CN102388094B - 丝素蛋白多孔质体的制造方法 - Google Patents
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Abstract
一种丝素蛋白多孔质体的制造方法，其特征在于，将在丝素蛋白水溶液中添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体。本发明可以提供一种制造具有优异的力学特性的丝素蛋白多孔质体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及丝素蛋白(silk fibroin)多孔质体的制造方法。
背景技术
能够利用蛋白质、糖类等生物源物质制作的多孔质体已被用于创伤包覆材料、止血海绵、药剂缓释载体等医疗领域，纸尿布、生理用品等生活日用品领域，能有效用作作为微生物、细菌等栖身地的支持体的水净化领域，美容沙龙、个人用的用于保湿等的化妆品/美容领域，组织工程学、再生医学工程学中的细胞培养支持体、组织再生支持体等产业上的广阔领域中。
作为构成这些多孔质体的生体源物质，已知的是纤维素、几丁质等糖类，胶原、角蛋白、丝素蛋白等蛋白质类。
其中，作为蛋白质，胶原是一直以来最常用的，但自从BSE问题出现后，利用来自于牛的胶原已变得越来越困难。此外，角蛋白可以从羊毛、羽毛而获得，但原料的获得方面存在问题，工业上也难以利用。羊毛的原料价格非常昂贵，而羽毛则由于没有销售的市场而无法获得原料。与这些相对，从原料获得的观点来看，丝素蛋白能够期待稳定供给，进而价格也稳定，因此更易于工业利用。
丝素蛋白除用于衣服类用途以外，有着长期以来被用作手术用缝合线的实际应用，目前还被用作食品、化妆品的添加物，对人体的安全性方面也不存在问题，因此能够充分用于上述多孔质体的利用领域。
对于制作丝素蛋白多孔质体的方法，存在几种报道。例如，存在迅速冷冻丝素蛋白水溶液后将其浸渍于结晶化溶剂中，同时进行融解和结晶化从而获得的方法(专利文献1)。然而，该方法需要大量使用作为结晶化溶剂的有机溶剂，进而无法否定溶剂残留的可能性，在医疗领域等上述应用领域中的用途方面存在问题。其次，存在将丝素蛋白水溶液的pH保持在6以下而使其凝胶化或在其水溶液中加入贫溶剂使其凝胶化，并将获得的凝胶冻干而制作多孔质体的方法(专利文献2)。然而，该方法无法获得具有充分强度的多孔质体。此外，还报道了冷冻丝素蛋白水溶液后长时间维持冻结状态从而制作多孔质体的方法(专利文献3)。然而，发明人等的研究发现，该方法缺乏再现性，多数情况下无法制作多孔质体。
对上述丝素蛋白多孔质体的制作方法进行比较并报告了可靠且简便的方法(专利文献4，非专利文献1)。该方法对丝素蛋白水溶液添加少量的有机溶剂后，进行一定时间的冷冻、融解，从而获得丝素蛋白多孔质体。该方法中，由于连少量使用的有机溶剂也通过利用超纯水进行的洗涤工序而除去，几乎不存在残留的有机溶剂，进而获得的含水状态的多孔质体比在此之前报道的多孔质体强度更高，形态稳定性优异。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平8-41097号公报
专利文献2：日本特公平6-94518号公报
专利文献3：日本特开2006-249115号公报
专利文献4：日本专利第3412014号公报
非专利文献
非专利文献：Biomacromolecules，6，3100-3106(2005)
发明内容
虽然强度还取决于多孔质体的使用领域、使用方法，但根据专利文献4的方法制作的多孔质体也存在强度不足的情况，期望进一步提高强度。
因此，本发明的目的在于提供一种制造具有优异的力学特性的丝素蛋白多孔质体的方法。
本发明人等反复进行了深入研究，结果发现通过将在丝素蛋白水溶液中添加脂肪族羧酸而成的溶液冻结，接着将其融解，从而能够获得强度高的多孔质体。
即，本发明提供一种丝素蛋白多孔质体的制造方法，所述方法将在丝素蛋白水溶液中添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体。
根据本发明，能够简便地获得强度高的丝素蛋白多孔质体。
附图说明
图1是实施例1中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图2是实施例2中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图3是实施例3中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图4是实施例4中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图5是实施例5中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图6是实施例6中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图7是实施例7中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图8是实施例8中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图9是实施例9中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图10是比较例1中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图11是比较例2中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图12是比较例3中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图13