CN104774925B - Brca2的3′非翻译区在制备肿瘤诊断、治疗和预后试剂中的应用 - Google Patents
Brca2的3′非翻译区在制备肿瘤诊断、治疗和预后试剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了BRCA2的3′非翻译区在制备肿瘤诊断、治疗和预后试剂中的应用。本发明发现多种肿瘤细胞系中BRCA2‑3’UTR的RNA表达水平升高；且发现miR‑145结合于BRCA2‑3’UTR，抑制miR‑145表达量，BRCA2‑3’UTR表达上调，癌症干细胞成球率升高和小鼠体内成瘤能力增强，另外，特异锁核酸LNA抑制BRCA2‑3’UTR表达、发挥正常功能时，癌症干细胞成球率下降及体内成瘤能力减弱，结果表明BRCA2‑3’UTR能够增强癌症干细胞自我更新能力，促进癌症细胞呈现癌症干细胞样表型。BRCA2‑3’UTR的表达有望成为癌症治疗的潜在靶点，本发明对于更好地理解癌症的发生机理，制定癌症风险评估和早期检测的有效措施具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及BRCA2的3’UTR的新应用，特别涉及BRCA2的3’UTR在制备肿瘤诊断、治疗和预后试剂中的应用。
背景技术
世界卫生组织的国际癌症研究机构(International Agency for Research onCancer , IARC)发布的全球肿瘤流行病统计数据（GLOBOCAN）表明：2012年全球新增约1,410万例癌症病例，癌症死亡人数达820万（相当于全年总死亡人数的14.6%）。男性最常见的癌症包括肺癌、前列腺癌、大肠直肠癌、以及胃癌；女性最常见的则是乳腺癌、大肠直肠癌、子宫颈癌和肺癌。由于DNA的损伤会随着年龄而累积增加，人们生活方式的改变，以及全球人口增长和老龄化，全球的罹癌率整体而言持续走高，预计至2025年癌症新增发病将高达1930万例。癌症的筛查、早期诊断及治疗尤为迫切，而肿瘤相关的发病机制尚未完全清楚，通过对癌症相关基因改变的研究，寻找与癌症发生相关的不稳定基因，探究癌症干细胞与癌症发生发展的相关机制。癌症干细胞是指具有干细胞性质的癌细胞，即具有无限自我更新潜能以及多细胞分化的能力，是造成癌症转移、复发，是肿瘤产生耐药性以及对放化疗法产生抗性的重要原因。针对癌症干细胞标志物的研究可帮助探究更有效的癌症早期诊断和治疗手段，是当前癌症基因领域的一个重要研究方向，同时能够为肿瘤药物的研制提供新的靶点。
BRCA2基因（Breast cancer 2, early onset, GenBank 登录号：NM_000059.3）：编码蛋白为肿瘤抑制因子BRCA2，这种蛋白主要涉及基因组稳定性的维持，特别是对双链DNA修复的同源重组通路的调节。BRCA2在多种肿瘤中，转录水平得到上调，蛋白表达却被抑制，提示可能是BRCA2-3’UTR，抑制了翻译，且BRCA2的RNA过度表达提示了癌症的预后不佳，但目前其在肿瘤生长中的相关机制尚不明确。关于转录因子BRCA2涉及癌症发生发展的报道日益增多，而BRCA2-3’UTR与癌症相关的研究还是相对较少的，BRCA2-3’UTR所促进癌症生长发展的机制仍需进一步地阐明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种肿瘤预后试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种肿瘤治疗药剂。
本发明所采取的技术方案是：
BRCA2的3′ 端非翻译区作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
一种肿瘤检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测BRCA2的3′端非翻译区BRCA2-3’UTR的试剂。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（SEQ ID NO：1）和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（SEQ ID NO：2）。
进一步的，上述肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
进一步的，上述试剂盒中含有能够定量PCR检测BRCA2-3’UTR的试剂。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量检测BRCA2-3’UTR的引物序列。
进一步的，上述试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（SEQ ID NO：1）和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（SEQ ID NO：2）。
一种肿瘤治疗药剂，该药剂中含有能够特异性沉默BRCA2-3’UTR的试剂。
