WO2023063418A1 - 接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法 - Google Patents

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WO2023063418A1
WO2023063418A1 PCT/JP2022/038383 JP2022038383W WO2023063418A1 WO 2023063418 A1 WO2023063418 A1 WO 2023063418A1 JP 2022038383 W JP2022038383 W JP 2022038383W WO 2023063418 A1 WO2023063418 A1 WO 2023063418A1
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WO
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nanofibers
cells
medium
chitosan
manufactured
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PCT/JP2022/038383
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French (fr)
Inventor
大輔 畑中
鵬 徐
克彦 木田
昌史 岩上
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日産化学株式会社
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling the size and/or number of adherent cell spheres.
  • somatic stem cells and progenitor cells have attracted attention because they have a lower cancer risk and a shorter differentiation period than pluripotent stem cells.
  • microcarriers tend to settle in the culture solution under stationary conditions, so it is necessary to agitate the culture medium, and the agitation causes cell death due to collisions between the microcarriers. It is pointed out that problems such as In addition, the efficiency of cell proliferation is not sufficient, and further improvement is expected.
  • the present inventors have found that by culturing adherent cells in suspension using a medium containing a substrate containing chitin nanofibers as a main component at a specific concentration, We have found that the size and number of adherent cell spheres can be controlled. The present inventors also found that the adherent cells obtained by this method have desirable qualities in terms of undifferentiation and migration. Furthermore, the present inventors also found that the use of a base material containing chitin nanofibers as a main component at a low concentration improves the efficiency of recovering cells after culturing. Based on these findings, the inventors have further studied and completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a method for controlling the size and/or the number of spheres of adherent cells which comprises the step of suspension culture of adherent cells in a medium containing nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides.
  • the method according to [1], wherein the concentration of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides in the medium is 0.0001 to 0.2% (w/v).
  • [4] The method of [3], wherein the extracellular matrix is at least one selected from the group consisting of collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, RGD sequence, and cadherin.
  • the adherent cells are selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells, somatic non-stem cells, primary cultured cells, cell lines, and cancer cells.
  • the medium further contains chitosan nanofibers.
  • [7] The method according to [6], wherein the concentration of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides and chitosan nanofibers in the medium is 0.0001 to 0.2% (w/v).
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the water-insoluble polysaccharide is at least one selected from the group consisting of chitin, chitosan, cellulose, and hemicellulose.
  • a method for isolating spheres comprising the step of subjecting a suspension of spheres produced by the method according to any one of [1] to [8] to a cell strainer.
  • the size and/or number of adherent cell spheres can be controlled.
  • FIG. 1 shows photographs of spheres observed under each condition of Test Example 1 when human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured in suspension in a medium containing vitronectin-loaded chitin nanofibers and chitosan nanofibers.
  • FIG. 2 is a photograph of cells cultured in suspension under each condition of Test Example 1 and then seeded in a well plate, taken using Cell 3 iMagerduos (manufactured by SCREEN Holdings).
  • 3 is a diagram showing a sphere extraction image obtained as a result of image analysis in Test Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the number of spheres and the average diameter of spheres under each condition of Test Example 1.
  • FIG. 1 shows photographs of spheres observed under each condition of Test Example 1 when human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were cultured in suspension in a medium containing vitronectin-loaded chitin nanofibers and chitosan nanofibers.
  • FIG. 2
  • FIG. 5 is a micrograph showing the state of spheres obtained by culturing under each condition of Test Example 2.
  • FIG. 6 is a photograph showing the state of spheres under each condition of Test Example 5.
  • FIG. 7 is a diagram showing substrates and cells in the filtrate in Test Example 5.
  • the present invention provides adherent cell spheres comprising a step of suspension culture of adherent cells in a medium containing nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides. (hereinafter sometimes referred to as "the method of the present invention").
  • the adherent cells are not particularly limited, but examples include stem cells, progenitor cells, somatic non-stem cells, primary cultured cells, cell lines, cancer cells, and the like.
  • Stem cells are cells that have both the ability to replicate themselves and the ability to differentiate into other cells of multiple lineages.
  • adherent stem cells include, but are not limited to, mesenchymal stem cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, liver stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, Somatic stem cells such as hair follicle stem cells can be used.
  • Mesenchymal stem cells are stem cells that have the ability to differentiate into all or some of osteocytes, chondrocytes and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells are present in tissues such as bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood, and adipose tissue at low frequencies, and can be isolated from these tissues by known methods.
  • Progenitor cells are cells that are in the process of differentiating from the stem cells to specific somatic cells or germ cells. Examples of adhesive progenitor cells include, but are not limited to, preadipocytes, cardiomyocyte precursors, endothelial precursor cells, neural progenitor cells, hepatic progenitor cells, pancreatic progenitor cells, renal progenitor cells, and the like.
  • adherent somatic non-stem cells include, but are not limited to, fibroblasts, osteocytes, bone pericytes, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells , endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, chondrocytes, cumulus cells, nervous system cells, glial cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, astrocytes, cardiac cells, esophageal cells, muscle cells (e.g. , smooth muscle cells or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanocytes, and the like.
  • adherent somatic non-stem cells include, but are not limited to, fibroblasts, osteocytes, bone pericytes, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells , endothelial cells, vascular endotheli
  • Primary cultured cells refer to cells that are in a state of being cultured until cells or tissues separated from a living body are seeded and the cells are subcultured for the first time.
  • Primary cultured cells for example skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage, blood vessels It can be cells taken from any tissue such as tissue, blood, heart, eye, brain or nerve tissue.
  • a cell line refers to a cell that has acquired unlimited proliferative capacity through artificial manipulation in vitro.
  • Adherent cells in the method of the present invention are preferably stem cells or progenitor cells, more preferably mesenchymal stem cells.
  • the plant is not particularly limited as long as the collected cells can be cultured in a liquid.
  • plants that produce herbal medicines e.g. saponins, alkaloids, berberine, scoporine, plant sterols, etc.
  • plants e.g., blueberry, safflower, madder, saffron, etc.
  • body e.g., anthocyanin, safflower pigment, madder pigment, saffron pigment, flavones, etc.
  • plants that produce active pharmaceutical ingredients e.g., but not limited to them.
  • nanofibers refer to fibers with an average fiber diameter (D) of 0.001 to 1.00 ⁇ m.
  • the average fiber diameter of the nanofibers used in the present invention is preferably 0.005 to 0.50 ⁇ m, more preferably 0.01 to 0.05 ⁇ m, still more preferably 0.01 to 0.02 ⁇ m.
  • the aspect ratio (L/D) of the nanofibers to be used is obtained from average fiber length/average fiber diameter, and is not particularly limited, but is usually 2 to 500, preferably 5 to 300. , more preferably 10-250.
  • the average fiber diameter (D) of nanofibers is obtained as follows. First, a collodion support film manufactured by Oken Shoji Co., Ltd. was subjected to hydrophilization treatment for 3 minutes with an ion cleaner (JIC-410) manufactured by JEOL Ltd., and a nanofiber dispersion (diluted with ultrapure water) to be evaluated was applied several times. Add dropwise and dry at room temperature. This was observed with a transmission electron microscope (TEM, H-8000) manufactured by Hitachi, Ltd. (10,000 times) at an acceleration voltage of 200 kV, and the number of specimens: 200 to 250 using the obtained image. The fiber diameter of each nanofiber is measured, and the number average value is defined as the average fiber diameter (D).
  • TEM transmission electron microscope
  • the average fiber length (L) is obtained as follows.
  • the nanofiber dispersion to be evaluated is diluted with pure water to 100 ppm, and the nanofibers are uniformly dispersed using an ultrasonic cleaner.
  • This nanofiber dispersion is cast onto a silicon wafer whose surface has been hydrophilized in advance using concentrated sulfuric acid, and dried at 110° C. for 1 hour to obtain a sample.
  • a scanning electron microscope SEM, JSM-7400F
  • the number of specimens 150 to 250 nanofibers one by one
  • the fiber length of the book is measured, and the number average value is defined as the average fiber length (L).
  • the nanofibers when the nanofibers are mixed with a liquid medium, the nanofibers are uniformly dispersed in the liquid while maintaining the primary fiber diameter, and adhere to the nanofibers without substantially increasing the viscosity of the liquid. It has the effect of substantially retaining the cells and preventing their sedimentation.
  • the nanofibers used in the method of the present invention are composed of water-insoluble polysaccharides.
  • a polysaccharide means a sugar polymer in which 10 or more monosaccharides (eg, triose, tetrose, pentose, hexose, heptose, etc.) are polymerized.
  • water-insoluble polysaccharides include, but are not limited to, celluloses such as cellulose and hemicellulose; chitin substances such as chitin and chitosan;
  • the water-insoluble polysaccharide is preferably chitin or chitosan, more preferably chitin.
  • nanofibers composed of chitin may be referred to as “chitin nanofibers”. The same applies to other water-insoluble polysaccharides.
  • Chitosan refers to one or more carbohydrates selected from the group consisting of chitin and chitosan.
  • the main sugar units that constitute chitin and chitosan are N-acetylglucosamine and glucosamine, respectively.
  • chitin and glucosamine have a high N-acetylglucosamine content and are poorly soluble in acidic aqueous solutions.
  • Chitosan has a high content and is soluble in an acidic aqueous solution.
  • a sugar containing 50% or more of N-acetylglucosamine in the constituent sugars is called chitin, and a sugar containing less than 50% is called chitosan.
  • the chitin used in the present invention may be chitin having an ⁇ -type crystal structure such as chitin derived from crab shells or shrimp shells, or chitin having a ⁇ -type crystal structure such as chitin derived from squid carapace. good too.
  • Outer shells of crabs and shrimps are often treated as industrial waste, and are preferable as a raw material from the viewpoint of easy availability and effective utilization. process is required. Therefore, in the present invention, it is preferable to use purified chitin that has already been subjected to dematrix treatment. Purified chitin is commercially available.
  • the raw material for chitin nanofibers used in the present invention may be chitin having either an ⁇ -type or a ⁇ -type crystal structure, but ⁇ -type chitin is preferred.
  • Polysaccharide nanofibers can be obtained by pulverizing the above-mentioned polysaccharides.
  • the pulverization method is not limited, but in order to pulverize to the fiber diameter and fiber length suitable for the purpose of the present invention, a high-pressure homogenizer, a grinder (stone mill), or a medium agitating mill such as a bead mill, which can obtain a strong shearing force. is preferred.
  • a high-pressure homogenizer for example, it is desirable to refine (pulverize) using a wet pulverization method as disclosed in JP-A-2005-270891 and Japanese Patent No. 5232976. .
