CN107937526B - 一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物PHF20，以及一种用于检测PHF20的表达水平的试剂盒在神经母细胞瘤检测和诊断或对患者预后评价中的应用，属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域。PHF20的表达高低与临床病理学参数与患者预后密切相关，能够作为一种神经母细胞瘤早期检测的特异性肿瘤标志物或预后指标。

Description

一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域，涉及一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物及应用。

背景技术

神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)属于神经内分泌性肿瘤，主要起源于肾上腺髓质、颈上、胸腔等部位的交感神经节，临床表现具有恶性度高、多样性和易转移等特点，是最常见的儿童期颅外实体瘤。该病多发于10岁以下的儿童，大约占儿童肿瘤发生的8-10％，年发病率大约为1/10万，仅低于白血病和中枢神经系统肿瘤，虽少数可自行缓解，但是大多数预后较差，神经母细胞瘤具有明显的异质性，对化疗易产生耐药性。目前，在对神经母细胞瘤的治疗中，国际普遍倾向于使用高强度的化学治疗，但该方法使得患者化疗后严重感染的几率较高；而另一方面，对于手术切除的治疗方案而言，由于肿瘤对脏器与血管的侵犯倾向，手术又往往面临着挑战，术后并发症的发生率约占20％，主要涉及肿瘤周围血管及脏器的损伤。因此，找到和研究新的神经母细胞瘤生物标记物和防治靶标，为神经母细胞瘤的早期诊断和靶向治疗打下了基础，并具有重要的意义。

PHF20(NCBI登录号NM_016436.4，Gene ID:51230，参见SEQ ID NO:5)最早发现于神经母细胞瘤的病人的血清自身抗体识别的抗原，其对于细胞重编程有表观遗传调控作用。PHF20蛋白含有多个功能域，其第2个Tudor区域可识别并结合p53，结合后会通过阻止p53的泛素化而稳定和并促进p53的活性转录。目前PHF20在神经母细胞瘤的临床相关性仍然在很大程度上没有被研究，而已有研究又报道其为癌基因，因此，探究其在肿瘤标志物上的应用显得尤为重要。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种神经母细胞瘤肿瘤相关的肿瘤标志物。所述肿瘤标志物为PHF20。PHF20有望成为神经母细胞瘤肿瘤诊断和预后判断的标志物，同时为神经母细胞瘤肿瘤的治疗提供了新的靶点。发明人研究发现，PHF20在神经母细胞瘤细胞和肿瘤样品中高表达，表达水平与病人不良生存预后存在显著相关性，敲除PHF20对于神经母细胞瘤成瘤有明显的抑制作用。因此，PHF20在神经母细胞癌发生发展过程中可能十分重要。因此PHF20可用于制备神经母细胞瘤肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断制剂。还可用于制备神经母细胞瘤肿瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒。

所述神经母细胞瘤肿瘤干细胞辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括PHF20和内参基因GAPDH RNA的特异性引物,PHF20的特异性上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，GAPDH RNA的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，GAPDH RNA的下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。PCR引物见表1。所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒和免疫学检测试剂盒。实时荧光定量PCR检测试剂盒所述特异性引物适用于SYBR Green的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBR Green，Taq酶为热启动酶。免疫学检测试剂盒所用PHF20抗体适用于免疫组化检测。试剂盒包括标准切片阳性对照和免疫组化检测相关试剂。

表1

所述神经胶质母细胞瘤PHF20检测诊断试剂盒用途包括：检测PHF20基因在受试者的测定细胞即神经母细胞瘤中的表达；将所述值与参考值相比较，PHF20基因明显同时高于参考值，表明受试者患有神经母细胞瘤。所述参考值水平是PHF20基因在正常细胞即正常人神经组织细胞中的表达水平，所述正常细胞与测定细胞同一品系且无癌变。所述测定细胞已知或被怀疑包含肿瘤细胞。

