CN102844363B - 丝素蛋白多孔质体及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明通过含有丝素蛋白和氨基酸的丝素蛋白多孔质体以及丝素蛋白多孔质体的制造方法，从而提供一种不含溶剂、安全性高的多孔质体及其制造方法，所述丝素蛋白多孔质体的制造方法的特征在于，将在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体。

Description

丝素蛋白多孔质体及其制造方法
技术领域
本发明涉及丝素蛋白（silk fibroin）多孔质体及其制造方法。
背景技术
能够利用蛋白质、糖类等生物源物质制作的多孔质体已被广泛应用于创伤包覆材料、止血海绵、药剂缓释载体、索引工具（索引具）等医疗领域，纸尿布、生理用品等生活日用品领域，能有效用作成为微生物、细菌等的栖身地的支持体的净水领域，美容沙龙、个人用的用于保湿等的化妆品·美容领域，组织工程学、再生医学工程学中的细胞培养支持体、组织再生支持体等产业上的领域中。
作为构成这些多孔质体的生物体源物质，已知的是纤维素、几丁质等糖类，胶原、角蛋白、丝素蛋白等蛋白质类。
其中，作为蛋白质，胶原一直以来最为常用，但自从产生BSE问题后，利用来自于牛的胶原逐渐变得非常困难。另外，使用来自于猪的胶原存在新的感染病的问题，使用来自鱼类的胶原存在多孔质体强度的问题而难以实用化。此外，角蛋白可以从羊毛、羽毛得到，但在原料获得方面存在问题，难以在工业上利用。羊毛由于原料价格非常昂贵，羽毛由于没有市场，因此不易获得原料。与它们相对，丝素蛋白可以容易地从蚕丝获得，从原料获得的观点来看，丝素蛋白能够期待稳定供给，而且价格也稳定，因此易于工业利用。
此外，丝素蛋白除用于衣服类用途以外，还有长期一直被用作手术用缝合线的实际成果，目前还被用作食品、化妆品的添加物，在对人体的安全性方面也不存在问题，所以能够充分适用于上述多孔质体的利用领域。
对于制作丝素蛋白多孔质体的方法，存在几种报道。例如，提出了在迅速冷冻丝素蛋白水溶液后将其浸渍于结晶化溶剂中，同时进行融解和结晶化从而获得丝素蛋白多孔质体的方法（专利文献1）。然而，该方法需要使用大量作为结晶化溶剂的有机溶剂，并且也无法否定溶剂残留的可能性，在医疗领域等上述应用领域中的使用方面存在问题。
另外，提出了将丝素蛋白水溶液的pH保持在6以下而使其凝胶化或在其水溶液中添加不良溶剂而使其凝胶化，并将获得的凝胶冻干而制造丝素蛋白多孔质体的方法（专利文献2）。然而，该方法无法获得具有充分强度的多孔质体。
此外，提出了冷冻丝素蛋白水溶液后长时间维持冻结状态从而制造多孔质体的方法(专利文献 3)。然而，根据发明人等的研究，该方法缺乏再现性，多数情况下无法制作多孔质体。
另一方面，报道了与上述丝素蛋白多孔质体的制作方法相比，确实且简便地获得强度高的丝素蛋白多孔质体的方法（专利文献4和非专利文献1）。专利文献4和非专利文献1中提出了在对丝素蛋白水溶液添加少量的有机溶剂后，使其冻结一定时间，然后进行融解，从而可以制造高含水率、且力学强度优异的水凝胶。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平8-41097号公报
专利文献2：日本特公平6-94518号公报
专利文献3：日本特开2006-249115号公报
专利文献4：日本专利第3412014号公报
非专利文献
非专利文献：Biomacromolecules，6，3100-3106(2005)
发明内容
发明要解决的课题
由于通过专利文献4的方法所制作的多孔质体在其制造工序中使用了少量的有机溶剂，因此根据本发明人等的研究，为了除去其残留溶剂，需要使用以大量超纯水进行的透析等的长时间的洗涤工序。此外，即使通过长时间的洗涤而得以将溶剂除去直至检测界限以下的浓度，也可能包含检测界限以下的微量残留溶剂，从而存在无法用在更加要求安全性的领域中这样的问题。
因此，本发明的目的在于，提供不含有机溶剂、安全性优异的丝素蛋白多孔质体以及制造不使用有机溶剂的丝素蛋白多孔质体的方法。