进一步的，上述能够特异性沉默BRCA2-3’UTR的试剂为锁核酸序列LNA-1：5'-ATTCCAGTCTTA-3'（SEQ ID NO：3），其中斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰；或者为锁核酸序列LNA-2：5'- ATTCCAGTCTTA -3'（SEQ ID NO：4）其中斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰。
进一步的，上述肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现BRCA2-3’UTR能够增强癌症干细胞自我更新能力，促进癌症细胞呈现癌症干细胞样表型，增强癌症干细胞成球率升高及在体内成瘤的能力，而降低BRCA2-3’UTR表达或抑制BRCA2-3’UTR发挥正常功能时，癌症干细胞成球率下降和体内成瘤能力减弱，故BRCA2-3’UTR的表达有望成为癌症治疗的潜在靶点，本发明对于更好地理解癌症的发生机理，制定癌症风险评估和早期检测的有效措施具有及其重要意义。
本发明首次发现通过实时荧光定量PCR检测BRCA2的3′端非翻译区BRCA2-3’UTR，作为肿瘤检测和预后的靶点；特异性沉默BRCA2-3’UTR的锁核酸序列LNA用作肿瘤治疗药剂。
附图说明
图1为多种肿瘤细胞中BRCA2在转录水平的表达情况；TCGA数据分析BRCA2在16种肿瘤中的转录表达情况，包括乳腺浸润性癌(BRCA)，子宫内膜癌(UCEC)，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌(CESC)，前列腺癌(PRAD)，肺腺癌(LUAD)，肺鳞癌(LUSC)，食管癌(ESCA)，胃腺癌(STAD)，肝细胞癌(LIHC)，胰腺癌(PAAD)，结肠腺癌(COAD)，甲状腺癌(THCA)，肾脏肾透明细胞癌(KIRC)，肾脏肾乳头状细胞癌(KIRP)，膀胱尿路上皮癌(BLCA)，头颈部鳞状细胞癌(HNSC)；肿瘤组织（T）与非肿瘤组织（N）中BRCA2的mRNA表达量中位值的比值为T/N，热图中颜色深浅代表的是log2(T/N)值；
图2为BRCA2 mRNA在多种肿瘤细胞中的表达水平，包括乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231，卵巢癌细胞系SK-OV-3、TOV-21G，肺癌细胞株A549、Calu3，肝癌细胞系Bel-7402、HepG2，胃癌细胞系MKN28、MGC803，食管癌细胞系Eca109、Eca9706；误差线表示三次独立实验产生的标准差 (SD)；
图3为癌症组织中BRCA2基因表达情况与患者总体生存的关系曲线； A为乳腺癌，BRCA2低表达（n=563）与BRCA2高表达（n=552）；B为卵巢癌，BRCA2低表达（n=1166）与BRCA2高表达（n=415）；C为肺癌，BRCA2低表达（n=971）与BRCA2高表达（n=955）；D为胃癌，BRCA2低表达（n=381）与BRCA2高表达（n=212），Log-rank检验进行BRCA2低表达（红线）与BRCA2高表达（黑线）两组患者的生存曲线比较具有显著性差异（乳腺癌，P=0.009；卵巢癌，P=0.028；肺癌，P<0.001；胃癌，P=0.042）；
图4 A. TargetScan预测BRCA2-3’UTR的microRNA靶位点，位于BRCA2碱基位置10539-10545；B. 为miR-145与BRCA2-3’UTR的结合作用，RIP实验分析，沉淀下来的microRNA由荧光定量PCR分析，U6作为内参；
图5为BRCA2-3’UTR促进癌细胞的干细胞特性，A.利用antagomiR-145抑制MDA-MB-231细胞中miR-145的表达，实时荧光定量PCR分析BRCA2-3’UTR的表达水平，GAPDH用作管家基因；B. 癌症干细胞成球实验分析，抑制miR-145的实验组细胞的成球率明显高于对照组细胞；C. 利用LNA结合MDA-MB-231细胞中的BRCA2-3’UTR，实时荧光定量PCR分析BRCA2-3’UTR的表达水平，GAPDH用作管家基因；D. 癌症干细胞成球实验分析，LNA组细胞的成球率明显低于对照组细胞；误差线表示三次独立实验产生的标准差 (SD)；E为在BRCA2-3’UTR的miR-145靶位点处设计LNA序列（其中粗斜体及下划线的碱基为LNA修饰）；
图6为BRCA2-3’UTR促进小鼠体内成瘤。A. 测量antagomiR-145处理实验组和对照组中小鼠体内的成瘤大小；B. 测量LNA处理实验组和对照组中小鼠体内的成瘤大小。
具体实施方式
BRCA2的3′ 端非翻译区作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
一种肿瘤检测试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测BRCA2的3′端非翻译区BRCA2-3’UTR的试剂。
