TW202117003A - 用以懸浮培養接著性細胞的培養基組成物之製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用以懸浮培養接著性細胞的培養基組成物之製造方法，其包含下列步驟：
(i)使非水溶性多糖類所構成之奈米纖維承載細胞外基質的步驟；
(ii)將步驟(i)所得到之承載有細胞外基質的奈米纖維添加於培養基的步驟。

Description

用以懸浮培養接著性細胞的培養基組成物之製造方法
本發明係關於用以懸浮培養接著性細胞的培養基組成物之製造方法等。
近年來，以醫療或美容之領域為中心，正在開發將細胞移植或注入活體內的方法。其中，體性幹細胞或前驅細胞與多能性幹細胞相比，由於癌化風險低，分化期間短等緣故，因而受到矚目。
利用此等細胞時，必須大量地提供良好狀態之細胞，而就其方法而言，已知有將幹細胞等以接著於微載劑(micro carrier)等之狀態培養、增殖的方法。
然而，現今一般可取得的微載劑被指出有下述問題，亦即，由於在靜置條件下會於培養液中沉降，所以培養時必須攪拌，而該攪拌會造成微載劑彼此之衝突等而引起細胞死亡等。又，關於細胞增殖之效率，亦不充分，期待進一步改良。
本發明人等開發一種以懸浮狀態培養動、植物細胞及/或組織的培養基組成物，其中使用提高對水之分散性的多糖類等之奈米纖維(專利文獻1)。
再者，本發明人等發現非水溶性多糖類構成的奈米纖維，可成為接著性細胞之i)懸浮培養、ii)分化誘導、iii)於非凍結條件下之輸送或保存、iv)移植、v)從培養上清液回收生理活性物質等各種操作中的通用載劑(carrier)(專利文獻2、專利文獻3)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]WO2015/111686
[專利文獻2]WO2017/175751
[專利文獻3]WO2018/182016
本發明之課題，為提供大量生產體性幹細胞或前驅細胞等接著性細胞的技術。
本發明人等為解決上述問題，重複專心努力的結果，發現藉由使用細胞外基質承載於非水溶性多糖類所構成之奈米纖維者，作為載劑(carrier)基材，以懸浮培養接著性細胞，可效率極良好地促進該接著性細胞之增殖。又，亦發現藉由將承載有細胞外基質的奈米纖維混合於液體培養基中，並將接著性細 胞以接著於該奈米纖維之狀態培養，可將該細胞以靜置狀態懸浮培養，或只需藉由追加新鮮培養基組成物，即可在不藉由胰蛋白酶等進行細胞剝離處理下擴大培養。本發明人等基於此等見識，進一步進行檢討，於是完成本發明。
亦即，本發明如以下之說明。
[1]一種用以懸浮培養接著性細胞的培養基組成物之製造方法，其包含下列步驟：
(i)使由非水溶性多糖類構成之奈米纖維承載細胞外基質的步驟；
(ii)將步驟(i)所得到之承載有細胞外基質的奈米纖維添加於培養基的步驟。
[2]如[1]所述之方法，其中非水溶性多糖類為選自甲殼素(chitin)、殼聚糖(chitosan)、纖維素、及半纖維素(hemicellulose)所構成之群組中的至少1種。
[3]如[1]或[2]所述方法，其中細胞外基質為選自膠原(collagen)、纖網蛋白(fibronectin)、玻連蛋白(vitronectin)、層黏連蛋白(laminin)、RGD序列、及鈣黏蛋白(cadherin)所構成之群組中的至少1種。
[4]如[1]至[3]中任一項所述之方法，其中奈米纖維所承載之細胞外基質的量為，相對於每1g奈米纖維，細胞外基質為0.01至50mg。
[5]如[1]至[4]中任一項所述之方法，其中非水溶性多糖類為甲殼素。
[6]如[5]所述之方法，其中在步驟(ii)中進一步添加殼聚糖奈米纖維。
[7]如[6]所述之方法，其中承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維與殼聚糖奈米纖維之含量比(以重量計)，承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至20。
[8]如[1]至[7]中任一項所述之方法，其中細胞外基質為玻連蛋白。
[9]一種培養基添加用組成物，其包含承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維、及殼聚糖奈米纖維。
[10]如[9]所述之組成物，其中細胞外基質為選自膠原、纖網蛋白、玻連蛋白、層黏連蛋白、RGD序列、及鈣黏蛋白所構成之群組中的至少1種。
[11]如[9]或[10]所述之組成物，其中甲殼素奈米纖維所承載之細胞外基質的量為，相對於1g之甲殼素奈米纖維，細胞外基質為0.01至50mg。
[12]如[9]至[11]中任一項所述之組成物，其中培養基組成物中所含有之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維與殼聚糖奈米纖維之含量比(重量)為，為承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至20。
[13]如[9]至[12]中任一項所述之組成物，其中細胞外基質為玻連蛋白。
[14]一種接著性細胞之懸浮培養用培養基組成物，其包含如[9]至[13]中任一項所述之組成物。
若依照本發明，藉由將接著性細胞以接著於承載有細胞外基質之由非水溶性多糖類構成之奈米纖維的狀態培養，可在不需要振盪或旋轉等操作下，以靜置狀態進行懸浮培養。此外，藉由細胞外基質之效果，可促進細胞之增殖。
又，若依照本發明，亦可進行接著性細胞之維持培養，亦可原樣維持其形質而增殖。
圖1為展示CBB染色液添加後之甲殼素奈米纖維水分散液之相位差顯微鏡照片的圖。
圖2為展示CBB染色液添加後之甲殼素奈米纖維/殼聚糖奈米纖維水分散液之相位差顯微鏡照片的圖。
圖3為展示CBB染色液添加後之承載玻連蛋白之甲殼素奈米纖維水分散液之相位差顯微鏡照片的圖。
圖4為展示CBB染色液添加後之承載玻連蛋白之甲殼素奈米纖維/殼聚糖奈米纖維水分散液之相位差顯微鏡照片的圖。
[用於實施發明之型態]
以下，詳細地說明本發明。
1.培養基組成物之製造方法
本發明提供一種用以懸浮培養接著性細胞之培養基組成物的製造方法(以下，稱為「本發明之製造方法」等)，其包含下列步驟：
(i)使非水溶性多糖類所構成之奈米纖維承載細胞外基質的步驟；
(ii)將步驟(i)所得到之承載有細胞外基質的奈米纖維添加於培養基的步驟。
在本發明之製造方法中，接著性細胞意指於生存或增殖中需要容器壁等支架的細胞。
在本發明之製造方法中，就接著性細胞而言，無特別限定，例如，可列舉幹細胞、前驅細胞、體性非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、癌細胞等。幹細胞意指兼具複製自己本身之能力及分化為其他複數個系統之細胞之能力的細胞。就接著性幹細胞之例而言，不限定以下者，例如，可列舉間葉系幹細胞、神經幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹 細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等體性幹細胞等。間葉系幹細胞意指具有成為骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞之全部或數種的分化能力的幹細胞。間葉系幹細胞以低頻率存在於骨髓、末梢血、臍帶血、脂肪組織等組織中，可從此等組織藉由周知之方法單離。前驅細胞意指從前述幹細胞分化為特定之體細胞或生殖細胞之途中階段的細胞。就接著性前驅細胞之例而言，不限定以下者，例如，可列舉前驅脂肪細胞、前驅心肌細胞、前驅內皮細胞、神經前驅細胞、肝前驅細胞、胰臟前驅細胞、腎臟前驅細胞等。就接著性體性非幹細胞之例而言，不限定以下者，例如，可包含纖維母細胞、骨細胞、骨周皮細胞、角質形成細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系細胞、膠質細胞、神經元、少突膠質細胞、小膠質細胞、星狀膠細胞、心臟細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如，平滑肌細胞或骨骼肌細胞)、胰臟β細胞、黑色素細胞等。初代培養細胞意指將從活體分離之細胞或組織播種，至進行第1次繼代之培養狀態的細胞。初代培養細胞，可為例如從皮膚、腎臟、脾臟、副腎、肝臟、肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前列腺、睪丸、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等任何組織所採集的細胞。細胞株意指藉由活體外之人為操作，獲得無限增殖能力的細胞。本發明之製造方法中的接著性細胞，較佳為幹細胞或前驅細胞，更佳為間葉系幹細胞。
本發明之製造方法中的接著性細胞之來源，無特別限定，可為源自動物及植物之任一者的細胞。就動物而言，無限定，例如可列舉魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、泛甲殼類、六足類、哺乳類等，較佳為哺乳類。就哺乳類之例而言，無限定，可列舉大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、倉鼠、田鼠、鴨嘴獸、海 豚、鯨魚、狗、貓、山羊、牛、馬、綿羊、豬、大象、普通狨猿、松鼠猴、恆河猴、黑猩猩、人類等。就植物而言，只要所採集之細胞可進行液體培養者即可，無特別限定。例如，可列舉生產生藥類(例如，皂苷(saponin)、生物鹼類、小蘗鹼(berberine)、異東莨菪醇(scopoline)、植物固醇等)的植物(例如，藥用人參、日日草、風信子、黃蓮、顛茄等)，或生產成為化妝品/食品原料之色素或多糖體(例如，花青素、紅花色素、茜草色素、藏紅花色素、黃酮類等)的植物(例如，藍莓、紅花、茜草、藏紅花等)，或生產醫藥品原體之植物等，然而不以彼等為限。藉由本發明之製造方法所製造的培養基，較佳使用於哺乳類之接著性細胞。