解决课题的方法
本发明人等反复进行了深入研究，结果发现通过使在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的溶液冻结，接着将其融解，能够获得多孔质体。
即，本发明提供一种含有丝素蛋白及氨基酸作为必须成分的丝素蛋白多孔质体和一种丝素蛋白多孔质体的制造方法，该丝素蛋白多孔质体的制造方法的特征在于，使在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得丝素蛋白多孔质体。
发明效果
根据本发明，能够简便地获得安全性高的丝素蛋白多孔质体。
附图说明
图1是实施例1中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图2是实施例2中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图3是实施例3中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图4是实施例5中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图5是实施例9中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图6是实施例12中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图7是实施例13中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图8是实施例14中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图9是实施例15中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图10是实施例16中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图11是实施例17中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图12是实施例18中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图13是实施例19中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图14是实施例20中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图15是实施例21中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图16是实施例22中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图17是实施例23中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图18是实施例24中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图19是实施例25中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
图20是实施例26中制作的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片。
具体实施方式
本发明的丝素蛋白多孔质体的制造方法的特征在于，使在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体。
此外，本发明的丝素蛋白多孔质体的制造方法中，通过将融解后得到的多孔质体浸渍在纯水中进行洗涤，可以调整氨基酸浓度。这里，对于得到的丝素蛋白多孔质体中残留的氨基酸浓度而言，制作多孔质体时添加的氨基酸浓度为最大值，根据洗涤多孔质体的次数、时间等，可以在从0.01质量%到所添加的氨基酸浓度的范围内进行控制。此外，还可以省略该洗涤工序而积极获得含有氨基酸的多孔质体。
本发明中使用的丝素蛋白优选源自由家蚕、野蚕、天蚕等天然蚕、转基因蚕产生的蚕丝，对其制造方法没有限制。本发明中，以丝素蛋白水溶液的形式进行使用，但丝素蛋白对水的溶解性差，难以直接溶解于水。作为获得丝素蛋白水溶液的方法，可以使用公知的任何方法，简便且优选的方法是，将丝素蛋白溶解于高浓度的溴化锂水溶液后，经透析脱盐、风干浓缩的方法。
在本发明的丝素蛋白多孔质体的制造方法中，丝素蛋白的浓度在后述的添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液中优选为0.1～50质量％，更优选为0.5～20质量％，进一步优选为1～12质量％。通过设定在该范围内，能够有效地制造具有充分强度的多孔质体。此外，通过调节丝素蛋白的配合量，可以得到满足需要的强度的丝素蛋白多孔质体。例如，为了得到更高强度的丝素蛋白多孔质体，可以在至50质量%的范围内提高丝素蛋白的配合量从而获得，优选设为30～50质量％，更优选设为40～50质量％。
其次，本发明中，作为向丝素蛋白水溶液中添加的氨基酸，除有害物质外没有特别限制，优选水溶性的氨基酸（水溶性氨基酸），更优选在水中的溶解度高的氨基酸。
作为本发明中使用的氨基酸，例如可以列举，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等一氨基一羧酸，天冬氨酸、谷氨酸等一氨基二羧酸（酸性氨基酸），谷氨酰胺等的二氨基羧酸等脂肪族氨基酸；苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸；脯氨酸、羟基脯氨酸、色氨酸等有杂环的氨基酸等，其中，从容易调整形态、物性的观点考虑，优选酸性氨基酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸等氧氨基酸。
从同样的观点考虑，酸性氨基酸中更优选一氨基二羧酸，特别优选天冬氨酸和谷氨酸，氧氨基酸中更优选羟基脯氨酸。这些氨基酸可以单独使用任一种或者2种以上组合使用。
本发明的制造方法中，氨基酸的配合量在配合有氨基酸的丝素蛋白水溶液中优选为0.01～18质量％，更优选为0.1～5质量％，进一步优选为0.5～2质量％。
作为本发明中使用的氨基酸，从防止丝素蛋白析出的观点出发，优选以水溶液的形式进行使用。本发明中，使用对水的溶解度低的氨基酸时，优选使用在加热的水中溶解氨基酸，之后冷却至30℃以下（例如，室温）的氨基酸水溶液。在该冷却过程中氨基酸析出时，优选使用过滤等方法来除去。
另外，氨基酸中有L性和D型的光学异构体，本发明中，使用L性和D型时，得到的多孔质体未见差异，所以可以使用其中一种氨基酸。
本发明的制造方法中，特别是使用酸性氨基酸的情况下，对于在丝素蛋白水溶液中添加酸性氨基酸而成的丝素蛋白水溶液，冻结前在该溶液不凝固的温度下静置，由此可以得到强度更高的丝素蛋白多孔质体。该添加酸性氨基酸而成的丝素蛋白水溶液的静置只要将该水溶液流入模具或容器中，在规定的温度条件下进行即可。
静置时的温度只要为不凝固的温度就没有特别限制，但如果考虑到不易凝固、溶液不易凝胶化、或丝素蛋白分子不易发生分解，则优选为-5～50℃，更优选-3～20℃，进一步优选3～10℃。静置温度可以通过将丝素蛋白水溶液放置在恒温槽中等进行调节。通过调节静置丝素蛋白水溶液的温度，可以调整所得的丝素蛋白多孔质体的细孔直径、强度，通过将温度设为3～10℃，可以得到细孔直径小、强度高的多孔质体。
对静置丝素蛋白水溶液的时间没有特别限制，但通过调节静置时间，可以得到满足需要的强度的丝素蛋白多孔质体。例如，如果需要强度更高的多孔质体，则将静置时间优选设为10小时以上，更优选设为40小时～300小时，进一步优选设为50小时～300小时。