优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列。
更优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（SEQ ID NO：1）和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（SEQ ID NO：2）。
优选的，上述肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
一种肿瘤的预后试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测BRCA2-3’UTR的试剂。
优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列。
更优选的，上述试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（SEQ ID NO：1）和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（SEQ ID NO：2）。
优选的，上述肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
一种肿瘤治疗药剂，该药剂中含有能够特异性沉默BRCA2-3’UTR的试剂。
优选的，上述能够特异性沉默BRCA2-3’UTR的试剂为锁核酸序列LNA-1：5'-ATTCCAGTCTTA-3'（SEQ ID NO：3），其中斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰；或者为锁核酸序列LNA-2：5'- ATTCCAGTCTTA -3'（SEQ ID NO：4）其中斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰。
优选的，上述肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1：BRCA2在肿瘤中表达上调
（1）TCGA数据库分析
方法：为了探讨BRCA2在肿瘤中的表达情况，应用生物学分析方法分析The CancerGenome Atlas (TCGA) 公共数据库的16种肿瘤中RNA表达数据，包括女性生殖系统癌症：乳腺浸润性癌(Breast invasive carcinoma, BRCA)，子宫内膜癌(Endometrial Carcinoma,UCEC)，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌(Cervical squamous cell carcinoma andendocervical adenocarcinoma, CESC)；男性生殖系统癌症：前列腺癌(Prostateadenocarcinoma, PRAD)；呼吸系统癌症：肺腺癌(Lung adenocarcinoma, LUAD)，肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma, LUSC)；消化系统癌症：食管癌(Esophagealcarcinoma, ESCA)，胃腺癌(Stomach adenocarcinoma, STAD)，肝细胞癌(Liverhepatocellular carcinoma, LIHC)，胰腺癌(Pancreatic adenocarcinoma, PAAD)，结肠腺癌(Colon adenocarcinoma, COAD)；内分泌系统癌症：甲状腺癌(Thyroid carcinoma,THCA)；泌尿道系统癌症：肾脏肾透明细胞癌(Kidney renal clear cell carcinoma,KIRC)，肾脏肾乳头状细胞癌(Kidney renal papillary cell carcinoma, KIRP)，膀胱尿路上皮癌(Bladder Urothelial Carcinoma, BLCA)；其它：头颈部鳞状细胞癌(Head andNeck squamous cell carcinoma, HNSC)。
结果：汇总16种肿瘤的TCGA数据，具体分析结果如表1所示，N(n) 表示非肿瘤组织（N）的组织样品数，T(n) 表示非肿瘤组织（N）的组织样品数，肿瘤组织（T）与非肿瘤组织（N）中BRCA2 RNA表达中位值的比值为T/N， t检验得出P值。
表1. 多种肿瘤细胞中BRCA2在转录水平的表达情况
应用MeV软件绘制的热图如图1所示，肿瘤组织（T）与非肿瘤组织（N）中BRCA2的mRNA表达量中位值的比值为T/N，热图中颜色深浅代表的是log2(T/N)值。
上述表1和图1中的结果均显示，除了前列腺癌 (PRAD)和胰腺癌(PAAD)外的14种肿瘤中，相对于非癌组织，癌组织中BRCA2的在转录水平上显著上调表达。
