JP3437430B2 - コラーゲン成形体及びコラーゲン成形体の作製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コラーゲン成形体
の作製法に関する。詳しくは、細胞又は組織を培養する
ための基材、熱傷、創傷、褥瘡または皮膚潰瘍などの皮
膚欠損創に用いて、表皮及び表皮を含む欠損組織を早期
に再建させたり、あるいは、治療するために用いる培養
皮膚に用いられるコラーゲン成形体に関する。

【０００２】

【従来の技術】コラーゲンの成形体は、近年、細胞培養
基材や、培養皮膚等のインプラント基材として用いられ
るようになってきている。コラーゲン成形体は、低抗原
性で生体適合性が良好で、しかも物理的強度も良好であ
り、前記した用途に適した素材として注目されている。
かかるコラーゲン成形体のうち、スポンジ状の成形体が
広い用途に適した材料として製造されることが多い。か
かるスポンジ状の成形体は、通常、次のような方法で作
製されている。第１の方法は、コラーゲンの酸性溶液を
調製し、このコラーゲン溶液をアンモニア雰囲気でゲル
化させた後、必要に応じて系内に存在するアンモニウム
塩を水洗除去し、その後、凍結し、乾燥させてスポンジ
状体とし、さらにＵＶ照射により架橋を施す方法であ
る。第２の方法は、ゲル化工程を、コラーゲン酸性溶液
をリン酸緩衝食塩液等の中性溶液及び／又は塩基性溶液
と直接混合することによりゲル化することにより行い、
その他は第１の方法と同様に行う方法である。第３の方
法は、ゲル化工程を、リン酸緩衝食塩液等の中性溶媒を
用いて低温で中性のコラーゲン溶液を調製し、これを加
温してゲル化することにより行い、その他は第１の方法
と同様に行う方法である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、第１の
方法によって得られたコラーゲン成形体は、通常使用さ
れる生理的条件下では、その使用過程において徐々に収
縮することが知られている。収縮による形態変化、及び
物理的特性の変化は、安定した細胞培養のみならず、培
養皮膚等のインプラントの作製にも不都合を生じてい
る。第２の方法では、コラーゲン酸性溶液に対して添加
する中性溶媒及び／又は塩基性溶媒との混合により、ゲ
ル化に適したｐＨや緩衝能を付与するが、高濃度の酸性
コラーゲン溶液を用いてコラーゲン濃度の高いコラーゲ
ンゲルを作成しようとしても、ゲル化に適したｐＨや緩
衝能を得るためには前記中性溶媒及び／又は塩基性溶媒
を多く用いる必要があり、結果として、コラーゲン濃度
が低下することになり、所望の濃度のコラーゲンゲルを
得ることが困難である。一方、ゲル化に際してのコラー
ゲン濃度の低下を小さくするために高濃度の中性溶媒あ
るいは塩基性溶媒を用いると、コラーゲン酸性溶液の高
粘性とあいまって均一なゲル化が困難である。第３の方
法では、リン酸緩衝食塩液等の中性溶媒に対するコラー
ゲンの低温での溶解性が低いために、この方法によって
も高濃度のコラーゲンゲルの作製は困難である。したが
って、このような問題を生じない、新規なコラーゲン成
形体及びコラーゲン成形体の製造方法が望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、コラーゲ
ン溶液をゲル化する際に、コラーゲン酸性溶液を、生理
的塩類溶液で平衡化してゲル化すると、コラーゲン濃度
の高いゲルを簡易にかつ均質な状態に作製することがで
き、しかも、この過程を経て作製したコラーゲン成形体
を生理的条件下においても顕著な収縮を起こさないこと