在本发明的丝素蛋白多孔质体的制造方法中，使在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液流入模具或容器等中，放入低温恒温槽等中使其冻结，接着将其融解，从而制造丝素蛋白多孔质体。
作为冻结的方法，可以一次性将添加氨基酸而成的丝素蛋白水溶液降至冻结温度进行冻结，但为了获得均匀结构的丝素蛋白多孔质体，优选在冻结前将添加氨基酸而成的丝素蛋白水溶液暂时在4～-9℃左右、优选在0～-5℃左右保持30分钟以上，使反应容器内均匀化后，再降至冻结温度进行冻结。此外，在将该保持温度设定为-1～-9℃左右、优选-1℃～-5℃左右时，丝素蛋白水溶液在冻结前成为达到过冷却状态的温度(过冷却温度)，可以获得结构更均匀的丝素蛋白多孔质体。此外，通过调整在该过冷却温度下保持的时间、调整从过冷却温度降至冻结温度的温度梯度等，能够获得结构更均匀的丝素蛋白多孔质体，此外还能在某种程度上控制多孔质体的结构、强度。
接着，将冻结了的丝素蛋白溶液融解，从而获得多孔质体。作为融解的方法，没有特别限制，可以举出自然融解、恒温槽内保管等，但自然融解为简便的方法。
另外，通过本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体可以通过适当选择制作多孔质体时的模具或容器而制成膜状、块状、管状等与目标相应的形状。此外，通过调整作为原料使用的丝素蛋白、氨基酸的配合量，选择氨基酸的种类，可以调整丝素蛋白多孔质体的内部结构和硬度，可以得到具有各种硬度的凝胶状、片状·块状的丝素蛋白多孔质体。
获得的多孔质体中含有氨基酸，在根据用途需要除去氨基酸时，可以通过在纯水中静置、超声波洗涤等方法从多孔质体中除去氨基酸再使用。例如，作为最简便的方法，可以列举出将多孔质体浸渍于纯水中除去氨基酸。
此外，作为在制造丝素蛋白多孔质体后调整水分浓度的方法，可以举出例如，对丝素蛋白多孔质体进行干燥而使水分蒸发的方法。作为干燥的方法，可以列举出自然干燥、冻干、加热干燥等，但从抑制干燥时的收缩的观点出发，优选冻干。
通过本发明的制造方法得到的丝素蛋白多孔质体具有海绵状多孔质结构，通常该多孔质体中含有水，为含水状态。多孔质中含有的水分可以通过自然干燥、冻干、加热干燥等进行控制，但从抑制干燥时的收缩的观点出发，优选冻干。
通过本发明的制造方法得到的多孔质体中的细孔的大小（细孔直径）为1～300μm左右，可以通过调整丝素蛋白与氨基酸的混合比、如上所述冻结时的冷却工艺的条件而在某种程度上进行控制，根据用途来确定。特别是通过进行静置，可以使细孔直径优选为1～50μm这样极小的直径。
本发明中的丝素蛋白多孔质体的拉伸弹性模量可以进行适当调整，但通常为0.04～16（MPa）左右，可以根据用途选择适当硬度的丝素蛋白多孔质体。例如，在优选强度高的多孔质体的用途中，在制作丝素蛋白多孔质体时优选使丝素蛋白水溶液浓度为20%以上，这样可以得到具有非常高强度的多孔质体。这里，通过向丝素蛋白水溶液中添加酸性氨基酸后静置溶液，还可以进一步提高强度。在优选柔软的多孔质体的用途中，在制作丝素蛋白多孔质体时优选使丝素蛋白水溶液浓度为1%～5%，这样可以得到柔软的多孔质体。此外，此处的拉伸弹性模量为：从本发明的丝素蛋白多孔质体切出40mm×4mm×4mm的试验片，在2mm/min的条件下对试验片进行拉伸，对此时的强度和应变进行制图，从斜率求出的数值。
此外，本发明的丝素蛋白多孔质体的孔隙率可以通过调整制作丝素蛋白多孔质体所使用的丝素蛋白水溶液的浓度，根据需要进行适当调整。例如，在需要高孔隙率的用途中，将丝素蛋白水溶液的浓度优选设为10质量%以下，由此可以得到孔隙率90%以上的多孔质体。这里，孔隙率是如下获得的值。首先，将得到的多孔质体在纯水中静置1天，使其完全吸水，进行称量后（湿重量），进行冻结干燥而完全除去多孔质体中的水分，再次进行称量（干燥重量）。接下来，假定水密度为1g/cm3、丝素蛋白的密度为1.2g/cm3、含水状态的丝素蛋白多孔质体的密度为1g/cm3，将根据下式得到的值作为丝素蛋白多孔质体的孔隙率。
孔隙率=（湿重量-干燥重量/1.2）/湿重量×100