是比较例4中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图14是比较例5中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图15是比较例6中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图16是比较例7中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图17是比较例8中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图18是比较例9中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图19是比较例10中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图20是比较例11中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图21是比较例12中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图22是表示实施例10～13中制作的丝素蛋白多孔质体的25％压缩硬度的图表。
图23是实施例10中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图24是实施例12中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图25是表示实施例14～16中制作的丝素蛋白多孔质体的25％压缩硬度的图表。
图26是实施例14中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图27是实施例15中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图28是实施例16中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图29是表示实施例17～19中制作的丝素蛋白多孔质体的25％压缩硬度的图表。
图30是实施例17中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图31是实施例18中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图32是实施例19中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图33是表示实施例20～22中制作的丝素蛋白多孔质体的力学特性的图表。
图34是实施例20中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图35是实施例21中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
图36是实施例22中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片。
具体实施方式
本发明的丝素蛋白多孔质体的制造方法的特征在于，将在丝素蛋白水溶液中添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体。
此外，本发明的制造方法中，优选还含有将融解后获得的多孔质体浸渍于纯水中或通过冻干而除去前述脂肪族羧酸的工序。
本发明中使用的丝素蛋白可以是由家蚕、野蚕、天蚕等蚕产生的丝素蛋白中的任意一种，对其制造方法也没有限制。本发明中，以丝素蛋白水溶液形式使用，但丝素蛋白溶解性差，难以直接溶解于水。作为获得丝素蛋白水溶液的方法，可以使用公知的所有方法，简便的方法是，将丝素蛋白溶解于高浓度的溴化锂水溶液后，经历透析脱盐、风干浓缩的方法。
在本发明的丝素蛋白多孔质体的制造方法中，丝素蛋白的浓度在添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白溶液中优选为0.1～40质量％，更优选为0.5～20质量％，进一步优选为1.0～12质量％。通过设定在该范围内，能够高效地制造具有充分强度的多孔质体。
本发明中，对丝素蛋白水溶液中添加的脂肪族羧酸没有特别限制，优选为水溶性的脂肪族羧酸，更优选在水中的溶解度高的脂肪族羧酸。此外，作为本发明中使用的脂肪族羧酸，优选pKa为5.0以下者，更优选为3.0～5.0者，进一步优选为3.5～5.0者。
作为本发明中使用的脂肪族羧酸，可以优选使用例如碳原子数为1～6的饱和或不饱和的一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸，可以列举出例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸、丙烯酸、2-丁烯酸、3-丁烯酸等。这些脂肪族羧酸可以单独使用或者将2种以上组合使用。
丝素蛋白水溶液中添加的脂肪族羧酸的量在丝素蛋白溶液中为0.01～18.0质量％，更优选为0.1～5.0质量％。通过设定在该范围内，能够制造具有充分强度的多孔质体。
在本发明的制造方法中，使在丝素蛋白水溶液中添加脂肪族羧酸而成的溶液流入模具或容器中，放入低温恒温槽中将其冻结，接着将其融解，从而制造丝素蛋白多孔质体。
作为冻结温度，只要是添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白水溶液冻结的温度，就没有特别限制，优选为-1～-40℃左右，更优选-5～-40℃左右，进一步优选-10～-30℃。
