WO2020045620A1 - 接着性細胞の浮遊培養用培地組成物 - Google Patents

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WO2020045620A1
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nanofiber
culture
chitin
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達朗 金木
克彦 木田
昌孝 南
畑中　大輔
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日産化学株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for suspension culture of adhesive cells and a method for suspension culture of adhesive cells. More specifically, the present invention relates to a medium composition for suspension culture of adhesive cells containing chitin nanofibers and chitosan nanofibers, and a method for suspension culture of adhesive cells using the medium composition.
  • organ regeneration means using pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells is being studied intensively.
  • establishment of ES cells involves ethical problems, and iPS cells are recognized as problems of canceration risk and length of culture period. Therefore, somatic stem cells such as mesenchymal stem cells and neural stem cells with a relatively low risk of canceration, precursor cells such as preadipocytes and precursor cardiomyocytes with a relatively short differentiation induction period, or means using chondrocytes, etc. Possibilities are being explored in parallel.
  • a culture method capable of efficiently preparing high quality cells is required.
  • mesenchymal stem cells can be relatively easily proliferated in a petri dish by monolayer culture (also referred to as two-dimensional (2D) culture or the like).
  • Patent Document 1 As a method for culturing adherent cells in a large amount, an apparatus for culturing and growing cells in a state of being adhered to a microcarrier has been reported (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 currently available microcarriers sediment in a culture solution under static conditions, and thus need to be stirred during culture. It has been pointed out that cell death occurs due to collision between carriers during the stirring.
  • cells are collected from microcarriers for the purpose of medium exchange or scale-up of culture, it is necessary to separate cells from each other or cells and the carrier.
  • One of the problems is that the cells are damaged by the degrading enzyme, and as a result, the survival rate of the cells is reduced.
  • the object of the present invention is to suspend cells of adherent cells using conventional microcarriers, such as cell death due to collision of microcarriers during stirring, damage to cells due to proteolytic enzyme treatment during subculture, and the like. It is an object of the present invention to provide a new culture method which can solve a plurality of problems in the above.
  • the present inventors have made intensive efforts to solve the above problems, and as a result, by mixing chitin nanofiber and chitosan nanofiber or a specific polysaccharide in a specific ratio in a liquid medium, (1) the liquid medium Can be used for suspension culture of adherent cells and can efficiently grow adherent cells because stirring is not required. (2) The liquid medium adheres to the carrier and the carrier by gentle stirring. Adhesive cells can be easily redispersed, and if left undisturbed, suspension culture can be continuously performed again.
  • the liquid medium can be used to maintain and culture cells for a long period of time under low serum conditions, Can be efficiently produced, (5) the use of the liquid medium, found like can be maintained dispersibility of spheres long time, and have completed the present invention by further research based on this finding. That is, the present invention is as follows.
  • Medium composition for suspension culture [3] The medium composition for suspension culture according to [1], wherein the medium composition comprises chitin nanofibers and a polysaccharide, and the polysaccharide is selected from the group consisting of methylcellulose, deacylated gellan gum, and sodium alginate.
  • [4] The medium composition for suspension culture according to any one of [1] to [3], wherein the adherent cells are adhesive cells that self-aggregate in suspension culture.
  • [5] The medium composition for suspension culture according to any one of [1] to [4], wherein the adherent cells are stem cells.
  • [6] The medium composition for suspension culture according to [5], wherein the stem cells are mesenchymal stem cells.
  • [7] The medium composition for suspension culture according to [5] or [6], wherein the suspension culture is for proliferation of stem cells and maintenance of pluripotency and migration of the stem cells.
  • Adhering cells (1) chitin nanofiber; and (2) chitosan nanofiber or polysaccharide;
  • a method for culturing adherent cells comprising the step of performing suspension culture in a medium composition containing: [9]
  • the culture method according to [8].
  • the medium composition comprises chitin nanofibers and a polysaccharide, and the polysaccharide is selected from the group consisting of methylcellulose, deacylated gellan gum, and sodium alginate.
  • the adherent cells are self-aggregating adherent cells in suspension culture.
  • the adherent cells are stem cells.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells.
  • Adhering cells (1) chitin nanofiber; and (2) chitosan nanofiber or polysaccharide;
  • a method for producing a cell secretion comprising the step of performing suspension culture in a medium composition comprising: [17]
  • the medium composition comprises chitin nanofibers and a polysaccharide, and the polysaccharide is selected from the group consisting of methylcellulose, deacylated gellan gum, and sodium alginate.
  • the adherent cells are self-aggregating adherent cells in suspension culture.
  • the adherent cells are stem cells.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells.
  • the method of any one of [16] to [21], wherein the concentration of the serum in the medium composition is 2% or less.
  • the cell secretion is at least one selected from the group consisting of a low-molecular compound, a protein, a nucleic acid, and a cell secretory vesicle.
  • the concentration of the poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofiber having a specific degree of acetylation in the medium composition is 0.0001 to 0.2% (w / v).
  • the medium composition for suspension culture according to [24] which is: [26] The medium composition for suspension culture according to [24] or [25], wherein the adherent cells are adhesive cells that self-aggregate in suspension culture. [27] The medium composition for suspension culture according to any one of [24] to [26], wherein the adherent cells are stem cells. [28] The medium composition for suspension culture according to [27], wherein the stem cells are mesenchymal stem cells. [29] The medium composition for suspension culture according to [27] or [28], wherein the suspension culture is for proliferation of stem cells and maintenance of pluripotency and migration of the stem cells.
  • the adhesive cells are poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofibers having a specific acetylation degree, wherein the specific acetylation degree is 5 to 70%.
  • a method for culturing adherent cells comprising a step of performing suspension culture in a medium composition containing nanofibers.
  • the concentration of the poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofiber having a specific degree of acetylation in the medium composition is 0.0001 to 0.2% (w / v).
  • the culture method according to any one of [30] to [35], further comprising the following steps: (1) [24] to [29] without performing a treatment for detaching cells cultured in suspension from poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofiber having a specific degree of acetylation. And (2) a step of subjecting the mixture obtained in step (1) to suspension culture. [37]
  • the adherent cells are poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofibers having a specific acetylation degree, wherein the specific acetylation degree is 5 to 70%.
  • a method for producing a cell secretion comprising a step of suspension culture in a medium composition containing nanofibers.
  • the concentration of the poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofiber having a specific degree of acetylation in the medium composition is 0.0001 to 0.2% (w / v).
  • the present invention is as follows.
  • [2 ′] The culture medium composition for suspension culture according to [1 ′], wherein the ratio of chitin nanofibers and chitosan nanofibers is chitin nanofiber: chitosan nanofiber 1: 0.5 to 20.
  • [3 '] The medium composition for suspension culture according to [1'] or [2 '], wherein the adherent cells are stem cells.
  • [7 ′] The culture method according to [6 ′], wherein the ratio of chitin nanofiber and chitosan nanofiber in the medium composition is chitin nanofiber: chitosan nanofiber 1: 0.5 to 20.
  • [12 ′] A method for producing cell secretion, comprising the step of suspending and culturing adherent cells in a medium composition containing chitin nanofibers and chitosan nanofibers.
  • [13 '] The method according to [12'], wherein the ratio of chitin nanofiber and chitosan nanofiber in the medium composition is chitin nanofiber: chitosan nanofiber 1: 0.5 to 20.
  • [15 '] The method according to any one of [12'] to [14 '], wherein the adherent cells are mesenchymal stem cells.
  • [16 '] The method according to any one of [12'] to [15 '], wherein the cell secretion is at least one selected from the group consisting of a low-molecular compound, a protein, a nucleic acid, and a cell secretory vesicle. .
  • the adherent cells cultured using the present invention are stem cells, a high-quality stem cell characteristic (for example, differentiation ability or migration / homing ability in mesenchymal stem cells) is maintained at a high level. Stem cells can be efficiently prepared.
  • cultivation can be easily performed only by gentle stirring by pipetting or the like and addition of a fresh medium without performing a peeling operation of a carrier using a protease such as trypsin and cells attached thereto. Can be scaled up. As a result, useful cell secretions can be efficiently produced.
  • FIG. 1 shows sample 1 (chitin nanofiber), sample 6 (mixture of chitin nanofiber and chitosan nanofiber), sample 14 (chitin / chitosan nanofiber prepared by simultaneous defibration), or sample 15 (N-acetylglucosamine).
  • It is a graph which shows the number of viable cells over time when HEK293-IFN ⁇ cells were subjected to suspension culture for 21 days using a medium composition to which an amount-regulated nanofiber (N-acetylglucosamine amount: 50%) was added.
  • the four bar graphs in each sample show the number of viable cells on the 0th day, the 7th day, the 14th day, and the 21st day from the left, respectively.
  • FIG. 1 shows sample 1 (chitin nanofiber), sample 6 (mixture of chitin nanofiber and chitosan nanofiber), sample 14 (chitin / chitosan nanofiber prepared by simultaneous defibration), or sample 15 (N-acet
  • FIG. 2 is a photograph showing the sphere state of cells (day 8) when HEK293-IFN ⁇ cells were subjected to suspension culture using the medium composition to which each nanofiber was added.
  • FIG. 3 is a photograph showing the sphere state of cells (day 15) when HEK293-IFN ⁇ cells were subjected to suspension culture using a medium composition to which each nanofiber was added.
  • FIG. 4 is a photograph showing the sphere state of cells (day 21) when HEK293-IFN ⁇ cells were subjected to suspension culture using the medium composition to which each nanofiber was added.
  • the present invention relates to a medium composition for suspension culture of adherent cells , comprising (1) chitin nanofiber; and (2) chitosan nanofiber or polysaccharide (hereinafter referred to as “the present invention”). Of the present invention). Since the medium composition of the present invention contains chitin nanofibers, chitosan nanofibers, or polysaccharides, the adherent cells can be cultured in suspension without performing operations such as stirring and shaking.
  • Adhesive cells used in the present invention are cells that require a scaffold such as a container wall for survival or proliferation.