在本說明書中，奈米纖維意指平均纖維徑(D)為0.001至1.00μm之纖維。在本發明中所使用的奈米纖維之平均纖維徑，較佳為0.005至0.50μm，更佳為0.01至0.05μm，進一步更佳為0.01至0.02μm。
在本發明之製造方法中，所使用的奈米纖維之長寬比(aspect ratio)(L/D)，係藉由平均纖維長度/平均纖維徑而得到，無特別限定，而通常為2至500，較佳為5至300，更佳為10至250。
在本說明書中，奈米纖維之平均纖維徑(D)係依照如以下之方法求得。首先將應研商事股份有限公司製火綿膠(Collodion)支持膜，藉由日本電子股份有限公司製離子清潔劑(JIC-410)施行3分鐘親水化處理，滴入數滴為評價對象之奈米纖維分散液(藉由超純水稀釋)，於室溫乾燥。將其藉由日立製作所股份有限公司製穿透型電子顯微鏡(TEM，H-8000)(10,000倍)，以加速電壓200kV觀察，使用所得到之圖像，對於標本數：200至250支之奈米纖維，一支一支地計測纖維徑，以其數平均值作為平均纖維徑(D)。
又，平均纖維長度(L)係以如以下之方法求得。將為評價對象之奈米纖維分散液藉由純水稀釋，成為100ppm，使用超音波洗淨機，使奈米纖維均勻地分散。將該奈米纖維分散液澆鑄在表面預先用濃硫酸親水化處理的矽晶圓上，於110℃乾燥1小時，作為試料。藉由日本電子股份有限公司製掃描型電子顯微鏡(SEM，JSM-7400F)(2,000倍)觀察所得到之試料，使用所得之圖像，對於標本數：150至250支之奈米纖維，一支一支地計測纖維長度，以其數平均值作為平均纖維長度(L)。
在較佳之型態中，奈米纖維在與液體培養基混合時，該奈米纖維於保持一次纖維徑下，均勻地分散於該液體中，實質上未提高該液體之黏度，且實質上使細胞保持附著於奈米纖維，而具有防止其沉降的效果。
本發明之製造方法中所用的奈米纖維係由非水溶性多糖類所構成者。糖類意指10個以上單糖類(例如，丙醣、丁醣、戊醣、己醣、庚醣等)聚合而成的糖聚合物。
就非水溶性多糖類而言，可列舉纖維素、半纖維素等纖維素類；甲殼素、殼聚糖等甲殼素質等，然而不以此等為限。非水溶性多糖類，較佳為甲殼素或殼聚糖，更佳為甲殼素。再者，在本說明書中，將「由甲殼素所構成之奈米纖維」稱為「甲殼素奈米纖維」。又，在其他非水溶性多糖類之情況亦相同。
甲殼素質意指選自甲殼素及殼聚糖所構成之群組中的1種以上之糖質。構成甲殼素及殼聚糖之主要糖單元，分別為N-乙醯基葡萄糖胺及葡萄糖胺，一般而言，N-乙醯基葡萄糖胺之含量多且對酸性水溶液為難溶性者為甲殼素；葡萄糖胺之含量多且對酸性水溶液為可溶性者為殼聚糖。在本說明書中，為 方便起見，將構成糖中N-乙醯基葡萄糖胺所佔之比例為50%以上者稱為甲殼素，未達50%者稱為殼聚糖。
就甲殼素之原料而言，例如，可使用蝦、蟹、昆蟲、貝類、菇等多種生物資源。本發明中所用之甲殼素，可為具有源自蟹殼或蝦殼之甲殼素等α型結晶構造的甲殼素，亦可為具有源自烏賊之甲殼的甲殼素等β型結晶構造的甲殼素。蟹或蝦之外殼多作為產業廢棄物處理，取得容易，從有效利用之觀點，以其作為原料為較佳；為了除去所含之雜質，即蛋白質或灰分等，必須有脫蛋白步驟及脫灰步驟。因此，在本發明中，以使用已經施行脫基質處理的精製甲殼素為較佳。精製甲殼素為市售。就在本發明中所用的甲殼素奈米纖維之原料而言，可為具有α型及β型之任一結晶構造的甲殼素，然而以α型甲殼素為較佳。
藉由將上述之多糖類粉碎，可得到多糖類奈米纖維。粉碎方法無限定，在達到符合本發明目的之纖維徑/纖維長度的微細化方面，以高壓均質機、研磨機(石臼)、或珠磨機等介質攪拌磨機得到強剪切力的方法為較佳。
此等中，以使用高壓均質機進行微細化為較佳，例如期望如日本特開2005-270891號公報或專利第5232976號所揭示的使用濕式粉碎法之微細化(粉碎化)。具體而言，藉由將使原料分散之分散液，從一對噴嘴以高壓分別噴射、衝撞，而將原料粉碎，例如藉由使用星爆系統(Starburst System)(杉野機械股份有限公司製之高壓粉碎裝置)或Nanovater系統(吉田機械興業股份有限公司之高壓粉碎裝置)而實施。
使用前述之高壓均質機將原料微細化(粉碎化)時，微細化或均質化之程度，依賴於對高壓均質機之超高壓室壓送的壓力，及通過超高壓室之次數 (處理次數)、以及水分散液中之原料的濃度。壓送壓力(處理壓力)無特別限定，通常為50至250MPa，較佳為100至200MPa。
又，微細化處理時水分散液中之原料的濃度，無特別限定，通常為0.1質量%至30質量%，較佳為1質量%至10質量%。微細化(粉碎化)之處理次數，無特別限定，隨前述水分散液中之原料濃度而定，在原料之濃度為0.1至1質量%之情況，處理次數只要約10至100次即可充分地微細化，然而為1至10質量%時，有時必須處理約10至1000次。
前述微細化處理時之水分散液之黏度無特別限制，例如，為α甲殼素之情況，該水分散液之黏度的範圍為1至100mPa‧S，較佳為1至85mPa‧S(根據25℃條件下之音叉振動式黏度測定(SV-1A，A & D Company Ltd.))。又，在殼聚糖之情況，該水分散液之黏度的範圍為0.7至30mPa‧S，較佳為0.7至10mPa‧S(根據25℃條件下之音叉振動式黏度測定(SV-1A，A & D Company Ltd.))。
關於奈米纖維之調製方法，記載於WO2015/111686A1等中。
本發明之製造方法，於第1步驟中，使非水溶性多糖類所構成之奈米纖維承載細胞外基質。在本說明書中，奈米纖維「承載」細胞外基質，意指奈米纖維與細胞外基質以不經由化學共價鍵之方式附著或吸附的狀態。藉由奈米纖維所進行之細胞外基質的承載，可藉由分子間力或靜電相互作用、氫鍵、疏水性相互作用等而達成，然而不以此等為限。又，奈米纖維承載細胞外基質之狀態亦可稱為，奈米纖維與細胞外基質不經由化學性共價鍵而保持接觸的狀態，或者奈米纖維與細胞外基質不經由化學性共價鍵而形成複合體的狀態。
在本發明之製造方法的第1步驟中，承載於奈米纖維之細胞外基質，只要能得到期望之效果，無特別限定，可列舉膠原(膠原I至XIX)、纖網蛋 白、玻連蛋白、層黏連蛋白(層黏連蛋白-1至12)、RGD序列、鈣黏蛋白等。細胞外基質之選擇，隨增殖細胞的種類而異，若為本技術領域人士，當可適宜選擇。例如在間葉系幹細胞之情況，細胞外基質以玻連蛋白為較佳。又，玻連蛋白，在源自人類之玻連蛋白的情況，以胺基酸序列(以下，表記為胺基酸序列)為20-398(序列編號1)或62-478(序列編號2)者為較佳。使用源自非人類之玻連蛋白的情況，可使用對應於源自人類之玻連蛋白之片段的區域。
在本發明之製造方法中，奈米纖維承載的細胞外基質之量，相對於每1g之奈米纖維，細胞外基質通常為0.001至50mg，較佳為0.01至10mg，更佳為0.1至10mg，進一步更佳為0.3至10mg，再進一步更佳為1至10mg，特佳為2至10mg，然而不以此等為限。
在本發明之製造方法中，承載細胞外基質的奈米纖維之調製，可將使奈米纖維已分散於水性溶劑之分散液與細胞外基質之水溶液混合，視需要可經一定時間靜置而調製。就使奈米纖維分散的水性溶劑之例而言，可列舉水、二甲基亞碸(DMSO)等，然而不以此等為限。就水性溶劑而言，以水為較佳。水性溶劑中，亦可包含適當之緩衝劑或鹽。為使細胞外基質均勻地與奈米纖維接觸，以藉由吸液(pipetting)操作等充分地混合為較佳。又，就靜置之時間而言，可將奈米纖維之分散液與細胞外基質之水溶液的混合液靜置，通常30分鐘以上，較佳為1小時以上，更佳為3小時以上，進一步更佳為6小時以上，再進一步更佳為9小時以上，特佳為12小時以上。靜置時間無特別上限，例如，就上限而言，可設定為48小時以下(例如36小時以下、24小時以下、或16小時以下等)。就靜置時之溫度而言，無特別限定，通常可為1至30℃，較佳為1至15℃，更佳為2至10℃，特佳為2至5℃(例如4℃)。
由非水溶性多糖類構成之奈米纖維與細胞外基質的混合比，雖隨所使用的此等物質之種類而異，然而以固體成分重量換算，例如，可為100：0.1至1，較佳為100：0.4至0.6，然而不以此等為限。
關於由非水溶性多糖類構成之奈米纖維所承載的細胞外基質之量，例如，可藉由Micro BCA法、酵素免疫測定法(ELISA法)等測定，然而不以此等為限。
在較佳之型態中，非水溶性多糖類所構成之奈米纖維均勻地分散於液體培養基中，使附著於該奈米纖維的接著性細胞懸浮於該液體培養基中。
本發明之製造方法之第2步驟中之添加有承載細胞外基質之奈米纖維的培養基，可隨所使用的接著性細胞之種類等而適宜選擇，例如，在目的為哺乳類之接著性細胞之培養的情況，可使用哺乳類細胞之培養一般用的培養基。就哺乳類細胞用培養基而言，例如，杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、哈姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基、麥考伊5A培養基(McCoy’s 5A Medium)、伊格爾MEM培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM培養基(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium；αMEM)、MEM培養基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊氏改良杜爾貝科培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E、IPL41培養基、費雪氏(Fischer’s)培養基、StemPro34(Invitrogen公司製)、X-VIVO 10(Kenbrex公司製)、X-VIVO 15(Kenbrex公司製)、HPGM(Kenbrex公司製)、StemSpan H3000(Stem Cell Technology公司製)、StemSpanSFEM(Stem Cell Technology公司製)、StemlineII(Sigma Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、 StemProhESCSFM(Invitrogen公司製)、mTeSR1或2培養基(StemCell Technology公司製)、Sf-900II(Invitrogen公司製)、Opti-Pro(Invitrogen公司製)等。