を見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明によれば以下の手段が提
供される。 （請求項１）コラーゲンゲル膜を介してコラーゲン溶液
と中性塩類溶液とを接触させて前記コラーゲン溶液をゲ
ル化させる工程を備える、コラーゲン成形体の製造方
法。 （請求項２）前記中性塩類溶液は、生理的塩類溶液であ
る、請求項１記載の方法。 （請求項３）前記生理的塩類溶液は、生理食塩液、生理
食塩液にＫ⁺及び／又はＣａ²⁺を含む生体内に存在する
主要イオンを添加した組成の塩類溶液、平衡塩類溶液、
及び細胞培養液から選択される、請求項２に記載の方
法。 （請求項４）前記コラーゲン溶液のコラーゲン濃度は、
１w/v%以上２w/v%以下である、請求項１〜３のいずれか
に記載の方法。 （請求項５）前記コラーゲン溶液は、酸性のコラーゲン
溶液である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 （請求項６）前記コラーゲン溶液には、ゼラチン、ヒア
ルロン酸、キチン、キトサン、ムコ多糖、並びにポリ乳
酸を含む糖類、ポリグリコール酸、並びにこれらの共重
合体、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチルを含む高分
子、及びフィブリン並びにアルブミンを含むタンパク質
から選択される高分子を含有する、請求項１〜５のいず
れかに記載の方法。 （請求項７）前記コラーゲンゲル膜は、前記コラーゲン
溶液の表面をゲル化して得られる、請求項１〜６のいず
れかに記載の方法。 （請求項８）前記コラーゲンゲル膜は、酸性の前記コラ
ーゲン溶液の表面をアンモニア雰囲気に曝すことにより
形成される、請求項７記載の方法。 （請求項９）請求項１〜８のいずれかに記載の方法によ
り得られる、コラーゲン成形体。 （請求項１０）請求項１〜８のいずれかに記載の方法に
より得られるコラーゲン成形体であって、当該コラーゲ
ン成形体を生理的塩類溶液に浸漬した後の面積保持率が
８５％以上である、コラーゲン成形体。 （請求項１１）ゲル状、乾燥成形体、及びスポンジ状の
いずれかである、請求項９又は１０に記載のコラーゲン
成形体。 （請求項１２）コラーゲンが架橋されている、請求項９
〜１１のいずれかに記載の成形体。 （請求項１３）細胞培養基材、培養皮膚基材、あるいは
創傷被覆材のいずれかである、請求項９〜１２のいずれ
かに記載のコラーゲン成形体。 （請求項１４）請求項９〜１２のいずれかに記載のコラ
ーゲン成形体を培養基材とする培養皮膚。 （請求項１５）コラーゲン成形体の製造方法であって、
コラーゲン溶液の表面のみにコラーゲンゲル膜を形成す
る工程と、前記コラーゲンゲル膜を介してコラーゲン溶
液と中性塩類溶液とを接触させて前記コラーゲン溶液を
ゲル化させる工程、とを備える方法。これらの発明によ
ると、コラーゲンゲル膜を介してコラーゲン溶液中のコ
ラーゲン以外の溶質組成（以下、本溶質組成という。）
が、コラーゲンがゲル化可能な状態に平衡化される。換
言すれば、コラーゲン分子を取り巻く本溶質組成が、コ
ラーゲンがゲル化可能な状態に徐々に移行される。この
ため、均質なコラーゲンゲルが得られる。また、従来の
コラーゲンゲルの作製方法では達成されなかった、コラ
ーゲン濃度や電解質条件でのゲル化が可能となり、従来
にないコラーゲン濃度や性質を備えるコラーゲンゲルが
得られる。かかるコラーゲンゲルはそのままコラーゲン
成形体とされ、あるいは、凍結乾燥等されて他の態様の
コラーゲン成形体とされる。かかるゲルを経て得られる
コラーゲン成形体は、ゲルと同様に均質であり、従来に
ないコラーゲン濃度や性質を備えるコラーゲン成形体と
なっている。