  • a dispersion liquid in which the raw material is dispersed is sprayed from a pair of nozzles at high pressure and caused to collide, thereby pulverizing the raw material.
  • high-pressure pulverizer or Nanoveita (high-pressure pulverizer manufactured by Yoshida Kikai Kogyo Co., Ltd.).
  • the concentration of the raw material in the aqueous dispersion during the micronization process is not particularly limited, but is usually 0.1% by mass to 30% by mass, preferably 1% by mass to 10% by mass.
  • the number of treatments for pulverization is not particularly limited, and depends on the concentration of the raw material in the aqueous dispersion, but when the concentration of the raw material is 0.1 to 1% by mass, the number of treatments is 10 to 10%. Sufficient micronization is achieved by about 100 cycles, but with 1 to 10% by mass, about 10 to 1000 cycles may be required.
  • the viscosity of the aqueous dispersion during the fine refining treatment is not particularly limited. It is a tuning fork vibration type viscosity measurement (SV-1A, A & D Company Ltd.) under the conditions. In the case of chitosan, the viscosity of the aqueous dispersion is in the range of 0.7 to 30 mPa ⁇ S, preferably 0.7 to 10 mPa ⁇ S (measurement of tuning-fork vibratory viscosity at 25° C. (SV-1A, by A&D Company Ltd.).
  • the state in which the nanofibers carry the extracellular matrix refers to the state in which the nanofibers and the extracellular matrix remain in contact without chemical covalent bonds, or the state in which the nanofibers and the cell It can be rephrased as a state in which the outer matrix forms a complex without chemical covalent bonds.
  • the amount of extracellular matrix carried by the nanofibers is usually 0.001 to 50 mg, preferably 0.01 to 10 mg, more preferably 0.1 to 50 mg per 1 g of nanofibers. 10 mg, more preferably 0.3 to 10 mg, even more preferably 1 to 10 mg, particularly preferably 2 to 10 mg, but not limited thereto.
  • nanofibers carrying an extracellular matrix are prepared by mixing a dispersion of nanofibers in an aqueous solvent and an aqueous solution of the extracellular matrix, and allowing the mixture to stand for a certain period of time if necessary.
  • aqueous solvents in which the nanofibers are dispersed include, but are not limited to, water, dimethylsulfoxide (DMSO), and the like. Water is preferred as the aqueous solvent.
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the aqueous medium may contain suitable buffers and salts. In order to bring the extracellular matrix into contact with the nanofibers uniformly, it is preferable to mix them sufficiently by a pipetting operation or the like.
  • the mixture of the nanofiber dispersion and the extracellular matrix aqueous solution is usually left for 30 minutes or longer, preferably 1 hour or longer, more preferably 3 hours or longer, and still more preferably 6 hours or longer. Still more preferably 9 hours or more, particularly preferably 12 hours or more, can be allowed to stand still.
  • the upper limit can be set to 48 hours or less (eg, 36 hours or less, 24 hours or less, or 16 hours or less).
  • the temperature during standing is not particularly limited, but is usually 1 to 30°C, preferably 1 to 15°C, more preferably 2 to 10°C, particularly preferably 2 to 5°C (eg, 4°C). can be done.
  • the amount of extracellular matrix supported by nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides can be measured, for example, by Micro BCA method, enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA method), etc., but is not limited thereto. .
  • the medium containing nanofibers can be appropriately selected depending on the type of adherent cells to be used.
  • Any medium commonly used for Media for mammalian cells include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's Nutrient Mixture F12, DMEM/F12 medium, McCoy's 5A medium (McCoy' S5A medium), Eagle MEM medium (Eagle's Minimum Essential Medium; EMEM), ⁇ MEM medium (alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium; ⁇ MEM), MEM medium (Minimum Essential Fulbecco Medium, modified Dulbeccois Medium 6 medium (RP MI140) Iscove's Modified Dulbecco's Medium; IMDM), MCDB131 medium, William medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, StemPro34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO 10 (manufactured by Cambrex), X-VIVO 15 ( Cambre
  • DMEM
  • a person skilled in the art may freely add sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, various amino acids, various vitamins, antibiotics, serum, fatty acids, sugars, etc. to the above medium according to the purpose.
  • those skilled in the art can also add one or more other chemical components or biological components in combination depending on the purpose.
  • Components that can be added to media for mammalian cells include fetal bovine serum, human serum, horse serum, insulin, transferrin, lactoferrin, cholesterol, ethanolamine, sodium selenite, monothioglycerol, 2-mercaptoethanol, bovine serum.
  • albumin sodium pyruvate, polyethylene glycol, various vitamins, various amino acids, agar, agarose, collagen, methylcellulose, various cytokines, various hormones, various growth factors, various extracellular matrices, various cell adhesion molecules, and the like.
  • Hormones that can be added to the medium include melatonin, serotonin, thyroxine, triiodothyronine, epinephrine, norepinephrine, dopamine, anti-Müllerian hormone, adiponectin, adrenocorticotropic hormone, angiotensinogen and angiotensin, antidiuretic hormone, atrial Natriuretic peptide, calcitonin, cholecystokinin, corticotropin-releasing hormone, erythropoietin, follicle-stimulating hormone, gastrin, ghrelin, glucagon, gonadotropin-releasing hormone, growth hormone-releasing hormone, human chorionic gonadotropin, human placental lactogen, growth hormone, inhibin , insulin, insulin-like growth factor, leptin, luteinizing hormone, melanocyte-stimulating hormone, oxytocin, parathyroid hormone,
  • Growth factors that can be added to the medium include transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), macrophage inflammatory protein-1 ⁇ (MIP-1 ⁇ ), epidermal growth factor ( EGF), fibroblast growth factor-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), nerve cell growth factor (NGF), hepatocyte growth factor (HGF), leukemia inhibitory factor (LIF), protease nexin I, protease nexin II, platelet-derived growth factor (PDGF), cholinergic differentiation factor (CDF), chemokines , Notch ligand (such as Delta1), Wnt protein, Angiopoietin-like protein 2, 3, 5 or 7 (Angpt2, 3, 5, 7), Insulin-like growth factor (IGF), Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), Prey Examples include, but are not limited to, Otrophin (Pleiotrophin).
  • TGF- ⁇ transforming
  • supplements and serum replacements may be added to the medium.
  • these include StemPro (registered trademark) Neural Supplement (manufactured by Thermo Fisher), B-27 (registered trademark) Supplement (manufactured by Thermo Fisher), KnockOut (registered trademark) Serum Replacement (manufactured by Thermo Fisher), CTS (registered trademark) KnockOut (registered trademark) SR Xeno Free Medium (manufactured by Thermo Fisher), ELAREM (registered trademark) Prime I Research Grade (manufactured by PL Bioscience), ELAREM (registered trademark) Perform I Research Grade or GMP Grade (PL Bioscience), ELAREM (registered trademark) Perform-FDI Research Grade or GMP Grade (manufactured by PL Bioscience), ELAREM (registered trademark) Ultimate-FDI GMP Grade (manufactured by PL Bioscience), Human Platelet (registered Lysate) Trademark) (manufactufact
  • Cell adhesion molecules that can be added to the medium include Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated (manufactured by Thermo Fisher), CTS (registered trademark) Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated (manufactured by Thermo Fisher ), rhLaminin-521 (manufactured by Thermo Fisher), iMatrix-511MG (manufactured by Matrixome), iMatrix-511 silk or -411 or -221 (manufactured by Matrixome), NutriCoat (registered trademark) Attachment Solution (manufactured by Biological Industries) ), but not limited to these.
  • the mixing ratio is not particularly limited, but the nanofiber dispersion: liquid medium (aqueous medium solution) (volume ratio) is usually 1:99 to 99:1, preferably 10:90 to 90:10. , more preferably 20:80 to 80:20.
  • the medium composition used in the method of the present invention allows cells to be left in suspension at at least one temperature range where cell culture is possible (eg, 0 to 40°C).
  • the medium composition preferably allows cells to remain suspended at at least one point in the temperature range of 25 to 37°C, most preferably at 37°C.
  • the adherent cells can be cultured in suspension by culturing the adherent cells while attached to nanofibers that may carry an extracellular matrix.
  • the base material made of nanofibers that may carry an extracellular matrix does not dissolve in a liquid medium and disperses without adhering to a culture vessel. Therefore, when adherent cells are cultured in the liquid medium, , adherent cells attach to the substrate and float in the medium.
  • the adherent cells are collected from subculture, dispersed to single cells or a state close thereto using an appropriate cell dissociation solution, and the dispersed adherent cells are suspended in a medium composition. , and subjected to suspension culture (preferably suspension stationary culture).
  • suspension culture preferably suspension stationary culture
  • the resulting cell suspension may be cultured while stirring.
  • a known method may be used for stirring the liquid medium.
  • homogeneous as used herein means a state of suspension from a macroscopic point of view, in which the substrate and cells are unevenly distributed on the bottom surface of the vessel and do not remain statically in place. It does not mean that the base material and cells are evenly distributed from the point of view.
  • a method known per se may be used to stir the liquid medium. Examples include, but are not limited to, magnetic stirrers and stirring blades. Moreover, the rotational speed and frequency for stirring may be appropriately set according to the purpose of those skilled in the art.
  • the lower limit of the stirring speed (i.e., blade tip speed) used in the present invention is not particularly limited as long as the cells and substrate are not stationary. 0.10 m/min or more (eg, 0.15 m/min or more), more preferably 0.90 m/min or more (eg, 0.97 m/min or more).
  • the upper limit is, for example, usually 50.0 m/min or less, preferably 30.0 m/min or less (eg, 22.6 m/min or less), more preferably 20.00 m/min or less (eg, 15.08 m/min or less). /min or less).
  • the tip speed is typically 0.01 to 50.0 m/min, preferably 0.10 to 30.0 m/min (eg, 0.15 to 22.6 m/min), more preferably can be from 0.90 to 20.00 m/min.
  • one cycle may consist of stirring at a specific number of rotations selected from the number of rotations described above for 1 minute and not stirring for 59 minutes, and this cycle may be repeated during cell culture.
  • one cycle may consist of stirring at a specific rotation speed selected from the rotation speeds described above for 1 minute and no stirring for 119 minutes, and this cycle may be repeated during cell culture.
  • the mixture may be constantly stirred during cell culture.
  • the temperature for culturing cells is usually 25 to 39°C, preferably 33 to 39°C (eg, 37°C) for animal cells.
  • the CO 2 concentration is usually 4-10% by volume, preferably 4-6% by volume, in the culture atmosphere.
