CN115227871B - 一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用 - Google Patents

一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用，属于组织工程再生医学领域。本发明提供的丝素蛋白生物材料墨水的制备方法，包括如下步骤：(1)对蚕茧进行脱胶处理，得到脱胶后的丝素蛋白；(2)将所述脱胶后的丝素蛋白溶于甲酸溶液中，溶解后离心，弃上清液，得到高浓度丝素蛋白溶液；(3)在所述高浓度丝素蛋白溶液中添加乙酸溶液或者冰醋酸和1,4‑二氧六环的混合液，即得到所述丝素蛋白生物材料墨水。本发明的方法获得了具有剪切变稀性的丝素蛋白生物材料墨水，不需要复合其他材料就具有3D可打印性，实现了丝素蛋白单一材料的3D打印。

Description

一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及组织工程再生医学领域，具有涉及的是一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用。
背景技术
通过组织工程再生医学的方法再生修复损伤的组织或器官已成为发展趋势。丝素蛋白因具备优异的生物相容性，可生物降解性和透气透氧性，已在组织工程再生医学领域得到广泛应用，并且其生物活性已得到美国食品药品管理局(FDA)的官方认证。
3D打印技术可以制备出复杂可控微型形貌的生物材料，可以精确控制孔径大小，孔隙率和连通率等。人体器官组织结构极其复杂，3D打印技术与传统的技术相比，在仿生复杂结构方面具有明显的优势。但是单纯的丝素蛋白材料由于自身的剪切变稠性、物理不稳定性，以及难以制备出较高浓度和粘度的丝素蛋白溶液，难以满足3D打印生物材料墨水的要求，因此在不复合其他材料的情况下，单纯的丝素蛋白依然难以实现3D打印。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种丝素蛋白生物材料墨水及其制备方法和应用，本发明的方法可以获得具有剪切变稀性的丝素蛋白生物材料墨水，不需要复合其他材料就具有3D可打印性。
本发明首先提供了一种丝素蛋白生物材料墨水的制备方法，包括如下步骤：
(1)对蚕茧进行脱胶处理，得到脱胶后的丝素蛋白；
(2)将所述脱胶后的丝素蛋白溶于甲酸溶液中，溶解后离心，弃上清液，得到高浓度丝素蛋白溶液；
(3)在所述高浓度丝素蛋白溶液中添加乙酸溶液或者冰醋酸和1,4-二氧六环的混合液，即得到所述丝素蛋白生物材料墨水。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述脱胶后的丝素蛋白和甲酸溶液的比为5～10g：200mL；
所述甲酸溶液的质量百分浓度为50％-100％；具体可为90％；
所述脱胶后的丝素蛋白溶于甲酸溶液的方法包括将所述脱胶后的丝素蛋白加入甲酸溶液中，25～70℃加热并搅拌，直至完全溶解；具体的，所述脱胶后的丝素蛋白加入甲酸溶液中后先温室浸泡24～60h，然后再置于50～70℃下搅拌溶液。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述离心为10000～100000rpm离心60～120min；
上述的制备方法，步骤(3)中，所述乙酸溶液和所述高浓度丝素蛋白溶液的体积比为1:10～40；
所述乙酸溶液的质量百分浓度为80％～100％；具体可为90％；
所述冰醋酸和1,4-二氧六环的混合液中，所述冰醋酸和1,4-二氧六环的体积比为4～5:1；
所述冰醋酸和1,4-二氧六环的混合液和所述高浓度丝素蛋白溶液的体积比为1:10～40。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述蚕茧的脱胶处理包括如下步骤：将所述蚕茧加入碳酸钠溶液中，煮沸，冲洗并自然风干。
具体的，所述碳酸钠溶液的质量百分浓度为0.1％～10％；具体可为0.5％；
所述煮沸的次数为1～4次；每次煮沸的时间至少1h；具体可为1h。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的丝素蛋白生物材料墨水。
本发明进一步提供了所述丝素蛋白生物材料墨水在用于制备低温3D打印组织工程支架中的应用。
进一步的，本发明提供了一种组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：以上述的丝素蛋白生物材料墨水作为打印墨水采用3D打印机进行打印；打印后将支架进行冷冻升华干燥，然后将支架置于交联剂中进行交联，再次冷冻升华干燥，得到所述组织工程支架；
所述打印的温度为低温；
具体的，所述低温的温度范围可为-10～-80℃；
所述冷冻升华干燥的具体条件如下：真空度<100mTorr，温度-20～-60℃，时间12～72h；
所述交联剂具体可为包括乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的溶液；
更为具体的，所述交联剂的溶剂为乙醇、水、丙酮和氯仿中的至少一种；具体可为乙醇溶液；