为了验证发明的在靶向治疗上有效性，本发明通过以下方法验证，1、采用CRISPR基因编辑敲除PHF20基因表达，检测不同组细胞增殖情况。2、采用皮下成瘤方法分别在两个神经母细胞瘤细胞系SK-N-AS(ATCC编号：CRL-2137^TM，人源，上皮样贴壁生长)和SH-EP(ATCC编号：CRL-2269^TM，人源，上皮样贴壁生长)中比较PHF20基因敲除情况下肿瘤大小的差别。结果显示，PHF20基因表达被敲除时细胞增殖明显变慢以及皮下成瘤能力明显减弱。

本发明证实了PHF20基因在癌变的组织细胞中高表达，可作为神经母细胞瘤的检测指标以及靶向治疗的分子靶点。本发明为神经母细胞瘤肿瘤的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

因此，本发明提供了

一种肿瘤生物标志物PHF20作为神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物的用途，PHF20在神经母细胞瘤中表达显著增高。

所述肿瘤生物标志物在制备神经母细胞瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒中的应用。

一种肿瘤生物标志物PHF20检测试剂盒，其通过检测PHF20的表达产物检测PHF20的表达水平，其包括PHF20的表达产物的特异性结合物。其中的特异性结合物是特异性检测PHF20mRNA的探针或引物，其采用定量PCR、基因芯片或免疫学方法检测PHF20基因的表达，其中的引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述试剂盒还包括内参特异性引物，所述内参特异性引物是GAPDH RNA引物，上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，GAPDH的下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。所述试剂盒可以进一步包括实时荧光定量SYBR染料，例如Roche 4887352001 LightCycler480 SYBR Green I Master，还可以包括分子生物学级别H2O。所述试剂盒还可以进一步包含抽提总RNA所用试剂，例如包含Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC水。

所述试剂盒还可以进一步包含将总RNA逆转录为cDNA所用试剂。总RNA逆转录为cDNA所用试剂也选择市售的逆转录试剂盒，例如promega逆转录试剂盒(GoScriptTMReverse Transcriptase，A5003)，包括:GoScriptTM5X Reaction Buffer、MgCl2、PCR Nucleotide Mix、Recombinant Ribonuclease Inhibitor、Go ScriptTMReverse Transcriptase、Nuclease-Free Water。

所述神经母细胞瘤肿瘤辅助诊断的试剂盒可以是通过免疫学方法进行定量检测的试剂盒，其通过检测PHF20的表达产物检测PHF20的表达水平，其包括特异性结合PHF20的抗体。通过免疫学方法，例如免疫印迹法、免疫组化法和酶联免疫吸附测定法中的至少一种检测PHF20的表达水平，比如，通过免疫印迹法(Western Blot)进行检测的试剂盒，其中包含免疫印迹法(Western Blot)相关试剂。进一步地还可以包含从细胞中抽提总蛋白所用试剂，例如包括RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂。

PHF20作为神经母细胞瘤药物靶点的用途。

一种抑制神经母细胞瘤细胞增殖的药物，其中包含PHF20基因表达抑制剂，其中的基因表达抑制剂是miRNA，siRNA，dsRNA或shRNA或者通过CRISPR基因编辑技术敲除PHF20基因。

附图说明

图1为PHF20表达高低对患者生存时间的影响；PHF20高表达组病人生存率与低表达组相比显著降低，生存率差异存在统计学意义。

图2为临床组织样本中PHF20的表达差异；神经母细胞瘤病人肿瘤细胞中PHF20表达比例明显高于正常神经组织，且III期病人较Ⅱ期病人PHF20表达比例更高,II期病人较I期病人PHF20表达比例更高

图3为敲除PHF20对神经母细胞瘤SH-EP和SK-NA-S细胞生长的影响。与正常细胞相比，神经母细胞瘤PHF20的总水平显著上升。

图4为敲除PHF20对神经母细胞瘤SH-EP和SK-NA-S体内成瘤的影响；敲除PHF20之后SH-EP和SK-N-AS细胞生长速度显著降低，成神经母细胞瘤的能力显著降低。

具体实施方式

实施例1：比较PHF20基因在神经母细胞瘤病人中表达与生存率的关系。

The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库包含了多种肿瘤类型多种层次的数据信息，包括：miRNA、mRNA、蛋白质谱、突变谱、临床诊断信息等。这些数据为肿瘤数据分析提供了丰富的资源。因此，我们首先借助TCGA数据库对PHF20基因与癌症的相关性进行分析。