这样，通过本发明的制造方法得到的丝素蛋白多孔质体具有非常大的孔隙率，可以在各种用途中显示优越的性能。
本发明的丝素蛋白多孔质体因为不含溶剂，所以安全性高。因此，可以应用于医疗领域、适用于人体的领域。特别是其吸水性高、皮肤触感好、并且安全性也不存在问题，因此可以广泛应用于以保湿等为目的的化妆品·美容领域等。具体而言，可适合用作剥落式面膜（peeling pack）、化妆用粉扑。而且，由于多孔质体中含有氨基酸，因此可以期待角质的保湿效果，在护肤用途等中特别有用。具体而言，可适合用作剥落式面膜、化妆用粉扑。此外，通过改变冻结中使用的容器的形状，可以容易地获得期望形状的多孔质体，因此例如可适合用作适合面部形状的面膜。
此外，本发明的丝素蛋白多孔质体可以通过改变吸水量而控制其重量且安全性方面也不存在问题，因此例如可适合用作用于牵引在内窥镜观察下切除的生物体组织的重物（重り）。
此外，本发明的丝素蛋白多孔质体由于强度·吸水性高且安全性方面也不存在问题，因此可适用于创伤包覆材料、药剂缓释载体、止血海绵等医疗领域，纸尿布、生理用品等生活日用品领域，组织工程学、再生医学工程学中的细胞培养支持体、组织再生支持体，净水用途·环境领域中作为微生物、细菌等的栖身地的支持体等。
此外，本发明的丝素蛋白多孔质体中，特别是凝胶状的多孔质体可适合用作创伤包覆材料，以保湿、改善皮肤粗糙、美白等为目的的化妆品。
对于氨基酸而言，已报道了其各种生理作用，所以对于本发明的含有氨基酸的丝素蛋白多孔质体，也期待由氨基酸所带来的各种效果。将所期待的具体效果记述于下。
已报道了L-精氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸等氨基酸通过涂布所带来的促进创伤治愈的效果，所以对于使用本发明的丝素蛋白多孔质体的创伤包覆材料以及凝胶状外用剂，可期待促进创伤治愈的效果，对于面膜等护肤材料，可期待改善、预防皮肤粗糙的效果。
已报道了L-谷氨酸、L-天冬氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸等多种氨基酸通过涂布对皮肤的保湿效果，所以使用本发明的丝素蛋白多孔质体的面膜等护肤材料可期待其对皮肤的保湿效果。
已报道了L-鸟氨酸、其盐等一部分氨基酸通过在皮肤上涂布所带来的美白效果，所以使用本发明的丝素蛋白多孔质体的面膜等护肤材料可期待其美白效果。
已报道了L-酪氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸等芳香族氨基酸的吸收紫外线的效果，所以使用本发明的丝素蛋白多孔质体的面膜等护肤材料可期待其防晒效果、美白效果等。
通过上述本发明的制造方法制造的丝素蛋白多孔质体含有来自制造工序的氨基酸。因此，本发明另外还提供含有丝素蛋白和氨基酸作为必须成分的丝素蛋白多孔质体。
对于得到的丝素蛋白多孔质体中含有的氨基酸以何种程度残留的定量分析，可以使用范斯莱克（Van Slyke）法、茚三酮法、荧光标记分析、毛细管电泳分析等。氨基酸是由羧基和氨基构成的有机物，但熟知的主要为检测氨基的方法。其中，使用自动氨基酸分析仪（例如，日立L-8500）时，可以简便地进行氨基酸的定性·定量分析。自动氨基酸分析仪通过离子交换树脂而分离氨基酸，之后进行茚三酮显色从而进行检测。对于所得的丝素蛋白多孔质体中残留的氨基酸浓度，制作多孔质体时添加的氨基酸浓度为最大值，根据制作多孔质体后进行洗涤的次数、时间等，多孔质体中的氨基酸浓度可以在从0.01质量%到所添加的氨基酸浓度的范围内进行控制。但是，使用的丝素蛋白并不完全成为多孔质体的成分，可能残留了一部分，所以有必要在测定前使用过滤器等从试验液中除去丝素蛋白。
实施例
以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
实施例1
(丝素蛋白水溶液的制备)