  • the culture period may be appropriately set according to the purpose of the culture.
  • Adherent cells can be cultured in the method of the present invention using petri dishes, flasks, plastic bags, Teflon (registered trademark) bags, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multidishes, and microplates that are commonly used for cell culture. , microwell plates, multiplates, multiwell plates, chamber slides, tubes, trays, culture bags, roller bottles and the like. These culture vessels desirably have low cell adhesion so that adherent cells attached to the substrate used in the present invention do not adhere to the culture vessels.
  • the culture vessel with low cell adhesion is one in which the surface of the culture vessel has not been artificially treated (for example, a coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion to cells, or a culture vessel with a Those whose surfaces are artificially treated for the purpose of reducing adhesion to cells can be used.
  • the cells can be separated by centrifugation or filtration, and then fresh medium can be added to the cells.
  • the cells may be appropriately concentrated by centrifugation or filtration, and then fresh medium may be added to this concentrate.
  • the acceleration of gravity (G) during centrifugation is 100 to 400 G
  • the pore size of the filter used for filtration is 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, but is not limited to these.
  • Cultivation of adherent cells is performed automatically in a closed environment under mechanical control, cell seeding, medium exchange, cell image acquisition, cultured cell recovery, and controlling pH, temperature, oxygen concentration, etc. It can also be performed using a bioreactor or an automatic culture apparatus capable of high-density culture.
  • the adherent cells When the adherent cells are cultured in suspension in a state where they are adhered to a nanofiber substrate that may carry an extracellular matrix, the adherent cells proliferate in the form of spheres, but the cells are undifferentiated. Gene expression of markers (OCT4, NANOG, etc.) and migratory markers (CXCR4, etc.) is enhanced. That is, the adherent cells obtained by the present invention can be suitable, for example, as cells for living body transplantation.
  • the culture medium used for the suspension culture maintains the traits of the adherent cells.
  • a medium is used in which the cells can grow.
  • the medium can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of adherent cells.
  • the medium used in the method of the present invention may contain chitosan nanofibers in addition to nanofibers that may carry an extracellular matrix.
  • the chitosan nanofibers used in the method of the present invention can be those prepared according to the nanofiber preparation method described above. Alternatively, commercially available chitosan nanofibers may be used.
  • nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides added to the medium is not particularly limited as long as the desired effect can be obtained, but usually 0.0001 to 0.2% (w / v), preferably 0.0005 to 0.1% (w / v), and further It can be added to the liquid medium at a concentration of preferably 0.001 to 0.07% (w/v), particularly preferably 0.003 to 0.05% (w/v).
  • the concentration of the total nanofibers (nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides and chitosan nanofibers) contained in the medium was adjusted to , usually 0.0001 to 0.2% (w/v), preferably 0.0005 to 0.1% (w/v), more preferably 0.001 to 0.07% (w/v), especially It can be added to the liquid medium preferably at a concentration of 0.003 to 0.05% (w/v).
  • the required amount of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides (e.g., chitin nanofibers) and chitosan nanofibers may be separately added to a liquid medium and stirred well to prepare the desired medium. good.
  • the concentrations of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides (eg, chitin nanofibers) and chitosan nanofibers in the method of the present invention satisfy the following conditions: (1) the concentration of total nanofibers (nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.0001 to 0.2% (w/v); And, the weight ratio of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides contained in the medium composition to chitosan nanofibers is 1:0.01 to 10 (preferably 1:0.02 to 9, 1: 0.05-8, 1: 0.1-7, 1: 0.5-7, or 1: 1-6); (2) the concentration of total nanofibers (nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.0005 to 0.1% (w/v); And, the weight ratio of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides contained in the medium
  • the resulting mixture of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides/chitosan nanofibers is added to the total nanofibers contained in the medium (nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides and chitosan).
  • Nanofiber) concentration is usually 0.0001 to 1.0% (w/v), preferably 0.001 to 0.5% (w/v), more preferably 0.002 to 0.3% ( w/v), particularly preferably 0.003 to 0.1% (w/v).
  • the concentrations of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides (eg, chitin nanofibers) and chitosan nanofibers in the method of the present invention satisfy the following conditions: (5) the concentration of total nanofibers (nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.0001 to 1.0% (w/v); And, the weight ratio of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides contained in the medium composition to chitosan nanofibers is 1:0.01 to 10 (preferably 1:0.02 to 9, 1: 0.05-8, 1: 0.1-7, 1: 0.5-7, or 1: 1-6); (6) the concentration of total nanofibers (nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.001 to 0.5% (w/v); And, the weight ratio of nanofibers composed of water-insoluble polysaccharides contained in the medium composition
  • the obtained extracellular matrix-supporting nanofiber/chitosan nanofiber mixture is added to the medium so that the concentration of the total nanofibers (extracellular matrix-supporting nanofibers and chitosan nanofibers) is usually from 0.0001 to 0.0001. 0.2% (w/v), preferably 0.0005 to 0.1% (w/v), more preferably 0.001 to 0.07% (w/v), particularly preferably 0.003 to It can be blended into the liquid medium at 0.05% (w/v).
  • the required amount of extracellular matrix (eg, vitronectin)-carrying nanofibers (eg, chitin nanofibers) and chitosan nanofibers are separately added to the liquid medium, and the mixture is stirred well to prepare the desired medium.
  • the concentration of extracellular matrix (eg, vitronectin)-loaded nanofibers (eg, chitin nanofibers) and chitosan nanofibers in the method of the present invention satisfies the following conditions: (1) the concentration of total nanofibers (extracellular matrix-supporting nanofibers and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.0001 to 0.2% (w/v), and The weight ratio of extracellular matrix-carrying nanofibers to chitosan nanofibers contained in the medium composition is 1:0.01 to 10 (preferably 1:0.02 to 9, 1:0.05 to 8, 1:0.1-7, 1:0.5-7, or 1:1-6); (2) the concentration of total nanofibers (extracellular matrix-supporting nanofibers and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.0005 to 0.1% (w/v), and The weight ratio of extracellular matrix-carrying nanofibers to chitosan nanofibers contained in the medium composition is 1:0.01 to 10 (preferably 1:0.0
  • the obtained mixture of extracellular matrix-loaded nanofibers/chitosan nanofibers is mixed with the concentration of total nanofibers (extracellular matrix-loaded nanofibers and chitosan nanofibers) contained in the medium. , usually 0.0001 to 1.0% (w/v), preferably 0.001 to 0.5% (w/v), more preferably 0.002 to 0.3% (w/v), especially It can be added to the liquid medium preferably at a concentration of 0.003 to 0.1% (w/v).
  • the concentrations of extracellular matrix (eg, vitronectin)-supported nanofibers (eg, chitin nanofibers) and chitosan nanofibers in the method of the present invention satisfy the following conditions: (5) the concentration of total nanofibers (extracellular matrix-supporting nanofibers and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.0001 to 1.0% (w/v), and The weight ratio of extracellular matrix-carrying nanofibers to chitosan nanofibers contained in the medium composition is 1:0.01 to 10 (preferably 1:0.02 to 9, 1:0.05 to 8, 1:0.1-7, 1:0.5-7, or 1:1-6); (6) the concentration of total nanofibers (extracellular matrix-supporting nanofibers and chitosan nanofibers) contained in the medium composition is 0.001 to 0.5% (w/v), and The weight ratio of extracellular matrix-carrying nanofibers to chitosan nanofibers contained in the medium composition is 1:0.01 to 10 (preferably 1:0.02
  • the present invention also provides a method for isolating spheres (hereinafter referred to as the "isolation method of the present invention"), which comprises the step of subjecting a suspension of spheres prepared by the method of the present invention to a cell strainer. is available).
  • the pore size of the mesh of the cell strainer used in the isolation method of the present invention is not particularly limited as long as it is smaller than the size of the spheres to be recovered. 180 ⁇ m, 20-170 ⁇ m, 20-160 ⁇ m, 20-150 ⁇ m, more preferably 30-150 ⁇ m, 30-140 ⁇ m, 30-130 ⁇ m, 30-120 ⁇ m, 30-120 ⁇ m, particularly preferably 40-110 ⁇ m, 40-100 ⁇ m, It can be 40-90 ⁇ m, 40-80 ⁇ m.
  • the cell strainer used in the isolation method of the present invention may be a commercial product.
  • a cell strainer manufactured by pluriSelect which is used in the following examples, can be preferably used.
  • the conditions for passing the sphere suspension through the cell strainer are not particularly limited, and it is sufficient to follow a method known per se or instructions provided by the cell strainer manufacturer.
  • the spheres prepared by the method of the present invention are mixtures with nanofibers and the like composed of water-insoluble polysaccharides. By using the isolation method of the present invention, spheres can be efficiently isolated from the mixture.
  • aqueous dispersion containing chitin nanofibers supporting vitronectin and chitosan nanofibers was prepared according to the descriptions in WO2015/111686 and WO2021/002448. Specifically, it was prepared as follows. A 2% by mass chitin nanofiber aqueous dispersion prepared according to the description of WO2015/111686 was subjected to autoclave sterilization at 121° C. for 20 minutes.
  • this aqueous dispersion was mixed and suspended in sterile distilled water (Otsuka distilled water, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) so as to have a concentration of 1% (w/v), thereby containing sterile chitin nanofibers.
  • An aqueous dispersion was prepared.
  • Vitronectin aqueous solution containing 500 ⁇ g/mL (Gibco Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated, manufactured by Thermo Fisher Scientific) (0.5 mL) in 1% (w/v) chitin nanofiber aqueous dispersion (5 mL) was added, mixed by pipetting, and stored at 4° C.
  • aqueous dispersion containing vitronectin-loaded chitin nanofibers When analyzed according to the description in WO2021/002448, the amount of vitronectin carried was 20 ⁇ g/mL (2.2 mg of vitronectin per 1 g of chitin nanofibers). Next, a 2% by mass chitosan nanofiber aqueous dispersion prepared according to the description of WO2015/111686 was subjected to autoclave sterilization at 121° C. for 20 minutes.
  • this aqueous dispersion was mixed and suspended in sterile distilled water (Otsuka distilled water, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) so as to have a concentration of 1% (w/v), thereby containing sterile chitosan nanofibers.
  • sterile distilled water Otsuka distilled water, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.
  • An aqueous dispersion was prepared.
  • the prepared chitosan nanofiber aqueous dispersion (8 mL) was added to the aqueous dispersion (2 mL) containing the vitronectin-loaded chitin nanofibers, and mixed by pipetting to obtain 0.2% (w / v)
  • An aqueous dispersion (10 mL) containing vitronectin-loaded chitin nanofibers and 0.8% (w/v) chitosan nanofibers was prepared.