在上述之培養基中，本技術領域人士亦可依據目的而自由地添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。哺乳類細胞之培養時，本技術領域人士亦可依據目的，添加一種以上其他化學成分或活體成分的組合。就可添加於哺乳類細胞用培養基的成分而言，可列舉牛胎兒血清、人類血清、馬血清、胰島素、轉鐵蛋白(transferrin)、乳鐵蛋白(lactoferrin)、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原、甲基纖維素、各種細胞激素(cytokine)、各種荷爾蒙、各種增殖因子、各種細胞外基質或各種細胞接著分子等。就可添加於培養基中的細胞激素而言，例如介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、介白素-13(IL-13)、介白素-14(IL-14)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、介白素-21(IL-21)、干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、單核球群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、flk2/flt3配體(FL)、白血病細胞阻礙因子(Leukemia inhibiting factor,LIF)、抑癌素M(oncostatin M)(OM)、促紅血球生成素(erythropoietin)(EPO)、血小板生成素(thrombopoietin)(TPO)等，然而應不以此等為限。
就可添加於培養基之荷爾蒙而言，可列舉褪黑激素(melatonin)、血清素(serotonin)、甲狀腺素、三碘甲狀腺素、腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、 抗穆勒管荷爾蒙(anti-Mullerian hormone)、脂聯素(adiponectin)、副腎皮質刺激荷爾蒙、血管緊張素原(angiotensinogen)及血管緊張素(angiotensin)、抗利尿荷爾蒙、心房鈉利尿性肽、降鈣素(calcitonin)、膽囊收縮素、促腎上腺皮質激素釋出荷爾蒙、促紅血球生成素、濾泡刺激荷爾蒙、胃泌素(gastrin)、飢餓素(ghrelin)、升糖素(glucagon)、促性腺激素釋出荷爾蒙、成長荷爾蒙釋出荷爾蒙、人類絨毛性促性腺激素、人類胎盤性乳原、成長荷爾蒙、抑制素(inhibin)、胰島素、類胰島素成長因子、瘦素(leptin)、黃體形成荷爾蒙、黑色素細胞刺激荷爾蒙、催產素(oxytocin)、副甲狀腺荷爾蒙、催乳素(prolactin)、促胰液素(secretin)、生長抑素(somatostatin)、血小板生成素(thrombopoietin)、甲狀腺刺激荷爾蒙、催甲狀腺素釋出荷爾蒙、皮質醇(cortisol)、醛固酮(aldosterone)、睾丸激素(testosterone)、脫氫表雄酮(dehydroepiandrone)、雄烯二酮(androstenedione)、二氫睾丸激素、雌二醇(estradiol)、雌酮(estrone)、雌三醇(estratriol)、孕酮(progesterone)、骨化三醇(calcitriol)、骨化二醇(calcidiol)、前列腺素(prostaglandin)、白三烯(leucotriene)、前列環素(prostacyclin)、血栓素(thromboxane)、催乳素釋出荷爾蒙、促脂素(lipotropin)、腦鈉利尿肽、神經肽Y、組織胺、內皮素(endosialin)、胰臟多肽、腎素(renin)、及腦啡肽(enkephalin)，然而應不以此等為限。
就可添加於培養基之增殖因子而言，可列舉轉型(transforming)成長因子-α(TGF-α)、轉型(transforming)成長因子-β(TGF-β)、巨噬細胞炎症蛋白質-1α(MIP-1α)、上皮細胞增殖因子(EGF)、纖維母細胞增殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8、或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神經細胞增殖因子(NGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、白血病阻障因子(LIF)、蛋白酶連接蛋白I、蛋白酶連接蛋白II、源自血小板之成長因子(PDGF)、膽鹼促效性分化因子(CDF)、趨化因子 (chemokine)、Notch配體(Delta1等)、Wnt蛋白質、類血管生成素蛋白質2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、類胰島素成長因子(IGF)、類胰島素成長因子結合蛋白質(IGFBP)、多效生長因子(Pleiotrophin)等，然而應不以此等為限。
又，亦可添加藉由基因重組技術，將此等細胞激素或增殖因子之胺基酸序列以人為方式改變者。就其例而言，可列舉IL-6/可溶性IL-6受體複合體或Hyper IL-6(IL-6與可溶性IL-6受體之融合蛋白質)等。
就可添加於培養基的抗生素之例而言，可列舉硫磺製劑、青黴素、非奈西林(pheneticillin)、二甲苯青黴素(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、二氯唑西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、納夫西林(nafcillin)、胺苄青黴素(ampicillin)、青黴素、阿莫西林(amoxicillin)、環青黴素(cyclacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、哌拉西林(piperacillin)、阿洛西林(azlocillin)、美洛西林(meczlocillin)、美西林(mecillinam)、阿米西林(amdinocillin)、頭孢菌素(cephalosporin)及其衍生物、草酸、阿米沙星(amifloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)、
Figure 109122609-A0202-12-0015-22
啶酮酸(nalidixic acid)、吡咯嘧啶酸(pyromidic acid)、環丙沙星(ciprofloxacin)、西沙星(sinoxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、羅沙星(rosaxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、哌啶酸(pipemidic acid)、舒巴坦(sulbactam)、克拉維酸(clavulinic acid)、β-溴青黴酸、β-氯青黴酸、6-乙醯基亞甲基-青黴酸、頭孢噁唑(cefoxazole)、舒坦比西林(sultapicillin)、阿迪西林(adinocillin)及舒巴坦(sulbactam)之甲醛/食品級酯、他唑巴坦(tazobactam)、胺曲南(aztreonam)、硫唑嗪(sulfazetin)、異硫唑嗪(isosulfazetin)、諾卡汀(nocardicin)、苯基乙醯胺基膦酸甲酯、金黴素、土黴素、四環素、地氯環 素(demeclocycline)、強力黴素(doxycycline)、間環素(metacycline)以及米諾環素(minocycline)。
混合比率無特別限定，然而奈米纖維之分散液：液體培養基(培養基之水溶液)(體積比)，通常為1：99至99：1，較佳為10：90至90：10，更佳為20：80至80：20。
在本說明書中，細胞之懸浮意指對培養容器而言，細胞為不接著的狀態(非接著)，不管細胞是否沉降。再者，在本說明書中，將培養細胞時，不伴隨對液體培養基組成物之來自外部的壓力或振動，或於該組成物中之振盪、旋轉操作等，而使細胞分散於該液體培養基組成物中，且為懸浮狀態的狀態，稱為「懸浮靜置」，將以該狀態培養細胞及/或組織，稱為「懸浮靜置培養」。就「懸浮靜置」中可懸浮之期間而言，至少5分鐘以上，較佳為1小時以上、24小時以上、48小時以上、6日以上、21日以上，然而只要保持懸浮狀態，不限定於此等期間。
在較佳之型態中，依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物，在可進行細胞之培養的溫度範圍(例如，0至40℃)之至少1點，可進行細胞之懸浮靜置。該培養基組成物，較佳為25至37℃之溫度範圍之至少1點，最佳為在37℃，可進行細胞之懸浮靜置。