将20g丝素蛋白粉末(KB SEIREN公司制造，商品名：“Silkpowder IM”)添加在400mL 9M溴化锂水溶液中，室温下搅拌4小时进行溶解。离心分离（12,000rpm，5分钟）后，通过倾析法除去沉淀的不溶物后，注入至透析管（Spectrum Laboratories,Inc制，Spectra/PorR1 Dialysis Membrane，MWCO6,000～8,000），相对于从纯水制造装置（Millipore制，DirectQ-UV）取得的超纯水5L进行12小时的透析，并重复5次，接下来在透析管中进行风干浓缩直至体积为1/8左右，得到丝素蛋白水溶液。
取2mL所得的丝素蛋白水溶液至聚苯乙烯制容器中，进行称量后，在预先将内部温度调整为-20℃左右的无氟冰箱（日立制作所制“R-Y370”）的冷冻室中经12小时进行冻结，并在冻结干燥机（EYELA公司制“FDU-1200”）中冻结干燥7小时。从冻结干燥机中取出所得的干燥物并在30秒内进行称量，由重量减少对丝素蛋白水溶液中的丝素蛋白浓度（质量%）进行定量。
（氨基酸水溶液的制备）
量取与上述制备的丝素蛋白水溶液混合时的最终浓度为1质量%的量的L-天冬氨酸（氨基酸），加入加热至80℃的纯水中后，一边为了维持80℃进行加热一边搅拌10分钟，溶解后静置，冷却至室温，得到L-天冬氨酸水溶液（氨基酸水溶液）。
（丝素蛋白多孔质体的制造）
在上述丝素蛋白水溶液中添加L-天冬氨酸水溶液，制备最终丝素蛋白浓度为5质量%、L-天冬氨酸浓度为1质量%的丝素蛋白溶液。
使该丝素蛋白溶液流入用铝板制作的模具（内侧尺寸：80mm×40mm×4mm)中，放入低温恒温槽（EYELA公司制，NCB-3300)，冻结保存。
就冻结而言，预先将低温恒温槽冷却到-5℃，将装入了丝素蛋白溶液的模具投入低温恒温槽中，保持2小时，然后以3℃/h的冷却速度经5小时冷却直至槽内达到-20℃，然后在-20℃下保持5小时。通过自然解冻使冻结的试样恢复至室温后，将其从模具中取出，从而得到丝素蛋白多孔质体。该丝素蛋白多孔质体为保持有作为模具使用的容器形状的硬多孔质体。
对于通过本发明的制造方法得到的丝素蛋白多孔质体，根据使用目的，可以直接使用得到的丝素蛋白多孔质体，也可以除去残留在多孔质体中的水分中的L-天冬氨酸。在本实施例中，将得到的多孔质体浸渍于超纯水中，1天更换2次超纯水，更换3天，从而将使用的L-天冬氨酸除去。
（通过扫描型电子显微镜进行的观察）
用扫描型电子显微镜观察得到的丝素蛋白多孔质体的结构。扫描型电子显微镜使用的是Philips公司制的XL30-FEG，在低真空无蒸镀模式、加速电压10kV下进行测定。另外，就丝素蛋白多孔质体的结构而言，不是观察多孔质体的表面，而是观察切断多孔质体后露出的内部。将获得的丝素蛋白多孔质体的剖面的扫描型电子显微镜照片示于图1。此外，无论有无除去所使用的氨基酸的工序，得到的多孔质体的内部结构基本相同。在该多孔质体中可观察到细孔，其细孔的大小（细孔直径）为10～300μm左右。
（拉伸弹性模量）
使用INSTRON公司的MicroTester-5548型对丝素蛋白多孔质体的力学特性进行评价。从制作的丝素蛋白多孔质体切出40mm×4mm×4mm的试验片，在2mm/min的条件下对该试验片进行拉伸，对此时的强度和应变进行作图，由斜率求出拉伸弹性模量。将其结果示于2。此外，拉伸弹性模量表示：从所制作的多孔质体制作5片试验片，进一步从在不同日制作的多孔质体切出5片试验片，对这10片进行测定而得到的平均值。
（孔隙率）
将得到的丝素蛋白多孔质体在纯水中静置1天，使其完全吸水，进行称量后（湿重量），进行冻结干燥而完全除去丝素蛋白多孔质体中的水分，再进行称量（干燥重量）。假定水密度为1g/cm3、丝素蛋白的密度为1.2g/cm3、含水状态的丝素蛋白多孔质体的密度为1g/cm3，根据下式进行丝素蛋白多孔质体的孔隙率的测定。将其结果示于表2。
孔隙率=（湿重量-干燥重量/1.2）/湿重量×100
实施例2～11