  • Adhesive cells used in the present invention are not particularly limited, and include, for example, stem cells, progenitor cells, somatic non-stem cells, primary cultured cells, cell lines, cancer cells and the like.
  • Stem cells are cells that have both the ability to replicate themselves and the ability to differentiate into cells of other multiple lineages.
  • Examples of adhesive stem cells include, but are not limited to, mesenchymal stem cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, Somatic stem cells such as hair follicle stem cells and the like can be mentioned.
  • Mesenchymal stem cells are stem cells capable of differentiating into all or some of bone cells, chondrocytes and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells are present at low frequency in tissues such as bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood, and adipose tissue, and can be isolated from these tissues by a known method.
  • Progenitor cells are cells that are in the process of differentiating from the stem cells to specific somatic cells or germ cells.
  • adhesive precursor cells include, but are not limited to, preadipocytes, precursor cardiomyocytes, precursor endothelial cells, neural precursor cells, liver precursor cells, pancreatic precursor cells, kidney precursor cells, and the like. Can be mentioned.
  • adhesive somatic non-stem cells include, but are not limited to, fibroblasts, bone cells, bone pericytes, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells , Endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatic parenchymal cells, chondrocytes, cumulus cells, nervous system cells, glial cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, astrocytes, heart cells, esophageal cells, muscle cells (eg, , Smooth muscle cells or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanocytes and the like.
  • Primary culture cells refer to cells that have been cultured until seeding cells or tissues separated from a living body and performing the first passage.
  • Primary cultured cells include, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, spleen, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage Cells from any tissue, such as vascular tissue, blood, heart, eye, brain or nerve tissue.
  • the cell line refers to a cell that has acquired an infinite proliferative ability by an artificial operation in vitro.
  • the adherent cells used in the present invention are preferably stem cells or progenitor cells, more preferably mesenchymal stem cells.
  • the origin of the adherent cells used in the present invention is not particularly limited, and may be cells derived from any of animals and plants.
  • animals include, but are not limited to, fish, amphibians, reptiles, birds, pancrustaceans, hexapods, mammals, and the like, and are preferably mammals.
  • mammals include, but are not limited to, rat, mouse, rabbit, guinea pig, squirrel, hamster, vole, platypus, dolphin, whale, dog, cat, goat, cow, horse, sheep, pig, elephant, Common marmosets, squirrel monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees, humans, and the like.
  • the plant is not particularly limited as long as the collected cells can be cultured in liquid.
  • plants that produce crude drugs for example, saponins, alkaloids, berberine, scoporin, plant sterols, etc.
  • plants that produce the body eg, anthocyanins, safflower pigments, madder pigments, saffron pigments, flavones, etc.
  • plants that produce the drug substance eg., blueberries, safflowers, radish, saffron, etc.
  • mammalian adherent cells are preferably used.
  • the adherent cells may be adherent cells that self-aggregate in suspension culture.
  • Adhesive cells that self-aggregate in suspension culture include cells that form spheres in suspension culture.
  • Adhesive cells that self-aggregate in suspension culture include, for example, somatic cells include HEK293 cells, HeLa cells, A549 cells, and the like.
  • Stem cells include mesenchymal stem cells, preadipocytes, iPS cells, and the like. No.
  • HEK293 cells and HeLa cells are preferable as somatic cells
  • mesenchymal stem cells and iPS cells are preferable as stem cells.
  • the chitin nanofiber, chitosan nanofiber, or polysaccharide used in the present invention is dispersed in a liquid medium, and has an effect of suspending the adherent cells attached to the nanofiber or polysaccharide in the liquid medium.
  • Chitin nanofibers and chitosan nanofibers or polysaccharides used in the present invention when mixed with a liquid medium, the nanofibers are dispersed in the liquid while maintaining the primary fiber diameter, and substantially increase the viscosity of the liquid. Without this, it has an effect of substantially retaining cells attached to the nanofibers and preventing sedimentation and attachment to the culture vessel.
  • To not substantially increase the viscosity of the liquid means that the viscosity of the liquid does not exceed 8 mPa ⁇ s.
  • the viscosity of the liquid (that is, the viscosity of the following medium composition of the present invention) is 8 mPa ⁇ s or less, preferably 4 mPa ⁇ s or less, and more preferably 2 mPa ⁇ s or less.
  • the viscosity of the liquid containing chitin nanofibers and chitosan nanofibers or polysaccharides can be evaluated, for example, by using a tuning fork vibrating viscometer (SV-1A, A & D Company Ltd.) at 25 ° C.
  • the chitin nanofibers and chitosan nanofibers used in the present invention are composed of water-insoluble polysaccharides, chitin and chitosan (that is, chitin).
  • the saccharide means a saccharide polymer obtained by polymerizing 10 or more monosaccharides (for example, triose, tetroses, pentose, hexose, heptose, etc.).
  • Chitin refers to one or more carbohydrates selected from the group consisting of chitin and chitosan.
  • the main sugar units constituting chitin and chitosan are N-acetylglucosamine and glucosamine, respectively.
  • chitin and glucosamine are those having a high N-acetylglucosamine content and being hardly soluble in an acidic aqueous solution.
  • chitosan those having a high content and being soluble in an acidic aqueous solution.
  • chitin those in which the ratio of N-acetylglucosamine to constituent sugars is 50% or more may be referred to as chitin, and those in which the ratio is less than 50% may be referred to as chitosan.
  • the proportion of N-acetylglucosamine in the saccharide unit constituting chitin can be 80% or more, 90% or more, 98% or more, or 100%.
  • the proportion of N-acetylglucosamine in the saccharide units constituting chitosan may be 40% or less, 30% or less, 20% or less, or 10% or less.
  • Chitin used in the present invention may be chitin having an ⁇ -type crystal structure such as chitin derived from crab shell or shrimp shell, or chitin having a ⁇ -type crystal structure such as chitin derived from squid shell. Is also good. Crab and shrimp shells are often treated as industrial waste, and are preferred as raw materials from the viewpoint of easy availability and effective use.However, in order to remove proteins and ash contained as impurities, a deproteinization step and demineralization A process is required.
  • purified chitin that has been subjected to a dematrix treatment.
  • Purified chitin is commercially available.
  • the raw material of the chitin nanofiber used in the present invention may be chitin having either ⁇ -type or ⁇ -type crystal structure, but ⁇ -type chitin is preferred.
  • chitosan can be produced by deacetylating chitin by performing boiling treatment in a concentrated alkali (eg, a concentrated aqueous NaOH solution) or the like. Chitosan may also be commercially available.
  • a concentrated alkali eg, a concentrated aqueous NaOH solution
  • Chitosan may also be commercially available.
  • the above-described chitin and chitosan can be pulverized (also referred to as nanofiber formation or fibrillation) to obtain chitin nanofibers and chitosan nanofibers.
  • the pulverization method is not limited. However, in order to reduce the fiber diameter and fiber length to meet the purpose of the present invention, a method capable of obtaining a strong shearing force such as a high-pressure homogenizer, a grinder (stone mill), or a medium stirring mill such as a bead mill. Is preferred.
  • the mixture of chitin nanofiber and chitosan nanofiber used in the present invention may be prepared by mixing chitin nanofiber and chitosan nanofiber individually defibrated, and mixing chitin powder and chitosan powder. It may be prepared by simultaneously defibrating the mixture.
  • the raw material is pulverized by injecting and colliding a dispersion liquid in which the raw material is dispersed at a high pressure from a pair of nozzles.
  • a star burst system manufactured by Sugino Machine Co., Ltd.
  • a high-pressure pulverizer or a nano perenniala a high-pressure pulverizer of Yoshida Kikai Kogyo Co., Ltd.
  • the degree of fineness and homogenization are determined by the pressure for feeding to the ultra-high pressure chamber of the high-pressure homogenizer and the number of times of passing through the ultra-high pressure chamber (the number of processes). , And the concentration of the raw material in the aqueous dispersion.
  • the pumping pressure is not particularly limited, but is usually 50 to 250 MPa, preferably 100 to 200 MPa.
  • the concentration of the raw material in the aqueous dispersion at the time of the fine treatment is not particularly limited, but is usually 0.1% by mass to 30% by mass, preferably 1% by mass to 10% by mass.
  • the number of treatments for pulverization is not particularly limited, and depends on the concentration of the raw material in the aqueous dispersion, but when the concentration of the raw material is 0.1 to 1% by mass, the number of treatments is 10 to 10%. About 100 times, the fineness is sufficiently obtained, but about 1 to 10% by mass may require about 10 to 1,000 times.
  • the viscosity of the aqueous dispersion during the micronization treatment is not particularly limited.
  • the range of the viscosity of the aqueous dispersion is 1 to 100 mPa ⁇ S, preferably 1 to 85 mPa ⁇ S (25 ° C.
  • FIG. 4 shows a tuning fork vibration type viscosity measurement under conditions (SV-1A, A & D Company Ltd.).
  • the viscosity range of the aqueous dispersion is 0.7 to 30 mPa ⁇ S, preferably 0.7 to 10 mPa ⁇ S (tuned vibrating viscosity measurement under the condition of 25 ° C.
  • the particle size of chitin or chitosan in the aqueous dispersion at the time of micronization treatment is not particularly limited, for example, in the case of ⁇ -chitin, the average particle size of ⁇ -chitin in the aqueous dispersion is 0.5% 200200 ⁇ m, preferably 30-150 ⁇ m (by a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer LA-960 (Horiba, Ltd.)).
  • the average particle size of chitosan in the aqueous dispersion is in the range of 0.5 to 300 ⁇ m, preferably 50 to 100 ⁇ m (Laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer LA-960 (Horiba Seisakusho)) According to).
  • the method for preparing nanofibers is described in WO2015 / 111686A1 and the like.
  • a polysaccharide may be added to the medium composition of the present invention.
  • the polysaccharide means a saccharide polymer obtained by polymerizing 10 or more monosaccharides (for example, triose, tetroses, pentoses, hexoses, and heptose).