作为冻结时间，为了使添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白水溶液充分冻结且能够使冻结状态维持一定时间，优选为2小时以上，进一步优选4小时以上。
作为冻结的方法，可以一次性将添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白水溶液降温至冻结温度进行冻结，但从获得结构均一的丝素蛋白多孔质体方面来看，优选在冻结前将添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白水溶液暂时在4～-9℃左右、优选在0～-5℃左右保持30分钟以上，使反应容器内均一化后，降温至冻结温度进行冻结。进而，在将该保持温度设定为-1～-9℃左右、优选-1℃～-5℃左右时，丝素蛋白水溶液在冻结前成为达到过冷却状态的温度(过冷却温度)，可以获得结构更均一的丝素蛋白多孔质体。此外，通过调整在该过冷却温度下保持的时间、从过冷却温度降温至冻结温度的温度梯度等，能够获得结构更均一的丝素蛋白多孔质体，此外还能在某种程度上控制多孔质体的结构、强度。
之后，将冻结了的丝素蛋白溶液融解，从而可以获得丝素蛋白多孔质体。作为融解的方法没有特别限制，可以列举出自然融解、在恒温槽内保管等。
获得的多孔质体中含有脂肪族羧酸，需要根据用途除去脂肪族羧酸或调整其浓度。这种情况下，可以在制造丝素蛋白多孔质体后通过适当的方法除去多孔质体中的脂肪族羧酸、调整其浓度。具体而言，作为最简便的方法，可以列举出将多孔质体浸渍于纯水中进行透析的方法。
此外，作为在制造丝素蛋白多孔质体后调整水分浓度的方法，可以列举出例如对丝素蛋白多孔质体进行干燥而蒸发水分的方法。作为干燥的方法可以列举出自然干燥、冻干、加热干燥等，从抑制干燥时的收缩的观点出发，优选冻干。通过将多孔质体利用冻干等进行干燥，能够同时除去脂肪族羧酸和水分。
予以说明，根据本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体，可以通过适当选择制作多孔质体时的模具或容器而制成膜状、块状、管状等与目标相应的形状。
根据本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体具有海绵状的多孔质结构，通常若未通过冻干等对该多孔质体除水则会含有水，为含水状态的坚硬的结构物。
根据本发明的制造方法获得的多孔质体中的细孔的大小(细孔直径)通常为10～300μm。此外，通过将多孔质体冻干可以获得丝素蛋白多孔质体的干燥品。
根据本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体具有优异的力学特性。即，与专利文献4中使用的使用了作为有机溶剂的甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、甘油、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶、丙酮、乙腈的多孔质体相比，具有更大的拉伸强度，此外，具有相对较大的伸长(伸び)。
根据本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体吸水性高且安全性方面也不存在问题，因此可以广泛用于以保湿等为目的的化妆品/美容领域等。具体而言，可以合适地用作剥落式面膜(Peeling Pack)、化妆用粉扑。此外，通过改变冻结中使用的容器的形状，可以容易地获得希望形状的多孔质体，因此例如可以合适地用作配合面部形状的面罩(face mask)。
此外，根据本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体由于可以通过改变吸水量而控制其重量且安全性方面不存在问题，因此例如可以合适地用作牵拉在内窥镜观察下切除的生物体组织的重物(重り)。
此外，根据本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体由于强度、吸水性高且安全性方面不存在问题，因此可以合适地用于创伤包覆材料、药剂缓释载体、止血海绵等医疗领域，纸尿布、生理用品等生活日用品领域，组织工程学、再生医学工程学中的细胞培养支持体、组织再生支持体，水净化用途/环境领域中作为微生物、细菌等栖身地的支持体等。
实施例
以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例任何限定。
实施例1
(丝素蛋白溶液的制备)
丝素蛋白溶液如下获得，即，将丝素蛋白粉末(KB SeiRen(KBセ一レン)公司制造，商品名：“Silkpowder IM”)溶解于9M溴化锂水溶液中，通过离心分离除去不溶物后，相对于超纯水反复透析，从而获得。将获得的丝素蛋白溶液在透析管中风干、浓缩。在该浓缩液中加入甲酸水溶液，制备丝素蛋白浓度为5质量％、甲酸浓度为2质量％的丝素蛋白溶液。
(丝素蛋白多孔质体的制造)
使该丝素蛋白溶液流入用铝板制作的模具(内侧尺寸：80mm×40mm×4mm)中，放入低温恒温槽(EYELA公司制，NCB-3300)，冻结保存。
(冻结条件)
就冻结而言，将装入了丝素蛋白溶液的模具投入预先冷却到-5℃的低温恒温槽中保持2小时，然后以3℃/h的冷却速度冷却5小时直至槽内达到-20℃，然后在-20℃下保持5小时。
通过自然解冻使冻结的试样恢复至室温后，将其从模具中取出，浸渍于超纯水中，1天交换2次超纯水，交换3天，从而除去使用的甲酸。
使用INSTRON公司微型试验机5548型对获得的丝素蛋白多孔质体的力学特性进行评价。从制作的丝素蛋白多孔质体切出40mm×4mm×4mm的试验片，在2mm/min的条件下拉伸该试验片，测定此时的拉伸强度(最大断裂强度)和最大(断裂)应变(伸长)。此外，由对强度和应变作图时的斜率求出弹性模量。其结果示于表1。予以说明，测定结果表示的是由制作的多孔质体切出5片试验片并从不同日期制作的多孔质体切出5片试验片、对这10片进行测定而得的平均值。
