JP5621487B2 - シルクフィブロイン多孔質体及びその製造方法 - Google Patents
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Description
これら多孔質体を構成する生体由来物質としては、セルロースやキチン等の糖類、コラーゲン、ケラチン、シルクフィブロイン等のタンパク質群が知られている。
一方、用途に応じてシルクフィブロイン多孔質体の特性に対する要求は多様かつ精密となってきている。特に人工心膜、人工脳膜などの用途においては体液等の吸収保持と癒着防止の両立、フェイスマスクなどの用途においては美容液の浸透性と保湿性の両立、創傷被覆剤などの用途においては体液の吸収と揮発防止の両立などの効果が期待される、シルクフィブロイン多孔質体の開発が強く望まれている。
多孔質層は、スポンジ状の多孔質構造を有しており、含水状態で硬い構造物である。多孔質体における多孔質層中の細孔直径は、適宜調整可能であるが、通常1〜300μm程度であり、所望によって1〜50μmという極めて小さいものとすることもできる。該多孔質層の細孔の面積比は好ましくは50〜99%であり、より好ましくは70〜99%、さらに好ましくは90〜99%であり、特に好ましくは95〜99%である。
また、多孔質層の厚さは適宜調整可能であるが、通常0.05〜2cm程度である。
なお、多孔質層及びフィルム層の細孔の面積比、細孔の個数及び細孔直径は、走査型電子顕微鏡写真を、画像解析ソフトImageJ(アメリカ国立衛生研究所製)を用いて画像処理することで測定したものである。細孔の面積比及び個数が上記範囲であれば、多孔質層及びフィルム層の細孔の状態の違いによる効果、例えば上記したような人工心膜、人工脳膜などの用途における体液などの吸収保持と癒着防止の両立、フェイスマスクなどの用途における美容液の浸透性と保湿性の両立、創傷被覆剤などの用途における体液の吸収と揮発防止の両立が顕著となる(以下、本効果のことを、単に本発明の効果と称することがある。)。
空孔率=(湿重量−乾燥重量/1.2)/湿重量×100
このように、本発明のシルクフィブロイン多孔質体は極めて大きい空孔率を有するものであり、様々な用途において、優れた性能を示すものである。
(吸水速度の算出方法)
シルクフィブロイン多孔質体(多孔質層)に純水を100μl滴下し、吸収されるまでの時間を測定した。吸水速度は、測定した時間を用いて、下記の式より算出した値である。測定は5回行い、その平均値を吸水速度とした。
吸水速度(μl/s)=純水滴下量/吸水に要した時間
(蒸発速度の算出方法)
シルクフィブロイン多孔質体(多孔質層)を48時間純水中に浸漬し、完全に吸水させた後、温度:40℃、相対湿度:50%の条件に設定した恒温恒湿槽中で金網上に静置し、10分経過までは1分ごとに、10分以降は2分ごとにその重量を測定し、その変化を水の蒸発量の変化とした。蒸発速度は、静置して1分後から30分までの蒸発量の変化から下記の式より算出した値である。
蒸発速度(g/m2・s)=(蒸発量の変化)/多孔質体表面積
脂肪族カルボン酸としては、特に制限はないが、水溶性のものが好ましく、水への溶解度が高いものがより好ましい。また、本発明において用いられる脂肪族カルボン酸としては、pKaが、5.0以下のものが好ましく、3.0〜5.0のものがより好ましく、3.5〜5.0のものがさらに好ましい。
本発明において用いられる脂肪族カルボン酸としては、特に制限はないが、水溶性を示すものが好ましく、例えば、炭素数1〜6、好ましくは炭素数3〜5の飽和または不飽和のモノカルボン酸、ジカルボン酸、トリカルボン酸を好ましく用いることができ、例えば、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、乳酸、アクリル酸、2−ブテン酸、3−ブテン酸などの不飽和モノカルボン酸;シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸などのジカルボン酸などが好ましく挙げられる。これらの脂肪族カルボン酸は、単独あるいは2種以上組み合わせて使用することができる。
これと同様の観点から、酸性アミノ酸の中でもモノアミノジカルボン酸がより好ましく、アスパラギン酸及びグルタミン酸が特に好ましく、オキシアミノ酸の中でもヒドロキシプロリンがより好ましい。これらのアミノ酸は、いずれか1種を単独であるいは2種以上組み合わせて使用することができる。さらに、機械特性に優れる多孔質体が必要な場合は、モノアミノジカルボン酸を用いることが好ましい。
