸漬して前記脂肪族カルボン酸を除去する工程又は凍結乾燥して前記脂肪族カルボン酸を除去する工程をさらに含む請求項1に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結前に、過冷却状態となる温度に30分以上保持することを特徴とする請求項1又は2に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記脂肪族カルボン酸の添加量が、シルクフィブロイン溶液中で0.01〜18.0質量%である請求項1〜3のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- シルクフィブロインの濃度が、前記脂肪族カルボン酸を添加したシルクフィブロイン溶液中で0.1〜40質量%である請求項1〜4のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記脂肪族カルボン酸が、炭素数1〜6の飽和又は不飽和のモノカルボン酸、ジカルボン酸、及びトリカルボン酸からなる群から選ばれる1種以上である請求項1〜5のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記脂肪族カルボン酸が、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、乳酸、アクリル酸、2−ブテン酸及び3−ブテン酸からなる群から選ばれる1種以上である請求項6に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
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