结论：上述结果表明BRCA2在多种肿瘤细胞中表现为较高的转录水平，在肿瘤组织中检测到BRCA2高表达更能确诊为肿瘤。
（2）qRT-PCR检测BRCA2在多种肿瘤细胞中的表达水平
通过上述分析获知BRCA2在多种肿瘤中RNA水平高表达，本发明进一步对多种肿瘤细胞系的BRCA2进行qRT-PCR检测验证。
方法：1）细胞系和细胞培养：人胚肾上皮细胞293FT，以及12株肿瘤细胞系：乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231，卵巢癌细胞系SK-OV-3、TOV-21G，肺癌细胞株A549、Calu3，肝癌细胞系Bel-7402、HepG2，胃癌细胞系MKN28、MGC803，食管癌细胞系Eca109、Eca9706购自American Type Culture Collection (ATCC)。将细胞培养于含有10%FBS的DMEM(Dulbecco's Minimum Essential Medium, Invitrogen, Carlsbad, USA)培养基中，放置37℃的5% CO2培养箱。
2）实时荧光定量PCR：收集上述13种细胞，分别利用Trizol提取以上细胞的RNA，使用MMLV反转录酶(Promega)进行反转录合成cDNA，使用2X SYBR mix (Roche)对各组细胞中BRCA2的表达水平进行qRT-PCR检测，BRCA2的qRT-PCR引物为5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（SEQ ID NO：1）和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（SEQ ID NO：2），GAPDH作为内参。
结果：如图2所示，与人胚肾上皮细胞293FT相比，乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231，卵巢癌细胞系SK-OV-3、TOV-21G，肺癌细胞株A549、Calu3，肝癌细胞系BEL-7402、HepG2，胃癌细胞系MKN28、MGC803，食管癌细胞系Eca109、Eca9706，12株肿瘤细胞系中BRCA2的mRNA表达水平显著升高。
结论：上述结果进一步证明了BRCA2在多种肿瘤细胞中表现为较高的转录水平，在肿瘤组织中检测到BRCA2高表达更能确诊为肿瘤。
实施例3：BRCA2的RNA表达水平与多种癌症患者总体生存预后相关
BRCA2在多种肿瘤中RNA水平高表达，其可能与癌症的疾病发生发展进程相关，故本发明进一步探究了BRCA2的表达量的高低与多种癌症患者总体生存情况的关系。
方法：利用生存预后在线工具Kaplan-Meier plotter分析多种癌组织（乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌）中BRCA2 mRNA表达量的高低与患者总体生存预后之间的关系。应用Log-rank检验比较不同实验组间的结果是否具有显著性差异。
以上所涉及到的乳腺癌患者共1115例，Kaplan-Meier plotter自动选取BRCA2高低表达组划分的最优点，将癌组织BRCA2表达低于划分最优点表达值的563例划分为低表达组，另外BRCA2表达较高的552例划分为高表达组；
卵巢癌患者共1581例，同上，将癌组织BRCA2表达低于划分最优点表达值的1166例划分为低表达组，另外BRCA2表达较高的415例划分为高表达组；
肺癌患者共1926例，同上，将癌组织BRCA2表达低于划分最优点表达值的971例划分为低表达组，另外BRCA2表达较高的955例划分为高表达组；
胃癌患者共593例，同上，将癌组织BRCA2表达低于划分最优点表达值的381例划分为低表达组，另外BRCA2表达较高的212例划分为高表达组。
结果：如图3所示，在上述4种癌症中，BRCA2 mRNA低表达组的患者的生存时间较长，而BRCA2高表达组的生存时间相对较短，Log-rank检验具有显著性差异（图3A为乳腺癌，P=0.009；图3B为卵巢癌，P=0.028；图3C为肺癌，P<0.001；图3D为胃癌，P=0.042）。结论：上述结果表明BRCA2基因表达水平越高，预示着癌症患者生存时间越短，即生存预后较差。BRCA2基因高表达明确指示较差的预后。因此，miR-425可作为诊断癌症患者预后的靶点。
综上所述，BRCA2在人乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌中高表达，并且与乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌患者总体生存预后密切相关，BRCA2可能作为多种癌症的预后生物标志物，在多种癌症的发展发生中具有潜在的重要作用。
实施例4：BRCA2-3’UTR与microRNA相互作用