【０００６】この発明において、コラーゲン溶液をコラ
ーゲンを通さないが他の溶質を通すことのできる半透膜
（以下、本半透膜という。）を介して生理的塩類溶液と
接触させることにより該生理的塩類溶液に平衡化してゲ
ル化することが好ましい形態である。本半透膜を用いる
ことにより、簡易にゲル化可能な状態に平衡化され、ま
た、コラーゲン溶液のコラーゲン濃度を大きく低下させ
ることなくゲル化でき、所望のコラーゲン濃度のゲルが
得られる。また、コラーゲン溶液中の本溶質組成を生理
的塩類溶液に平衡化しながらゲル化すると、生理的塩類
条件下で均質にゲル化されたコラーゲンゲルが得られ
る。このため、生理的塩類溶液中に接触しても、収縮し
たりひずんだりすることがないコラーゲン成形体が得ら
れる。

【０００７】また、この発明において、コラーゲン溶液
をコラーゲン溶液の表面をゲル化して得たコラーゲンゲ
ル膜を介して生理的塩類溶液と接触させることにより該
生理的塩類溶液に平衡化してゲル化することも好ましい
態様である。コラーゲンゲル膜は、コラーゲンを通すこ
となく、他の溶質を通すことのできる半透膜であり、本
半透膜に含められる。特に、この態様によると、簡易
に、平衡化し、ゲル化される。

【０００８】本発明は、また、コラーゲン溶液を、コラ
ーゲン溶液中のコラーゲン以外の溶質組成をコラーゲン
がゲル化可能な状態に平衡化してコラーゲンをゲル化す
ることを経て得られるコラーゲン成形体である。また、
コラーゲン溶液をコラーゲンを通さないが他の溶質を通
すことのできる半透膜を介して生理的塩類溶液と接触さ
せることにより、コラーゲン溶液中のコラーゲン以外の
溶質組成を該生理的塩類溶液に平衡化してゲル化するこ
とを経て得られるコラーゲン成形体である。また、コラ
ーゲン溶液をコラーゲン溶液の表面をゲル化して得たコ
ラーゲンゲル膜を介して生理的塩類溶液と接触させるこ
とにより、該生理的塩類溶液に平衡化してゲル化するこ
とを経て得られるコラーゲン成形体である。これらのコ
ラ−ゲン成形体においては、生理的塩類溶液に浸漬後の
成形体の面積保持率が８５％以上であることが好ましい
態様である。さらに、上記したコラーゲン成形体が、細
胞培養基材、培養皮膚基材あるいは創傷被覆材のいずれ
かであることが好ましい態様である。また、上記したコ
ラーゲン成形体を培養基材とする培養皮膚であることが
好ましい態様である。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明では、コラーゲン溶液をゲル
化するのに際して、本溶質組成を、所望のゲル化溶液を
用いて、コラーゲンがゲル化可能な状態に平衡化するこ
とを特徴とするものである。すなわち、この発明による
と、コラーゲンの存在する環境が、コラーゲンを溶解し
ている状態から、所望のゲル化可能状態へと変化され
る。この結果、所望の条件下でのコラーゲンゲル及びコ
ラーゲン成形体を得ることができるというものである。

【００１０】（コラーゲン溶液）コラーゲン溶液中に
は、少なくともコラーゲンを溶質として含有する。コラ
ーゲン溶液を構成するコラーゲンとしては、医療上既に
広く利用され、種々のタイプが市販されている。本発明
では、これらを特に限定することなく使用することがで
きる。好ましくは、入手が容易であること、変性温度が
高いこと等から牛や豚の皮膚や腱などから抽出されたコ
ラーゲンである。さらに、より抗原性を低減させて安全
性を高める必要がある場合には、コラーゲンを例えばペ
プシン等のプロテアーゼ等で処理してテロペプチドをで
きる限り除去したアテロコラーゲンを用いる。さらに、
コラーゲンゲルあるいは成形体の用途に応じて各種型の
コラーゲンを適宜使用する。例えば、真皮の機能を培養
皮膚に付加するためには真皮の主要構成成分に近いＩ
型、III 型を単独であるいは組み合わせて用いることが
好ましい。

【００１１】コラーゲン溶液は、その液性（ｐＨ）を特
に問わないで用いることができる。ただし、コラーゲン
を高濃度に溶解できる溶媒で溶解したものが好ましい。
酸性溶液は、コラーゲンの濃度の高い溶液を調製できる
点において好ましい。また、酸性溶液は、中性塩類溶液
や生理的塩類溶液に平衡化しながらゲル化するのに都合
がよい点でも好ましい。特に、好ましくは、アテロコラ
ーゲンの酸性溶液を用いることができる。コラーゲンの
酸性溶液を調製するには、通常、塩酸、クエン酸、乳酸
等が用いられるが、特に限定しないでその他の無機酸や
有機酸を使用することができる。ただし、得られたコラ
ーゲンゲルあるいは成形体が生体あるいは培養系に対し
て毒性を示さないことが好ましい。そのｐＨは、７未満
の範囲で適宜選択できるが、コラーゲンの溶解性を考慮
すると、好ましくは、５以下、より好ましくは４以下で
ある。また、変性に対する安定性を考慮すると、好まし
くは２以上、より好ましくは３以上である。また、イオ
ン強度に関しては、特に限定するものでなく、本平衡化
過程におけるゲル化が完結可能であればよい。コラーゲ
ン濃度は、０．０５w/v ％以上に調整するのが好まし
く、より好ましくは、１w/v ％以上である。また、２w/
v ％以下に調整するのが好ましい。