藉由將接著性細胞以附著於承載有細胞外基質之奈米纖維的狀態培養，可懸浮培養接著性細胞。承載有細胞外基質的奈米纖維，顯示使附著於該奈米纖維之細胞懸浮於培養基中的效果(較佳為使其懸浮靜置之效果)及細胞增殖促進效果。承載有細胞外基質的奈米纖維，由於亦溶解於液體培養基中，而不附著於培養容器，並分散，若在該液體培養基組成物中培養接著性細胞，則接 著性細胞附著於該奈米纖維，而懸浮於該培養基組成物中。藉由該懸浮效果，與單層培養相比，可增加每一定體積之細胞數，而實施培養。又，先前伴隨旋轉或振盪操作之懸浮培養，由於賦予細胞剪切力，細胞之增殖率或回收率低，或者細胞之功能有時受損，然而藉由使用依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物，由於可在不需要振盪等操作下，將細胞以分散狀態培養，所以可期待細胞功能不損失且容易大量懸浮培養目標接著性細胞。又，先前之含凝膠基材的培養基，於懸浮培養細胞時，有時細胞之觀察或回收困難，或在回收時其功能受損，然而藉由使用依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物，可期待在無損其功能下觀察、回收懸浮培養的細胞。又，先前之包含凝膠基材的培養基，有黏度高，培養基之交換困難的情況，然而依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物，由於為低黏度，可期待容易地用吸液管或泵浦等交換培養基。
在使用承載有細胞外基質的奈米纖維，懸浮培養接著性細胞之情況，只要對於含有該奈米纖維之培養基組成物，添加另行調製的接著性細胞，再均勻地混合即可。此時之混合方法無特別限制，例如可列舉藉由吸液等手動之混合、使用攪拌器、渦旋混合器、微孔板混合器、振盪機等機器進行混合。混合後，可將所得到之細胞懸浮液以靜置狀態培養，亦可視需要進行旋轉、振盪或攪拌，同時培養。其旋轉數及頻率，可配合本技術領域人士之目的而適宜設定。例如，將接著性細胞於繼代培養後回收，使用適當之細胞解離液，分散至單一細胞、或與其接近之狀態，將分散之接著性細胞懸浮於培養基組成物中，再將其付諸於懸浮培養(較佳為懸浮靜置培養)。
培養細胞時之溫度，若為動物細胞，通常為25至39℃，較佳為33至39℃(例如37℃)。CO2濃度通常在培養之蒙氣中，為4至10體積%，以4至6體積%為較佳。培養期間只要配合培養之目的而適宜設定即可。
在依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物中之接著性細胞的培養，可使用細胞培養一般用的培養器皿(schale)、燒瓶、塑膠袋、鐵氟龍(註冊商標)袋、碟(dish)、培養皿(petri dish)、組織培養用皿、多孔培養皿(multidish)、微培養盤、微孔培養盤、多孔盤(multiplate)、多孔培養盤(multi-well plate)、腔室載玻片(chamber slide)、管、托盤、培養袋、螺旋瓶等培養容器而實施。附著於奈米纖維之接著性細胞，期望不與培養容器接著，此等培養容器以細胞低接著性為較佳。就細胞低接著性之培養容器而言，可使用培養容器之表面不施行以提高與細胞之接著性為目的之人工處理(例如，藉由細胞外基質等進行塗布處理)者，或培養容器之表面施行以減低與細胞之接著性為目的之人工處理者。
當培養基交換成為必要時，只要藉由進行離心或過濾處理，將細胞分離後，將新鮮培養基或依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物添加於該細胞即可。或者，只要藉由進行離心或過濾處理，將細胞適宜濃縮後，將新鮮培養基或本發明之培養基組成物添加於該濃縮液中即可。例如，離心時之重力加速度(G)為100至400G，進行過濾處理時所用的過濾器之細孔大小為10μm至100μm，然而不以此等為限制。
接著性細胞之培養，亦可於機械控制下及封閉環境下，自動施行細胞播種、培養基交換、細胞圖像取得、培養細胞回收，控制pH、溫度、氧濃度等，同時藉由能以高密度培養的生物反應器或自動培養裝置進行。
若將接著性細胞，以附著於承載有細胞外基質之奈米纖維的狀態進行懸浮培養，接著性細胞可效率良好地增殖，所以該懸浮培養，就作為接著性細胞之增殖方法而言為優異。若將接著性細胞以附著於承載有細胞外基質之奈米纖維的狀態進行懸浮培養，則接著性細胞不會只偏存於培養容器之底面，而以三次元方式廣泛地分散，促進增殖。其結果，增殖之細胞成為以葡萄串狀連接於奈米纖維上的狀態。在此增殖促進效果方面，為使接著性細胞懸浮(亦即，避免接著性細胞對培養容器之接著)，只要充分濃度之奈米纖維包含於培養基組成物中即可，懸浮靜置(亦即，不伴隨來自外部之壓力、振動、振盪、旋轉操作等，細胞均勻地分散於液體培養基組成物中，且成為懸浮狀態)可能不需要。
以將接著性細胞附著於承載有細胞外基質之奈米纖維的狀態，進行懸浮培養，而增殖該細胞的情況，就使用於該懸浮培養之培養基而言，可使用維持該接著性細胞之形質，同時能使該細胞增殖的培養基。若為本技術領域人士，該培養基可依據接著性細胞之種類而適宜選擇。
在本發明之製造方法的另一型態中，除了承載有細胞外基質的奈米纖維外，可進一步摻合殼聚糖奈米纖維。藉由使用含有承載有細胞外基質之奈米纖維及殼聚糖奈米纖維的培養基組成物，懸浮培養接著性細胞，可促進培養之細胞的增殖，且維持其品質。例如，在懸浮培養哺乳動物之幹細胞(例如間葉系幹細胞)的情況，可使其維持分化能力、歸巢(homing)能力/移行能力，同時增殖。因此，若依照本型態，可大量地調製高品質之幹細胞。再者，幹細胞是否維持分化能力或移行能力等特性，可依照本身周知之方法判別。簡言之，藉由以mRNA濃度及/或蛋白質量濃度來決定幹細胞之未分化性相關細胞標記(例如OCT4基因、 SOX2基因、NANOG基因等)或移行性相關細胞標記(例如CXCR4基因等)的表現量，可容易地判別。
在本型態中，為了調製以期望之比率(重量)含有承載有細胞外基質(例如玻連蛋白)之奈米纖維(例如甲殼素奈米纖維)及殼聚糖奈米纖維的培養基，以承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至20(較佳為承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至10，更佳為承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.7至9，進一步更佳為承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：1至8，再進一步更佳為承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：2至7，特佳為承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：3至6)之比率摻合。可將所得到之承載有細胞外基質的奈米纖維/殼聚糖奈米纖維的混合物，以培養基中所含有的總奈米纖維(承載細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)之濃度，通常成為0.0001至0.2%(w/v)，較佳成為0.0005至0.1%(w/v)，更佳成為0.001至0.05%(w/v)，特佳成為0.006至0.05%(w/v)的條件，摻入液體培養基中。或者，亦可藉由在液體培養基中，分別添加必要量之承載細胞外基質(例如玻連蛋白)的奈米纖維(例如甲殼素奈米纖維)及殼聚糖奈米纖維，並充分攪拌，而調製成期望之培養基。
在一型態中，依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物中之承載有細胞外基質(例如玻連蛋白)的奈米纖維(例如甲殼素奈米纖維)及殼聚糖奈米纖維的濃度滿足以下之條件：
(1)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.0001至0.2%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承 載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(2)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.0005至0.1%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(3)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.001至0.05%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
或者
(4)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.006至0.05%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)。
在其他實施型態中，可將所得到之承載有細胞外基質的奈米纖維/殼聚糖奈米纖維之混合物，以培養基中所含有的總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)之濃度，通常成為0.0001至1.0%(w/v)，較佳成為0.001至0.5%(w/v)，進一步更佳成為0.005至0.3%(w/v)，特佳成為0.01至0.1%(w/v)的方式，摻入液體培養基。