  • water-insoluble polysaccharide examples include, but are not limited to, celluloses such as cellulose and hemicellulose; and chitin such as chitin and chitosan.
  • water-soluble polysaccharide examples include an acidic polysaccharide having an anionic functional group.
  • the acidic polysaccharide having an anionic functional group is not particularly limited.
  • a polysaccharide having uronic acid eg, glucuronic acid, iduronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid
  • sulfuric acid examples include polysaccharides having phosphoric acid, or polysaccharides having both structures.
  • hyaluronic acid gellan gum, deacylated gellan gum, ramzan gum, diutan gum, xanthan gum, carrageenan, xanthan gum, hexuronic acid, fucoidan, pectin, pectic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, kerato
  • examples thereof include one or more of sulfuric acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, rhamnan sulfate, alginic acid and salts thereof.
  • the salt examples include salts of alkali metals such as lithium, sodium and potassium; salts of alkaline earth metals such as calcium, barium and magnesium; salts of aluminum, zinc, copper and iron; ammonium salts; tetraethylammonium and tetrabutyl Quaternary ammonium salts such as ammonium, methyltributylammonium, cetyltrimethylammonium, benzylmethylhexyldecylammonium, and choline; with organic amines such as pyridine, triethylamine, diisopropylamine, ethanolamine, diolamine, tromethamine, meglumine, procaine, and chloroprocaine. Salts; salts with amino acids such as glycine, alanine and valine.
  • methylcellulose deacylated gellan gum, alginic acid, xanthan gum, carrageenan, diutan gum, locust bean gum, tamarind seed gum, pectin, and carboxymethylcellulose or a salt thereof can be preferably used.
  • the mixing ratio of chitin nanofiber and chitosan nanofiber may be important.
  • the obtained mixture of chitin nanofibers / chitosan nanofibers was prepared by mixing the concentration of the total nanofibers (chitin nanofiber and chitosan nanofiber) contained in the medium composition with 0.0001 to 0.2% (w / v), preferably 0.0005 to 0.1% (w / v), more preferably 0.001 to 0.05% (w / v), and particularly preferably 0.006 to 0.05% (w / v). v) can be blended with the liquid medium.
  • the medium composition of the present invention may be prepared by separately adding the required amounts of chitin nanofibers and chitosan nanofibers to a liquid medium and stirring well.
  • the medium composition of the present invention satisfies the following conditions with respect to the concentration of nanofibers: (1) The concentration of the total nanofibers (chitin nanofiber and chitosan nanofiber) contained in the medium composition is 0.0001 to 0.2% (w / v), and The weight ratio of chitin nanofibers: chitosan nanofibers contained in the mixture is 1: 0.5-20 (preferably 1: 0.5-10, 1: 0.7-9, 1: 1-8, 1: 2-7, or 1: 3-6); (2) The concentration of the total nanofibers (chitin nanofiber and chitosan nanofiber) contained in the medium composition is 0.0005 to 0.1% (w / v), and The weight ratio of chitin nanofibers: chitosan nanofibers contained in the mixture is 1: 0.5-20 (preferably 1:
  • Chitin nanofiber: deacylated gellan gum 0.0005 to 0.1% (w / v): 0.0001 to 0.1 (w / v) (more preferably 0.001 to 0.05% (w / v) / V): 0.001 to 0.01% (w / v))
  • Chitin nanofiber: sodium alginate 0.0005 to 0.1% (w / v): 0.0004 to 0.4 (w / v) (more preferably 0.001 to 0.05% (w / v) ): 0.001 to 0.04% (w / / / v)
  • the fact that the mixing ratio of chitin nanofibers and chitosan nanofibers is important to obtain the desired effect of the present invention is based on the fact that chitin nanofibers and chitosan nanofibers are important. It is suggested that the total amount of acetylated glucosamine in the fiber is important. Therefore, in one embodiment of the present invention, instead of using a mixture of two types of nanofibers, chitin nanofibers and chitosan nanofibers, an acetyl group having the number of acetyl groups corresponding to the number of acetyl groups in the two types of nanofiber mixture is used.
  • a nanofiber prepared from a single poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine having an optimized degree of conversion (hereinafter referred to as “N-acetylglucosamine content-regulated nanofiber” or the like) can be used. Accordingly, in one aspect, the present invention also provides a culture medium for suspension culture of adherent cells, comprising a poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofiber having a specific degree of acetylation.
  • the specific degree of acetylation of the poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine is generally 5 to 70%, preferably 9 to 70%, more preferably 11 to 55%, and further preferably It can be 14 to 50%, more preferably 16 to 50%, particularly preferably 22 to 33%, but is not limited to these as long as the desired effect can be obtained.
  • ⁇ ⁇ Poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine having a specific degree of acetylation as described above can be produced by a method known per se.
  • chitin having a relatively high acetylation ratio eg, 90% or more
  • an alkali eg, a concentrated NaOH aqueous solution or the like
  • a method for producing poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine having a specific degree of acetylation as described above can be produced by a method known per se.
  • chitin having a relatively high acetylation ratio eg, 90% or more
  • an alkali eg, a concentrated NaOH aqueous solution or the like
  • the poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine thus obtained having a specific degree of acetylation is miniaturized (sometimes referred to as nanofibrillation or fibrillation) by the method described above.
  • a poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofiber having a specific degree of acetylation can be prepared.
  • N-acetylglucosamine-regulated nanofibers can be added to the liquid medium composition.
  • the concentration of N-acetylglucosamine-regulated nanofibers in the liquid medium composition is such that the concentration of the nanofibers contained in the medium composition is usually 0.0001 to 0.2% (w / v), preferably 0%. 0.0005 to 0.1% (w / v), more preferably 0.001 to 0.1% (w / v), and particularly preferably 0.006 to 0.06% (w / v). It can be added to a liquid medium, but is not limited to these as long as a desired effect can be obtained.
  • the medium contained in the medium composition of the present invention can be appropriately selected depending on the type of the adherent cells to be used and the like.
  • culture of mammalian cells can be used as a medium contained in the medium composition of the present invention.
  • Examples of a medium for mammalian cells include Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM), Ham F12 medium (Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM / F12 medium, McCoy's medium (McCoy'A).
  • MMEM medium 40 s @ 5A medium, Eagle's MEM medium (Eagle's Minimum Essential Medium; EMEM), ⁇ MEM medium (alpha @ Modified @ Eagle's @ Minimum Essential Medium; ⁇ MEM), MEM medium and MEM medium, MEM medium, ERP medium, and MEM medium (MMEM medium 40).
  • a person skilled in the art may freely add sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, various amino acids, various vitamins, antibiotics, serum, fatty acids, sugars, etc. to the above-mentioned medium according to the purpose.
  • those skilled in the art can also add one or more other chemical components or biological components in combination according to the purpose.
  • Components that can be added to the medium for mammalian cells include fetal bovine serum, human serum, horse serum, insulin, transferrin, lactoferrin, cholesterol, ethanolamine, sodium selenite, monothioglycerol, 2-mercaptoethanol, bovine serum
  • fetal bovine serum human serum
  • horse serum insulin
  • transferrin lactoferrin
  • cholesterol ethanolamine
  • sodium selenite sodium selenite
  • monothioglycerol 2-mercaptoethanol
  • bovine serum examples include albumin, sodium pyruvate, polyethylene glycol, various vitamins, various amino acids, agar, agarose, collagen, methylcellulose, various cytokines, various hormones, various growth factors, various extracellular matrices and various cell adhesion molecules.
  • cytokines examples include interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), interleukin-6 (IL-6), interleukin-7 (IL-7), interleukin-8 (IL-8), interleukin-9 (IL-9), Interleukin-10 (IL-10), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-14 (IL-14), Interleukin-15 (IL-15), interleukin-18 (IL-18), interleukin-21 (IL-21), interleukin Ron- ⁇ (IFN- ⁇ ), interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), monocyte colony stimulating factor (M-CSF), granule Sphere-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), stem cell factor (S), interleukin-1 (
  • Hormones that can be added to the medium include melatonin, serotonin, thyroxine, triiodothyronine, epinephrine, norepinephrine, dopamine, anti-Mullerian hormone, adiponectin, adrenocorticotropic hormone, angiotensinogen and angiotensin, antidiuretic hormone, atrial Natriuretic peptide, calcitonin, cholecystokinin, corticotropin-releasing hormone, erythropoietin, follicle-stimulating hormone, gastrin, ghrelin, glucagon, gonadotropin-releasing hormone, growth hormone-releasing hormone, human chorionic gonadotropin, human placental lactogen, growth hormone, inhibin , Insulin, insulin-like growth factor, leptin, luteinizing hormone, melanocyte stimulating hormone, oxytocin, parathyroid hormone , Pro
  • Growth factors that can be added to the medium include transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), macrophage inflammatory protein-1 ⁇ (MIP-1 ⁇ ), epidermal growth factor ( EGF), fibroblast growth factor-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), nerve Cell growth factor (NGF), hepatocyte growth factor (HGF), leukemia inhibitory factor (LIF), protease nexin I, protease nexin II, platelet derived growth factor (PDGF), cholinergic differentiation factor (CDF), chemokine , Notch ligands (such as Delta1), Wnt proteins, angiopoietin-like proteins 2, 3, 5, or 7 (Angpt2, 3, 5, 7, 7), insulin-like growth factors ( GF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), but such pleiotrophin (Pleiotrophin), and the like, but is not limited to these.
  • those obtained by artificially modifying the amino acid sequences of these cytokines and growth factors by genetic recombination technology can also be added.
  • examples thereof include an IL-6 / soluble IL-6 receptor complex or Hyper @ IL-6 (a fusion protein of IL-6 and a soluble IL-6 receptor).
  • Examples of various extracellular matrices and various cell adhesion molecules include collagen I to XIX, fibronectin, laminin-1 to 12, nitogen, tenascin, thrombospondin, von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen, and various elastins.