此外，用电子扫描显微镜观察获得的丝素蛋白多孔质体的结构。电子扫描显微镜使用的是Philips公司制的XL30-FEG，在低真空无蒸镀模式、加速电压10kV下进行测定。予以说明，就丝素蛋白多孔质体的结构而言，并非是观察多孔质体的表面，而是观察切断多孔质体露出的内部。获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图1。
此外，将获得的丝素蛋白多孔质体浸渍在超纯水中，使其含水直至平衡状态，测定湿重量(Wa)。将该多孔质体冻干，充分干燥，测定多孔质体的干燥重量(Wb)。由这些值按照下式算出多孔质体的含水率。结果如后所述。
含水率(％)＝(Wa-Wb)×100/Wa
实施例2
在实施例1中，使用乙酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图2。
实施例3
在实施例1中，使用丙酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图3。
实施例4
在实施例1中，使用丁酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图4。
实施例5
在实施例1中，使用琥珀酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图5。
实施例6
在实施例1中，使用乳酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图6。
实施例7
在实施例1中，使用丙烯酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图7。
实施例8
在实施例1中，使用2-丁烯酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图8。
实施例9
在实施例1中，使用3-丁烯酸代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图9。
比较例1
在实施例1中，使用甲醇代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图10。
比较例2
在实施例1中，使用乙醇代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图11。
比较例3
在实施例1中，使用异丙醇代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图12。
比较例4
在实施例1中，使用丁醇代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图13。
比较例5
在实施例1中，使用叔丁醇代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图14。
比较例6
在实施例1中，使用甘油代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图15。
比较例7
在实施例1中，使用DMSO代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图16。
比较例8
在实施例1中，使用DMF代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图17。
比较例9
在实施例1中，使用吡啶代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图18。
比较例10
在实施例1中，使用乙腈代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图19。
比较例11
在实施例1中，使用丙酮代替甲酸，除此以外同样地获得丝素蛋白多孔质体。其力学特性的评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图20。
比较例12
专利文献2的实施例8中，在丝素蛋白水溶液中加入乙酸溶液，析出凝胶状物，将获得的凝胶冻干，获得多孔质体。在按照该记载的追加试验中，未生成凝胶，按照下述条件获得凝胶状物和多孔质体。
首先，在50mL 5％丝素蛋白水溶液中加入130mL pH2.65的乙酸溶液(该阶段pH为3.0)，将获得的溶液在5℃下静置40小时，结果生成了凝胶。对获得的凝胶进行离心分离，除去上清液后，在-30℃下冻结3小时后，进行50小时冻干，结果获了多孔质体。其多孔质体的力学特性评价结果示于表1。此外，获得的多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图21。
表1
由表1所示的结果可知，使用了脂肪族羧酸的实施例1～9的丝素蛋白多孔质体的拉伸强度，与专利文献4中使用的使用了作为有机溶剂的甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、叔丁醇、甘油、DMSO、DMF、吡啶、乙腈、丙酮的比较例1～11中任何一种丝素蛋白多孔质体的拉伸强度相比均更大。此外，实施例1～9的丝素蛋白多孔质体的最大应变(伸长)也大。进而，实施例1～9中制作的多孔质体与比较例12相比显示出更高的拉伸强度。
此外，根据图1来看，实施例1中制作的丝素蛋白多孔质体是由比较薄的壁和数十μm的空孔构成的多孔质结构。对于实施例2～9中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面(图2～9)，也获得了基本相同的电子扫描显微镜照片。