  • the mixture of vitronectin-loaded chitin nanofibers and chitosan nanofibers prepared here may be simply referred to as "substrate".
  • the cells were detached using DetachKit (manufactured by PromoCell, #C- 41210 ), and the base material of Preparation Example 1 was added to a final concentration of 0.05% ( w/v), 0.02% (w/v) or 0.01% (w/v) of the cells were added to 30 mL of the medium composition added to the mesenchymal stem cell growth medium 2, and CO 2 Stirring culture was performed for 7 days in an incubator (37° C., 5% CO 2 ).
  • a 30 mL single-use reactor (manufactured by ABLE, #BWV-S03A) was used as the culture vessel, and stirring was performed constantly at 25 rpm using a dedicated magnetic stirrer (manufactured by ABLE, #BWS-S03N0S-6). . On day 4 of culture, the culture vessel was allowed to stand for 10 minutes, and half of the culture supernatant was replaced with medium.
  • FIG. 3 shows the extracted sphere image from which data was finally obtained
  • FIG. 4 shows the number of spheres and the average diameter of the spheres. Bubbles were excluded from the contour extraction.
  • the substrate of Preparation Example 1 was added to a 96-well U-bottom low-adhesion plate (manufactured by Corning, #3474) at final concentrations of 0.10% (w/v), 0.08% (w/v), and 0.06% ( w/v), 0.04% (w/v), 0.02% (w/v), 0.01% (w/v) or 0.006% (w/v)
  • the medium composition (100 ⁇ L/well) added to the stem cell growth medium 2 was dispensed, and the cell suspension (100 ⁇ L/well) was added to obtain a final base concentration of 0.05% (w/ v), 0.04% (w/v), 0.03% (w/v), 0.02% (w/v), 0.01% (w/v), 0.005% (w/v) v) or 0.003% (w/v) or 100 ⁇ g, 80 ⁇ g, 60 ⁇ g, 40 ⁇ g, 20 ⁇ g, 10 ⁇ g or 6 ⁇ g/0.2 mL
  • mesenchymal stem cell growth medium 2 100 ⁇ L/well was dispensed into a 96-well U-bottom low-adhesion plate (Corning, #3474), and the above cell suspension (100 ⁇ L/well) was added.
  • cells were seeded at 2.5 ⁇ 10 ⁇ 3 cells/well in substrate-free medium.
  • Inoculated plates were cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for 7 days, observed microscopically on days 0, 3 and 7 and proliferation by ATP assay on days 0, 2, 3 and 7. A gender assessment was performed.
  • an ATP reagent manufactured by Promega, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (500 ⁇ L) was added to the cell culture medium (500 ⁇ L) on each culture day, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes. After that, 300 ⁇ L / well was dispensed into 3 wells into a white 96-well plate, and the luminescence intensity (RLU value) was measured with a plate reader (manufactured by Tecan, Infinite M200PRO). The average value of 3 points) was calculated.
  • RNA extraction solution 3 ⁇ 10 ⁇ 4 cells / mL was seeded in a medium without base material added, and then per well of a 24-well flat-bottom adhesive surface microplate (manufactured by Corning, #3516) (adherent culture group). Dispensed to 1 mL. Next, each plate was cultured in a stationary state in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ), half of the medium was exchanged on the fourth day, and the culture was continued for 7 days. The cells were collected on day 7, and 350 ⁇ L of RLT solution (RNeasy mini kit (manufactured by QIAGEN, #74106)) was added to prepare an RNA extraction solution.
  • RLT solution RNeasy mini kit (manufactured by QIAGEN, #74106)
  • RNA extraction solution After adding 350 ⁇ L of 70% ethanol to the RNA extraction solution, it was added to an RNeasy spin column and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds. Subsequently, 700 ⁇ L of RW1 solution was added to the RNeasy spin column and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds. Subsequently, 500 ⁇ L of RPE solution was added and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds. An additional 500 ⁇ L of RPE solution was added and centrifuged at 8000 ⁇ g for 2 minutes. An RNase-free solution was added to the RNA present in the RNeasy spin column and eluted.
  • cDNA was synthesized from the obtained RNA using PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc., #RR037A).
  • Real-time PCR was performed using the synthesized cDNA, Premix EX Taq (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc., #RR039A), and Taqman Probe (manufactured by Applied Bio Systems).
  • Taqman Probes manufactured by Applied Bio Systems
  • Hs04260367_gH was used for OCT4, Hs04399610_g1 for NANOG, Hs00607978 s1 for CXCR4, and Hs99999905_m1 for GAPDH.
  • a real-time PCR7500 was used as an instrument.
  • the relative value was calculated by correcting the value of each target gene with the value of GAPDH.
  • Table 4 shows the relative values of each gene expression with the value of the adherent culture set to 1.
  • the cells are detached using DetachKit (manufactured by PromoCell, #C-41210), and the base material of Preparation Example 1 is added to a final concentration of 0.05 % (w /v), the cells were added to 30 mL of the medium composition added to the mesenchymal stem cell growth medium 2, and cultured for 4 days in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) under stirring conditions of 25 rpm. gone.
  • a 30 mL single-use reactor manufactured by ABLE, #BWV-S03A
  • a dedicated magnetic stirrer manufactured by ABLE, #BWS-S03N0S-6) were used as culture vessels.
  • the culture medium, sphere suspension, and 0.5 mL of the filtrate before passing through a uniformly suspended cell strainer were transferred to a 12-well plate (#351143, manufactured by Corning) and subjected to an inverted microscope (#IX73, manufactured by Olympus). ) was used to observe.
  • a culture solution in which the sphere suspension was further cultured for 1 day and a suspension in which the sphere suspension was cultured for 4 days without the cell strainer treatment were similarly observed.
  • the acquired image is shown in FIG. Scale bar indicates 500 ⁇ m.
  • multiple spheres are formed by adding the base material prepared in Preparation Example 1 to the culture system of adherent cells.
  • the resulting adherent cells have higher expressions of undifferentiated markers and homing markers than when no base material is added, that is, good adherent cells can be obtained. Therefore, the present invention is preferably used, for example, for preparing cells for transplantation into a living body. Therefore, the present invention can be extremely useful in the technical field of living body transplantation.

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Abstract

本発明は、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーを含む培地において、接着性細胞を浮遊培養する工程を含む、接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法を提供する。

Description

接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法
　本発明は、接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法等に関する。
　近年、医療や美容の分野を中心に、細胞を生体内に移植や注入する方法が開発されている。中でも、体性幹細胞や前駆細胞は、多能性幹細胞に比べて癌化リスクが低く、分化期間が短い等の理由から注目されている。
　これらの細胞を利用する際には、良好な状態の細胞を大量に提供する必要があるが、その方法としては、幹細胞等をマイクロキャリア等に接着した状態で培養し、増殖させる方法が知られている。
　しかしながら、現在、一般的に入手可能なマイクロキャリアは、静置条件では培養液中で沈降してしまうことから、培養時に撹拌する必要があり、その撹拌によりマイクロキャリア同士の衝突などにより細胞死が起こる等の課題が指摘されている。また、細胞増殖の効率についても十分ではなく、更なる改良が期待されている。
　本発明者らは、水への分散性を高めた多糖類等のナノファイバーを用いて、動植物細胞及び／又は組織を浮遊状態にて培養するための培地組成物を開発している（特許文献１）。
　さらに本発明者らは、非水溶性多糖類からなるナノファイバーが、接着性細胞のｉ）浮遊培養、ｉｉ）分化誘導、ｉｉｉ）非凍結条件下での輸送や保存、ｉｖ）移植、ｖ）培養上清からの生理活性物質の回収等の種々の操作における共通のキャリアとなり得ることを見出している（特許文献２、特許文献３）。
ＷＯ２０１５／１１１６８６ ＷＯ２０１７／１７５７５１ ＷＯ２０１８／１８２０１６
　本発明は、体性幹細胞や前駆細胞等の接着性細胞の大量生産につながる技術を提供することを課題とする。また、本発明は、より品質の良い接着性細胞を効率よく生産する技術を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意工夫を重ねた結果、キチンナノファイバーを主要な成分とする基材を特定の濃度で含む培地を用いて接着性細胞を浮遊培養することにより、接着性細胞のスフェアのサイズや個数を制御することができることを見出した。また、本発明者らは、本方法で得られた接着性細胞が、未分化性や遊走性の点において、好ましい品質を有していることも見出した。さらに、本発明者らは、キチンナノファイバーを主要な成分とする基材を低濃度で用いることで、培養後の細胞の回収効率が良くなることをも見出した。本発明者らは、これらの知見に基づきさらに検討を進め、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーを含む培地において、接着性細胞を浮遊培養する工程を含む、接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法。
［２］培地中の非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、［１］記載の方法。
［３］非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーが細胞外マトリクスを担持する、［１］又は［２］記載の方法。