在另一型態中，依照本發明之製造方法所製造的培養基組成物中之承載有細胞外基質(例如玻連蛋白)的奈米纖維(例如甲殼素奈米纖維)及殼聚糖奈米纖維之濃度，滿足以下之條件：
(5)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.0001至1.0%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(6)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)之濃度為0.001至0.5%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(7)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.005至0.3%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
或者
(8)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.01至0.1%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)。
在將接著性細胞附著於承載有細胞外基質的奈米纖維及/或殼聚糖奈米纖維之狀態進行懸浮培養的情況，不需要從培養容器剝離細胞之操作，可 只將新鮮培養基或本發明之培養基組成物添加於該懸浮培養物中，或只將該懸浮培養物之全部或一部分添加於新鮮培養基或本發明之培養基組成物中，進行接著性細胞的繼代培養。藉由採用此繼代培養方法，接著性細胞可在不進行從培養容器剝離細胞之操作下，進行繼代培養。又，藉由採用該繼代培養方法，可在不進行從培養容器剝離細胞之操作下，擴大接著性細胞之培養規模。就從培養容器剝離細胞之操作而言，可列舉藉由螯合劑(例如EDTA)及/或蛋白質分解酵素(例如胰蛋白酶、膠原酶)的處理。上述繼代培養方法，在對從培養容器剝離細胞之操作敏感性高的接著性細胞(例如，因剝離操作而生存性降低的接著性細胞、因剝離操作形質容易改變的接著性細胞)的繼代培養為有利。就對從培養容器剝離細胞之操作敏感性高的接著性細胞而言，可列舉幹細胞(例如間葉系幹細胞)、前驅細胞(例如前驅脂肪細胞)、初代培養細胞等，然而不以此等為限。
例如，對於附著於甲殼素奈米纖維之接著性細胞的懸浮液，添加甲殼素之分解酵素，將混合物以足以使接著性細胞剝離的時間進行培育。使用甲殼素之分解酵素的培育溫度，通常為20℃至37℃。培育時間取決於酵素之種類等，而通常為5至60分鐘。
若甲殼素奈米纖維分解，接著性細胞從奈米纖維剝離，藉由將懸浮液付諸於離心分離，可回收剝離之接著性細胞。
以此方法回收之接著性細胞，由於可將損傷抑制至最小限度，所以適合使用於功能解析或移植等。
2.培養基添加用組成物
又，本發明提供一種培養基添加用組成物(以下，稱為「本發明之組成物」)，其包含承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維、以及殼聚糖奈米纖維。
本發明之組成物，其特徵為包含承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維、以及殼聚糖奈米纖維。本發明之組成物中的甲殼素奈米纖維、殼聚糖奈米纖維、及細胞外基質等，與本發明之製造方法中所說明者相同。
就本發明之組成物的調製方法之一例而言，如以下之方法例示。首先，將細胞外基質(例如玻連蛋白)之水溶液混入甲殼素奈米纖維及水性溶劑所構成之分散液中，進行攪拌後靜置(靜置時之時間或溫度等的條件，與「本發明之製造方法」中所說明者相同)。攪拌無特別限定，只要藉由吸液操作等進行即可。藉此，可調製承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維之分散液。繼而，在承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維之分散液中，摻入由殼聚糖奈米纖維及水性溶劑所構成的分散液，將其攪拌，可調製本發明之組成物。
關於本發明之組成物中含有之甲殼素奈米纖維所承載之細胞外基質的量，只要能得到期望之效果，無特別限定，每1g之甲殼素奈米纖維，細胞外基質通常為0.001至50mg，較佳為0.01至10mg，更佳為0.1至10mg，進一步更佳為0.3至10mg，再進一步更佳為1至10mg，特佳為2至10mg，然而不以此等為限。
在本發明之組成物中，承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維與殼聚糖奈米纖維之量比(重量)，只要能得到期望之效果，無特別限定，通常為承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至20(較佳為承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至10，更佳為承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.7至9，進一步更佳為承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：1至8，再進一步更佳為 承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：2至7，特佳為承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：3至6)。
本發明之組成物，係摻入接著性細胞之培養基中。本發明之組成物對培養基之添加量，只要能得到期望之效果，無特別限定，例如，以能使該培養基中所含有的總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)之濃度通常成為0.0001至0.2%(w/v)，較佳成為0.0005至0.1%(w/v)，進一步更佳成為0.001至0.05%(w/v)，特佳成為0.006至0.05%(w/v)之方式添加。
在另一型態中，本發明之組成物對培養基的添加量，以能使該培養基中所含有的總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)之濃度通常成為0.0001至1.0%(w/v)，較佳成為0.001至0.5%(w/v)，進一步更佳成為0.005至0.3%(w/v)，特佳成為0.01至0.1%(w/v)之方式添加。
3.培養基組成物
又，本發明提供包含本發明之組成物的接著性細胞之懸浮培養用培養基組成物(以下，稱為「本發明之培養基組成物」)。
本發明之培養基組成物，藉由將本發明之組成物與細胞培養用之培養基混合而調製。細胞培養用之培養基，可依據所培養之接著性細胞的種類而適宜決定。就用於調製本發明之培養基組成物的培養基而言，可列舉「本發明之製造方法」中所例示的培養基。
在一型態中，本發明之培養基組成物中的承載有細胞外基質(例如玻連蛋白)之甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維，滿足以下之條件：
(1)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.0001至0.2%(w/v)，且該組成物中所含之承 載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(2)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.0005至0.1%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(3)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.001至0.05%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比，為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
或者
(4)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.006至0.05%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)。
在另一型態中，本發明之培養基組成物中的承載有細胞外基質(例如玻連蛋白)之甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維，滿足以下之條件：
(5)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.0001至1.0%(w/v)，且該組成物中所含之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(6)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.001至0.5%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
(7)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.005至0.3%(w/v)，且該培養基組成物中所含有之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)；
或者