予以说明，比较例的丝素蛋白多孔质体的剖面(图10～20)虽然也存在具有同样的多孔质结构的部分、和层状结构的部分，但看不到这些结构和力学特性的相关性。此外，比较例12中，无法确认明显的多孔质结构。
可知实施例1～9中制作的丝素蛋白多孔质体的含水率与比较例1～11中制作的多孔质体的含水率基本相同，在94％～96％的范围。予以说明，比较例12中制作的多孔质体非常脆，无法算出含水率。
予以说明，使用上述实施例中获得的丝素蛋白多孔质体作为培养床来培养光合细菌，结果确认了细菌的增殖。
实施例10
在实施例1中，使用乙酸代替甲酸，使由铝板制作的模具的内侧尺寸为80mm×40mm×10mm，使冻结条件为如下，除此以外与实施例1同样地获得丝素蛋白多孔质体。予以说明，获得的多孔质体通过与实施例1所述的同样方法除去乙酸。
(冻结条件)
就冻结而言，将装入了丝素蛋白溶液的模具投入预先冷却到-1℃的低温恒温槽中保持0.5小时，然后以3℃/h的冷却速度冷却6小时20分钟直至槽内达到-20℃，然后在-20℃下保持5小时。通过自然解冻使冻结的试样恢复至室温后，将其从模具中取出，从而获得丝素蛋白多孔质体。该丝素蛋白多孔质体保持了作为模具使用的容器的形状。
对该丝素蛋白多孔质体，通过以下方法测定25％压缩硬度。
(通过压缩试验测定25％压缩硬度)
将获得的丝素蛋白多孔质体在纯水中静置1天使其完全吸水后，利用压缩试验机测定其硬度。压缩试验机使用的是(株)岛津制作所制的EZ Test，负荷元件(load cell)使用的是10N和50N的元件，负荷板使用的是直径8mm的板。以1mm/min的速度将多孔质体压缩初期厚度的25％，读取此时施加的荷重，将其作为25％压缩硬度。25％压缩硬度示于图22和表2。
予以说明，测定结果为对制作的多孔质体的任意的5个位置、和不同日期制作的多孔质体的任意的5个位置共计10个位置测得的平均值(±标准偏差)。
此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图23。
实施例11
在实施例10中，将在-1℃维持的时间从0.5小时变成5小时，除此以外与实施例10同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图22和表2。
实施例12
在实施例10中，将在-1℃维持的时间从0.5小时变成10小时，除此以外与实施例10同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图22和表2。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图24。
实施例13
在实施例10中，将在-1℃维持的时间从0.5小时变成50小时，除此以外与实施例10同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图22和表2。
表2
| 实施例 | 10 | 11 | 12 | 13 |
| 预冷时间(h) | 0.5 | 5 | 10 | 50 |
| 25％压缩硬度(N) | 2.22(±0.103) | 2.19(±0.492) | 4.05(±0.482) | 15.4(±1.311) |
实施例14
在实施例10中，使冻结条件如下，除此以外与实施例10同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图25和表3。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图26。
(冻结条件)
就冻结而言，将装入了丝素蛋白溶液的模具投入预先冷却到-5℃的低温恒温槽中保持2小时，然后以0.3℃/h的冷却速度冷却50小时直至槽内达到-20℃，然后在-20℃下保持5小时。通过自然解冻使冻结的试样恢复至室温后，将其从模具中取出，从而获得丝素蛋白多孔质体。该丝素蛋白多孔质体保持了作为模具使用的容器的形状。
实施例15
在实施例14中，将从-5℃至-20℃的冷却速度变成3℃/h、使其冷却时间为5小时，除此以外与实施例14同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图25和表3。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图27。
实施例16
在实施例14中，将从-5℃至-20℃的冷却速度变成6℃/h、使其冷却时间为2.5小时，除此以外与实施例14同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图25和表3。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图28。
表3
| 实施例 | 14 | 15 | 16 |
| 冷却速度(℃/h) | 0.3℃/h | 3℃/h | 6℃/h |
| 25％压缩硬度(N) | 3.95(±0.804) | 1.91(±0.170) | 1.79(±0.347) |
如实施例10～16所示，在本发明的制造方法中，能够通过控制其冻结条件来控制获得的丝素蛋白多孔的强度。
实施例17
在实施例10中，使冻结条件如下，除此以外与实施例10同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图29和表4。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图30。
(冻结条件)
就冻结而言，将装入了丝素蛋白溶液的模具投入预先冷却到-1℃的低温恒温槽中保持2小时，然后以3℃/h的冷却速度冷却6小时20分钟直至槽内达到-20℃，然后立即以8℃/h升温，使其融解。
实施例18