方法：应用在线工具TargetScan预测BRCA2的3′端非翻译区（以下简称为BRCA2-3’UTR）是否具有与microRNA结合的靶位点。然后通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP) 实验进行验证。构建BRCA2-3’UTR过表达质粒pMSCV-BRCA2-3’UTR，转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，获得稳定过表达BRCA2-3’UTR的细胞系MDA-MB-231-BRCA2-3’UTR，将空载体质粒pMSCV-Vector转染细胞系MDA-MB-231获得MDA-MB-231-Vector细胞作为对照组。分别收集约5×106个MDA-MB-231-BRCA2-3’UTR细胞及MDA-MB-231-Vector细胞用于RIP实验，检测与BRCA2-3’UTR结合的Argonaute复合体中存在的microRNA，再通过实时荧光定量PCR鉴定所捕获的microRNA，U6作为实时荧光定量PCR检测的内参。
结果：TargetScan预测结果显示，BRCA2-3’UTR具有与microRNA结合的靶位点，其中显示BRCA2-3’UTR可能存在与miR-145结合的结合位点（如图4A所示）。
RIP实验结果显示，相对于对照组，BRCA2-3’UTR过表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231-3’UTR中可捕获到大量的miR-145，miR-145被富集（图4B）。
结论：上述结果说明miR-145能够直接结合于BRCA2-3’UTR，而已有研究报道miR-145调控OCT4、SOX2和KLF4等癌症干细胞相关转录因子的表达并且抑制人胚胎干细胞的多能性。从而提示BRCA2-3’UTR通过与负调控癌症干细胞相关转录因子的microRNA相互结合，从而解除对癌症干细胞相关转录因子的抑制作用，提高癌细胞的干细胞特性；进而促进癌细胞的增殖，增强癌症干细胞自我更新的能力。
实施例5：BRCA2-3’UTR促进癌细胞成瘤
（1）体外实验：癌症干细胞成球实验
方法：分别用可以沉默miR-145的拮抗剂antagomiR-145（购自广州锐博公司）、antagomiR-control（阴性对照，购自广州锐博公司）、BRCA2-3’UTR的锁核酸LNA（购自广州锐博公司）和LNA-control（作为对照，购自广州锐博公司）分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231，工作浓度为5nM。分别获得对照组细胞MDA-MB-231-antagomiR-control和沉默miR-145的细胞MDA-MB-231- antagomiR-145，对照组细胞MDA-MB-231-LNA-control和实验组细胞MDA-MB-231-LNA ，将这些细胞分别接种于低吸附六孔板，用含EGF的无血清干细胞培养基培养，每孔细胞数为1000个，培养10天后，光学显微镜下分析，计算细胞成球率，并通过qRT-PCR检测各组细胞中BRCA2-3’UTR的表达量，其BRCA2-3’UTR的qRT-PCR检测引物序列为5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（SEQ ID NO：1）和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（SEQ ID NO：2），内参为GAPDH管家基因。
上述BRCA2-3’UTR的锁核酸序列LNA为LNA-1：5'- ATTCCAGTCTTA-3'（SEQ ID NO：3），斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰（也可以选择锁核酸序列LNA-2：5'- ATTCCAGTCTTA -3'（SEQ ID NO：4）其中斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰），其可以能强有力地、特异性地与BRCA2-3’UTR结合（如图5E所示），从而有效抑制BRCA2蛋白的翻译，也有效抑制BRCA2-3’UTR与其他microRNAs的结合。上述LNA-control其碱基序列为5'- GCTGTACTAATC-3'（SEQ IDNO：5）斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰，其不能与BRCA2-3’UTR结合，作为对照。