静置する際の温度は、凝固しない温度であれば特に制限はないが、凝固のしにくさ、溶液のゲル化のしにくさ、あるいはフィブロイン分子の分解の起こりにくさを考慮すると、−5〜50℃であることが好ましく、−3〜20℃がより好ましく、3〜10℃がさらに好ましい。静置する温度は、シルクフィブロイン溶液を恒温槽中に入れるなどして調節できる。シルクフィブロイン溶液を静置する温度を調節することで、得られるシルクフィブロイン多孔質体の細孔直径や強度を調整することができ、温度を3〜10℃とすることで、特に細孔直径が小さく、強度の高い多孔質体が得られる。
凍結温度は、添加剤を含有させたシルクフィブロイン溶液が凍結する温度であれば特に制限されないが、−4〜−40℃が好ましく、−10〜−30℃がより好ましく、−10〜−20℃がさらに好ましい。凍結温度を上記範囲内にすると、良質なシルクフィブロイン多孔質体を再現よく得ることができる。
凍結時間は、十分に凍結し、かつ凍結状態を一定時間保持できるよう、所定の凍結温度で2時間以上であることが好ましく、4時間以上がより好ましい。
過冷却状態とする方法としては、例えば一旦、5〜−10℃程度、好ましくは0〜−5℃程度で、30分以上保持して容器内を均一にして過冷却状態としてから、凍結温度まで下げて凍結することで、均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。静置あるいは過冷却状態から凍結温度までにかける時間を調整することで、多孔質体の構造や強度をある程度制御することが可能であり、例えば、0.1〜2℃/h程度でゆっくり温度を下げると、より高い強度のシルクフィブロイン多孔質体が得られる。
該シートとしては、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体(FEP)やテトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体(PFA)などのフッ素樹脂からなるシート、あるいはポリエチレンテレフタレート(PET)やポリプロピレン(PP)などからなる離型処理されたシートなどが好ましく挙げられる。これらのシートを用いた場合、細孔が少なく平滑なフィルム層を得ることができる。また、フィルム層を設けたくない場合は、ろ紙などといった表面が粗いシートを設けることもできる。これらのシートの採用については、多孔質体の用途に応じて、適宜選択すればよい。
また、シートは、熱伝導を阻害しにくい厚さ1mm以下のものを用いることが好ましい。
(シルクフィブロイン溶液の調製)
シルクフィブロイン水溶液は、シルクフィブロイン粉末(KBセーレン社製、商品名:「フィブロインIM」)を9M臭化リチウム水溶液に溶解し、遠心分離で不溶物を除去したのち、超純水に対して透析を繰り返すことによって得た。得られたシルクフィブロイン水溶液を透析チューブ中で風乾し濃縮した。この濃縮液に添加剤として酢酸水溶液を添加し、シルクフィブロイン濃度が5質量%、酢酸濃度が2質量%であるシルクフィブロイン溶液を調製した。
(多孔質体の製造)
このシルクフィブロイン溶液をアルミ板で作製した型(内側サイズ;80mm×40mm×4mm)に流し込み、低温恒温槽(EYELA社製NCB−3300)に入れて下記条件で凍結保存した。また、型は、その内壁面に接着剤を用いてPTFEシート(厚さ:0.5mm)を貼り付けた型を用いた。
(凍結条件)
凍結は、予め低温恒温槽を−5℃に冷却しておいた低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して2時間保持し、その後3℃/時間の速度で−20℃まで冷却し、そのままの温度で5時間保持した。
凍結した試料を自然解凍で室温に戻してから、型から取り出し、超純水に浸漬し、超純水を1日2回、3日間交換することによって、使用した酢酸を除去した。
(多孔質体の切削)
酢酸を除去して得られたシルクフィブロイン多孔質体を、スライサー(有限会社北島マシンナイフ製KMK−09−0005−HT)を用いて図1に示されるように切削し、2枚のシルクフィブロイン多孔質体(79mm×39mm×1.5mm)を得た。さらに、該多孔質体の全側面にあるフィルム層を、スライサーを用いて切削することで、多孔質層の一方の面にフィルム層が形成したシルクフィブロイン多孔質体を得た。
切削後のシルクフィブロイン多孔質体中の水分を冷凍庫中で凍結後、凍結乾燥機中で完全に乾燥することで乾燥シルクフィブロイン多孔質体を得た。乾燥シルクフィブロイン多孔質体の切削面(多孔質層)と非切削面(フィルム層)にピペットを用いて純水を100μl滴下し、吸収されるまでの時間から吸水速度を次式に従って算出した。測定は5回行い、その平均値を示した。結果は第1表に示す。
吸水速度(μl/s)=純水滴下量/吸水に要した時間
実施例1において、第1−1表に示される添加剤、添加剤の濃度、及び型の材質とした以外は、実施例1と同様にしてシルクフィブロイン多孔質体を作製した。得られた多孔質体について、実施例1と同様に細孔面積比を測定した結果を第1−1表に示す。また、得られた多孔質体について、フィルム層と多孔質層の走査型電子顕微鏡写真を各々図5〜32に示す。