(1)、从两个数据库(数据库一为Therapeutically Applicable Research toGenerate Effective Treatments[TARGETS],病人数量n＝149,链接为http:// cancergenome.nih.gov/,数据库二为德州儿童医院[Texas Children’s Hospital]未公开数据，病人数量n＝88)随机选取神经母细胞瘤病人，患者肿瘤组织已经经过RNA-seq检测全基因表达水平。

(2)、根据检测到的PHF20基因表达水平将病人分为PHF20低表达、PHF20高表达两组，比较其五年生存率。并验证其差异是否具有统计学意义。

结果：PHF20高表达组病人生存率与低表达组相比显著降低，生存率差异存在统计学意义(图1)。

实施例2：利用免疫组化染色比较肿瘤组织与正常组织PHF20基因表达量差异。

(1)、随机选取临床上手术切除的神经组织进行石蜡包埋切片。

(2)、随机选取神经母细胞瘤I期、II期和III期病人，取肿瘤组织进行石蜡包埋切片，利用PHF20抗体(购自Cell Signaling Technology公司，货号3934)进行的免疫组化染色。

(3)、结果：神经母细胞瘤病人肿瘤细胞中PHF20表达比例明显高于正常神经组织，且III期病人较Ⅱ期病人PHF20表达比例更高,II期病人较I期病人PHF20表达比例更高(图2)。

实施例3:PHF20检测试剂盒检测PHF20基因与不同神经母细胞瘤细胞系中的表达。

检测10种不同的细胞中PHF20基因表达状态，这10种细胞分别是：1种正常人外周血细胞PBMC，代表正常样品；9种神经母细胞瘤细胞系CHLA-255,JF,LA-N-6,NB-19,NGP,SK-N-AS,SH-EP,SH-SY5Y和IMR-32(图3)。

检测过程如下：

提取10种细胞的总蛋白样本，用Western Blot对10种样本中PHF20总水平进行表征,检测结果如图3A的所示：结果表明，与正常细胞相比，神经母细胞瘤PHF20的总水平显著上升。因此，PHF20表达水平联合临床指标评估，可以作为判断是否为神经母细胞瘤的参考。

提取神经母细胞瘤肿瘤和配对的正常组织总RNA，

(1)新鲜或-80℃冻存组织约20mg左右，加入1ml Trizol冰上研磨，可先用剪刀剪碎组织，为防止溢出，一般先加400ul Trizol，呆研磨充分，再补齐至1ml。室温放置5-10min。

(2)按Trizol与三氯甲烷的体积比为5比1的比例加入三氯甲烷，涡旋振荡30s，室温放置5min，12000g转速4℃离心15min。

(3)吸取约400ul上清层，尽量小心，避免吸取中间固体层，加入400ul异丙醇，上下颠倒混匀，切勿剧烈振荡。室温放置10min，12000g转速4℃离心10min。

(4)吸弃上清液，用DEPC配制浓度为75％的乙醇加入1ml，在实验台上轻轻磕起沉淀，7500g转速4℃离心5min。

(5)吸弃上清层，室温放置5-10min，加入70左右的PEPC水溶解RNA，-80℃保存。

(6)用1％的琼脂糖凝胶，按1ug的RNA加1ul 6X LoadingBuffer混匀，电泳20min左右，凝胶电泳成像系统照相保存，分析。

(7)Nano Drop检测RNA浓度和纯度，用DEPC水调零，将RNA样品充分混匀，滴加2ul样品在Nano Drop检测探头上，放心测量臂，测量RNA的浓度，记录260/280的比值。

2、将总RNA逆转录为cDNA

采用Promega逆转录试剂盒。

配置如下体系:

体系I：

2ugRNA溶于DEPC水中，加1ul随机引物，补齐至10ul。与PCR仪上70℃5分钟，立即冰浴5分钟。

体系II如表2所示:

表2

将体系I和体系II混合，瞬时离心，放入PCR仪中，程序为表3

表3

	Step1	Step2	Step3	Step4
					温度	25℃	℃	℃	℃
时间	5min	1h	15min	∞

实时荧光定量PCR检测PHF20的表达量

实时荧光定量PCR采用罗氏LightCycler480 SYBRGreenI Master试剂盒。

反应体系如下(表4)：

表4

名称	体积
		cDNA	1ul
DEPCE水	1ul
		上游引物	1ul
下游引物	1ul
		SYBR GREEN	10ul

仪器采用Roche 480，实时荧光定量PCR程序为：95℃10min预变性，接40个循环：95℃10s，60℃20s，72℃30s。

本实验数据采用相对定量的分析方法，将GAPDH作为内参基因，计算公式为：

△CT＝△CT-△CTGAPDH

△△CT＝△C癌组织-△C正常组织

相对表达量＝log2-△△CT

分析实时荧光定量PCR PHF20的相对表达量。发现9种神经母细胞瘤细胞系与正常细胞相比，发现神经母细胞瘤细胞系高表达PHF20，结果见图3B。

实施例4:检测神经母细胞瘤细胞SH-EP和SK-N-AS中PHF20对细胞生长的影响。

首先，使用CRISPR基因编辑技术在SH-EP和SK-N-AS细胞中敲除PHF20的基因。对照细胞和PHF20敲除细胞使用DMEM/F12完全培养基(DMEM+10％胎牛血清+100-U/ml青霉素/链霉素)，在37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞贴壁生长，取对数生长期细胞，利用免疫印迹法检验PHF20表达(图4A)，结果显示在两种细胞中都有很好的PHF20敲除效果。

然后，用胰蛋白酶将细胞消化并计数，按每孔2x10³个细胞接种于96孔板，置于37℃培养箱培养。在细胞培养12h,24h,36h，以及48h时采用胰蛋白酶消化细胞并计数。由结果可知，敲除PHF20之后SH-EP和SK-N-AS细胞生长速度显著降低(图4B)。

最后，将对照细胞和PHF20敲除细胞以1x10⁶个细胞/只的数量注射到裸鼠皮下，14天后开始测量肿瘤大小，28天结束测量并解剖小鼠取出肿瘤称重。结果表明，敲除PHF20之后SH-EP和SK-N-AS细胞成神经母细胞瘤的能力显著降低(图4C和4D)

以上结果表明，PHF20可作神经母细胞瘤肿瘤诊断的新型分子标志物,为神经母细胞瘤的辅助诊断提供了强有力的分子生物学工具，并且可以作为神经母细胞瘤的治疗靶点，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