［４］細胞外マトリクスが、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＲＧＤ配列、およびカドヘリンからなる群から選択される少なくとも１つである、［３］記載の方法。
［５］接着性細胞が、幹細胞、前駆細胞、体性非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、および癌細胞からなる群から選択される、［１］～［４］のいずれか記載の方法。
［６］培地が、キトサンナノファイバーをさらに含む、［１］～［５］のいずれか記載の方法。
［７］培地中の非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーとキトサンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、［６］記載の方法。
［８］非水溶性多糖類が、キチン、キトサン、セルロース、およびヘミセルロースからなる群から選択される少なくとも１つである、［１］～［７］のいずれか記載の方法。
［９］［１］～［８］のいずれか記載の方法により製造したスフェアの懸濁液をセルストレーナーに供する工程を含む、スフェアの単離方法。
　本発明によれば、接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数を制御することができる。
　また、本発明によれば、未分化性や遊走性の観点において品質の良い接着性細胞を調製することができるほか、これらの細胞を効率よく回収することができる。
図１は、試験例１の各条件において、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞をビトロネクチン担持キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーとを含む培地で浮遊培養したときのスフェアを観察した写真である。 図２は、試験例１の各条件において浮遊培養され、その後ウェルプレートに播種された細胞を、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス社製）を用いて撮影した写真である。 図３は、試験例１において、画像解析の結果取得されたスフェア抽出像を示す図である。 図４は、試験例１の各条件における、スフェアの個数およびスフェアの平均直径を示す図である。 図５は、試験例２の各条件において培養して得られたスフェアの状態を示す顕微鏡写真である。 図６は、試験例５の各条件における、スフェアの状態を示す写真である。 図７は、試験例５における、ろ液中の基材および細胞を示す図である。
　以下、本発明について詳述する。
１．接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法
　本発明は、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーを含む培地において、接着性細胞を浮遊培養する工程を含む、接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法（以下、「本発明の方法」等と称することがある）を提供する。
　本発明の方法において接着性細胞とは、生存や増殖に容器壁等の足場を必要とする細胞である。
　本発明の方法において、接着性細胞としては、特に限定されるものではないが、例えば、幹細胞、前駆細胞、体性非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、癌細胞等を挙げることができる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。接着性の幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。間葉系幹細胞とは、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の全て又はいくつかへの分化能を有する幹細胞である。間葉系幹細胞は骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織等の組織中に低頻度で存在し、これらの組織から公知の方法で単離することが出来る。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。接着性の前駆細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、前駆脂肪細胞、前駆心筋細胞、前駆内皮細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞、膵臓前駆細胞、腎臓前駆細胞等を挙げることができる。接着性の体性非幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、線維芽細胞、骨細胞、骨周皮細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞等が含まれる。初代培養細胞とは、生体から分離した細胞や組織を播種し、第１回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいう。初代培養細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取された細胞であり得る。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞をいう。本発明の方法における接着性細胞は、好ましくは幹細胞又は前駆細胞であり、より好ましくは、間葉系幹細胞である。
　本発明の方法における接着性細胞の由来は特に限定されず、動物および植物のいずれに由来する細胞であってよい。動物としては、限定されるものではないが、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられ、好適には哺乳類である。哺乳類の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等が挙げられる。植物としては、採取した細胞が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。
　本明細書において、ナノファイバーとは、平均繊維径（Ｄ）が、０．００１乃至１．００μｍの繊維をいう。本発明において使用するナノファイバーの平均繊維径は、好ましくは、０．００５乃至０．５０μｍ、より好ましくは０．０１乃至０．０５μｍ、更に好ましくは０．０１乃至０．０２μｍである。
　本発明の方法において、使用するナノファイバーのアスペクト比（Ｌ／Ｄ）は、平均繊維長／平均繊維径より得られ、特に限定されないが、通常２～５００であり、好ましくは５～３００であり、より好ましくは１０～２５０である。
　本明細書において、ナノファイバーの平均繊維径（Ｄ）は以下のようにして求める。まず応研商事（株）製コロジオン支持膜を日本電子（株）製イオンクリーナ（ＪＩＣ－４１０）で３分間親水化処理を施し、評価対象のナノファイバー分散液（超純水にて希釈）を数滴滴下し、室温乾燥する。これを（株）日立製作所製透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ－８０００）（１０，０００倍）にて加速電圧２００ｋＶで観察し、得られた画像を用いて、標本数：２００～２５０本のナノファイバーについて一本一本の繊維径を計測し、その数平均値を平均繊維径（Ｄ）とする。
　また、平均繊維長（Ｌ）は、以下のようにして求める。評価対象ナノファイバー分散液を純水により１００ｐｐｍとなるように希釈し、超音波洗浄機を用いてナノファイバーを均一に分散させる。このナノファイバー分散液を予め濃硫酸を用いて表面を親水化処理したシリコンウェハー上へキャストし、１１０℃にて１時間乾燥させて試料とする。得られた試料の日本電子（株）製走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＳＭ－７４００Ｆ）（２，０００倍）で観察した画像を用いて、標本数：１５０～２５０本のナノファイバーについて一本一本の繊維長を計測し、その数平均値を平均繊維長（Ｌ）とする。
　好ましい態様において、ナノファイバーは、液体培地と混合した際、一次繊維径を保ちながら当該ナノファイバーが当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く、ナノファイバーに付着した細胞を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有する。
　本発明の方法において用いられるナノファイバーは、非水溶性多糖類から構成されるものである。多糖類とは、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した糖重合体を意味する。
　非水溶性多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース等のセルロース類；キチン、キトサン等のキチン質等が挙げられるが、これらに限定されない。非水溶性多糖類は、好ましくは、キチン又はキトサンであり、より好ましくはキチンである。尚、本明細書において、「キチンから構成されるナノファイバー」を「キチンナノファイバー」と称することがある。また、その他の非水溶性多糖類の場合も同様である。
　キチン質とは、キチンおよびキトサンからなる群より選ばれる１以上の糖質をいう。キチン及びキトサンを構成する主要な糖単位は、それぞれ、Ｎ－アセチルグルコサミン及びグルコサミンであり、一般的に、Ｎ－アセチルグルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し難溶性であるものがキチン、グルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し可溶性であるものがキトサンとされる。本明細書においては、便宜上、構成糖に占めるＮ－アセチルグルコサミンの割合が５０％以上のものをキチン、５０％未満のものをキトサンと呼ぶ。
　キチンの原料としては、例えば、エビ、カニ、昆虫、貝、キノコなど、多くの生物資源を用いることができる。本発明に用いるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。カニやエビの外殻は産業廃棄物として扱われることが多く、入手容易でしかも有効利用の観点から原料として好ましいが、不純物として含まれるタンパク質や灰分等の除去のために脱タンパク工程および脱灰工程が必要となる。そこで、本発明においては、既に脱マトリクス処理が施された精製キチンを用いることが好ましい。精製キチンは、市販されている。本発明に用いられるキチンナノファイバーの原料としては、α型およびβ型のいずれの結晶構造を有するキチンであってもよいが、α型キチンが好ましい。
　上述の多糖類を粉砕することにより、多糖類ナノファイバーを得ることができる。粉砕方法は限定されないが、本発明の目的に合う繊維径・繊維長にまで微細化するには、高圧ホモジナイザー、グラインダー（石臼）、あるいはビーズミルなどの媒体撹拌ミルといった、強いせん断力が得られる方法が好ましい。
　これらの中でも高圧ホモジナイザーを用いて微細化することが好ましく、例えば特開２００５－２７０８９１号公報や特許第５２３２９７６号に開示されるような湿式粉砕法を用いて微細化（粉砕化）することが望ましい。具体的には、原料を分散させた分散液を、一対のノズルから高圧でそれぞれ噴射して衝突させることにより、原料を粉砕するものであって、例えばスターバーストシステム（（株）スギノマシン製の高圧粉砕装置）やナノヴェイタ（吉田機械興業（株）製の高圧粉砕装置）を用いることにより実施できる。
　前述の高圧ホモジナイザーを用いて原料を微細化（粉砕化）する際、微細化や均質化の程度は、高圧ホモジナイザーの超高圧チャンバーへ圧送する圧力と、超高圧チャンバーに通過させる回数（処理回数）、及び水分散液中の原料の濃度に依存することとなる。圧送圧力（処理圧力）は、特に限定されないが、通常５０～２５０ＭＰａであり、好ましくは１００～２００ＭＰａである。
　また、微細化処理時の水分散液中の原料の濃度は、特に限定されないが、通常０．１質量％～３０質量％、好ましくは１質量％～１０質量％である。微細化（粉砕化）の処理回数は、特に限定されず、前記水分散液中の原料の濃度にもよるが、原料の濃度が０．１～１質量％の場合には処理回数は１０～１００回程度で充分に微細化されるが、１～１０質量％では１０～１０００回程度必要となる場合がある。
　前記微細化処理時の水分散液の粘度は特に制限されないが、例えば、αキチンの場合、該水分散液の粘度の範囲は、１～１００ｍＰａ・Ｓ、好ましくは１～８５ｍＰａ・Ｓ（２５℃条件下での音叉振動式粘度測定（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ．）による）である。また、キトサンの場合、該水分散液の粘度の範囲は、０．７～３０ｍＰａ・Ｓ、好ましくは０．７～１０ｍＰａ・Ｓ（２５℃条件下での音叉振動式粘度測定（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ．）による）である。
　ナノファイバーの調製方法については、ＷＯ２０１５／１１１６８６Ａ１等に記載されている。
　一態様において、本発明の方法では、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーに細胞外マトリクスを担持させることができる。本明細書において、ナノファイバーが細胞外マトリクスを「担持する」とは、ナノファイバーと細胞外マトリクスが、化学的な共有結合を介さずに付着または吸着している状態を意味する。ナノファイバーによる細胞外マトリクスの担持は、分子間力や静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用等により達成され得るが、これらに限定されるものではない。また、ナノファイバーが細胞外マトリクスを担持している状態とは、ナノファイバーと細胞外マトリクスが、化学的な共有結合を介さずに、接した状態で留まっている状態、或いは、ナノファイバーと細胞外マトリクスが、化学的な共有結合を介さずに、複合体を形成している状態と言い換えることができる。
　本発明の方法において、ナノファイバーに担持させる細胞外マトリクスは、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、コラーゲン（コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン（ラミニン－１乃至１２）、ＲＧＤ配列、カドヘリン等が挙げられる。細胞外マトリクスの選択は、増殖させる細胞の種類によって異なるが、当業者であれば適宜選択可能である。例えば間葉系幹細胞の場合、細胞外マトリクスとしてはビトロネクチンが好ましい。また、ビトロネクチンは、ヒト由来のビトロネクチンの場合、アミノ酸配列が２０－３９８（配列番号２）または６２－４７８（配列番号１）のものが好ましい。非ヒト由来のビトロネクチンを使用する場合、ヒト由来のビトロネクチンの断片に対応する領域を使用することができる。
　本発明の方法において、ナノファイバーが担持する細胞外マトリクスの量は、ナノファイバー１ｇ当たり、細胞外マトリクスが、通常０．００１～５０ｍｇ、好ましくは０．０１～１０ｍｇ、より好ましくは０．１～１０ｍｇ、さらに好ましくは０．３～１０ｍｇ、よりさらに好ましくは、１～１０ｍｇ、特に好ましくは２～１０ｍｇであるが、これらに限定されない。
　本発明の方法において、細胞外マトリクスを担持するナノファイバーの調製は、ナノファイバーを水性溶媒に分散させた分散液と細胞外マトリクスの水溶液を混合し、必要に応じて一定時間静置することで調製することができる。ナノファイバーを分散させる水性溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、これらに限定されない。水性溶媒としては、水が好ましい。水性溶媒中には、適切な緩衝剤や塩が含まれていてもよい。細胞外マトリクスを均一にナノファイバーと接触させるために、ピペッティング操作等により十分に混合することが好ましい。また、静置する時間としては、ナノファイバーの分散液と細胞外マトリクスの水溶液の混合液を、通常３０分以上、好ましくは１時間以上、より好ましくは３時間以上、さらに好ましくは６時間以上、よりさらに好ましくは９時間以上、特に好ましくは１２時間以上、静置することができる。静置時間に特に上限は無いが、例えば、上限として４８時間以下（例、３６時間以下、２４時間以下、または１６時間以下等）を設定し得る。静置時の温度としては、特に限定されないが、通常１～３０℃、好ましくは１～１５℃、より好ましくは２～１０℃、特に好ましくは２～５℃（例、４℃）とすることができる。
　非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーと細胞外マトリクスの混合比は、使用するこれらの物質の種類に応じて異なるが、固形分重量換算で例えば、１００：０．１～１、好ましくは、１００：０．４～０．６とすることができるが、これらに限定されない。
　非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーに担持された細胞外マトリクスの量については、例えば、Ｍｉｃｒｏ　ＢＣＡ法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等によって測定することができるが、これらに限定されない。
　好ましい態様において、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーは液体培地中で均一に分散し、該ナノファイバーに付着した接着性細胞を該液体培地中に浮遊させる。
　本発明の方法において、ナノファイバーを含む培地は、使用する接着性細胞の種類等により適宜選択することが可能であり、例えば、哺乳類の接着性細胞の培養を目的とする場合、哺乳類細胞の培養に一般的に使用される培地を使用することができる。哺乳類細胞用の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ或いはＢａｓｉｃ０２或いはＡＫ０３Ｎ或いはＢａｓｉｃ０３或いはＢａｓｉｃ０４培地（味の素ヘルシーサプライ株式会社製）、ＳＴＥＭＵＰ培地（日産化学株式会社製）などが挙げられる。