  • Various proteoglycans various cadherins, desmocholines, desmogleins, various integrins, E-selectin, P-selectin, L-selectin, immunoglobulin superfamily, matrigel, poly-D-lysine, poly-L-lysine, chitin, chitosan, Sepharose, hyaluronic acid, alginic acid gels, various hydrogels, and fragments thereof are also included.
  • antibiotics examples include sulfa preparations, penicillin, pheneticillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, flucloxacillin, nafcillin, ampicillin, penicillin, amoxicillin, cyclacillin, carbenicillin, ticarcillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, piperacillin, Mecculocillin, Mesilinam, Anginosillin, Cephalosporin and its derivatives, Oxolinic acid, Amifloxacin, Temafloxacin, Nalidixic acid, Piromidic acid, Ciprofloxacin, Synoxacin, Norfloxacin, Perfloxacin, Roxaxin, Ofloxacin, Enoxacin
  • serum and / or a serum substitute may be added to the medium composition of the present invention.
  • the serum and / or serum substitute in the medium may be added. Even when the concentration is lower than the concentration usually used (eg, 10% by weight), the cell can be maintained and / or expanded.
  • concentration of the serum to be added to the medium composition of the present invention may be appropriately set depending on the type of cells, culture conditions, the purpose of culture, and the like.
  • the concentration of serum in the medium composition of the present invention is 15% by weight or less, 10% by weight or less, 9% by weight or less, 8% by weight or less, 7% by weight or less, 6% by weight or less, 5% by weight or less, 4% by weight or less, 3% by weight % Or less, 2% by weight or less, 1% by weight or less, 0.9% by weight or less, 0.8% by weight or less, 0.7% by weight or less, 0.6% by weight or less, 0.5% by weight or less, 0. It can be up to 4% by weight, or up to 0.3% by weight.
  • the concentration of the serum may be constant during the culture period, or may be increased or decreased as needed when the medium is replaced.
  • the concentration of serum in the medium composition of the present invention may be, for example, 2% by weight or less, 1% by weight or less, 0.9% by weight or less, 0.8% by weight or less, 0.7% by weight or less. , 0.6 wt% or less, 0.5 wt% or less, 0.4 wt% or less, or 0.3 wt% or less.
  • the serum concentration is usually 0.05 to 2.0% by weight, preferably 0.1 to 2.0% by weight. %, More preferably 0.2 to 2.0% by weight, particularly preferably 0.2 to 1.0% by weight.
  • the serum concentration range for maximizing the yield of cell secretions is usually 0.05 to 2.0% by weight, preferably 0.1 to 1.5% by weight, and more preferably 0.1 to 1.5% by weight. Preferably it is 0.2 to 0.9% by weight, particularly preferably 0.4 to 1.0% by weight.
  • the period during which the cells are maintained and / or expanded in a low serum medium may be appropriately set according to the type of cells, culture conditions, or purpose of culture. Days or more, 7 days or more, 9 days or more, 11 days or more, 13 days or more, 15 days or more, 20 days or more, 25 days or more, 30 days or more, 40 days or more, 50 days or more, 60 days or more, 80 days or more Or 100 days or more.
  • the culture period is from 1 to 200 days, from 1 to 100 days, from 1 to 80 days, from 1 to 60 days, from 1 to 50 days, from 1 to 40 days, from 1 to 30 days, from 1 to 25 days, from 1 to 25 days.
  • the culture period can be preferably 10 to 60 days, more preferably 15 to 50 days, still more preferably 20 to 50 days, and particularly preferably 25 to 40 days.
  • the adherent cells can be suspended (preferably, allowed to stand still).
  • the above-described medium composition of the present invention can be produced by mixing with a suitable liquid medium so as to have a concentration.
  • the medium composition of the present invention can be prepared by mixing a dispersion of the chitin nanofiber and chitosan nanofiber or polysaccharide in an aqueous solvent with a liquid medium.
  • the dispersion may be sterilized (autoclave, gamma sterilization, etc.).
  • the dispersion may be mixed with a liquid medium (an aqueous solution of a medium) prepared by dissolving a powdered medium in water and then used after sterilization. Sterilization of the dispersion and the liquid medium may be performed separately before mixing.
  • aqueous solvents include, but are not limited to, water, dimethyl sulfoxide (DMSO), and the like. Water is preferred as the aqueous solvent.
  • the aqueous solvent may contain appropriate buffers and salts.
  • the nanofiber dispersion is useful as a culture medium additive for preparing the culture medium composition of the present invention.
  • the mixing ratio is not particularly limited, but the dispersion of the nanofiber: the liquid medium (aqueous medium) (volume ratio) is usually 1:99 to 99: 1, preferably 10:90 to 90:10. , More preferably from 20:80 to 80:20.
  • suspension of cells refers to a state where the cells do not adhere to the culture vessel (non-adhesion), regardless of whether the cells are sedimented. Further, in the present invention, when culturing cells, the cells are dispersed in the liquid medium composition without external pressure or vibration on the liquid medium composition or shaking in the composition, rotation operation, or the like.
  • the state in which the cells are in a floating state is referred to as "floating stationary culture", and culturing cells and / or tissues in this state is referred to as "floating static culture”.
  • the period during which the floating can be performed in the “floating standing” is at least 5 minutes or more, preferably 1 hour or more, 24 hours or more, 48 hours or more, 6 days or more, and 21 days or more, but the floating state is maintained. As long as it is not limited to these periods.
  • the culture medium composition of the present invention allows cells to be suspended and settled at at least one point in a temperature range where cells can be cultured (eg, 0 to 40 ° C.).
  • the medium composition of the present invention is capable of allowing cells to stand still at preferably at least one point in a temperature range of 25 to 37 ° C, most preferably at 37 ° C.
  • the adherent cells can be cultured in suspension.
  • the suspension culture can be carried out by culturing the adherent cells in the medium composition of the present invention.
  • the chitin nanofiber, the chitosan nanofiber, or the polysaccharide exhibits an effect of suspending the cells attached to the nanofiber or polysaccharide in a medium (preferably, an effect of allowing the cells to remain suspended).
  • chitin nanofibers and chitosan nanofibers or polysaccharides disperse without dissolving or attaching to the culture vessel, so that when adhesive cells are cultured in the medium composition, Adherent cells attach to the nanofibers or polysaccharides and float in the medium composition. Due to the floating effect, it is possible to increase the number of cells per fixed volume in cultivation as compared with monolayer culture. In the conventional suspension culture involving rotation and shaking operations, a shearing force acts on the cells, so that the cell growth rate and the recovery rate may be low, or the function of the cells may be impaired.
  • the medium composition of (1) By using the medium composition of (1), cells can be cultured in a dispersed state without the need for shaking or the like, and therefore, it is expected that the desired adherent cells can be cultured easily and in large amounts in suspension without loss of cell function. it can.
  • the desired adherent cells when cells are suspended and cultured in a conventional medium containing a gel substrate, observation and recovery of the cells may be difficult, or their functions may be impaired during recovery.
  • the method it is expected that the cells cultured in suspension can be observed and collected without impairing their functions.
  • the medium containing the conventional gel base material may have a high viscosity and it is difficult to replace the medium, but the medium composition of the present invention has a low viscosity, so that the medium can be easily cultured using a pipette or a pump. Can be expected to be replaced.
  • adhesive cells separately prepared may be added to the medium composition of the present invention and mixed uniformly.
  • the mixing method at that time is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a stirrer, a vortex mixer, a microplate mixer, and a shaker.
  • the obtained cell suspension may be cultured in a stationary state, or may be rotated, shaken, or agitated as necessary.
  • the rotation speed and the frequency may be appropriately set according to the purpose of those skilled in the art.
  • the adherent cells are recovered from the subculture and dispersed into a single cell or a state close thereto using an appropriate cell dissociation solution, and the dispersed adherent cells are dispersed in the medium composition of the present invention.
  • the suspension is subjected to suspension culture (preferably suspension stationary culture).
  • the temperature for culturing cells is usually 25 to 39 ° C, preferably 33 to 39 ° C (eg, 37 ° C) for animal cells.
  • the CO 2 concentration is usually 4 to 10% by volume, preferably 4 to 6% by volume, in the culture atmosphere.
  • the culturing period may be appropriately set according to the purpose of culturing.
  • the culture of the adherent cells in the medium composition of the present invention may be performed by using a dish, a flask, a plastic bag, a Teflon (registered trademark) bag, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, It can be carried out using a culture vessel such as a dish, a microplate, a microwell plate, a multiplate, a multiwell plate, a chamber slide, a tube, a tray, a culture bag, and a roller bottle. It is desirable that these culture vessels have low cell adhesion so that the adherent cells attached to the nanofibers do not adhere to the culture vessels.
  • a culture vessel having low cell adhesion one in which the surface of the culture vessel is not artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving the adhesion to cells, or Those whose surface is artificially treated for the purpose of reducing the adhesiveness to cells can be used.
  • the cells When the medium needs to be changed, the cells may be separated by centrifugation or filtration, and then a fresh medium or the medium composition of the present invention may be added to the cells.
  • the cells may be appropriately concentrated by performing centrifugation or filtration, and then a fresh medium or the medium composition of the present invention may be added to the concentrated solution.
  • the gravitational acceleration (G) at the time of centrifugation is 100 to 400 G
  • the size of the pores of the filter used at the time of the filtration treatment is 10 ⁇ m to 100 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • Cultivation of adherent cells is performed automatically in a closed environment under mechanical control, cell seeding, medium exchange, cell image acquisition, culture cell recovery, while controlling pH, temperature, oxygen concentration, etc. It can also be carried out by a bioreactor or an automatic cultivation device that enables cultivation at high density.
  • the adherent cells When the adherent cells are suspended and cultured in a state where they are attached to chitin nanofibers and chitosan nanofibers or polysaccharides, the adherent cells are efficiently proliferated. Therefore, the suspension culture is an excellent method for growing adherent cells. .