(8)培養基組成物中所含有之總奈米纖維(承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維)的濃度為0.01至0.1%(w/v)，且該培養基組成物中所含之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維的重量比為1：0.5至20(較佳為1：0.5至10、1：0.7至9、1：1至8、1：2至7、或1：3至6)。
在以下之實施例中，進一步具體說明本發明，然而本發明不受此等例之任何限定。
[實施例]
[調製例1]
(包含甲殼素奈米纖維之水分散液的調製)
將依據上述專利文獻1(國際公開第2015/111686號)之記載調製的2質量%甲殼素奈米纖維水分散液，於121℃進行20分鐘高壓釜(autoclave)滅菌處理。然後，藉由將此水分散液以成為1%(w/v)之條件，混合於無菌蒸餾水(大塚蒸餾水， 大塚製藥股份有限公司工場製)中，並使其懸浮，製作無菌之包含甲殼素奈米纖維的水分散液。
[調製例2]
(包含殼聚糖奈米纖維之水分散液的調製)
將依據上述專利文獻1(國際公開第2015/111686號)之記載調製的2質量%殼聚糖奈米纖維水分散液，於121℃進行20分鐘高壓釜滅菌處理。然後，藉由將此水分散液以成為1%(w/v)之條件，混合於無菌蒸餾水(大塚蒸餾水，大塚製藥股份有限公司工場製)中，並使其懸浮，製作包含無菌之殼聚糖奈米纖維的水分散液。
[調製例3]
(包含甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之水分散液的調製)
在調製例1中製作的甲殼素奈米纖維水分散液(2mL)中，添加調製例2中所製作的殼聚糖奈米纖維水分散液(8mL)，藉由吸液混合，製作包含甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維的水分散液(10mL)。
[調製例4]
(包含玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維的水分散液之調製)
在調製例1中製作之1%(w/v)甲殼素奈米纖維水分散液中，添加含有500μg/mL之玻連蛋白水溶液(Gibco Vitronectin(VTN-N)重組人類蛋白質，截短的，Thermo Fisher Scientific公司製)，藉由吸液混合後，於4℃靜置保管一晚，製作玻連蛋白摻合量不同的包含玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維的水分散液。將所製作的包含玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維的水分散液示於表1。藉由下述所記載之分析例1，確認玻連蛋白已承載於甲殼素奈米纖維。
[表1]
Figure 109122609-A0202-12-0029-1
[調製例5]
(包含玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維的水分散液的調製)
在調製例4所製作之玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維水分散液(2mL)中，添加調製例2中所製作之殼聚糖奈米纖維水分散液(8mL)，藉由吸液混合，製作包含玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維的水分散液(10mL)。將所製作之包含玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維的水分散液示於表2。
[表2]
Figure 109122609-A0202-12-0029-2
[分析例1]
(組成物中的玻連蛋白之染色)
在調製例1中所製作的甲殼素奈米纖維水分散液(100μL)、調製例3中所製作的甲殼素奈米纖維/殼聚糖奈米纖維水分散液(100μL)、調製例4中所製作的 DHd511(100μL)、調製例5中所製作的DHd515(100μL)中，分別添加蛋白質高感度染色液(TaKaRa CBB Protein Safe Stain，Takara Bio股份有限公司製)(40μL)，靜置10分鐘。將此等以每個20μL滴入玻璃平板，覆上蓋玻片，藉由相位差顯微鏡進行觀察。將甲殼素奈米纖維水分散液之觀察圖示於圖1，將甲殼素奈米纖維/殼聚糖奈米纖維水分散液之觀察圖示於圖2，將DHd511之觀察圖示於圖3，將DHd515之觀察圖示於圖4。圖1及圖2方面，無法觀察到染色部分，相對地，圖3及圖4方面，可在甲殼素奈米纖維部分觀察到染色。由此，可確認依照調製例4之方法，玻連蛋白物理吸附並承載於甲殼素奈米纖維表面。研判此係玻連蛋白以(非化學鍵結)物理方式吸附於甲殼素奈米纖維之故。又，藉由圖4，亦顯示即使經過調製例5之步驟後，原樣使甲殼素奈米纖維承載玻連蛋白。
[分析例2]
(甲殼素纖維所承載的玻連蛋白量之計算)
調製例4中所製成之玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維水分散液中，蛋白質只含玻連蛋白。因此，將玻連蛋白承載量，使用為總蛋白質定量用套組的Micro BCA蛋白質檢定套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，依照以下之方法算出。
將調製例4中所製作的DHd509、510、511(各1mL)分別分注於1.5mL微管中，進行離心分離(12300×g，5分鐘)。將上清液(500μL)藉由0.45μm過濾器小瓶(Thomson公司製)過濾，將濾液(300μL)分別回收至新1.5mL微管中。參考上述套組之規程(protocol)，將以MA液(5.0mL)/MB液(4.8mL)/MC液(0.2mL)之比例混合而調製的Working Reagent試藥(300μL)加入回收之上清液中，於60℃進行1小時加溫。加溫後，分別以每孔300μL分注於96孔檢定板(Corning 3603)中，藉由培養盤讀數器(Plate Reader)(infiniteM200PRO，Tecan公司製)，測 定562nm之吸光度。再者，玻連蛋白之校正線，係使用將1、5、25、50、100μg/mL溶液以與上述樣本同樣之方法處理、測定而得之562nm之吸光度製成。從藉由所得到之測定值定量的水分散液之上清液中所含的玻連蛋白量，將甲殼素表面所承載(物理性吸著)的玻連蛋白量，依照以下之式算出。
[添加之玻連蛋白全量]-[水分散液之上清液所含的玻連蛋白量]=[甲殼素表面所承載之玻連蛋白量]
將結果示於表3。從表3，確認摻入之玻連蛋白承載於甲殼素奈米纖維，可知若增加玻連蛋白之添加量，則甲殼素奈米纖維之玻連蛋白承載量亦增加。
[表3]
Figure 109122609-A0202-12-0031-3
[試驗例1]
(使用含有玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物的3D培養中，源自人類臍帶的間葉系幹細胞之連續擴大培養)
在為血清培養基之間葉系幹細胞增殖培養基(C-28009，Takara Bio公司製)中，以成為0.05%(w/v)之終濃度的方式，分別添加調製例5中所製作之DHd513、DHd514、DHd515，調製培養基組成物。又，就對照樣本而言，添加包含調製例 3中所製作的1%(w/v)甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之水分散液，成為0.05%(w/v)之終濃度的方式，調製培養基組成物。
接著，將所培養的源自人類臍帶之間葉系幹細胞(C-12971，Takara Bio公司製)，以成為16667細胞/mL之方式，分別懸浮於上述之各培養基組成物後，在24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3473)中，以1.2mL/孔播種。將細胞於CO2培育器(37℃，5%CO2)內，以靜置狀態培養4日。針對播種時(第0日)及播種後第4日之培養液300μL，添加300μL之ATP試藥(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製)並使其懸浮，於室溫靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，減去只有培養基之發光值，算出活細胞量(2點之平均值)。
在播種後第4日，將接著有細胞之奈米纖維藉由吸液使其再分散，將其懸浮液，從24孔平底超低接著表面微培養盤回收2孔份(約2.4mL)，在其中分別重新追加7.6mL之上述各培養基組成物，並藉由吸液混合後，以全量/孔播種於6孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3471)中，進行培養。第7日，使接著有細胞之奈米纖維藉由吸液再分散，從6孔平底超低接著表面微培養盤回收約5mL之該懸浮液，在其中分別重新追加5mL之上述各培養基組成物，並藉由吸液混合後，以全量/孔播種於新6孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3471)中，進行培養。第10日亦實施與第7日同樣之操作，繼續培養至第13日。相對於藉由6孔平底超低接著表面微培養盤進行擴大培養的第7、10、13日之細胞培養液500μL，添加500μL之ATP試藥(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製)，使其懸浮，在室溫靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，減 去只有培養基之發光值，算出活細胞量(2點之平均值)。又，第4、7、10、13日之最終ATP值，係使用各步驟中的擴大比率換算。