在实施例1中，除了使添加的氨基酸、丝素蛋白浓度、以及进行静置时的静置条件如第2表所示以外，与实施例1同样地进行，获得丝素蛋白多孔质体。这些实施例中得到的丝素蛋白多孔质体与实施例1同样，为保持有作为模具使用的容器形状的硬丝素蛋白多孔质体。对于实施例1、2、3、5和9中得到的丝素蛋白多孔质体，与实施例1同样地进行，将观察到的丝素蛋白多孔质体的内部剖面的扫描型电子显微镜照片分别显示于图2、3、4和5。此外，与实施例1同样地进行，进行各种物性的测定。将得到的结果显示于第2表。
实施例12～24
在实施例1中，除使用第1表中所示的氨基酸代替L-天冬氨酸以外，与实施例1同样地进行，获得丝素蛋白多孔质体。该丝素蛋白多孔质体保持有作为模具使用的容器形状，实施例12～21中得到的丝素蛋白多孔质体有柔软的多孔质体的情况和凝胶状多孔质体的情况。
此外，实施例22～24中得到的丝素蛋白多孔质体为保持有作为模具使用的容器形状的凝胶状多孔质体。对于实施例12～24中得到的丝素蛋白多孔质体，与实施例1同样地进行，将观察到的多孔质体的内部剖面的扫描型电子显微镜照片分别显示于图6～18。在该多孔质体中可观察到细孔，其细孔的大小（细孔直径）为10～300μm左右。
实施例25和26
在实施例1中，除分别使用第1表中所示的L-酪氨酸和L-色氨酸代替L-天冬氨酸以外，与实施例1同样地进行，获得丝素蛋白多孔质体。但由于在使L-酪氨酸和L-色氨酸分别溶解于纯水后的冷却过程中，发生L-酪氨酸和L-色氨酸的析出，因此通过过滤除去析出物。得到的丝素蛋白多孔质体为保持有作为模具使用的容器形状的凝胶状多孔质体。
与实施例1同样地进行，将观察到的多孔质体的内部剖面的扫描型电子显微镜照片分别显示于图19和图20。在任一多孔质体中均可观察到细孔，其细孔的大小（细孔直径）为10～300μm左右。
实施例27和29
（氨基酸含有率）
使用自动氨基酸分析仪（日立制L-8500）对得到的丝素蛋白多孔质体中含有的氨基酸进行定性·定量分析。自动氨基酸分析仪在通过离子交换树脂将氨基酸分离之后，进行茚三酮显色，为了进行检测，不仅进行定量分析，还可同时进行定性分析。但是，使用的丝素蛋白并非完全成为多孔质体的成分，有可能一部分残留在水溶液中，所以在测定前从试验液中除去丝素蛋白。
在最后的超纯水中洗涤实施例1、5、9中制作的丝素蛋白多孔质体的工序中，分别在洗涤前、12小时洗涤后、24小时洗涤后、36小时洗涤后、48小时洗涤后、60小时洗涤后、72小时洗涤后回收试样，回收这些丝素蛋白多孔质体中含有的水分。接下来，使用Millipore公司的Amicon Ultra离心超滤装置（截留分子量：5000和10000）除去丝素蛋白，回收滤液。使用自动氨基酸分析仪对这些滤液进行测定，对含有的氨基酸进行定性·定量分析。试样量为10微升，离子交换树脂为作为阳离子交换树脂的#2622，氨基酸分离时的柱尺寸为4.6mm×60mm，氨捕获时的柱尺寸为4.6mm×40mm，流速为0.30mL/分，检测器使用570nm和440nm的可见光。将所得结果示于第3表。对于所有实施例，可知丝素蛋白多孔质体中的氨基酸随着洗涤时间（次数）逐渐减少。所以，对于所得的丝素蛋白多孔质体中残留的氨基酸浓度，制作多孔质体时添加的氨基酸浓度为最大值，根据制作多孔质体后进行洗涤的次数、时间等，多孔质体中的氨基酸浓度可以在从0至添加的氨基酸浓度的范围内进行控制。此外，洗涤前检测的氨基酸浓度为制作丝素蛋白多孔质体时添加的浓度以下时，认为是由于添加的氨基酸的一部分以某种形式（例如，吸附等）进入了形成多孔质体的丝素蛋白中。
[表1]
第1表
  添加的氨基酸
  实施例1   L-天冬氨酸
  实施例2   L-天冬氨酸
  实施例3   L-天冬氨酸
  实施例4   L-天冬氨酸
  实施例5   L-谷氨酸
  实施例6   L-谷氨酸
  实施例7   L-谷氨酸
  实施例8   L-谷氨酸
  实施例9   L-羟基脯氨酸
  实施例10   L-羟基脯氨酸
  实施例11   L-羟基脯氨酸
  实施例12   L-丝氨酸
  实施例13   L-苏氨酸
  实施例14   L-异亮氨酸
  实施例15   D-苯丙氨酸
  实施例16   L-苯丙氨酸
  实施例17   D-蛋氨酸