【００１２】なお、コラーゲン溶液には、コラーゲンと
ともにゲルを構成する他の高分子を含有させることがで
きる。具体的には、生体適合性のある高分子や、生体内
吸収性高分子、生体分解性高分子等であり、より具体的
には、ゼラチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサンやム
コ多糖のような糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の
合成高分子またはこれらの共重合体、ポリメタクリル酸
ヒドロキシエチル等の高含水高分子、フィブリンやアル
ブミン等のタンパク質を混合することができる。

【００１３】（コラーゲン溶液中の本溶質組成の平衡
化）本発明において、コラーゲン溶液中の本溶質組成を
コラーゲンがゲル化可能状態に平衡化するには、コラー
ゲン溶液を、コラーゲンを通さないが他の溶質を通すこ
とのできる本半透膜あるいはコラーゲンゲル膜を介して
ゲル化溶液と接触させることにより平衡化することが好
ましい。

【００１４】（ゲル化溶液）ゲル化溶液は、本溶質組成
を平衡化する過程、あるいは平衡化が完了した状態にお
いて、コラーゲン溶液側にコラーゲンがゲル化可能な状
態を形成できるものであればよい。すなわち、本溶質組
成が完全に平衡化されるまでのいずれかの段階で、コラ
ーゲン溶液側に、ｐＨ、イオン強度、その他について、
コラーゲンがゲル化可能な溶液条件を付与できるもので
あればよい。ゲル化溶液の組成は、コラーゲン溶液側の
コラーゲン濃度、イオン強度、ｐＨ、緩衝性等を考慮し
て、その組成が設定され、また、どのような状態でゲル
化したいかに応じて適宜設定される。好ましくはｐＨ
は、６〜９に設定される。

【００１５】平衡化を経ることによってコラーゲンゲル
を形成するには、ゲル化溶液は、中性域のｐＨを備えて
いることが好ましい。また、中性塩類溶液であることが
より好ましい。コラーゲン溶液中の本溶質組成を、中性
塩類溶液により、中性塩類溶液に平衡化してゲル化する
と、中性塩類条件下あるいはそれに近似された条件下で
ゲル化されたコラーゲンゲルが得られる。本発明におい
て使用する中性塩類溶液とは、中性域のｐＨを有する塩
類溶液である。このような中性塩類溶液としては、塩化
ナトリウム、塩化カリウム等の各種塩類の溶液を挙げる
ことができる。好ましくは、中性塩類溶液は、ｐＨの緩
衝能を有している。

【００１６】ゲル化溶液は、生理的塩類溶液であること
がより好ましい。コラーゲン溶液の本溶質組成を、生理
的塩類溶液で生理的塩類溶液に平衡化しながらゲル化す
ると、生理的塩類条件下あるいはそれに近似された条件
下でゲル化されたコラーゲンゲルが得られる。かかるコ
ラーゲンゲルは、生理的塩類溶液等、細胞の生存を維持
させるように調製された媒体や生体と接触しても、その
収縮が抑制される。

【００１７】本発明において使用する生理的塩類溶液と
は、細胞の生存に適したｐＨと浸透圧を備えた塩類溶液
である。このような生理的塩類溶液としては、生理食塩
液（0.9 ％NaCl水溶液）、さらには生理食塩液にK ⁺ 、
Ca²⁺等細胞液中の主要なイオンを数種加えた組成の塩類
溶液を挙げることができる。また、Na⁺ 、K⁺ 、Ca²⁺、M
g²⁺のイオンの平衡を保つように調合され、あるいはさ
らに、ｐＨを安定に維持するように緩衝系を加えた塩類
溶液である平衡塩類溶液を挙げることができる。また、
各種細胞培養液を挙げることができる。

