CN102988416A - 一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型及其建立方法 - Google Patents

一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型及其建立方法 Download PDF

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王�忠
李润生
彭御冰
周娟
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Abstract

本发明提供了一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型的建立方法，包括：(1)利用前列腺间质细胞，按照Mcneal解剖定义，分别提取外周带正常组织和移行带正常组织并从中培养原代间质细胞，鉴定其成份；(2)使用激素非依赖非敏感人源前列腺癌细胞系DU145，按照等细胞数量比混合间质细胞注入裸鼠皮下；(3)肿瘤形成后，在最大肿瘤体积小于400mm3的同一时间点采集标本并鉴定。本发明通过前列腺间质-上皮混合体内培养的方式实现，体现了外周带促进，而移行带抑制肿瘤发生的临床特征，为研究前列腺癌发生的带性差异的机制提供了有力的参考。

Description

一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型及其建立方法
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，具体地说，涉及一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型及其建立方法。
背景技术
前列腺癌(PCa)是西方国家最高发男性恶性肿瘤，在我国也已成为最常见恶性肿瘤之一，就诊时许多患者已属晚期，而去势治疗后易转为激素非依赖性并复发，因此PCa的治疗成为临床难点。PCa绝大多数发生于前列腺外周带，极少数发生于移行带的肿瘤恶性程度也较低。这种带性差异及去势治疗后的高复发率是PCa的重要临床特征，也是研究的热点及难点。有研究认为前列腺外周带及移行带细胞种类存在不同的相对比例，有的认为雄激素受体AR的某些亚型在两者分布比例不同，或者某些种类基因的核酸/蛋白水平差异表达，导致肿瘤发生差异，这些观点均缺乏有力的临床证据支持。对于前列腺癌的治疗，在我国，由于多数前列腺癌患者诊断时已经失去根治手术指证，内分泌治疗及化疗成为主要手段。大部分接受内分泌治疗者最初对去势或联合雄激素阻断治疗敏感，但经过中位时间，存活者中大部分转为激素非依赖性前列腺癌，即HRPC(Hormone refractory prostate cancer)。HRPC表现抗雄撤退治疗或二线内分泌治疗PSA进展。总体来说，前列腺癌的治疗效果不佳，有必要对前列腺癌的发病机制做更加深入的研究，尤其是前列腺癌发生的带性差异。
但是人前列腺癌发生的带性差异，到目前为止，还无法在体外或动物模型中进行复制或模拟，这不仅仅是由于人体前列腺解剖上的特点，而且也是由于对该现象缺乏有效的研究。我们的研究从肿瘤形成的间质-上皮作用出发，使用激素非依赖的前列腺癌细胞系，建立间质-肿瘤上皮混合体内培养的前列腺癌模型，对前列腺癌发生的带性差异进行了模拟。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型及其建立方法。
为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)利用前列腺间质细胞，按照Mcneal解剖定义，分别提取外周带正常组织和移行带正常组织并从中培养原代间质细胞，鉴定其成份；
(2)使用激素非依赖非敏感人源前列腺癌细胞系DU145，按照等细胞数量比混合间质细胞注入裸鼠皮下；
(3)肿瘤形成后，在最大肿瘤体积小于400mm3的同一时间点采集标本并鉴定。
利用上述建立方法获得的肿瘤模型能反应前列腺癌发生带性功能差异。
本发明的有益效果在于：前列腺癌的发生具有带性差异，外周带多发，恶性程度高；移行带少见，恶性程度低，但没有哪种动物或肿瘤模型能够反应前列腺癌发生的这种带性差异。本发明建立了一种间质-肿瘤上皮混合体内模型，体现了外周带促进，而移行带抑制肿瘤发生的临床特征，为研究前列腺癌发生的带性差异的机制提供了有力的参考。
附图说明
图1为外周带及移行带间质细胞原代培养(第4代)对比，细胞免疫组化染色，200×Vimentin，200×α-SMA，200×Smoothelin。Vimentin在两种细胞均为100％染色，而α-SMA阳性比例在PPSC较PTSC略多，Smoothelin阳性染色在PPSC较PTSC明显较多。