其結果，若使用含有玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物，培養源自人類臍帶的間葉系幹細胞，與含有未承載玻連蛋白之甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物(對照樣本)比較，顯示明顯的增殖促進作用。又，其增殖促進效果，依賴於玻連蛋白承載量。又，可藉由只追加新鮮的含有甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物，在不進行藉由胰蛋白酶等從基材剝離細胞之處理，而擴大培養。將各培養中之換算RLU值(ATP測定，發光強度)示於表4。
[表4]
Figure 109122609-A0202-12-0033-4
[試驗例2]
(使用含有玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物的3D培養中，源自人類骨髓間葉系幹細胞之連續擴大培養)
在為血清培養基之間葉系幹細胞增殖培養基(C-28009，Takara Bio公司製)中，以成為0.05%(w/v)之終濃度的方式，分別添加調製例5中所製作之DHd513、DHd514、DHd515，調製培養基組成物。又，就對照樣本而言，添加包含調製例 3中所製作的1%(w/v)甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之水分散液，成為0.05%(w/v)之終濃度的方式，調製培養基組成物。
接著，將所培養的源自人類骨髓之間葉系幹細胞(C-12977，Takara Bio公司製)，以成為8333細胞/mL之方式，分別懸浮於上述之各培養基組成物後，以1.2mL/孔播種在24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3473)中。將細胞於CO2培育器(37℃，5%CO2)內，以靜置狀態培養。第4日將孔中之培養基上清液約0.6mL除去，在孔中分別添加0.6mL之新鮮間葉系幹細胞增殖培養基，藉由吸液管懸浮後，進一步繼續培養至播種後第8日。針對播種時(第0日)及播種後第8日之培養液300μL，添加300μL之ATP試藥(CellTiter-GloTM發光法細胞活力檢測(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay)，Promega公司製)使其懸浮，於室溫靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，減去只有培養基之發光值，算出活細胞量(2點之平均值)。
在播種後第8日，將只接著DHd515群細胞之奈米纖維藉由吸液使其再分散，從24孔平底超低接著表面微培養盤回收約0.6mL之該懸浮液，在其中重新追加0.6mL之上述含DHd515的培養基組成物，藉由吸液混合後，以全量/孔播種於24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3471)中，再繼續培養至播種後第11日。對於其他樣本群，除去約0.6mL之孔中培養基上清液，分別於孔中添加0.6mL之新鮮間葉系幹細胞增殖培養基，藉由吸液管使其懸浮後，再繼續培養至播種後第11日。第11日，含DHd515之全部樣本群，除去約0.6mL之孔中培養基上清液，分別在孔中添加0.6mL之新鮮間葉系幹細胞增殖培養基，藉由吸液管懸浮後，再繼續培養至播種後第15日。在播種後第15 日，於DHd515群及DHd514群，使接著有細胞之奈米纖維藉由吸液而再分散，從24孔平底超低接著表面微培養盤回收約0.6mL之該懸浮液，分別重新追加0.6mL之含上述DHd515或DHd514的培養基組成物，藉由吸液混合後，以全量/孔播種在24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3471)中，再繼續培養至播種後第18日。對於其他樣本群，除去約0.6mL之孔中培養基上清液，分別在孔中添加0.6mL之新鮮間葉系幹細胞增殖培養基，藉由吸液管懸浮後，再繼續培養至播種後第18日。在第18日，含DHd515之所有樣本群，除去約0.6mL之孔中培養基上清液，分別於孔中添加0.6mL之新鮮間葉系幹細胞增殖培養基，藉由吸液管懸浮後、再繼續培養至播種後第22日。在播種後第22日，於DHd515群及DHd514群，使接著有細胞之奈米纖維藉由吸液而再分散，從24孔平底超低接著表面微培養盤回收約0.6mL之該懸浮液，分別重新追加0.6mL之上述包含DHd515或DHd514的培養基組成物，藉由吸液混合後，以全量/孔播種在24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3471)中，再繼續培養至播種後第27日。其他樣本群，將孔中之培養基除去約0.6mL，分別在孔中添加0.6mL之新鮮間葉系幹細胞增殖培養基，藉由吸液管懸浮後，再繼續培養至播種後第27日。
相對於藉由24孔平底超低接著表面微培養盤進行培養的第15、22、27日之細胞培養液300μL，添加300μL之ATP試藥(CellTiter-GloTM發光法細胞活力檢測，Promega公司製)，並使其懸浮，在室溫靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，減去只有培養基之發光值，算出活細胞量(2點之平均值)。又，第15、22、27日之最終ATP值，係使用各步驟中的擴大比率換算。
其結果，若使用含有玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物，培養源自人類骨髓的間葉系幹細胞，與含有未承載玻連蛋白甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物(對照樣本)比較，顯示明顯的增殖促進作用。又，其增殖促進效果，依賴於玻連蛋白承載量。又，可藉由只追加新鮮的含有甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物，不進行藉由胰蛋白酶等的從基材之細胞剝離處理，而擴大培養。將各培養中之換算RLU值(ATP測定，發光強度)示於表5。
[表5]
Figure 109122609-A0202-12-0036-5
[試驗例3]
(使用含有玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物的3D培養中，源自人類脂肪的間葉系幹細胞之連續擴大培養及與玻連蛋白添加效果之比較)
在為血清培養基之間葉系幹細胞增殖培養基(C-28009，Takara Bio公司製)中，以終濃度成為0.05%(w/v)的方式，分別添加調製例5中所製作之DHd513、DHd514、DHd515，調製成培養基組成物。又，就對照樣本而言，添加包含調製 例3中所製作的1%(w/v)甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之水分散液，使終濃度成為0.05%(w/v)，而調製成培養基組成物。
接著，將所培養的源自人類脂肪之間葉系幹細胞(C-12977，Takara Bio公司製)，以成為8333細胞/mL之方式，分別懸浮於上述之各培養基組成物後，以1.2mL/孔播種在24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3473)中。將細胞於CO2培育器(37℃，5%CO2)內，以靜置狀態培養。又，使用對照樣本播種，數小時後，添加含有500μg/mL之玻連蛋白水溶液(Gibco玻連蛋白(VTN-N)重組人類蛋白質，截短的，Thermo Fisher Scientific公司製)，最終濃度成為0.5μg/mL或1.0μg/mL的方式，繼續培養。0.5μg/mL為DHd515中，與用以承載的玻連蛋白量同等之添加量，1.0μg/mL為DHd515之2倍量的玻連蛋白添加量。針對播種時(第0日)及播種後第4日之培養液300μL，添加300μL之ATP試藥(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司製)使其懸浮，並於室溫靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，減去只有培養基之發光值，算出活細胞量(2點之平均值)。
在播種後第4日，對於對照樣本，除去約0.6mL之孔中培養基，分別在孔中添加新鮮間葉系幹細胞增殖培養基0.6mL，藉由吸液管懸浮後，再繼續培養至播種後第8日。另一方面，對於其他樣本，使接著有細胞之奈米纖維藉由吸液再分散，從24孔平底超低接著表面微培養盤回收約0.6mL之該懸浮液，在其中重新追加0.6mL之各培養基組成物，藉由吸液混合後，以全量/孔播種於24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3473)中，再繼續培養至播種後第8日。從播種後第8日以後，以3至4日之間隔，使接著有細胞之奈米纖維 藉由吸液再分散，從24孔平底超低接著表面微培養盤回收約0.6mL之該懸浮液，分別重新追加0.6mL之各培養基組成物，藉由吸液混合後，以全量/孔播種在24孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3473)中，再繼續培養至播種後第21日。