　上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。哺乳類細胞の培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。哺乳類細胞用の培地に添加され得る成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリクスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加され得るサイトカインとしては、例えばインターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　培地に添加され得るホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　培地に添加され得る増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、マクロファージ炎症蛋白質－１α（ＭＩＰ－１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ－１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　また、遺伝子組替え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものを添加させることもできる。その例としては、ＩＬ－６／可溶性ＩＬ－６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ　ＩＬ－６（ＩＬ－６と可溶性ＩＬ－６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。
　培地に添加され得る抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β－ブロモペニシラン酸、β－クロロペニシラン酸、６－アセチルメチレン－ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノカルディシン、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
　一態様において、サプリメントや血清代替物を培地に添加してもよい。これらの例としては、例えばＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャー社製）、Ｂ－２７（登録商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャー社製）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャー社製）、ＣＴＳ（登録商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）ＳＲ　ＸｅｎｏＦｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャー社製）、ＥＬＡＲＥＭ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ　Ｉ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｒａｄｅ（ＰＬ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＥＬＡＲＥＭ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍ　Ｉ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｒａｄｅ或いはＧＭＰ　Ｇｒａｄｅ（ＰＬ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＥＬＡＲＥＭ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍ－ＦＤ　Ｉ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｒａｄｅ或いはＧＭＰ　Ｇｒａｄｅ（ＰＬ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＥＬＡＲＥＭ（登録商標）Ｕｌｔｉｍａｔｅ－ＦＤｉ　Ｉ　ＧＭＰ　Ｇｒａｄｅ（ＰＬ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｌｙｓａｔｅ　Ｓｔｅｍｕｌａｔｅ（登録商標）（Ｓｅｘｔｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｐａｔｈｏｇｅｎ－Ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｌｙｓａｔｅ　ｎＬｉｖｅｎ　ＰＲ（登録商標）或いはＴ－Ｌｉｖｅｎ　ＰＲ（登録商標）（Ｓｅｘｔｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＵｌｔｒａＧＲＯ（登録商標）或いは－ＰＵＲＥ　ＧＩ或いは－Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＧＩ或いは－ＰＵＲＥ或いは－Ａｄｖａｎｃｅｄ（ＡｖｅｎｔａＣｅｌｌ　ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ社製）、Ｂｉｏ－Ｐｕｒｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ　（ＨＳＡ）　１０％　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＰＬＴＭａｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｌｙｓａｔｅ（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＰＬＴＧｏｌｄ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｌｙｓａｔｅ（バイオロジカルインダストリーズ社製）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　培地に添加され得る細胞接着分子としては、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　（ＶＴＮ－Ｎ）　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，　Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（サーモフィッシャー社製）、ＣＴＳ（登録商標）Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　（ＶＴＮ－Ｎ）　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ，　Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ（サーモフィッシャー社製）、ｒｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１（サーモフィッシャー社製）、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ＭＧ（マトリクソーム社製）、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ或いは－４１１或いは－２２１（マトリクソーム社製）、ＮｕｔｒｉＣｏａｔ（登録商標）Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（バイオロジカルインダストリーズ社製）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　混合比率は、特に限定されることはないが、ナノファイバーの分散液：液体培地（培地の水溶液）（体積比）が、通常１：９９～９９：１、好ましくは１０：９０～９０：１０、より好ましくは、２０：８０～８０：２０である。
　本明細書において、細胞の浮遊とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態（非接着）であることをいい、細胞が沈降しているか否かは問わない。さらに、本明細書において、細胞を培養する際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞が当該液体培地組成物中で分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、少なくとも５分以上、好ましくは、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、６日以上、２１日以上であるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
　好ましい態様において、本発明の方法において用いられる培地組成物は、細胞の培養が可能な温度範囲（例えば、０～４０℃）の少なくとも１点において、細胞の浮遊静置が可能である。該培地組成物は、好ましくは２５～３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞の浮遊静置が可能である。
　接着性細胞を、細胞外マトリクスを担持していてもよいナノファイバーに付着させた状態で培養することにより、接着性細胞を浮遊培養することができる。細胞外マトリクスを担持していてもよいナノファイバーからなる基材は、液体培地中で溶解することも、培養容器に付着することもなく分散するので、該液体培地中で接着性細胞を培養すると、接着性細胞は該基材に付着し、該培地中に浮遊する。
　細胞外マトリクスを担持していてもよいナノファイバーを用いて接着性細胞を浮遊培養する場合、該ナノファイバーを含有する培地組成物に対して別途調製した接着性細胞を添加し、均一に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ボルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は、得られた細胞懸濁液を静置状態にて培養してもよいし、必要に応じて回転、振とう或いは撹拌しながら培養してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。例えば、接着性細胞を継代培養から回収し、適切な細胞解離液を用いて単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、分散された接着性細胞を、培地組成物中に懸濁し、これを浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）に付す。
　培地と接着性細胞を混合後、得られた細胞懸濁液を撹拌しながら培養してもよい。液体培地の撹拌は自体公知の方法を用いればよい。
　本発明において「撹拌」とは、ファイバー等の基材と細胞とが培地中に懸濁した状態であって、かつ、当該基材と細胞とが、系中において外力によって動かされ続ける状態をとることを意味する。基材と細胞が培地中で外力により適度に接触し合うことで、当該基材を抱き込んだ細胞塊の形成が促進され、効率よく細胞を増殖させることができる。系中に印加させる外力は、基材濃度や培養スケール等により適宜調整すればよいが、細胞が傷害を受けない程度の穏やかな混合が好ましい。外力を加える方法としては、
（１）撹拌翼の回転による混合、
（２）往復型、旋回型（例、培養容器が水平方向に回転する態様）、シーソー型、波動形揺動型等の振とう混合、
（３）還流または気体通気による混合、
（４）ローラーボトルでの回転混合、あるいは
（５）ボルテックスミキサーによる振動での混合
などが挙げられるが、適度な外力の印加によって基材と細胞との均一な接触が促進され、その結果、当該基材を抱き込んだ細胞塊の形成が促進される混合状態であれば、外力の印加の態様については特に限定されない。
　なお、ここでいう「均一」とは、基材と細胞が容器底面に偏在し、静止してその場にとどまり続けることのないマクロな視点からの懸濁状態を意味し、培養液全体にミクロな視点で基材や細胞が均等分布することを意味するものではない。
　液体培地の撹拌は自体公知の方法を用いればよい。例えば、マグネチックスターラーや撹拌翼等が例示されるがこれらに限定されない。また、撹拌のための回転数や頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。本発明において用いられる撹拌速度（即ち、翼端速度）の下限は、細胞や基材が静止していない状態であれば、特に限定されないが、例えば、通常０．０１ｍ／分以上、好ましくは０．１０ｍ／分以上（例、０．１５ｍ／分以上）、より好ましくは０．９０ｍ／分以上（例、０．９７ｍ／分以上）である。また、その上限は、例えば、通常５０．０ｍ／分以下、好ましくは３０．０ｍ／分以下（例、２２．６ｍ／分以下）、より好ましくは２０．００ｍ／分以下（例、１５．０８ｍ／分以下）であり得る。本発明の一態様において、翼端速度は、通常０．０１～５０．０ｍ／分、好ましくは０．１０～３０．０ｍ／分（例、０．１５～２２．６ｍ／分）、より好ましくは０．９０～２０．００ｍ／分であり得る。
　一態様において、本発明において用いられる撹拌速度（即ち、回転数）の下限は、例えば、通常１ｒｐｍ以上、好ましくは５ｒｐｍ以上、より好ましくは１０ｒｐｍ以上である。また、その上限は、細胞や基材が静止していない状態であれば、特に限定されないが、例えば、通常１５０ｒｐｍ以下、好ましくは１４０ｒｐｍ以下、より好ましくは１２０ｒｐｍ以下であり得る。本発明の一態様において、撹拌の回転数は、通常１～１５０ｒｐｍ、好ましくは５～１４０ｒｐｍ、より好ましくは１０～１２０ｒｐｍであり得る。
　また、撹拌の頻度は、本発明の所望の効果が得られる限りどのような撹拌の頻度であってもよい。例えば、上述した回転数から選択される特定の回転数で１分間撹拌し、５９分間は無撹拌とすることを１サイクルとし、細胞培養中、このサイクルを繰り返してもよい。或いは、上述した回転数から選択される特定の回転数で１分間撹拌し、１１９分間は無撹拌とすることを１サイクルとし、細胞培養中、このサイクルを繰り返してもよい。或いは、細胞培養中、常時、撹拌してもよい。
　細胞を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５乃至３９℃、好ましくは３３乃至３９℃（例、３７℃）である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、４乃至６体積％が好ましい。培養期間は、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
　本発明の方法における接着性細胞の培養は、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。本発明において用いられる基材に付着した接着性細胞が、培養容器へ接着しないよう、これらの培養容器は細胞低接着性であることが望ましい。細胞低接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、あるいは培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。
　培地交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより細胞を分離した後、新鮮な培地を該細胞に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞を適宜濃縮した後、新鮮な培地をこの濃縮液に添加すればよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。
　接着性細胞の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
　接着性細胞を、細胞外マトリクスを担持していてもよいナノファイバーからなる基材に付着させた状態において浮遊培養すると、接着性細胞はスフェアの形態で増殖するが、該細胞は、未分化性マーカー（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ等）や遊走性マーカー（ＣＸＣＲ４等）の遺伝子発現が亢進している。即ち、本発明で得られる接着性細胞は、例えば、生体移植用の細胞として好適であり得る。
　接着性細胞を、細胞外マトリクスを担持していてもよいナノファイバーからなる基材に付着した状態で浮遊培養し増殖させる場合、該浮遊培養に用いる培地として、該接着性細胞の形質を維持しながら、該細胞を増殖することができる培地が用いられる。該培地は、接着性細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。
　一態様において、本発明の方法において用いられる培地は、細胞外マトリクスを担持していてもよいナノファイバーのほか、キトサンナノファイバーを含んでいてもよい。
　本発明の方法に用いられるキトサンナノファイバーは、上述したナノファイバーの調製方法に従って調製したものを用いることができる。或いは、市販のキトサンナノファイバーを用いてもよい。
　本発明の一態様において、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーのみが液体培地に添加される場合、培地に添加される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー（例、キチンナノファイバー）の量は、本所望の効果を得られる限り特に限定されないが、通常０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００１～０．０７％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００３～０．０５％（ｗ／ｖ）となるように液体培地に配合することができる。