序列表

<110> 徐州维康生物科技有限公司

<120> 一种神经母细胞瘤相关的肿瘤标志物及其应用

<130> 19000101

<141> 2017-12-26

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 1

acccggctcc ccaaaggtga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 2

ctgccactgg tgctgggagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 3

gtcaaggctg agaacgggaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 4

aaatgagccc cagccttctc 20

<210> 5

<211> 5899

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

gggggtcacg tggtgcagag cacgcagagt ccttctgtcg gttggtcctg gagcggcgca 60

gccggagtgg ggccgtgagg agaataaagg cagccccgtt gatgactgaa aatgacaaag 120

catccaccta acagacgagg aatcagcttt gaagtgggag cccagttgga agcccgggac 180

cgtttaaaaa actggtatcc agctcacata gaagacattg actacgagga aggaaaagta 240

ctcatccatt tcaagcgttg gaaccatcgt tatgatgagt ggttctgctg ggacagtcct 300

tatttacgcc ctttagagaa aatacagctg aggaaagagg gcttgcatga agaggatgga 360

tcttctgaat ttcaaataaa tgagcaggtc cttgcttgct ggtctgattg tcgtttttac 420

ccggccaaag tcactgctgt taacaaggat ggtacttaca ctgtgaaatt ttatgatgga 480

gtagttcaga ctgtcaaaca tattcatgtc aaagcttttt ccaaagatca gaatattgtg 540

ggtaatgcta ggcctaaaga aacagatcac aaaagtcttt catcatctcc tgataaacga 600

gagaagttta aagaacagag aaaagcaaca gtgaatgtga agaaagacaa agaagataaa 660

cccttaaaga cagaaaagcg acccaagcag cctgataaag aaggaaagtt aatctgttct 720

gaaaagggga aagtgtcaga gaaaagtctt cccaagaacg agaaggaaga caaggaaaac 780

atttccgaaa atgacagaga gtattctgga gatgcccaag tggataagaa acctgaaaat 840

gacattgtga agagtccaca agaaaacttg agggaaccca aaagaaaacg aggcagaccc 900

ccttccatag ctcctactgc tgtggattca aactctcaaa ctttgcaacc aataacattg 960

gaactgagaa gaaggaaaat atcaaaagga tgtgaagtcc cattaaaacg tcctcggctt 1020

gacaaaaatt catcccagga aaagtcaaaa aactactcgg aaaacactga caaagactta 1080

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acttgccact cctttgggga tggatccggg gctgcaggct tggagttgaa ctgcccatca 1320

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gacaaggaaa agaataaaga gaagaaattc aaggagtttg tgagagtgaa gccaaagaag 1740

aaaaagaaaa agaaaaagaa aaccaaacct gaatgcccct gcagtgagga gatcagtgac 1800

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aagccagggg tccatatgag cccgcagctt catggcccag aatctggaca ccacaaaggg 1920

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agtgatgatg agtatggcca agatgtggat gtgaccacca acccagatga ggaacttgat 2040

ggggatgacc gctatgactt cgaggtggtc cgctgcatct gtgaggtcca ggaggaaaat 2100

gacttcatga ttcagtgtga agagtgccag tgctggcagc atggggtctg catgggatta 2160

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cagcttcttg gtgatgtgca gagagtgatt gaggttctgc atggcctgca gctcaagatg 2400

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cactcagggg aggggagatc tcatttcaga aacatccctg tcactgacac caggagcaag 2520