所述交联剂中，所述乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺的浓度可为10～100mmol/L，具体可为50mmol/L；n-羟基琥珀酰亚胺的浓度可为10～100mmol/L，具体可为20mmol/L；
所述交联的温度具体可为0～25℃，更具体可为4℃；时间具体可为12～72h，更具体可为24h。
最后，本发明还提供了上述制备方法制备得到的组织工程支架。
本发明具有如下有益效果：
(1)传统常规方法的丝素蛋白溶液为剪切变稠，不具有3D可打印性；本发明的方法获得了具有剪切变稀性的丝素蛋白生物材料墨水，不需要复合其他材料就具有3D可打印性；本发明实现了丝素蛋白单一材料的3D打印；
(2)本发明采用的低温沉积3D打印技术，打印过程都是在深低温过程中实现的，可以避免传统打印高温给生物材料造成的活性破坏。
附图说明
图1为实施例1制备的丝素蛋白生物材料墨水照片；
图2为实施例1制备的丝素蛋白生物材料墨水的黏度-剪切速率曲线；
图3为通过低温沉积3D打印技术成功打印出的支架；
图4为实施例2制备的丝素蛋白支架大体观；
图5为细胞接种到丝素蛋白支架上的细胞死活染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)的配制方法如下：称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液pH至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，即可得0.01M PBS缓冲液。
实施例1、丝素蛋白生物材料墨水的制备
(1)将挑选干净的蚕茧加入质量百分浓度为0.5％的碳酸钠溶液中(碳酸钠溶液完全浸泡，没过蚕茧即可)，于100℃水浴锅煮沸3遍，每次1h，用玻璃棒将蚕丝取出。用双蒸水清洗2～3次并拧干，自然风干过夜；得到脱胶后的丝素蛋白。
(2)脱胶后的丝素蛋白直接溶于质量百分浓度为90％的甲酸溶液中，按照丝素蛋白:甲酸溶液＝10g:200mL的比例，室温浸泡溶解48h，然后置于60～65℃水浴锅内，磁子搅拌，直到完全溶解，溶解越完全溶液颜色越深，一般为粉红色溶液。
(3)溶解完后，进行离心，以100000rpm，离心120min，弃上清，沉淀即为高浓度丝素蛋白溶液。
该步所得高浓度丝素蛋白溶液虽然也会剪切变稀，但是用其进行3D打印挤出来的生物墨水无法瞬间凝固，故其并不能用于3D打印。
(4)向高浓度丝素蛋白溶液中添加质量百分浓度为90％的乙酸溶液，所述乙酸溶液的体积和所述高浓度丝素蛋白溶液的体积比为1:10，提高丝素蛋白溶液的冰点，有利于3D打印；得到丝素蛋白生物材料墨水。
得到的丝素蛋白生物材料墨水的照片见图1。
图2为丝素蛋白生物材料墨水的黏度-剪切速率曲线(室温测试)，由图2可知，本发明制备的素蛋白生物材料墨水具有剪切变稀特性(图中是两个重复样品的测试)。
实施例2、丝素蛋白生物材料墨水用于低温沉积3D打印
(1)以实施例1制备的丝素蛋白生物材料墨水为打印墨水，采用3D打印机(SUNPALPHA-BP31，上普博源(北京)生物科技有限公司)进行打印；
3D打印的参数设置为：孔径500μm，喷头直径500μm，厚度为1mm，纤维角度为90°，推出速度为0.05mm/s，打印速度为2mm/s，层厚0.05mm，低温冷冻平台为-50℃，打印仓温度为-20℃。
(2)将丝素蛋白生物材料墨水置于打印机料筒中，采用螺旋挤压的方式进行挤出打印，打印的材料会在冷冻平台上迅速固化成型。打印的支架图片见图3。
(3)将冷冻成型的支架放入到冷冻干燥机中升华干燥，冻结形成的冰相在真空条件下(<100mTorr)-60℃升华48h。
(4)将升华干燥后的支架放入交联剂中进行交联，交联的温度为4℃，交联的时间为24h；
所述交联剂为含有乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺(EDAC)与n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的95％(v/v)乙醇溶液，其中，EDAC的浓度为50mmol/L；NHS的浓度为20mmol/L；
(5)交联后用PBS缓冲液清洗，浸泡2h，去除多余的交联剂；三蒸水漂洗后，再次冷冻干燥升华处理(真空条件下(<100mTorr)-60℃升华48h)，得到低温沉积3D打印的丝素蛋白支架，其照片见图4。
将脂肪间充质干细胞(来源于SD大鼠的脂肪组织)接种到上述制备的丝素蛋白支架(10×10×1mm3)上，每个支架接种100万个细胞，等细胞充分粘附后再添加培养液(DMEM/F12，美国Gibco公司)，培养7天后取材，PBS溶液漂洗2遍，添加细胞死/活荧光染液(细胞死活染色试剂盒，美国Invitrogen公司，L3224)染色20min，PBS溶液漂洗2遍，共聚焦显微镜观察。激发绿色荧光和红色荧光的相关参数设置如下：激发波长：535nm和355nm，发射波长：585nm和460nm。结果见图5，由图5可知，细胞接种到丝素蛋白支架上具有很好的细胞活性，说明其具有良好的细胞相容性。