　本発明の方法の一態様において、細胞外マトリクスを担持しない非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーとキトサンナノファイバーが液体培地に添加される場合、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー（例、キチンナノファイバー）およびキトサンナノファイバーを所望の比率（重量）で含有する培地を調製するために、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．０１～１０（好ましくは非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．０２～９、より好ましくは非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．０５～８、さらに好ましくは非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．１～７、よりさらに好ましくは非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～６、特に好ましくは非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：１～５）でブレンドする。得られた非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー／キトサンナノファイバーの混合物を、培地に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、通常０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００１～０．０７％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００３～０．０５％（ｗ／ｖ）となるように液体培地に配合することができる。或いは、液体培地に、必要量の非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー（例、キチンナノファイバー）およびキトサンナノファイバーを別々に添加し、良く撹拌することによって所望の培地を調製してもよい。
　一態様において、本発明の方法における非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー（例、キチンナノファイバー）とキトサンナノファイバーの濃度は、次の条件を満たす：
（１）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（２）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（３）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
または、
（４）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００３～０．０５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）。
　別の実施形態において、得られた非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー／キトサンナノファイバーの混合物を、培地に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、通常０．０００１～１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１～０．５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００２～０．３％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００３～０．１％（ｗ／ｖ）となるように液体培地に配合することができる。
　別の一態様において、本発明の方法における非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー（例、キチンナノファイバー）とキトサンナノファイバーの濃度は、次の条件を満たす：
（５）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００１～１．０％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（６）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００１～０．５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（７）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００５～０．３％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
または、
（８）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）。
　本発明の方法において、細胞外マトリクス（例、ビトロネクチン）を担持したナノファイバー（例、キチンナノファイバー）およびキトサンナノファイバーを所望の比率（重量）で含有する培地を調製するために、細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．０１～１０（好ましくは細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．０２～９、より好ましくは細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．０５～８、さらに好ましくは細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．１～７、よりさらに好ましくは細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～６、特に好ましくは細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：１～５）でブレンドする。得られた細胞外マトリクスを担持したナノファイバー／キトサンナノファイバーの混合物を、培地に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、通常０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００１～０．０７％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００３～０．０５％（ｗ／ｖ）となるように液体培地に配合することができる。或いは、液体培地に、必要量の細胞外マトリクス（例、ビトロネクチン）を担持したナノファイバー（例、キチンナノファイバー）およびキトサンナノファイバーを別々に添加し、良く撹拌することによって所望の培地を調製してもよい。
　一態様において、本発明の方法における細胞外マトリクス（例、ビトロネクチン）を担持したナノファイバー（例、キチンナノファイバー）とキトサンナノファイバーの濃度は、次の条件を満たす：
（１）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（２）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（３）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
または、
（４）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００３～０．０５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）。
　別の実施形態において、得られた細胞外マトリクスを担持したナノファイバー／キトサンナノファイバーの混合物を、培地に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、通常０．０００１～１．０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１～０．５％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００２～０．３％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００３～０．１％（ｗ／ｖ）となるように液体培地に配合することができる。
　別の一態様において、本発明の方法における細胞外マトリクス（例、ビトロネクチン）を担持したナノファイバー（例、キチンナノファイバー）とキトサンナノファイバーの濃度は、次の条件を満たす：
（５）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００１～１．０％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（６）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００１～０．５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
（７）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００５～０．３％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）；
または、
（８）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（細胞外マトリクスを担持したナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有される細胞外マトリクスを担持したナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．０１～１０（好ましくは、１：０．０２～９、１：０．０５～８、１：０．１～７、１：０．５～７、または１：１～６）。
２．スフェアの単離方法
　本発明はまた、本発明の方法により調製したスフェアの懸濁液をセルストレーナーに供する工程を含む、スフェアの単離方法（以下、「本発明の単離方法」と称することがある）を提供する。
　本発明の単離方法において用いられるセルストレーナーが有するメッシュの孔径は、回収するスフェアのサイズよりも小さいものであれば特に限定されないが、通常、２０～２００μｍ、好ましくは、２０～１９０μｍ、２０～１８０μｍ、２０～１７０μｍ、２０～１６０μｍ、２０～１５０μｍ、より好ましくは、３０～１５０μｍ、３０～１４０μｍ、３０～１３０μｍ、３０～１２０μｍ、３０～１２０μｍ、特に好ましくは、４０～１１０μｍ、４０～１００μｍ、４０～９０μｍ、４０～８０μｍであり得る。
　本発明の単離方法において用いられるセルストレーナーは市販品であってもよい。一例としては、以下の実施例において用いられているｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製のセルストレーナーが好適に用いられ得る。
　セルストレーナーへスフェアの懸濁液を通す際の条件は特に限定されず、自体公知の方法や、セルストレーナーの製造会社が提供する指示に従えばよい。
　本発明の方法で調製されるスフェアは、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバー等との混合物である。本発明の単離方法を用いることにより、当該混合物からスフェアを効率よく単離することができる。
　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
［調製例１］基材の調製
　ビトロネクチンを担持したキチンナノファイバーと、キトサンナノファイバーとを含んだ水分散液を、ＷＯ２０１５／１１１６８６号及びＷＯ２０２１／００２４４８号の記載に準じて調製した。具体的には、次の通りに調製した。ＷＯ２０１５／１１１６８６号の記載に準じて調製した２質量％キチンナノファイバー水分散液を、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌処理を行った。その後、この水分散液を１％（ｗ／ｖ）となるように無菌蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）に混合し懸濁させることで、無菌のキチンナノファイバーを含んだ水分散液を作製した。１％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバー水分散液（５ｍＬ）に、５００μｇ／ｍＬ含有のビトロネクチン水溶液（Ｇｉｂｃｏ　Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（０．５ｍＬ）を加え、ピペッティングにより混合後、４℃で一晩静置保管することで、ビトロネクチン担持キチンナノファイバーを含んだ水分散液を作製した。ＷＯ２０２１／００２４４８号の記載に準じて分析したところ、担持されたビトロネクチン量は２０μｇ／ｍＬ（キチンナノファイバー１ｇあたりビトロネクチン２．２ｍｇ）であった。つぎに、ＷＯ２０１５／１１１６８６号の記載に準じて調製した２質量％キトサンナノファイバー水分散液を、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌処理を行った。その後、この水分散液を１％（ｗ／ｖ）となるように無菌蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）に混合し懸濁させることで、無菌のキトサンナノファイバーを含んだ水分散液を作製した。作製したキトサンナノファイバー水分散液（８ｍＬ）を、上記のビトロネクチン担持キチンナノファイバーを含んだ水分散液（２ｍＬ）に加え、ピペッティングにより混合することで、０．２％（ｗ／ｖ）のビトロネクチン担持キチンナノファイバーと０．８％（ｗ／ｖ）のキトサンナノファイバーとを含んだ水分散液（１０ｍＬ）を作製した。（以下、本実施例において、ここで調製されたビトロネクチン担持キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーとの混合物を単に「基材」と称することがある。）
〔試験例１〕基材によるスフェアの制御１（撹拌条件下）
　ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－１２９７１）は間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－２８００９）を用いて１０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４３０１６７）上で３日間接着培養を行った。その後、ＤｅｔａｃｈＫｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－４１２１０）を用いて細胞を剥離し、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの播種濃度となるように、調製例１の基材を終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）又は０．０１％（ｗ／ｖ）となるように間葉系幹細胞増殖培地２に添加した培地組成物３０ｍＬに細胞を添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間撹拌培養を行った。培養容器として３０ｍＬシングルユースリアクター（エイブル社製、＃ＢＷＶ－Ｓ０３Ａ）を使用し、撹拌は専用マグネチックスターラー（エイブル社製、＃ＢＷＳ－Ｓ０３Ｎ０Ｓ－６）を用いて、２５ｒｐｍで常時撹拌を行った。培養４日目に培養容器を１０分間静置し、培養上清の半量を培地交換した。
（増殖率の算出）
　培養０、１、２、４、７日目に均一に懸濁した培養液を０．５ｍＬ採取し、各々にＡＴＰ試薬０．５ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ボルテックスで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１５０μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞数を測定した。培養０日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１としたときの相対値を細胞増殖率とした。結果を表１に示す。
（細胞染色）
　培養７日目に均一に懸濁した培養液０．５ｍＬを１．５ｍＬチューブに採取し、遠心分離（６００×ｇ、３分間）後、培養上清を除去した。細胞を１ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬社製、＃０４５－２９７９５）で懸濁し、遠心分離（６００×ｇ、３分間）後、培養上清を除去した。終濃度０．５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解したＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（同仁化学社製、＃Ｃ３２６）溶液１０μＬを５ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬社製、＃０４５－２９７９５）に溶解し、染色溶液とした。細胞を１ｍＬの染色溶液で懸濁し、１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５１１４３）に移し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３０分間インキュベートした。その後、ＥＶＯＳ（登録商標）　ＦＬ　Ａｕｔｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて明視野像及び細胞特異的な蛍光染色像を取得した。結果を図１に示す。スケールバーは１０００μｍを示す。