【００１８】かかる生理的塩類溶液としては、リンガー
液、リンガー−ロック液、タイロード液、アール液、ハ
ンクス液、ロック液、Morgan、Morton、及びParkerの合
成培養液No.199、Evans らの合成培養液NCTC109 、Park
erらの合成培養液CMRL-1066 、McCoy らの5a培養液、Ea
gle の最小必須培養液、Dulbeccoの改変Eagle 培養液、
Leibovitz のL-15培養液、Ham の合成培養液F12 、Moor
たのRPMI-1640 培養液、Williamsらの培養液E 、Katsut
a らSFM-101 の培養液のDM-160培養液、YamaneらのRITC
80-7培養液、無血清培養液ASF104（RITC62-8）Grace の
昆虫細胞の合成培養液、Schneider の培養液、Mitsuhas
i-Maramoroshの培養液、Knop液、Gautheret の培養液等
を挙げることができる。なお、本発明では、上記した生
理的塩類溶液でなくても、上記した生理的塩類溶液に準
ずる電解質溶液も、生理的塩類溶液と同等に好ましく用
いることができる。

【００１９】（平衡化）ゲル化溶液による平衡化は、本
半透膜で行うことが好ましい。本半透膜は、所望の平衡
化速度が得られるように適宜選択される。コラーゲンと
ともに他の高分子も用いて複合化したコラーゲンゲルを
作製しようとする場合には、当該他の高分子も通さない
ような半透膜を、本半透膜として用いることが好まし
い。この場合、本半透膜は、使用するコラーゲンの分子
量の他、他の高分子の分子量も考慮して適宜選択され
る。

【００２０】平衡化は、コラーゲンゲル膜でも好ましく
行われる。コラーゲンゲル膜によっても、本半透膜と同
等の半透性を得ることができる。コラーゲンゲル膜によ
る平衡化は、通常、コラーゲン酸性溶液の表面のみをゲ
ル化してコラーゲンゲル膜を形成し、このコラーゲンゲ
ル膜を介して、膜の内側にあるコラーゲン酸性溶液とコ
ラーゲンゲル膜の外側のゲル化溶液とを接触させること
により行われる。かかるコラーゲンゲル膜は、コラーゲ
ン酸性溶液の表面を短時間アンモニア雰囲気に曝すこと
により得ることができる。コラーゲンゲル膜によると、
高価な半透膜を使用する必要がない、という利点があ
る。なお、この際、コラーゲンゲル膜の厚みは特に限定
はなく、所望の平衡化速度が得られるように適宜選択さ
れる。また、ゲル構成分子としてのコラーゲンの分子
量、あるいはその他の高分子の分子量も考慮して選択さ
れる。

【００２１】このように、本半透膜あるいはコラーゲン
ゲル膜を介してゲル化溶液と接触させることにより平衡
化すると、コラーゲン溶液のコラーゲン濃度がほぼ維持
されてコラーゲンがゲル化可能な状態となる。したがっ
て、所望のコラーゲン濃度のゲルを得ることができる。
特に、高濃度のコラーゲン濃度のゲルを得ることができ
る。また、平衡化における温度は、コラーゲンが変性し
ない温度であればよい。コラーゲンの線維化は、加温
（一般的には３７℃程度までである。）すると加速され
ることが知られている。したがって、平衡化に際して
は、コラーゲンが変性しないか、あるいは、コラーゲン
のゲル化に障害が生じない範囲で、コラーゲン溶液及び
ゲル化溶液を含む系を２５〜３７℃の範囲で加温するこ
とができる。ただし、本溶質組成が所望のゲル化条件に
まで到達するまでは、コラーゲンの変性をできるだけ避
けるために２５℃未満に保持し、平衡化により所望のゲ
ル化条件が得られた段階で２５〜３７℃に加温すること
が好ましい。

【００２２】なお、コラーゲン溶液として、中性コラー
ゲン溶液を用いる場合には、ゲル化しやすいため、でき
るだけ低温で平衡化を行う。また、平衡化あるいはゲル
化に際して、イオン強度やｐＨ、温度、コラーゲン濃
度、半透膜の性質、コラーゲンゲル膜の厚み等を調整す
ることにより、平衡化時間、ゲル化までの時間、ゲルの
強度、ゲルの性質等を調整することができる。イオン強
度やｐＨ等は、主としてゲル化溶液において調整され
る。コラーゲン濃度は、コラーゲン溶液において調整さ
れる。