  • the adherent cells When the adherent cells are suspended and cultured in a state where they are attached to chitin nanofibers and chitosan nanofibers or polysaccharides, the adherent cells are not unevenly distributed only on the bottom of the culture vessel, but are dispersed with a three-dimensional spread, Proliferation is promoted. As a result, the proliferated cells are connected to the nanofibers or polysaccharides in a tuft of grapes.
  • nanofibers are contained in the medium composition at a concentration sufficient for suspending the adherent cells (that is, avoiding adherence of the adherent cells to the culture vessel). It is essential that the cells can be suspended and suspended (that is, the cells are uniformly dispersed in the liquid medium composition without being subjected to external pressure, vibration, shaking, and rotation operations, and are in a suspended state). is not.
  • Adherent cells in the state of being attached to chitin nanofibers and chitosan nanofibers or polysaccharides, in suspension culture, when growing the cells, as a medium contained in the medium composition of the present invention used for the suspension culture, A medium that can grow the cells while maintaining the characteristics of the adherent cells is used.
  • the medium can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of the adherent cells.
  • mammalian stem cells eg, mesenchymal stem cells
  • suspension culture in a state where they are attached to chitin nanofibers and chitosan nanofibers or polysaccharides.
  • the suspension culture allows mammalian stem cells (eg, mesenchymal stem cells) to proliferate while maintaining their differentiation ability and homing / migration ability. Therefore, high-quality stem cells can be prepared using the medium composition of the present invention.
  • whether the stem cells maintain characteristics such as differentiation ability and migration ability can be determined by a method known per se.
  • the expression levels of cell markers related to undifferentiation in stem cells can be measured at mRNA level and / or protein level. The determination can be easily made by determining the amount level.
  • a fresh medium or the medium composition of the present invention can be used without the need to remove cells from the culture vessel.
  • Adherent cells can be passaged by simply adding to the suspension culture or by adding all or part of the suspension culture to a fresh medium or the medium composition of the present invention.
  • the adherent cells can be subcultured without performing the operation of detaching the cells from the culture container. Further, by using this subculturing method, the culture scale of the adherent cells can be enlarged without performing the operation of detaching the cells from the culture vessel.
  • An operation for detaching cells from the culture vessel includes a treatment with a chelating agent (eg, EDTA) and / or a protease (eg, trypsin, collagenase).
  • a chelating agent eg, EDTA
  • a protease eg, trypsin, collagenase
  • Adhesive cells highly sensitive to the operation of detaching cells from the culture vessel include, but are not limited to, stem cells (eg, mesenchymal stem cells), progenitor cells (eg, preadipocytes), primary cultured cells, and the like. Not done.
  • Adherent cells grown using the medium composition of the present invention can be prepared using chitin nanofibers and chitosan nanofibers by using one or more degrading enzymes such as chitinase, chitobiaase, chitosanase, and ⁇ -1,3-glucanase.
  • degrading enzymes such as chitinase, chitobiaase, chitosanase, and ⁇ -1,3-glucanase.
  • Yatalas is a mixture containing chitinase, chitobiaase, chitosanase, and ⁇ -1,3-glucanase, and can be suitably used as an enzyme for decomposing chitin and chitosan.
  • a chitin and chitosan degrading enzyme for example, to a suspension of adherent cells attached to chitin nanofibers and chitosan nanofibers, add a chitin and chitosan degrading enzyme and incubate the mixture for a time sufficient to detach adherent cells.
  • Incubation temperature of chitin and chitosan with a degrading enzyme is usually 20 ° C. to 37 ° C.
  • the incubation time is usually 5 to 60 minutes, though it depends on the type of the enzyme and the like.
  • the detached adherent cells can be collected by subjecting the suspension to centrifugation.
  • the adhesive cells collected in this manner have minimal damage, they can be suitably used for functional analysis, transplantation and the like.
  • the present invention also provides a method for culturing adherent cells, comprising the step of suspending and culturing adherent cells in a medium composition containing (1) chitin nanofiber; and (2) chitosan nanofiber or polysaccharide.
  • a method for culturing cells hereinafter, sometimes referred to as the “culturing method of the present invention”.
  • the culture method of the present invention is characterized by culturing adherent cells using the above-described medium composition of the present invention. Therefore, the medium composition, adherent cells, culture conditions, and the like in the culture method of the present invention are the same as those described for the medium composition of the present invention.
  • N-acetylglucosamine amount-regulated nanofibers may be used instead of the two types of nanofibers.
  • the present invention also provides a cell comprising the step of suspending and culturing adherent cells in a medium composition comprising (1) chitin nanofiber; and (2) chitosan nanofiber or polysaccharide.
  • a method for producing secretions hereinafter, may be referred to as “the production method of the present invention”.
  • N-acetylglucosamine amount-regulated nanofibers may be used instead of the two types of nanofibers.
  • the production method of the present invention is characterized by culturing adherent cells using the above-described medium composition of the present invention. Therefore, the medium composition, adherent cells, culture conditions, and the like in the culture method of the present invention are the same as those described for the medium composition of the present invention.
  • the adhesive cells used in the production method of the present invention are not particularly limited as long as they produce cell secretions, but in one embodiment, the adhesive cells may be mesenchymal stem cells.
  • the origin of such mesenchymal stem cells may be any of bone marrow, fat cells, umbilical cord, dental pulp and the like.
  • Cell secretions in the production method of the present invention can include any substance secreted by cells, such as low molecular compounds, proteins, nucleic acids (such as miRNA or mRNA), and cell secretory vesicles (see below).
  • Cell secretions produced by the production method of the present invention include, for example, prostaglandin E2 (PGE2), basic fibroblast growth factor (bFGF), Tumor necrosis factor-stimulated gene-6 (TSG-6), Vascular endothelial growth factor (VEGF), indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor (IGF), brain-derived Examples include, but are not limited to, neurotrophic factor (BDNF), nerve growth factor (NGF), angiopoietin-1 and the like.
  • PGE2 prostaglandin E2
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • TSG-6 Tumor necrosis factor-stimulated gene-6
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • IDO indoleamine-2,3-dioxygenase
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • HGF hepatocyte
  • cell secretory vesicle means a vesicle typically released from a cell and having a size that can be confirmed by an electron microscope.
  • the size of such cell secretory vesicles can be 1-1,000 nm, 10-500 nm, or 30-200 nm in average particle size.
  • the average particle diameter is an average value of the diameter of each particle measured by a dynamic light scattering method or an electron microscope.
  • Such cell secretory vesicles can be composed of a lipid bilayer surrounding biomolecules.
  • cell secretory vesicles include, for example, membrane particles, membrane vesicles, microvesicles, nanovesicles, microvesicles (average particle diameter of 30 to 1,000 nm), exosome-like vesicles, exosomes ( exosome, average particle size of 30 to 200 nm), ectosomal-like vesicles, ectosomes, exovesicles, and the like, but are not limited thereto.
  • the cell secretory vesicle may be an exosome.
  • a compound for initiating and / or promoting production of cell secretions may be added.
  • known compounds may be selected according to the cell secretions to be produced.
  • Such compounds include, but are not limited to, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , and interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ).
  • TNF- ⁇ TNF- ⁇
  • IFN- ⁇ interleukin-1 ⁇
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • the cell secretion is PGE2 or TSG-6, it may be preferable to add TNF- ⁇ to the medium composition.
  • the cell secretion is PGE2 or IDO, it may be preferable to add IFN- ⁇ to the medium composition.
  • the concentration of the compound for initiating and / or promoting the production of cell secretions in the medium composition is not particularly limited as long as a desired effect can be obtained. What is necessary is just to determine suitably based on a combination etc.
  • the cells and culture conditions used in the production method of the present invention may be appropriately optimized in order to increase the production amount of the cell secretion.
  • adherent cells exposed to hypoxic conditions eg, mesenchymal stem cells
  • Such optimization of the cells and / or culture conditions may use any technique known per se.
  • Test Example 1 Proliferation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in 3D culture using a mixture of chitin nanofibers and chitosan nanofibers) ⁇ -chitin nanofiber (proportion of N-acetylglucosamine: 95% or more) or chitosan nanofiber (proportion of N-acetylglucosamine: 20% or less) (biomass nanofiber) prepared according to the production method disclosed in WO 2015/111686 After suspending 2% by mass of BiNFi-S (Binfis) and Sugino Machine Co., Ltd.
  • the ⁇ -chitin nanofiber used was a ⁇ -chitin nanofiber (sample 1) that was converted into a nanofiber under the conditions of 200 MPa and 5 passes.
  • the chitosan nanofiber is a chitosan nanofiber (sample 2) that has been converted into a nanofiber under the conditions of 200 MPa and 5 passes.
  • the ratio (volume) of Sample 1 and Sample 2 is 50%: 50% (Sample 3), 33%: 67% (Sample 4), 25%: 75% (Sample 5), 20%: 80% (Sample 6), sample 1 and sample 15%: 85% (sample 7), 10%: 90% (sample 8), 5%: 95% (sample 9), 1%: 99% (sample 10)
  • Were mixed to obtain a chitin nanofiber / chitosan nanofiber mixture (samples 3 to 10).
  • Samples 1 to 10 obtained as described above were mixed with various final concentrations (final concentration: 0.0006% (w / v), 0. 002% (w / v), 0.006% (w / v), 0.02% (w / v)) of the medium composition, and the non-supplemented medium composition without the substrate (sample 11). ) was prepared. Subsequently, the cultured human fat-derived mesenchymal stem cells (C-12977, manufactured by TAKARA BIO INC.) Were suspended in each of the above medium compositions at 13333 cells / mL. The cells were seeded on a microplate (Corning Co., # 3474) at 150 ⁇ L / well.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state for 10 days.
  • a CO 2 incubator 37 ° C., 5% CO 2
  • 150 ⁇ L of ATP reagent CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • FlexStation3 The luminescence intensity (RLU value) was measured using Molecular Devices, and the luminescence value of the medium alone was subtracted to calculate the number of viable cells (average value of three points).