在实施例17中，在槽内温度冷却至-20℃后在-20℃保持1小时(将冷却至-20℃后的保持时间从0小时变成1小时)，除此以外与实施例17同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图29和表4。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图31。
实施例19
在实施例17中，在槽内温度冷却至-20℃后在-20℃保持5小时(将冷却至-20℃后的保持时间从0小时变成5小时)，除此以外与实施例17同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的25％压缩硬度示于图29和表4。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图32。
表4
| 实施例 | 17 | 18 | 19 |
| -20℃保持时间 | 0h | 1h | 5h |
| 25％压缩硬度/N | 1.78(±0.154) | 1.71(±0.181) | 1.62(±0.117) |
如实施例17～19所示，在本发明的制造方法中，若能够使从-1℃至-20℃的冷却时间为6小时20分和将冻结状态保持一定时间，不论在-20℃下的保持时间为多长，均能够获得同等强度的多孔质体。
实施例20
在实施例1中，使用乙酸代替甲酸，使由铝板制作的模具的内侧尺寸为80mm×40mm×10mm，使冻结条件如下，除此以外与实施例1同样地获得丝素蛋白多孔质体。予以说明，获得的多孔质体通过与实施例1所述的同样方法除去乙酸、进行力学特性评价。获得的多孔质体的拉伸强度(最大断裂强度)和最大断裂应变(伸长)示于图33和表5(左侧表示最大断裂强度，右侧表示最大断裂应变(伸长))。
予以说明，测定结果为对制作的多孔质体的任意的5个位置、和不同日期制作的多孔质体的任意的5个位置共计10个位置测得的平均值(±标准偏差)。
此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图34。
(冻结条件)
就冻结而言，将装入了丝素蛋白溶液的模具投入预先冷却到-1℃的低温恒温槽中保持2小时，然后以3℃/h的冷却速度冷却6小时20分钟直至槽内达到-20℃，然后在-20℃下保持5小时。
实施例21
在实施例20中，将预先冷却低温恒温槽的温度从-1℃变成-3℃(使冷却至-20℃的时间为5小时40分钟)，除此以外与实施例20同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的力学特性示于图33和表5。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图35。
实施例22
在实施例20中，将预先冷却低温恒温槽的温度从-1℃变成-5℃(使冷却至-20℃的时间为5小时)，除此以外与实施例20同样地获得丝素蛋白多孔质体。获得的多孔质体的力学特性示于图33和表5。此外，该丝素蛋白多孔质体的剖面的电子扫描显微镜照片示于图36。
表5
| 实施例 | 20 | 21 | 22 |
| 预冷却温度(℃) | -1 | -3 | -5 |
| 断裂强度(kPa) | 113.2(±9.62) | 83.9(±16.56) | 118.9(±21.68) |
| 断裂应变 | 0.648(±0.138) | 0.561(±0.129) | 0.765(±0.166) |
如实施例20～22所示，在本发明的制造方法中，通过将冻结前的冷却温度设为-1～-5℃左右的达到过冷却状态的温度(过冷却温度)，可以获得具有同等强度的多孔质体。
工业实用性
通过本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体，安全性高且具有优异的力学特性。因此能够应用于医疗领域、适用于人体的领域。具体而言，可以广泛用于化妆品/美容领域等中，作为配合面部形状的面罩是极其有用的。
此外，可以用于创伤包覆材料、药剂缓释载体、止血海绵等医疗领域，纸尿布、生理用品等生活日用品领域，组织工程学、再生医学工程学中的细胞培养支持体、组织再生支持体，水净化用途/环境领域中作为微生物、细菌等栖身地的支持体等各种产业中。
Claims (5)
1.一种丝素蛋白多孔质体的制造方法，其特征在于，将在丝素蛋白水溶液中添加脂肪族羧酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体，
所述脂肪族羧酸为选自碳原子数1～6的饱和或不饱和的一元羧酸、二元羧酸和三元羧酸组成的组中的1种以上，
丝素蛋白的浓度在添加所述脂肪族羧酸而成的丝素蛋白溶液中为1.0～12质量%。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，还含有将融解后获得的所述多孔质体浸渍于纯水中而除去所述脂肪族羧酸的工序或进行冻干从而除去所述脂肪族羧酸的工序。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，其特征在于，在将添加所述脂肪族羧酸而成的丝素蛋白溶液冻结前，在过冷却状态下保持一定时间。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，所述脂肪族羧酸的添加量在丝素蛋白溶液中为0.01～18.0质量%。
5.根据权利要求1所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，所述脂肪族羧酸为选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸、丙烯酸、2-丁烯酸和3-丁烯酸组成的组中的1种以上。
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