【００２３】得られたコラーゲンゲルは、そのままゲル
状のコラーゲン成形体として各種用途に使用できる。ま
た、このゲル状成形体の形態は、フィルム状、棒状、球
状、紡錘状、円筒状等、成形体の用途に応じて選択する
ことができる。さらに、このゲル状コラーゲン成形体を
乾燥したり凍結乾燥したりして、乾燥成形体やスポンジ
状成形体等のコラーゲン成形体とすることができる。こ
れらの各種成形体においては、紫外線照射やガンマー線
照射による架橋や、化学試薬による架橋が可能である。

【００２４】コラーゲンゲルが中性あるいはそれに近似
された条件下でゲル化されていれば、中性条件下に予め
順応したコラーゲンゲルあるいはコラーゲン成形体が得
られる。コラーゲンゲルが生理的条件あるいはそれに近
似された条件下でゲル化されている場合には、生理的条
件下に予め順応したコラーゲンゲルあるいはコラーゲン
成形体が得られる。

【００２５】本発明方法によって得られた各種のコラー
ゲン成形体を、生理的塩類溶液に浸漬した場合、初期状
態における成形体の面積（初期面積）と、生理的塩類溶
液浸漬後に成形体の面積の変化がほぼなくなった状態に
おける成形体の面積（平衡面積）とを測定し、初期面積
に対する平衡面積の割合（％）を、コラーゲン成形体の
面積保持率とすると、本発明のコラーゲン成形体は、８
０％以上の面積保持率を有し、好ましくは、８５％以
上、より好ましくは９０％以上の面積保持率を有する。
初期面積は、コラーゲンゲルについては、生理的塩類浸
漬前の成形体の面積であり、コラーゲンゲルを乾燥して
得たコラーゲン成形体の初期面積は、生理的塩類溶液浸
漬前のコラーゲン成形体が吸水していない乾燥状態の面
積をいうものとする。なお、面積保持率の算出に際して
の初期面積及び平衡面積は、コラーゲン成形体の全体の
面積の他、互いに対応付け可能な一部分の面積とするこ
ともできる。

【００２６】これらの各種成形体は、従来どおり、各種
用途に使用される。特に、細胞、組織、器官あるいは臓
器を培養する培養基材、創傷被覆材、止血材、コンタク
トレンズ、人工角膜、角膜バンテージ材、各種移植材
料、各種組織再生材料、人工弁、ＤＤＳ（Drug Delive
ry System）用材料、として使用される。好ましくは、
培養皮膚基材として用いられ、真皮細胞あるいは表皮細
胞が培養された本発明のコラーゲン成形体は培養皮膚と
して用いられる。

【００２７】特に、生理的塩類溶液に平衡化してゲル化
することを経て得られるコラーゲン成形体を、細胞等の
培養基材として用いた場合において、生理的塩類溶液中
で培養中の基材の収縮が抑制される。皮膚細胞を培養す
る基材として使用して培養皮膚を形成する場合において
も、生理的塩類溶液中で培養中の基材の収縮や培養皮膚
として適用した際の収縮が抑制される。また、熱傷、創
傷、褥瘡あるいは皮膚潰瘍等の創傷被覆材に用いた場合
に、使用中の創傷被覆材の収縮が抑制される。

【００２８】

【発明の効果】本発明によると、コラーゲン溶液をコラ
ーゲン溶液中のコラーゲン以外の溶質組成をコラーゲン
がゲル化可能な状態に平衡化してコラーゲンをゲル化す
るため、従来にない条件下でゲル化されたコラーゲン成
形体が提供される。