图2为不同来源人正常前列腺间质细胞与DU145体内成瘤模型肿瘤生长曲线比较。
图3为不同来源人正常前列腺间质细胞与DU145体内成瘤模型肿瘤重量比较。
图4为Ki67在各肿瘤组免疫组化表现及IPP图像分析比较。
图5为TUNEL7在各肿瘤组免疫组化表现及IPP图像分析比较。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。
实施例一：前列腺肿瘤模型的建立。
1、前列腺肿瘤模型的建立，包括以下步骤：
(1)利用前列腺间质细胞，按照Mcneal解剖定义，分别提取外周带正常组织和移行带正常组织并从中培养原代间质细胞，鉴定其成份，分别命名为PPSC与PTSC；
(2)使用激素非依赖非敏感人源前列腺癌细胞系DU145，按照等细胞数量比混合二种间质细胞注入裸鼠皮下，分组为PPSC-DU145(PD组)，PTSC-DU145(TD组)，DU145(DU组)单独注射组，每种细胞在每只裸鼠皮下均注射2×106个；
(3)肿瘤形成后，在最大肿瘤体积小于400mm3的同一时间点采集标本并鉴定。
2、肿瘤形成差异的验证方法，包括以下步骤：
(1)从注射后形成第一个肉眼可见瘤体开始，按照每周一次的频率，测量肿瘤的长、宽；按照公式Volumn＝length×width2/2计算肿瘤体积，绘制生长曲线，比较不同实验组生长速率；
(2)在肿瘤形成后4～5周，按照同一时间节点，处死所有存活裸鼠，切取肿瘤，称量重量；
(3)RNA抽提后，使用cDNA表达谱芯片，验证细胞周期相关信号通路在不同肿瘤组的表达差异；通过Ki67/TUNEL免疫组化，验证不同实验组的肿瘤的细胞增殖/凋亡水平；
(4)GO分析芯片结果，提示细胞周期相关基因，核分裂相关基因，细胞分裂增殖相关基因等表达差异最明显。Patyway提示了六个细胞信号通路(DNAReplication，Cell Cycle，P53 signaling，Mitotic，G1/S Transition，mRNA Splicing-Minor Pathway，cyclins and cell cycle regulation.)的差异表达最大。
研究显示，外周带及移行带间质细胞原代培养对比，细胞免疫组化染色，PPSC所含的肌纤维母细胞及平滑肌细胞成份较PTSC多如图1。
皮下注射后4周，PD组开始成瘤，DU组及TD组至5周始成瘤，皮下注射9周后，所有裸鼠统一处死取瘤。统计生长曲线，PD组与DU组及TD组均存在统计学差异(P＜0.05)。肿瘤湿重统计三组两两间均有差异如图2、图3(P＜0.05)。
各组肿瘤的细胞增殖凋亡率存在差异，使用Ki67/TUNEL试剂盒检测PD，DU，TD的细胞增殖情况呈现梯度下降的表现，而凋亡则无明显差异如图4、5。图4显示，PD组肿瘤的KI167染色明显多于DU及TD组(×100，1∶200)，并且分布范围较另二组广泛，IPP软件按照完全相同条件选取及统计总IOD值，PD组的阳性表达高于DU及TD组(two way ANOVA，P＜0.01)，DU组高于TD组但两者之间差异无统计意义(P＝0.1023)。图5显示，PD、DU、TD组的TUNEL染色情况无明显差异(×100，1∶200)，表明各组肿瘤的凋亡水平类似。
各组的肿瘤基因表达谱芯片检测结果及qRTPCR验证，提示P值＜0.05的基因共3643个，其中PD组相较DU组上调的2172个，下调的1471个，DU组相较TD组，上调的2337个，下调的1306个，PD组相较TD组上调的3177个，下调的466个。GO分析提示细胞周期相关基因，细胞有丝分裂相关基因，核分裂相关基因，细胞器分裂增殖相关基因等表达差异最明显。Patyway提示了六个细胞信号通路(DNA Replication，Cell Cycle，P53 signaling，Mitotic，G1/STransition，mRNA Splicing-Minor Pathway，cyclins and cell cycle regulation.)的差异表达最大。总之，上述分析基本提示了在PD、DU、TD肿瘤的基因表达中，最主要的差异集中在细胞分裂、代谢、周期调控的相关基因和细胞信号传导通路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)利用前列腺间质细胞，按照Mcneal解剖定义，分别提取外周带正常组织和移行带正常组织并从中培养原代间质细胞，鉴定其成份；
(2)使用激素非依赖非敏感人源前列腺癌细胞系DU145，按照等细胞数量比混合间质细胞注入裸鼠皮下；
(3)肿瘤形成后，在最大肿瘤体积小于400mm3的同一时间点采集标本并鉴定。
2.利用权利要求1所述的建立方法获得的反应前列腺癌发生带性功能差异的肿瘤模型。
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