结果与结论：从图5A中可以看出，利用antagomiR-145沉默miR-145后，乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达BRCA2-3’UTR表达水平显著上调。且从图5B所示的癌症干细胞成球实验结果可得出，miR-145被antagomiR-145沉默后的实验组细胞的成球率明显高于对照组细胞，表明BRCA2-3’UTR高表达可以提高癌细胞的成球率，提高癌细胞的干细胞特性。为了进一步验证BRCA2-3’UTR是否促进癌细胞的干细胞样特性，设计了锁核酸序列LNA能与BRCA2-3’UTR特异性结合，抑其与其他microRNAs结合，从图5C中可以看出，转染有锁核酸序列LNA的MDA-MB-231细胞中BRCA2-3’UTR的表达量明显低于对照组，且从图5D所示的癌症干细胞成球实验结果可得出，含有LNA的实验组细胞的成球率明显低于对照组细胞，进一步表明BRCA2-3’UTR高表达可以提高癌细胞的成球率，而BRCA2-3’UTR 被沉默后癌细胞的干细胞特性也随之降低。
（2）体内实验：小鼠体内成瘤实验
方法：首先进行构建小鼠体内癌症模型，将1×106个乳腺癌细胞MDA-MB-231进行小鼠皮下注射，10天后将分别剂量为10 mg/kg的antagomiR-145、antagomiR-control和LNA、LNA-control连续三天进行小鼠皮下注射，随后每天测量各体小鼠体内的成瘤大小。
结果：如图6A所示，antagomiR-145处理组相对于对照组，体内成瘤率和肿瘤体积明显大于对照组，表明BRCA2-3’UTR促进了小鼠体内成瘤。而LNA处理组相对于对照组（图6B），体内成瘤率和成瘤大小明显低于对照组，表明沉默BRCA2-3’UTR 表达有效抑制小鼠体内成瘤能力。
以上结果表明BRCA2-3’UTR促进癌细胞的干细胞样特性，说明BRCA2-3’UTR可作为癌症辅助治疗的一个靶点，利用特异的LNA沉默BRCA2-3’UTR可作为癌症辅助治疗的途径，并且LNA与核酸亲和性极强，短小易吸收，可作为以BRCA2-3’UTR为靶点的治疗癌症的药物。
为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
<110> 中山大学肿瘤防治中心
<120> BRCA2的3′非翻译区在制备肿瘤诊断、治疗和预后试剂中的应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcccgattcc gtattggtat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccacctcag cttctcaaag 20
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attccagtct ta 12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attccagtct ta 12
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctgtactaa tc 12
Claims (7)
1.定量检测BRCA2的3′端非翻译区BRCA2-3’UTR的试剂在制备肿瘤检测试剂盒中的应用，所述的肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：定量检测BRCA2的3′端非翻译区BRCA2-3’UTR的试剂中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：定量检测BRCA2的3′端非翻译区BRCA2-3’UTR的试剂中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列5'-GCCCGATTCCGTATTGGTAT-3'（SEQ ID NO：1）和5'-CCCACCTCAGCTTCTCAAAG-3'（SEQ ID NO：2）。
4.定量检测BRCA2-3’UTR的试剂在制备肿瘤的预后试剂盒中的应用，所述的肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：该试剂盒中含有实时荧光定量PCR检测BRCA2-3’UTR的引物序列。
6.特异性沉默BRCA2-3’UTR的试剂在制备肿瘤治疗药剂中的应用，所述的肿瘤为乳腺浸润性癌，子宫内膜癌，宫颈鳞状细胞癌和内膜腺癌，肺腺癌，肺鳞癌，食管癌，胃腺癌，肝细胞癌，结肠腺癌，甲状腺癌，肾脏肾透明细胞癌，肾脏肾乳头状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，头颈部鳞状细胞癌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述能够特异性沉默BRCA2-3’UTR的试剂为锁核酸序列LNA-1：5'- ATTCCAGTCTTA-3'（SEQ ID NO：3），其中斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰；
或者为锁核酸序列LNA-2：5'- ATTCCAGTCTTA -3'（SEQ ID NO：4）其中斜体加粗所示核苷酸带有LNA修饰。
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