【００２９】

【実施例】以下、本発明について、実施例をあげて具体
的に説明する。なお、本発明は、これらの実施例に限定
されるものでは決してない。 （実施例１）本半透膜を利用したアテロコラーゲンゲル
の作製 本実施例では、１w/v ％のアテロコラーゲン塩酸酸性溶
液５０mlを、ゲル化しない状態に保持しながら、スペク
トタム社の半透膜（再生セルロース製チューブ：平面幅
１００ｍｍ、長さ約２００ｍｍ、分画分子量６０００〜
８０００）に封入し、全体に約１２０メッシュサイズの
孔部を備えた金属製枠で、上記チュ−ブが、約５ｍｍ×
約９０ｍｍ×約２００ｍｍのほぼ直方体となるように固
定した。このコラーゲン溶液の封入された半透膜チュー
ブを、２Ｌのリン酸緩衝液（１リットル中に、塩化ナト
リウム8000mg、塩化カリウム200mg 、リン酸一水素ナト
リウム1150mg、リン酸ニ水素カリウム200mg を含有す
る。）に浸漬し、３７℃、約７２時間ゲル化を行った。
この結果、白色のアテロコラーゲンゲルを得た。

【００３０】このゲルを半透膜チューブから離型し、直
径５１ｍｍの円板状に切り出し、その全体を前記リン酸
緩衝液に７日間浸漬した。このゲルにおける浸漬前の底
面積（初期面積）に対する７日間浸漬後の底面積（平衡
面積）の割合は、１００％であった。

【００３１】（実施例２）本半透膜を利用したアテロコ
ラーゲンスポンジ状体の作製 実施例１と同様の方法でゲル化したアテロコラーゲンゲ
ルを凍結乾燥し、アテロコラーゲンスポンジを得た。得
られたスポンジ状体を離型し、前記リン酸緩衝液に８日
間浸漬した。このスポンジ状体における浸漬前の底面積
（初期面積）に対する８日間浸漬後の底面積（平衡面
積）の割合は、９５％であった。

【００３２】（実施例３）表面を予備的にゲル化し、そ
の後ゲル化溶液で平衡化することによるアテロコラーゲ
ンゲルの作製 ポリスチレンケース（内寸９５ｍｍ×６０ｍｍ×１０ｍ
ｍ）に１w/v ％のアテロコラーゲン塩酸酸性溶液１５ml
を入れ、アンモニア雰囲気に６分間静置して、表面のみ
をゲル化した。次いで、このケースの全体を２Ｌの前記
リン酸緩衝液に浸漬し、３７℃で約２４時間ゲル化を行
った。この結果、白色のアテロコラーゲンゲルを得た。
得られたゲルを離型し、前記リン酸緩衝液に１１日間浸
漬した。このゲルにおける浸漬前の底面積（９５ｍｍ×
６０ｍｍの部分、初期面積）に対する１１日間浸漬後の
底面積（平衡面積）の割合は９７％であった。

【００３３】（実施例４）表面を予備的にゲル化し、そ
の後ゲル化溶液で平衡化することによるアテロコラーゲ
ンスポンジ状体の作製 ポリスチレンケース（内寸９５ｍｍ×６０ｍｍ×１０ｍ
ｍ）に１w/v ％のアテロコラーゲン塩酸酸性溶液１５ml
を入れ、アンモニア雰囲気に３分間静置して、表面のみ
をゲル化した。次いで、このケースの全体を２Ｌの前記
リン酸緩衝液に浸漬し、３７℃で約１９時間ゲル化を行
った。この結果、白色のアテロコラーゲンゲルを得た。
このゲルを凍結乾燥し、アテロコラーゲンスポンジ状体
を得た。得られたアテロコラーゲンスポンジ状体を離型
し、紫外線を照射して架橋した。

【００３４】このアテロコラーゲンスポンジ状体の全体
を、１０v/v ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッ
コ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）（以下、ＤＭ
ＥＭ（ＦＣＳ）という。）３０mlに２日間浸漬した。こ
のスポンジ状体において、浸漬前の底面積（ゲル時に９
５ｍｍ×６０ｍｍに対応する部分、初期面積）に対する
２日間浸漬後の底面積（平衡面積）の割合は１００％で
あった。

【００３５】（比較例１）アンモニアガスを利用したア
テロコラーゲンゲルの作製 ポリスチレンケース（内寸９５ｍｍ×６０ｍｍ×１０ｍ
ｍ）に１w/v ％のアテロコラーゲン塩酸酸性溶液１５ml
を入れ、アンモニア雰囲気に２時間静置してゲル化して
白色のアテロコラーゲンゲルを得た。次いで、このゲル
を水洗した後離型し、その全体を２Ｌの前記リン酸緩衝
液に１０日間浸漬した。このゲルにおいて、浸漬前の底
面積（９５ｍｍ×６０ｍｍの部分、初期面積）に対する
１０日間浸漬後の底面積（平衡面積）の割合は６７％で
あった。