Claims (10)

1.一种组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：以丝素蛋白生物材料墨水作为打印墨水采用3D打印机进行打印；打印后将支架进行冷冻升华干燥，然后将支架置于交联剂中进行交联，再次冷冻升华干燥，得到所述组织工程支架；
所述打印的温度为低温；
所述丝素蛋白生物材料墨水的制备方法，包括如下步骤：
（1）对蚕茧进行脱胶处理，得到脱胶后的丝素蛋白；
（2）将所述脱胶后的丝素蛋白溶于甲酸溶液中，溶解后离心，弃上清液，得到高浓度丝素蛋白溶液；
（3）在所述高浓度丝素蛋白溶液中添加乙酸溶液或者冰醋酸和1,4-二氧六环的混合液，即得到所述丝素蛋白生物材料墨水。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述脱胶后的丝素蛋白和甲酸溶液的比为5~10 g：200 mL；
所述甲酸溶液的质量百分浓度大于等于50%小于100%；
所述脱胶后的丝素蛋白溶于甲酸溶液的方法包括将所述脱胶后的丝素蛋白加入甲酸溶液中，25~70℃加热并搅拌，直至完全溶解。
3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述离心为10000~100000 rpm离心60~120min。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述乙酸溶液和所述高浓度丝素蛋白溶液的体积比为1:10~40；
所述乙酸溶液的质量百分浓度大于等于80%小于100%；
所述冰醋酸和1,4-二氧六环的混合液中，所述冰醋酸和1,4-二氧六环的体积比为4~5:1；
所述冰醋酸和1,4-二氧六环的混合液的体积和所述高浓度丝素蛋白溶液的体积比为1:10~40。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述蚕茧的脱胶处理包括如下步骤：将所述蚕茧加入碳酸钠溶液中，煮沸，冲洗并自然风干。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述碳酸钠溶液的质量百分浓度为0.1%~10%；
所述煮沸的次数为1~4次；每次煮沸的时间至少1 h。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述每次煮沸的时间为1 h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述低温的温度范围为-10~-80℃；
所述冷冻升华干燥的条件如下：真空度<100 mTorr，温度-20~-60℃，时间12~72 h；
所述交联剂为包括乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的溶液；
所述交联的温度为0~25℃，时间为12~72 h。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂的溶剂为乙醇、水、丙酮和氯仿中的至少一种；
所述交联剂中，所述乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺的浓度为10~100 mmol/L；n-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10~100 mmol/L。
10.权利要求1-9中任一项所述的制备方法制备得到的组织工程支架。
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