  • a human fat-derived mesenchymal stem cell is cultured in a 96-well flat bottom ultra-low adhesion surface microplate using a medium composition containing a mixture of ⁇ -chitin nanofiber and chitosan nanofiber, the medium is contained in the medium composition.
  • the ⁇ -chitin nanofiber was 5% by weight or more in the total amount of the ⁇ -chitin nanofiber and the chitosan nanofiber, the cell growth promoting effect was exhibited.
  • ⁇ -chitin nanofiber is 25% by weight or more of the total amount of the ⁇ -chitin nanofiber and the chitosan nanofiber contained in the medium composition, it is equivalent to the case where the ⁇ -chitin nanofiber alone is added.
  • Level of cell growth promoting effect Tables 1, 2, and 3 show RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) in each culture.
  • the ⁇ -chitin nanofiber used was a ⁇ -chitin nanofiber (sample 1) that was converted into a nanofiber under the conditions of 200 MPa and 5 passes.
  • the chitosan nanofiber is a chitosan nanofiber (sample 2) that has been converted into a nanofiber under the conditions of 200 MPa and 5 passes. Further, the ratio of sample 1 to sample 2 (volume) is 50%: 50% (sample 3), 33%: 67% (sample 4), and 20%: 80% (sample 6).
  • a chitin nanofiber / chitosan nanofiber mixture samples 3, 4, and 6).
  • Samples 1 to 4 and 6 obtained above were added to various final concentrations (final concentration: 0.0006% (w / v)) in a mesenchymal stem cell growth medium (C-28009, manufactured by Takara Bio Inc.) as a serum medium.
  • a medium composition added at 0.002% (w / v), 0.006% (w / v), 0.02% (w / v)), and a non-added medium composition not containing the substrate ( Sample 11) was prepared.
  • the cultured human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (C-12977, manufactured by TAKARA BIO INC.) Were suspended in each of the above medium compositions at 13333 cells / mL.
  • the cells were seeded on a microplate (Corning Co., # 3474) at 150 ⁇ L / well.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state for 10 days.
  • 150 ⁇ L of ATP reagent CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • FlexStation3 manufactured by Molecular Devices.
  • the luminescence intensity (RLU value) was measured at, and the luminescence value of the medium alone was subtracted to calculate the number of viable cells (average value at three points).
  • ⁇ -chitin nanofiber is at least 20% by weight of the total amount of ⁇ -chitin nanofiber and chitosan nanofiber, the same cell growth promoting effect as in the case of only ⁇ -chitin nanofiber (ie, sample 1) showed that.
  • Table 4 shows RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) in each culture.
  • Test Example 3 Continuous expansion culture of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells in 3D culture using a mixture of chitin nanofibers and chitosan nanofibers) ⁇ -chitin nanofiber or chitosan nanofiber (2% by mass of biomass nanofiber BiNFi-S (Binfis), Sugino Machine Co., Ltd.) prepared according to WO 2015/111686 in ultrapure water to 1% (w / v) (Milli-Q water), dispersed by inversion, and this aqueous solution was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes.
  • the ⁇ -chitin nanofibers converted into nanofibers under the conditions of 200 MPa and 5 passes (sample 1) and the chitosan nanofibers converted into the nanofibers under the conditions of 200 MPa and 5 passes (sample 2) were used for the blending. Further, the ratio (volume) of Sample 1 and Sample 2 is 50%: 50% (Sample 3), 25%: 75% (Sample 4), 20%: 80% (Sample 6), and 15%: 85% (Sample Sample 1 and Sample 2 were mixed to obtain 7) to obtain a chitin nanofiber / chitosan nanofiber mixture (samples 3, 4, 6, and 7).
  • Samples 1-4, 6, and 7 obtained above were added to a mesenchymal stem cell growth medium (C-28009, manufactured by Takara Bio Inc.) as a serum medium so that the final concentration was 0.006% (w / v).
  • the final concentration of chitin nanofiber and / or chitosan nanofiber in the prepared medium composition is as follows: (1) Medium composition to which sample 1 was added (chitin nanofiber: 0.006% (w / v), chitosan nanofiber: 0% (w / v)) (2) Medium composition to which sample 2 was added (chitin nanofiber: 0% (w / v), chitosan nanofiber: 0.006% (w / v)) (3) Medium composition to which sample 3 was added (chitin nanofiber: 0.003% (w / v), chitosan nanofiber: 0.003% (w / v)) (4) Medium composition to which sample 4 was added (chitin nanofiber: 0.0015% (w / v), chi
  • the cultured human fat-derived mesenchymal stem cells (C-12977, manufactured by TAKARA BIO INC.) Were suspended in each of the above medium compositions at 13333 cells / mL.
  • the cells were seeded on a microplate (Corning Co., # 3474) at 150 ⁇ L / well.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state for 5 days.
  • the nanofibers to which the cells were adhered by pipetting were dispersed, and the suspensions were collected from the 96-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplates, each containing a new sample (0.006%).
  • the mixture was mixed with 600 ⁇ L of mesenchymal stem cell growth medium by pipetting, and seeded on a 24-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate (Corning Co., # 3473) at a total amount / well (day 0 of 24-well microplate seeding).
  • the cell culture solutions on the 5th and 10th days after seeding the 24-well microplate were respectively collected in 1.5 mL tubes, and centrifuged at 2800 g for 3 minutes to sediment the cell / nanofiber portions.
  • 150 ⁇ L of mesenchymal stem cell growth medium and 150 ⁇ L of ATP reagent (CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) were added, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes.
  • the luminescence intensity (RLU value) was measured using FlexStation3 (manufactured by Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone was subtracted to calculate the number of viable cells (average value at three points).
  • the nanofibers to which the cells were adhered by pipetting were dispersed, and the suspension was collected from the 24-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate, respectively, and a new sample (0.006 %) And mixed with pipetting to 3000 ⁇ L of a mesenchymal stem cell growth medium, and seeded in a 6-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate (Corning Co., # 3471) at a total amount / well (6-well microplate seeding 0). Day).
  • the cell culture solution on day 8 after seeding the 6-well microplate was suspended by pipetting, and the total amount was adjusted to 3500 ⁇ L by adding a mesenchymal stem cell growth medium in consideration of evaporation.
  • 500 ⁇ L of a cell culture solution and 500 ⁇ L of ATP reagent (CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega)
  • 500 ⁇ L of ATP reagent CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • FlexStation3 Molecular Devices
  • FlexStation 3 Molecular Devices
  • the intensity (RLU value) was measured, the luminescence value of the medium alone was subtracted, and the number of viable cells (average value at three points) was calculated.
  • the final ATP value was converted so as to be 3500 ⁇ L of the total amount.
  • the ⁇ -chitin nanofiber and the chitosan nanofiber contain 15 wt% to 50 wt% of the ⁇ -chitin nanofiber in the total amount of the ⁇ -chitin nanofiber and the chitosan nanofiber contained in the medium composition.
  • human fat-derived mesenchymal stem cells were cultured using the medium composition, it was possible to repeat loose aggregation of fibers and dispersion by pipetting.
  • a medium composition containing fresh ⁇ -chitin nanofibers and chitosan nanofibers expansion culture was possible without using trypsin.
  • ⁇ -chitin nanofiber is 15% by weight to 20% by weight of the total amount of ⁇ -chitin nanofiber and chitosan nanofiber contained in the medium composition
  • human fat on the nanofiber during continuous expansion culture The cell proliferation rate was hardly reduced due to the aggregation of the derived mesenchymal stem cells, and the 6-well plate showed a good growth promoting effect.
  • Table 5 shows RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) in each culture.
  • the ⁇ -chitin nanofiber used was a ⁇ -chitin nanofiber (sample 1) that was converted into a nanofiber under the conditions of 200 MPa and 5 passes.
  • the chitosan nanofiber is a chitosan nanofiber (sample 2) that has been converted into a nanofiber under the conditions of 200 MPa and 5 passes. Further, the ratio of sample 1 to sample 2 (volume) is 50%: 50% (sample 3), 33%: 67% (sample 4), and 25%: 75% (sample 5).
  • a chitin nanofiber / chitosan nanofiber mixture samples 3 to 5).
  • the final concentration of chitin nanofiber and / or chitosan nanofiber in the prepared medium composition is as follows: (1) Medium composition to which sample 1 was added (chitin nanofiber: 0.015% (w / v), chitosan nanofiber: 0% (w / v)) (2) Medium composition to which sample 2 was added (chitin nanofiber: 0% (w / v), chitosan nanofiber: 0.015% (w / v)) (3) Medium composition to which sample 3 was added (chitin nanofiber: 0.0075% (w / v), chitosan nanofiber: 0.0075% (w / v)) (4) Medium composition to which sample 4 was added (chitin nanofiber: 0.005% (w / v), chitosan nanofiber: 0.01% (w / v)) (5) Medium composition to which sample 5 was added (chitin nanofiber: 0.00375% (w / v), chitosan nanofiber: 0.01125% (w
  • the cultured human fat-derived mesenchymal stem cells (C-12977, manufactured by TAKARA BIO INC.) Were added to the above-mentioned chitin and / or chitosan nanofibers in a medium composition or a non-supplemented medium at 50,000 cells / mL. After seeding the composition, the mixture was dispensed into wells of a 6-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate (# 3471; manufactured by Corning Incorporated) at a volume of 2 mL per well.
  • 25,000 cells / mL were inoculated as a control into an unsupplemented medium composition, and then dispensed into wells of a 6-well flat-bottomed adhesive surface microplate (# 3516, manufactured by Corning Incorporated) at a rate of 2 mL per well ( Sample 12).
  • a 6-well flat-bottomed adhesive surface microplate # 3516, manufactured by Corning Incorporated
  • Each plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state and continued for 6 days.
  • the cells were collected, and 350 ⁇ L of an RLT solution (RNeasy mini kit (QIAGEN, # 74106) was added to prepare an RNA extraction solution. After adding 350 ⁇ L of 70% ethanol to the RNA extraction solution, the RNeasy spin was added.