【００３６】（比較例２）アンモニアガスを利用したア
テロコラーゲンスポンジ状体の作製 ポリスチレンケース（内寸９５ｍｍ×６０ｍｍ×１０ｍ
ｍ）に１w/v ％のアテロコラーゲン塩酸酸性溶液１５ml
を入れ、アンモニア雰囲気に２時間静置してゲル化して
白色のアテロコラーゲンゲルを得た。次いで、このゲル
を水洗した後、ゲルを凍結乾燥し、アテロコラーゲンス
ポンジ状体を得た。得られたスポンジ状体を離型し、そ
の全体をＤＭＥＭ（ＦＣＳ）に２日間浸漬した。このス
ポンジ状体において、浸漬前の底面積（ゲル時に９５ｍ
ｍ×６０ｍｍに対応する部分、初期面積）に対する２日
間浸漬後の底面積（平衡面積）の割合は７６％であっ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平９−31100（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−11100（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−153156（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−509143（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−501698（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 1/00 C07K 14/78 A61L 15/16 A61L 27/00 C12M 1/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】コラーゲンゲル膜を介してコラーゲン溶液
   と中性塩類溶液とを接触させて前記コラーゲン溶液をゲ
   ル化させる工程を備える、コラーゲン成形体の製造方
   法。
2. 【請求項２】前記中性塩類溶液は、生理的塩類溶液であ
   る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】前記生理的塩類溶液は、生理食塩液、生理
   食塩液にＫ⁺及び／又はＣａ²⁺を含む生体内に存在する
   主要イオンを添加した組成の塩類溶液、平衡塩類溶液、
   及び細胞培養液から選択される、請求項２に記載の方
   法。
4. 【請求項４】前記コラーゲン溶液のコラーゲン濃度は、
   １w/v%以上２w/v%以下である、請求項１〜３のいずれか
   に記載の方法。
5. 【請求項５】前記コラーゲン溶液は、酸性のコラーゲン
   溶液である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】前記コラーゲン溶液には、ゼラチン、ヒア
   ルロン酸、キチン、キトサン、ムコ多糖、並びにポリ乳
   酸を含む糖類、ポリグリコール酸、並びにこれらの共重
   合体、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチルを含む高分
   子、及びフィブリン並びにアルブミンを含むタンパク質
   から選択される高分子を含有する、請求項１〜５のいず
   れかに記載の方法。
7. 【請求項７】前記コラーゲンゲル膜は、前記コラーゲン
   溶液の表面をゲル化して得られる、請求項１〜６のいず
   れかに記載の方法。
8. 【請求項８】前記コラーゲンゲル膜は、酸性の前記コラ
   ーゲン溶液の表面をアンモニア雰囲気に曝すことにより
   形成される、請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】請求項１〜８のいずれかに記載の方法によ
   り得られる、コラーゲン成形体。
10. 【請求項１０】請求項１〜８のいずれかに記載の方法に
    より得られるコラーゲン成形体であって、当該コラーゲ
    ン成形体を生理的塩類溶液に浸漬した後の面積保持率が
    ８５％以上である、コラーゲン成形体。
11. 【請求項１１】ゲル状、乾燥成形体、及びスポンジ状の
    いずれかである、請求項９又は１０に記載のコラーゲン
    成形体。
12. 【請求項１２】コラーゲンが架橋されている、請求項９
    〜１１のいずれかに記載の成形体。
13. 【請求項１３】細胞培養基材、培養皮膚基材、あるいは
    創傷被覆材のいずれかである、請求項９〜１２のいずれ
    かに記載のコラーゲン成形体。
14. 【請求項１４】請求項９〜１２のいずれかに記載のコラ
    ーゲン成形体を培養基材とする培養皮膚。
15. 【請求項１５】コラーゲン成形体の製造方法であって、 コラーゲン溶液の表面のみにコラーゲンゲル膜を形成す
    る工程と、前記コラーゲンゲル膜を介してコラーゲン溶液と中性塩
    類溶液とを接触させて前記コラーゲン溶液をゲル化させ
    る工程、 とを備える、方法。