gaggaagctc caagctatag aactttgaac ggggcagtgg agaagcccag gcccctggcc 2580

ctgcccctgc cgcgttctgt ggaggaatcc tatatcacca gtgagcattg ctaccagaag 2640

ccccgcgcct attaccctgc cgtggagcag aagctggtgg tggagacgag gggctctgcc 2700

ctcgacgatg cggtcaaccc cctccatgag aacggcgatg attccctttc cccgcgcctg 2760

ggctggcctc tagaccaaga caggagcaag ggggacagtg accccaaacc cggctcccca 2820

aaggtgaagg aatatgtctc caaaaaggcc ctaccagaag aagcccctgc tcggaagctg 2880

ctggacagag gtggagaggg gctgctgagc tcccagcacc agtggcagtt taacctgctg 2940

acccatgtgg aatctcttca ggatgaagtt acgcacagga tggactccat tgagaaggag 3000

ttggatgtgt tggagagctg gctggactac actggggaac tggagccccc tgagccgctg 3060

gccaggcttc cgcagctcaa gcattgtatc aagcagctgc tgatggacct gggcaaggtg 3120

cagcagatcg ccctctgctg ctcaacatga aactgggcac ccaaaactca tgggggcaca 3180

atcctggggc acctgcagga ggagcttcgc atatttaaat aaataaacct agcatgctga 3240

atgcacgtga caccgactga cttcagggat ctgggccagg agtgtggtgg acattggaca 3300

aagaggccat tttggctgcg ggaggacact ctgatctcga agcctgccat aaaggtagca 3360

aatagactct tgggattccc ctcttctgtg cacatcgttg aatgaagaga gtctttttgc 3420

acaaacttca cttgaaattg tgccactgat gataaacgga atgagagcca aaaaagttta 3480

gttggagaca gttgtaaatt caatttggag tttatttaat tgacttttct atcacgttgg 3540

ggcacatgcc aactccctgg tttcttcctg gcatggtgtt tgggcagcag gcatcatttt 3600

ccttttctag cttcatagga atattgtgag ctcaccatgc tgtggaggtt gggaaagagc 3660

agagtcttgg ctgccctgct ttctccttag gactcttcac ttttctcacc acatctcttg 3720

catgacttca tggtactggg gacaagtttg tatgccttca ccccagagct ggctgggtta 3780

tggcttttgt agcagagccc atacagccta tggaagaact agaatctcac tcacagtaat 3840

aagaatctag gaggaattcc aaaccgaagc aggcagggtc tggaacccaa aggacagcat 3900

tttctaccca cttcttaata ttgacagctt ccccgttcta tttaatgtcc aaaaatgttt 3960

cccaaaattt caaactcttt cactgtaaag atttgttaca aagaatgtgg tttggggaat 4020

taccttattt tatattgttg taaacaaact tcaaattcta catgtgcgac ttttctcctt 4080

cctgaagggt gtttagtagt cagcgttttc agaattgttt tgttactata ctttaacatt 4140

ttacatttcc tgtttgtatt attttgtgag agcaaggtga tcatgctgct taaggtccag 4200

gtacaaccta tttgtacctt ttgagacaat atttgtgtta cttttgcagg ttacggttcc 4260

acatgtaatt gctatatttt gttttgtttt tccttactag gcaaagttaa aatgttccat 4320

gctttgagga gtgacccatt tcactacttt gttttcttat cactaaaggc aaaaatcaaa 4380

gcacagttgt ccattaacac ttataagtta attatgggtt tatgagtctg taatgttata 4440

tgctgcaaac atttactatg taaacgtgaa gtagccaata atatctcaat agtagtaaca 4500

gtatctttag cgacctttgg aatagttaag cacaggtcat tgtggacatg aattcaggcc 4560

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gacagctgca ttgtaagagt tctgtcatgc agtctgaaaa gggaagaaac aggatggctt 4860

tctgtagcca cacctgtgag gcgtgatgat tgttgtatta ttagattact gatttttctt 4920

ttctgaaaat acatttgagt tttaatcaca tctgtggaag ctgtaacttt taaggtagtc 4980

aatttcatgt cttgttcaac gatgtaagca gaaactgaat tgccctaatt ttgccaactg 5040

gccattattg ggattattgt ttaaattttt ggtaaaggaa gtaatctcct ttcattcatt 5100

gtgacttttg ttcttaggga agcagagaag actccccaag ttcttataac ctcattgtgc 5160

ttccctaatt taaagccatg ttgaggggct ccattcccaa ttcctgggtc aaggtgaatt 5220

aaccctatgt tggagcactg gaaaccgtta tttgcaaaca ttgctgttac catttagaaa 5280

tatgtgcact atcagctggg tgcagtggct cacgtctgta atcccagcac tttgggaggc 5340

cgaggcaggt ggatcacctg aggtcaggag ttcgagacca gcctggccaa cagggtgaaa 5400

ccccgtctct actaaaagta caaaaattag ctgggcgtgg tggcggacgc ctgtaatctc 5460

agctacttgg gaggctgaag caggagaggt gctggaacct gggaggcgga ggttgaagtg 5520

agccgagatt gcgctattgc actccagctc gggcgacaac tgcaagactc catctcaaaa 5580

aaataaaaat aaaagaaaag aaagaaatat gtgcactacc taagttttgt ctttagaaaa 5640

actatccacc tataaaaaat taccttgaca aaaatagttc cggtttgact aatcattttg 5700

tttctttaag tggtaagtgt atgcaaggtg gatccttgat gagccaacat tgcactgtgg 5760

atacatatct atgtttacgc gctattagaa cagaaggcgc tgtatataga aatgttgctt 5820

tgaagcaata tttgcaaaac acgcagactt ctgtatctgt atttggaaaa aataaaacag 5880

gttcttgtta aaaaaaaaa 5899

Claims (3)

1.PHF20作为神经母细胞瘤的生物标志物在制备神经母细胞瘤诊断制剂中的应用，其特征在于PHF20在神经母细胞瘤中表达水平显著增高。

2.一种PHF20基因表达水平抑制剂在制备抑制神经母细胞瘤细胞增殖的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的PHF20基因表达水平抑制剂在制备抑制神经母细胞瘤细胞增殖的药物中的应用，其特征在于，所述的基因表达水平抑制剂是通过CRISPR基因编辑技术敲除PHF20基因来抑制PHF20基因表达水平。

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