  • Perfec CDNA was synthesized using Real Time (manufactured by Takara Bio Inc., # RR037A), and the synthesized cDNA and Premix EX Taq (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc., # RR039A), Taq man Probe (Applied BioSystem).
  • Real-time PCR was performed using Taq man Probe (manufactured by Applied Bio Systems), OCT4 was Hs04260367_gH, SOX2 was Hs01053049_s1, NANOG was Hs04399610_g1, and CXCR4 was Hs99PD781 with Hs997905 for s9999H05.
  • Real-time PCR 7500 was used. Calculates the correct relative values were compared.
  • ⁇ -chitin nanofiber dispersion and the chitosan nanofiber dispersion prepared under various defibration conditions pressure and number of times of crushing used in Test Examples 1 to 4 (and Test Examples 5, 6, and 7 described below).
  • Table 7 shows the physical property values of ⁇ -chitin or chitosan (measured concentration, viscosity, median particle diameter, average particle diameter, etc.).
  • chitin nanofibers and chitosan nanofibers in the prepared mesenchymal stem cell growth medium containing nanofibers are as follows: chitin nanofiber: 0.01% (w / v), chitosan nanofiber: 0.04% (w / v).
  • the cultured human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (C-12971, manufactured by Takara Bio Inc.) were suspended in the above-mentioned mesenchymal stem cell growth medium containing nanofibers at a concentration of 15000 cells / mL, and then cultured in 6 wells.
  • the cells were seeded at 10 mL / well on a flat bottom ultra-low adhesion surface microplate (Corning's # 3471).
  • the cells were cultured for 3 days in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state. During the culture, the cells that adhered to the nanofibers precipitated at the bottom of the culture well, but did not adhere to the surface of the culture well.
  • the nanofibers to which the cells were adhered were dispersed by pipetting, and the suspension was collected from a 6-well flat bottom ultra-low adhesion surface microplate, and fresh mesenchymal stem cell growth medium containing nanofibers ( (40 mL) by pipetting, and seeded and cultured in a 125 mL flask (4115-0125, manufactured by Thermo Scientic) at a total volume / flask.
  • a pipette 25 mL of the medium in the flask was removed, 25 mL of fresh nanofiber-containing mesenchymal stem cell growth medium was added, suspended by a pipette, and the culture was continued until 14 days after seeding.
  • ATP reagent CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • 500 ⁇ L of ATP reagent was added to 500 ⁇ L of the cell culture solution 7 days after the expansion of the 125 mL flask, suspended, allowed to stand at room temperature for about 10 minutes, and then flexStation3.
  • the luminescence intensity (RLU value) was measured using (Molecular Devices), the luminescence value of the medium alone was subtracted, and the number of viable cells (average value of two points) was calculated.
  • the final ATP value in the flask was calculated using an expansion ratio (5 times) from 6 wells to the flask.
  • Test Example 6 Suspension culture of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells at a low serum concentration using a medium composition containing chitin nanofibers and chitosan nanofibers, and continuous recovery of cell secretions
  • Test Example 5 125 mL on day 14 of culturing human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells using a medium composition containing ⁇ -chitin nanofibers and chitosan nanofibers (ie, a nanofiber-containing mesenchymal stem cell growth medium) A flask culture was used.
  • the collected culture supernatant was centrifuged (400 g, 3 minutes), and then the culture supernatant was collected.
  • the collected culture supernatant was stored at -80 ° C until use.
  • the pellet (nanofiber / cells, etc.) after centrifugation was returned to the flask during cell culture, and the culture in the flask was continued. That is, the nanofiber concentration in the medium is always constant throughout all the steps described above.
  • Exosome production in each culture supernatant was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • PS Capture TM Exosome ELISA Kit # 297-79201, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the operation of adding 300 ⁇ L / well of the reaction / washing solution to the Exomesome Capture 96 Well Plate was repeated three times.
  • the culture supernatant diluted 10-fold was dispensed at 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 2 hours using a microplate shaker.
  • a control anti-CD63 antibody reaction solution for detection was dispensed at 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 1 hour using a microplate shaker.
  • the operation of discarding the reaction solution and adding 300 ⁇ L / well of the reaction / washing solution to each well was repeated three times.
  • the secondary antibody reaction solution for detection was dispensed at 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 1 hour using a microplate shaker.
  • TMB Solution was dispensed at 100 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • Stop Solution was added at 100 ⁇ L / well, and the absorbance at 450 nm and 620 nm was measured.
  • the absorbance value of each sample was a value obtained by subtracting the absorbance at 620 nm from the absorbance at 450 nm (nmAbs).
  • Test Example 7 Suspension culture of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells using a medium composition containing chitin nanofibers and chitosan nanofibers in stepwise lowering of serum and collection of cell secretions 2
  • a composition was prepared (the medium composition prepared herein may be hereinafter referred to as a "medium mesenchymal stem cell growth medium containing nanofibers").
  • the final concentrations of chitin nanofibers and chitosan nanofibers in the prepared mesenchymal stem cell growth medium containing nanofibers are as follows: (1) Medium composition to which sample 3 was added (chitin nanofiber: 0.025% (w / v), chitosan nanofiber: 0.025% (w / v)) (2) Medium composition to which sample 6 was added (chitin nanofiber: 0.01% (w / v), chitosan nanofiber: 0.04% (w / v))
  • the cultured human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (C-12971, manufactured by Takara Bio Inc.) were suspended in the above-mentioned mesenchymal stem cell growth medium containing nanofibers at a concentration of 15000 cells / mL, and then cultured in a 24 well.
  • the cells were seeded at 1.2 mL / well on a flat bottom ultra-low adhesion surface microplate (Corning's # 3473).
  • the cells were cultured for 3 days in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state.
  • the nanofibers to which the cells were adhered were dispersed by pipetting, and the suspension was recovered from a 24-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate, and a fresh nanofiber-containing mesenchymal stem cell growth medium ( 8.4 mL), and seeded at 9.6 mL / well in a 6-well flat bottom ultra-low adhesion surface microplate (Corning's # 3473).
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 4 days in a stationary state.
  • the nanofibers to which the cells were adhered were dispersed by pipetting, and the suspension was recovered from a 6-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate, and a fresh nanofiber-containing mesenchymal stem cell growth medium ( (About 40 mL) by pipetting, and inoculated in a 125 mL flask (manufactured by Thermo Scientic, 4115-0125) at a total volume / flask and cultured.
  • a fresh nanofiber-containing mesenchymal stem cell growth medium (About 40 mL) by pipetting, and inoculated in a 125 mL flask (manufactured by Thermo Scientic, 4115-0125) at a total volume / flask and cultured.
  • the collected medium was centrifuged (400 g, 3 minutes), and the culture supernatant was collected.
  • the collected culture supernatant was stored at -80 ° C until use.
  • the pellet (nanofiber / cells, etc.) after centrifugation was returned to the flask during cell culture, and the culture in the flask was continued. That is, the nanofiber concentration in the medium is always constant throughout all the steps described above.
  • Exosome production in each culture supernatant was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • PS Capture TM Exosome ELISA Kit # 297-79201, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the operation of adding 300 ⁇ L / well of the reaction / washing solution to the Exomesome Capture 96 Well Plate was repeated three times.
  • the culture supernatant diluted 10-fold was dispensed at 100 ⁇ L / well and reacted at room temperature for 2 hours using a microplate shaker.
  • a control anti-CD63 antibody reaction solution for detection was dispensed at 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 1 hour using a microplate shaker.
  • the operation of discarding the reaction solution and adding 300 ⁇ L / well of the reaction / washing solution to each well was repeated three times.
  • the secondary antibody reaction solution for detection was dispensed at 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 1 hour using a microplate shaker.
  • TMB Solution was dispensed at 100 ⁇ L / well and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • Stop Solution was added at 100 ⁇ L / well, and the absorbance at 450 nm and 620 nm was measured.
  • the absorbance value of each sample was a value obtained by subtracting the absorbance at 620 nm from the absorbance at 450 nm (nmAbs).
  • a 24-well flat-bottomed adhesive surface microplate (# 3526, manufactured by Corning) or a 6-well flat-bottomed adhesive surface microplate (# 3516, manufactured by Corning) was divided into wells at 1 mL or 2 mL per well. Noted. Each plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state and continued for 2 days. On the second day, the medium composition to which chitin and chitosan nanofiber were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred to a 15 mL tube and centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and then the culture supernatant was collected.
  • the mesenchymal stem cell growth medium 2 medium or the mesenchymal stem cell growth medium 2 medium containing 10 ng / mL final concentration of TNF- ⁇ (# 210-TA, manufactured by R & D Systems) was added.
  • the medium composition added to the 15 mL tube and added with chitin and chitosan nanofibers was returned to the wells of a 24-well flat bottom ultra-low adhesion surface microplate (# 3473, manufactured by Corning).
  • a 24-well flat-bottom adhesive surface microplate (# 3526, manufactured by Corning Incorporated) is a 1-ml mesenchymal stem cell growth medium 2 medium or a mesenchymal stem cell growth medium 2 medium containing a final concentration of 10 ng / ml TNF- ⁇ after removing the medium.
  • Each plate was cultured in a stationary state in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) and continued for one day. On the first day, the medium composition to which chitin and chitosan nanofibers were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred to a 15 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and the culture supernatant was collected.
  • the 3D culture in which the medium composition containing the chitin nanofiber and the chitosan nanofiber was added to the low adhesion plate was compared with the non-added medium composition and the monolayer culture on the adhesion plate, and the PGE2 secretion amount was smaller than that in the case of monolayer culture.
  • the relative value of increased when comparing TNF- ⁇ treatment, 3D culture combined with a low-adhesion plate using a medium composition containing chitin nanofibers and chitosan nanofibers is more monolayer-cultured with an unadded medium composition and an adhesion plate. There were more than you did.