  实施例18   L-蛋氨酸
  实施例19   L-脯氨酸
  实施例20   L-亮氨酸
  实施例21   L-缬氨酸
  实施例22   甘氨酸
  实施例23   L-丙氨酸
  实施例24   L-谷氨酰胺
  实施例25   L-酪氨酸
  实施例26   L-色氨酸
  实施例27   L-天冬氨酸
  实施例28   L-谷氨酸
  实施例29   L-羟基脯氨酸
[表2]
第2表
[表3]
第3表
工业实用性
本发明的丝素蛋白多孔质体以及通过本发明的制造方法获得的丝素蛋白多孔质体因安全性优异，因此能够应用于医疗领域、适用于人体的领域。具体而言，可以广泛用于化妆品·美容领域等中，作为适合面部形状的面膜是极其有用的。
此外，可以用于创伤包覆材料、药剂缓释载体、止血海绵等医疗领域，纸尿布、生理用品等生活日用品领域，组织工程学、再生医学工程学中的细胞培养支持体、组织再生支持体，在净水用途·环境领域中作为微生物、细菌等的栖身地的支持体等各种产业中。

Claims (14)

1.一种丝素蛋白多孔质体，其含有丝素蛋白和氨基酸，不含有有机溶剂，该丝素蛋白多孔质体通过将在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解而得到。
2.根据权利要求1所述的丝素蛋白多孔质体，所述氨基酸为酸性氨基酸。
3.根据权利要求1所述的丝素蛋白多孔质体，所述氨基酸为氧氨基酸。
4.根据权利要求2所述的丝素蛋白多孔质体，所述酸性氨基酸为一氨基二羧酸。
5.根据权利要求4所述的丝素蛋白多孔质体，所述一氨基二羧酸为天冬氨酸或谷氨酸。
6.根据权利要求3所述的丝素蛋白多孔质体，所述氧氨基酸为羟基脯氨酸。
7.一种丝素蛋白多孔质体的制造方法，其特征在于，将在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体。
8.根据权利要求7所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，还包含将融解后获得的所述多孔质体浸渍于纯水中而除去氨基酸的工序。
9.根据权利要求7所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，不含将融解后获得的所述多孔质体浸渍于纯水中而除去氨基酸的工序。
10.根据权利要求7～9中任意一项所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，其特征在于，在将添加所述氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结前，在过冷却状态下保持一定时间。
11.根据权利要求7～9中任意一项所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，其特征在于，在将添加所述氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结前，在该溶液不凝固的温度静置10小时以上。
12.根据权利要求7～9中任意一项所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，所述氨基酸的添加量在丝素蛋白溶液中为0.01～18质量％。
13.根据权利要求7～9中任意一项所述的丝素蛋白多孔质体的制造方法，丝素蛋白的浓度在添加所述氨基酸而成的丝素蛋白溶液中为0.1～40质量％。
14.一种丝素蛋白多孔质体的制造方法，其特征在于，将在丝素蛋白水溶液中添加氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结，接着将其融解，从而获得多孔质体，
在将添加所述氨基酸而成的丝素蛋白溶液冻结前，在过冷却状态下保持一定时间，
所述氨基酸的添加量在丝素蛋白溶液中为0.01～18质量％。
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