相對於藉由24孔平底超低接著表面微培養盤進行培養的第8、15、21日之細胞培養液300μL，添加ATP試藥300μL(CellTiter-GloTM發光法細胞活力檢測，Promega公司製)，使其懸浮，在室溫靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，減去只有培養基之發光值，算出活細胞量(2點之平均值)。又，第8、15、21日之最終ATP值，係使用各步驟中的擴大比率換算。
其結果，若使用含有玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物，培養源自人類脂肪的間葉系幹細胞，與含有未承載玻連蛋白甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物(對照樣本)比較，顯示明顯的增殖促進作用。又，其增殖促進效果依賴於玻連蛋白承載量。再者，DHd515之增殖促進效果，明顯地比使用對照樣本的培養液中直接將玻連蛋白以同量或2倍量添加之效果高。又，可藉由只追加新鮮的含有甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維之培養基組成物，不進行藉由胰蛋白酶等從基材剝離細胞之處理，而擴大培養。將各培養中之換算RLU值(ATP測定，發光強度)示於表6。
[表6]
Figure 109122609-A0202-12-0039-6
[試驗例4]
(因所承載的玻連蛋白之胺基酸序列之差異所致之細胞增殖效果的檢討)
在5mL之調製例1中所製作的1%(w/v)甲殼素奈米纖維水分散液中，添加3種胺基酸殘基相異之500μg/mL玻連蛋白水溶液((A)Gibco玻連蛋白(VTN-N)重組人類蛋白質，截短，胺基酸序列62-478，Thermo Fisher Scientific公司製，(B)PluriSTEM-XF重組玻連蛋白，胺基酸序列20-398，Sigma-Aldrich公司製，(C)無動物來源重組人類玻連蛋白，衍生自HEK293細胞，胺基酸序列20-478(序列編號3)，PeproTech公司製)之任一者0.5mL，藉由吸液混合後，於4℃靜置保管一晚，製作3種含有玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維的水分散液。以下，將使用上述(A)、(B)、或(C)所調製的包含玻連蛋白承載甲殼素奈米纖維及殼聚糖奈米纖維的水分散液分別記載為水分散液A、水分散液B、或水分散液C。
在為血清培養基的間葉系幹細胞增殖培養基(C-28009，Takara Bio公司製)中，分別添加水分散液A、水分散液B、或水分散液C，成為0.05%(w/v)之終濃度的方式，調製培養基組成物。
接著，將所培養的源自人類臍帶之間葉系幹細胞(C-12971，Takara Bio公司製)，以成為15000細胞/mL之方式，分別懸浮於上述之各培養基組成物後，以10mL/孔播種在6孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3471)中。將細胞於CO2培育器(37℃，5%CO2)內，以靜置狀態培養。第3日，除去約5mL之孔中培養基上清液，分別在孔中添加新鮮間葉系幹細胞增殖培養基5mL，藉由吸液管懸浮，進行半量培養基交換後，再繼續培養至播種後第7日。第7日，將接著有細胞的奈米纖維藉由吸液，使其再分散，從6孔平底超低接著表面微培養盤回收約5mL之該懸浮液，在其中分別重新追加5mL之上述各培養基組成物，藉由吸液混合後，以全量/孔播種在新6孔平底超低接著表面微培養盤(Corning公司製，#3471)中，進行培養。亦於第10日實施與第7日同樣之操作，繼續培養至第13日。對於在播種時(第0日)及藉由6孔平底超低接著表面微培養盤進行培養的第3、7、10、13日之細胞培養液500μL中，添加500μL之ATP試藥(CellTiter-GloTM發光法細胞活力檢測，Promega公司製)，使其懸浮，於室溫靜置約10分鐘後，藉由FlexStation3(Molecular Devices公司製)測定發光強度(RLU值)，減去只有培養基之發光值，算出活細胞量(2點之平均值)。又，第3、7、10、13日之最終ATP值，係使用各步驟中的擴大比率換算。將各培養之換算RLU值(ATP測定，發光強度)示於表7、及表8。
其結果，(A)與(B)之玻連蛋白顯示同等之增殖效果。另一方面，(C)之玻連蛋白亦比(A)之情況的增殖效果緩和。
[表7]
Figure 109122609-A0202-12-0041-7
[表8]
Figure 109122609-A0202-12-0041-8
[產業上之可利用性]
藉由使用細胞外基質承載於對培養基不溶而懸浮於培養基之奈米纖維狀多糖類而成的多糖類奈米纖維，作為載劑(carrier)基材，可將間葉系幹細胞或前驅脂肪細胞等接著性細胞以靜置狀態進行懸浮培養，且在懸浮培養條件下，接著於該奈米纖維之細胞，增殖增加，並顯示長期之生存性。
本文中所述之包含專利及專利申請說明書之全部刊物所記載的內容，係藉由於本文中引用，而以與全文被明示者相同程度之方式納入本說明書中。
本申請案係以在日本申請的特願2019-125536(申請日：2019年7月4日)作為基礎，其內容全部包含於本說明書中。
<110> 日商日產化學股份有限公司(NISSAN CHEMICAL CORPORATION)
<120> 用以懸浮培養接著性細胞的培養基組成物之製造方法
<130> 093047
<150> JP 2019-125536
<151> 2019-07-04
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類玻連蛋白之62至478的胺基酸片段
<400> 1
Figure 109122609-A0202-12-0043-9
Figure 109122609-A0202-12-0044-10
Figure 109122609-A0202-12-0045-11
<210> 2
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類玻連蛋白之20至398的胺基酸片段
<400> 2
Figure 109122609-A0202-12-0045-12
Figure 109122609-A0202-12-0046-13
Figure 109122609-A0202-12-0047-14
<210> 3
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類玻連蛋白之20至478的胺基酸片段
<400> 3
Figure 109122609-A0202-12-0047-15
Figure 109122609-A0202-12-0048-16
Figure 109122609-A0202-12-0049-17

Claims (14)

  1. 一種用以懸浮培養接著性細胞的培養基組成物之製造方法，其包含下列步驟：
    (i)使由非水溶性多糖類構成之奈米纖維承載細胞外基質的步驟；
    (ii)將步驟(i)所得到之承載有細胞外基質的奈米纖維添加於培養基的步驟。
  2. 如請求項1所述之製造方法，其中非水溶性多糖類為選自甲殼素、殼聚糖、纖維素、及半纖維素構成之群組中的至少1種。
  3. 如請求項1或2所述之製造方法，其中細胞外基質為選自膠原、纖網蛋白、玻連蛋白、層黏連蛋白、RGD序列、及鈣黏蛋白構成之群組中的至少1種。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之製造方法，其中奈米纖維所承載之細胞外基質的量為，相對於每1g之奈米纖維，細胞外基質為0.01至50mg。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之製造方法，其中非水溶性多糖類為甲殼素。
  6. 如請求項5所述之製造方法，其中在步驟(ii)中，進一步添加殼聚糖奈米纖維。
  7. 如請求項6所述之製造方法，其中承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維與殼聚糖奈米纖維的含量比(重量)為，承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至20。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之製造方法，其中細胞外基質為玻連蛋白。
  9. 一種培養基添加用組成物，其包含承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維，及殼聚糖奈米纖維。
  10. 如請求項9所述之培養基添加用組成物，其中細胞外基質為選自膠原、纖網蛋白、玻連蛋白、層黏連蛋白、RGD序列、及鈣黏蛋白構成之群組中的至少1種。
  11. 如請求項9或10所述之培養基添加用組成物，其中甲殼素奈米纖維所承載之細胞外基質的量為，相對於每1g之甲殼素奈米纖維，細胞外基質為0.01至50mg。
  12. 如請求項9至11中任一項所述之培養基添加用組成物，其中培養基組成物所含有之承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維與殼聚糖奈米纖維的含量比(重量)為，承載有細胞外基質的甲殼素奈米纖維：殼聚糖奈米纖維=1：0.5至20。
  13. 如請求項9至12中任一項所述之培養基添加用組成物，其中細胞外基質為玻連蛋白。
  14. 一種接著性細胞之懸浮培養用培養基組成物，其包含如請求項9至13中任一項所述之培養基添加用組成物。
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