（画像取得）
　培養７日目に均一に懸濁した培養液０．５ｍＬを１２ウェルプレートに採取し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス社製）を用いてウェル全体を撮影した。取得した画像を図２に示す。
（画像解析）
　取得したウェル全体の画像を用いて、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、６４－ｂｉｔ　Ｊａｖａ　１．８．０＿１７２）を用いた画像解析を実施した。画像中のスケールバーを用いてスケールの標準化を実施した後、Ｐｏｌｙｇｏｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓツールを用いてスフェアの輪郭を抽出し、スフェア個数、面積値（μｍ２）を取得した。取得した面積値を用いて、スフェアが真円であると仮定した際のスフェア平均直径を算出し、スフェア平均直径を取得した。スフェア平均直径の算出には下記数式を用いた。最終的にデータを取得したスフェア抽出像を図３に、スフェア個数、スフェア平均直径を図４に示す。輪郭抽出の際、気泡は対象外とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１のとおり、増殖率の最大値は基材濃度に依存することが明らかとなった。また、図１のとおり、得られるスフェアの大きさ及び個数は基材濃度に依存する傾向が見られた。換言すれば、調製例１で調製された基材を適切な濃度で用いれば、スフェアのサイズや個数を制御することができることが示された。既存のマイクロキャリア等を用いた場合、スフェアのサイズや個数を制御することはできないことが知られている。従って、調製例１で調製された基材の適切な濃度での使用は、投与部位や疾患ごとの目的に適したサイズのスフェア組成物を調製することができる。従って、本発明の方法は、再生医療に用いられる接着性細胞の調製に対しての新たな可能性を提供するものである。
〔試験例２〕基材によるスフェアの制御２（静置条件）
　ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（セルソース社製）は間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－２８００９）を用いて１０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４３０１６７）上で３日間接着培養を行った。その後、ＤｅｔａｃｈＫｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－４１２１０）を用いて細胞を剥離し、上記培地で希釈して２．５×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を得た。９６ｗｅｌｌ　Ｕ底低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４）に調製例１の基材を終濃度が０．１０％（ｗ／ｖ）、０．０８％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）または０．００６％（ｗ／ｖ）となるように間葉系幹細胞増殖培地２に添加した培地組成物（１００μＬ／ｗｅｌｌ）をそれぞれ分注し、さらに上記細胞懸濁液（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加えることで、基材の終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０３％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．００５％（ｗ／ｖ）または０．００３％（ｗ／ｖ）すなわち１００μｇ、８０μｇ、６０μｇ、４０μｇ、２０μｇ、１０μｇまたは６μｇ／０．２ｍＬ／ｗｅｌｌの培地組成物に２．５×１０＾３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種した。また、対照群として、９６ｗｅｌｌ　Ｕ底低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７４）に間葉系幹細胞増殖培地２（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を分注し、さらに上記細胞懸濁液（１００μＬ／ｗｅｌｌ）を加えることで、基材不含の培地に２．５×１０＾３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種した。播種したプレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７日間培養を行い、０、３、７日目に顕微鏡観察及び０、２、３、７日目にＡＴＰアッセイでの増殖性評価を実施した。ＡＴＰアッセイは、各培養日の細胞培養液（５００μＬ）に対してＡＴＰ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ）（５００μＬ）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、白色９６ウェルプレートに３００μＬ／ｗｅｌｌずつ３ｗｅｌｌに分注し、プレートリーダー（テカン社製、ｉｎｆｉｎｉｔｅＭ２００ＰＲＯ）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞量（３点の平均値）を算出した。
　結果を図５および表２に示す。図５に示される通り、基材を用いなかった対照群においてのみ、単一のスフェロイドが形成された。一方で、基材を用いた群は、いずれの群においても、細胞が自己集合し、複数のスフェロイドを形成した。加えて、基材の濃度の低減に伴って、小さなスフェロイドが複数形成されることが確認された。また、増殖性評価においては、基材を用いなかった対照群では、細胞は増殖しなかったが、基材を用いた群では、最も低濃度の０．００３％（ｗ／ｖ）でも細胞の増殖が認められた。この結果から、基材を添加することにより、細胞は増殖しながら複数のスフェロイドを形成することが示された。さらに、表３において示されるスフェロイドの平均直径の計測結果から、基材の濃度を変えることで、形成されるスフェロイドの数およびサイズをある程度制御することも可能であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔試験例３〕基材を用いたスフェアの制御３（静置条件下での幹細胞マーカー及び遊走性（ホーミング）マーカーの発現量評価）
　調製例１の基材を終濃度が０．０５、０．０１または０．００５％（ｗ／ｖ）となるように添加した培地組成物あるいは対照群として基材未添加培地に、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－１２９７１）を、３×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種した後、２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７３）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。また、比較対照群として３×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｍＬを基材未添加培地に播種した後、２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３５１６）（接着培養群）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。つぎに、各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、４日目に半量培地交換を行い、７日間継続した。７日目に細胞を回収し、ＲＬＴ溶液３５０μＬ（ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃７４１０６））を添加し、ＲＮＡ抽出溶液とした。ＲＮＡ抽出溶液に７０％エタノールを３５０μＬ加えた後、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。さらに５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで２分間遠心した。ＲＮｅａｓｙスピンカラム中に存在するＲＮＡにＲＮａｓｅフリー溶液を添加し、溶出させた。次に、得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３７Ａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡとＰｒｅｍｉｘ　ＥＸ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３９Ａ）、Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）としては、ＯＣＴ４はＨｓ０４２６０３６７＿ｇＨ、ＮＡＮＯＧはＨｓ０４３９９６１０＿ｇ１、ＣＸＣＲ４はＨｓ００６０７９７８　ｓ１、ＧＡＰＤＨはＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１を用いた。機器はリアルタイムＰＣＲ７５００を使用した。解析は各目的遺伝子の値をＧＡＰＤＨの値で補正した相対値を算出した。接着培養の値を１とした各遺伝子発現の相対値を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、調製例１の基材を添加した培地を用いて、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞を培養することで、未分化性を示すＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ遺伝子と、ホーミングに関わる遊走性を示すＣＸＣＲ４遺伝子の相対的な発現量の上昇が認められた。一方、接着プレートで単層培養した条件では、培養前と比較して、これら遺伝子の明確な発現量の増加は認められなかった。また、基材を含有しない培地を用いて、低接着プレートで細胞を３Ｄ培養する条件では、基材を含有する培地を用いる条件と比較して発現の変動は小さかった。
〔試験例４〕スフェアの分離
　ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－１２９７１）は間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－２８００９）を用いて１０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４３０１６７）上で３日間接着培養を行った。その後、ＤｅｔａｃｈＫｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製、＃Ｃ－４１２１０）を用いて細胞を剥離し、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの播種濃度となるように調製例１の基材を終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）となるように間葉系幹細胞増殖培地２に添加した培地組成物３０ｍＬに細胞を添加し、２５ｒｐｍの撹拌条件でＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で４日間培養を行った。培養容器として３０ｍＬシングルユースリアクター（エイブル社製、＃ＢＷＶ－Ｓ０３Ａ）及び専用マグネチックスターラー（エイブル社製、＃ＢＷＳ－Ｓ０３Ｎ０Ｓ－６）を使用した。
（スフェアの分離）
　培養３日目に全量の培養液を孔径６０μｍのセルストレーナー（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ社製、＃４３－５００６０－０３）に通液後、メッシュを上下反転させ、等量の間葉系幹細胞増殖培地２で洗浄することでメッシュ上にトラップされたスフェアを回収し、スフェア懸濁液とした。メッシュを通過した溶液はろ液とした。
（顕微鏡観察）
　均一に懸濁したセルストレーナーに通液する前の培養液、スフェア懸濁液、ろ液０．５ｍＬを１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５１１４３）に移し、倒立顕微鏡（オリンパス社製、＃ＩＸ７３）を用いて観察した。また、スフェア懸濁液をさらに１日間培養した培養液及びセルストレーナー処理を行わずに４日間培養した懸濁液を同様に観察した。取得した画像を図６に示す。スケールバーは５００μｍを示す。
（染色）
　取得したろ液１ｍＬを１．５ｍＬチューブに採取し、遠心分離（６００×ｇ、３分間）後、上清を除去した。ペレットを１ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬社製、＃０４５－２９７９５）で懸濁し、遠心分離（６００×ｇ、３分間）後、上清を除去した。終濃度０．５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解したＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（同仁化学社製、＃Ｃ３２６）溶液１０μＬを５ｍＬのＤ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬社製、＃０４５－２９７９５）に溶解し、染色溶液とした。ペレットを１ｍＬの染色溶液で懸濁し、１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５１１４３）に移し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で３０分間インキュベートした。その後、ＥＶＯＳ（登録商標）ＦＬ　Ａｕｔｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用いて明視野像及び細胞特異的な蛍光染色像を取得した。取得した画像を図７に示す。スケールバーは１０００μｍを示す。
　図６及び図７のとおり、セルストレーナーを用いることでスフェアと余分な基材を分離し、培養が継続できることが明らかとなった。以上の結果から、メッシュを用いることで、基材、シングルセル、及び死細胞からスフェアのみを分離できる可能性が示唆された。
　試験例１～３の結果をまとめると、調製例１で調製された基材を接着性細胞の培養系に添加することで、複数のスフェアが形成される。また、得られる接着性細胞は、未分化マーカーおよびホーミングマーカーの発現が基材未添加の場合よりも高くなり、即ち、良好な接着性細胞を得ることができる。従って、本発明は、例えば、生体移植用の細胞の調製に好ましく用いられる。よって、本発明は、生体移植の技術分野において極めて有用であり得る。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－１６９８６２（出願日：２０２１年１０月１５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (9)

  1. 　非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーを含む培地において、接着性細胞を浮遊培養する工程を含む、接着性細胞のスフェアのサイズ及び／又は個数の制御方法。
  2. 　培地中の非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項１記載の方法。
  3. 　非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーが細胞外マトリクスを担持する、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　細胞外マトリクスが、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ＲＧＤ配列、およびカドヘリンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項３記載の方法。
  5. 　接着性細胞が、幹細胞、前駆細胞、体性非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、および癌細胞からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　培地が、キトサンナノファイバーをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
  7. 　培地中の非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーとキトサンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項６記載の方法。
  8. 　非水溶性多糖類が、キチン、キトサン、セルロース、およびヘミセルロースからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１～７のいずれか一項記載の方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項記載の方法により製造したスフェアの懸濁液をセルストレーナーに供する工程を含む、スフェアの単離方法。
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