実施例1において、流し込む型をアルミ板で作製した型(内側サイズ;80mm×40mm×4mm)からアルミ板で作製した型(内側サイズ;264mm×205mm×4mm)とした以外は、実施例1と同様にしてシルクフィブロイン多孔質体(サイズ:263mm×204mm×3mm)を作製した。
(蒸発速度の測定)
得られたシルクフィブロイン多孔質体を48時間純水中に浸漬し、完全に吸水させた後、温度:40℃、相対湿度:50%の条件に設定した恒温恒湿槽中で金網上に静置し、10分経過までは1分ごとに、10分以降は2分ごとにその重量を測定した。該重量の変化を水の蒸発量の変化とした。水の蒸発量をグラフ1に示す。またグラフ1の、静置して1分後から30分までの直線部分の傾きから次式に従って算出した水の蒸発速度を第2表に示す。
蒸発速度(g−H2O/m2・s)=(静置して1分後から30分までの直線部分の傾き)/多孔質体表面積
実施例16と同様にして得たシルクフィブロイン多孔質体を、スライサー(有限会社北島マシンナイフ製KMK−09−0005−HT)を用いて厚さ方向で1mm及び2mmのところで切削して、三枚のシルクフィブロイン多孔質体(サイズ:サイズ:263mm×204mm×1mm)を得た。その中心から切削された多孔質層が露出した多孔質体(フィルム層なし)について、実施例16と同様にして蒸発速度を算出した。水の蒸発量をグラフ1に示す。またグラフ1の、静置して1分後から30分までの直線部分の傾きから次式に従って算出した水の蒸発速度を第2表に示す。
実施例16において酢酸に代えて、グルタミン酸を用いたこと以外は実施例16と同様にして多孔質体を作製した。得られたシルクフィブロイン多孔質体を実施例16と同様にして、蒸発速度を算出した。蒸発速度を第2表に示す。
実施例17において酢酸に代えて、グルタミン酸を用いたこと以外は実施例17と同様にして多孔質体を作製した。得られたシルクフィブロイン多孔質体を実施例17と同様にして、蒸発速度を算出した。蒸発速度を第2表に示す。
実施例16において酢酸に代えて、ジメチルスルホキシドを用いたこと以外は実施例16と同様にして多孔質体を作製した。得られたシルクフィブロイン多孔質体を実施例16と同様にして、蒸発速度を算出した。蒸発速度を第2表に示す。
実施例17において酢酸に代えて、ジメチルスルホキシドを用いたこと以外は実施例17と同様にして多孔質体を作製した。得られたシルクフィブロイン多孔質体を実施例17と同様にして、蒸発速度を算出した。蒸発速度を第2表に示す。
*3,鏡面仕上げポリスチレン板(テフロンシートなし)
Claims (6)
- シルクフィブロイン水溶液に添加剤を添加したシルクフィブロイン溶液を凍結する工程、融解する工程、及び切削する工程を順に有し、該添加剤が、脂肪族カルボン酸、及び酸性アミノ酸から選ばれる少なくとも一種であり、該凍結する工程において、その内壁面にフッ素樹脂からなるシート、又は、離型処理されたポリエチレンテレフタレート、若しくはポリプロピレンからなるシートを設けた型又は容器にシルクフィブロイン溶液を流し込むシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記型又は容器が、前記シートを内壁面の一面のみに設け、かつ他の面の内壁面にろ紙を設けたものである請求項1に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記脂肪族カルボン酸が、炭素数1〜6の飽和又は不飽和のモノカルボン酸、ジカルボン酸、及びトリカルボン酸からなる群から選ばれる1種以上である請求項1又は2に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記アミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸及びヒドロキシプロリンからなる群から選ばれる1種以上である請求項1〜3のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- 前記シルクフィブロイン水溶液に添加する添加剤の量が、シルクフィブロイン溶液中で0.01〜18.0質量%である請求項1〜4のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
- シルクフィブロイン溶液中のシルクフィブロイン濃度が、0.1〜50質量%である請求項1〜5のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
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