  • Tables 13 and 14 show the relative values of human bone marrow-derived and human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in each sample.
  • a 24-well flat bottom adhesive surface microplate (# 3526, manufactured by Corning Incorporated) was dispensed at 1 mL per well. Each plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state and continued for 2 days. On the second day, the medium composition to which chitin and chitosan nanofiber were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred from each well to a 15 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and then the culture supernatant was removed.
  • the medium composition to which chitin and chitosan nanofibers were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred to a 15 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and the culture supernatant was collected.
  • 1 mL of ATP reagent CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • the luminescence intensity was measured by Enspire (Perkin Elmer), and the number of viable cells was measured by subtracting the luminescence value of the medium alone.
  • the bFGF contained in the collected culture supernatant was quantified using a bFGF ELISA kit (# ELH-bFGF-1, manufactured by RayBiotech). 100 ⁇ L of the standard or sample solution was added to the well and shaken at room temperature for 2.5 hours. Subsequently, the solution was discarded and removed after adding 300 ⁇ L of 1 ⁇ wash solution. The above operation was repeated four times. 100 ⁇ L of 1 ⁇ Detection antibody was added and shaken for 1 hour at room temperature.
  • an unsupplemented medium composition (sample 12) containing no base material was prepared.
  • a 6-well flat bottom adhesive surface microplate (# 3516, manufactured by Corning) or a 24-well flat bottom adhesive surface microplate (# 3526, manufactured by Corning) was dispensed at 1 mL per well. .
  • Each plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state and continued for 2 days.
  • the medium composition to which chitin and chitosan nanofiber were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred from each well to a 15 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and then the culture supernatant was removed.
  • mesenchymal stem cell proliferation containing 1 mL of mesenchymal stem cell growth medium 2 medium or TNF- ⁇ (# 210-TA, manufactured by R & D Systems) at a final concentration of 10 ng / mL or 20 ng / mL Medium 2
  • the medium was added to a 15 mL tube, and the medium composition to which chitin and chitosan nanofibers were added was returned to the wells of a 24-well flat bottom ultra-low adhesion surface microplate (# 3473, manufactured by Corning).
  • a 24-well flat-bottomed adhesive surface microplate (# 3526, manufactured by Corning) is a mesenchymal stem cell containing 1 mL of mesenchymal stem cell growth medium 2 medium or a final concentration of 10 ng / mL or 20 ng / mL of TNF- ⁇ after removing the medium. Growth medium 2 medium was added. Each plate was cultured in a stationary state in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) and continued for one day.
  • the medium composition to which chitin and chitosan nanofibers were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred to a 15 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and the culture supernatant was collected.
  • 1 mL of ATP reagent CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • TSG-6 contained in the collected culture supernatant was quantified using ELISA.
  • a TSG-6 antibody (# sc-65886) diluted to 10 ⁇ g / mL in 0.2M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.2) in Maxisorp flat bottom (# 44-2404-21, manufactured by Thermo Fisher Scientific). , Santacruz) at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours.
  • Tween-20 (# P7949, manufactured by Sigma-Aldrich) was added to D-PBS (-) (# 043-29791, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration of 0.05% (v / v). After adding 300 ⁇ L of PBST solution added so as to be, it was removed. This operation was repeated three times. 100 ⁇ L of a PBST solution containing 5% of BSA (# A2153, manufactured by Sigma-Aldrich) was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes. After discarding the solution, 300 ⁇ L of PBST solution was added and removed. This operation was repeated three times.
  • TSG-6 (# 2104-TS, manufactured by R & D Systems) and an evaluation sample prepared for a calibration curve were added to each well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 hours. After discarding the solution, 300 ⁇ L of PBST solution was added and removed. This operation was repeated three times. 50 ⁇ L of a solution of Biotinylated anti human TSG-6 antibody (# BAF2104, manufactured by R & D Systems) diluted to 5 ⁇ g / mL with PBST was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 120 minutes. After discarding the solution, 300 ⁇ L of PBST solution was added and removed. This operation was repeated three times.
  • the 3D culture in which the medium composition to which chitin nanofiber and chitosan nanofiber were added and the low adhesion plate were compared with the culture medium without addition and the monolayer culture with the adhesion plate compared to TSG-6.
  • the relative value of secretion increased.
  • the rate of increase when comparing control and TNF- ⁇ treatment in each sample was also higher in a 3D culture combined with a low-adhesion plate using a medium composition containing chitin nanofibers and chitosan nanofibers. And more than in the case of monolayer culture on the adhesion plate.
  • Tables 17 and 18 show relative values of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in each sample.
  • the cultured human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (C-12974, manufactured by TAKARA BIO INC.) Were added to the above-mentioned chitin and chitosan nanofibers in a medium composition containing 100000 cells / mL or a medium composition without the addition.
  • the medium composition to which chitin and chitosan nanofibers were added was placed in a 24-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate (# 3473, manufactured by Corning). (# 3526, manufactured by Corning Incorporated)). Each plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state and continued for 2 days.
  • the medium composition to which chitin and chitosan nanofiber were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred from each well to a 15 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and then the culture supernatant was removed. Subsequently, 1 mL of MEM ⁇ medium containing 17% FBS was added, and the medium composition containing chitin and chitosan nanofibers was returned to the wells of a 24-well flat-bottom ultra-low adhesion surface microplate (# 3473, manufactured by Corning).
  • MEM ⁇ medium containing 17% FBS was added to a 24-well flat-bottom adherent surface microplate (# 3526, manufactured by Corning Incorporated) as an unsupplemented medium composition.
  • a 24-well flat-bottom adherent surface microplate # 3526, manufactured by Corning Incorporated
  • Each plate was cultured in a stationary state in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) and continued for one day.
  • the medium composition to which chitin and chitosan nanofibers were added and the medium composition to which no chitin was added were transferred to a 15 mL tube, centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes, and the culture supernatant was collected.
  • ATP reagent CellTiter-Glo (registered trademark) Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega
  • RLU value luminescence intensity
  • Enspire Perkin Elmer
  • VEGF contained in the collected culture supernatant was quantified using VEGF165 ELISA kit, Human (# ENZ-KIT156-0001, manufactured by Enzo Life Science).
  • 100 ⁇ L of the standard or sample solution was added to the well and shaken at room temperature for 60 minutes. Subsequently, the solution was discarded and removed after adding 300 ⁇ L of 1 ⁇ wash solution. The above operation was repeated three times. 100 ⁇ L of VEGF detector antibody was added and shaken for 30 minutes at room temperature. The solution was discarded and removed after adding 300 ⁇ L of 1 ⁇ wash solution. The above operation was repeated three times. 100 ⁇ L of VEGF conjugate (blue) was added and shaken at room temperature for 30 minutes. Subsequently, the solution was discarded and removed after adding 300 ⁇ L of 1 ⁇ wash solution. The above operation was repeated four times. 100 ⁇ L of TMB solution was added and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • VEGF concentration contained in each sample was calculated from a four-parameter logistic regression of a calibration curve. In order to calculate the amount of secretion per cell number, a relative value was calculated by dividing the calculated amount of VEGF by the luminescence intensity.
  • the amount of VEGF produced per cell increased in the case of culturing in a medium composition to which chitin nanofibers and chitosan nanofibers were added, compared to the case of culturing in a medium composition to which no chitin nanofibers and chitosan nanofibers were added.
  • Table 19 shows the relative values of each sample.
  • Test Example 12 Variation in stem cell marker expression of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in 3D culture using a mixture of chitin nanofiber and chitosan nanofiber or microcarrier
  • a medium composition was prepared by adding the sample 6 obtained above to a mesenchymal stem cell growth medium 2 medium (C-28009, manufactured by Takara Bio Inc.) so as to have a final concentration of 0.05% (w / v). did.
  • 360 mg of Corning low concentration Synthemax II microcarrier (Corning Co., Ltd., 3781) was weighed, hydrated with sterile purified water, and immersed in 10 mL of ethanol for 30 minutes.
  • a mesenchymal stem cell growth medium 2 medium A medium composition in which the above microcarrier was added to 10 mL of the mesenchymal stem cell growth medium 2 medium was prepared as a control (sample 13). Subsequently, 600,000 cultured human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (C-12971, manufactured by TAKARA BIO INC.) Were suspended in 40 mL of the above-described nanofiber-containing mesenchymal stem cell growth medium, and the antibody immobilized on a culture bag was used.
  • C-12971 600,000 cultured human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • bag A After filling in bag A (manufactured by Nipro, 87-362), the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state for 3 days.
  • 600,000 cultured human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were suspended in 15 mL of microcarrier-containing mesenchymal stem cell growth medium, transferred to a Corning 125 mL disposable spinner flask, and placed in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). The cells were cultured for 1 day in a static state.
  • the cells were further cultured for 2 days by shaking at 30 rpm for 15 minutes using a microstar slow-speed magnetic stirrer (W9001B, W900701), and then allowing to stand for 2 hours.
  • a microstar slow-speed magnetic stirrer W9001B, W900701
  • the cells cultured in the antibody-immobilized bag A and the disposable spinner flask were exchanged for half the medium, and further cultured under the same conditions as above for 4 days.
  • 1 mL was taken out from 40 mL, transferred to a 1.5 mL tube, and centrifuged at 300 xg for 3 minutes. After removing the supernatant, 350 ⁇ L of an RLT solution (RNeasy mini kit, manufactured by QIAGEN, # 74106) was added to obtain an RNA extraction solution.
  • RLT solution RNeasy mini kit, manufactured by QIAGEN, # 74106
  • RNA extraction solution 350 ⁇ L of 70% ethanol was added to the RNA extraction solution, then added to the RNeasy spin column, and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds.
  • 700 ⁇ L of the RW1 solution was added to the RNeasy spin column, and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds.
  • 500 ⁇ L of RPE solution was added and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds. Further, 500 ⁇ L of the RPE solution was added and centrifuged at 8000 ⁇ g for 2 minutes.
  • An RNase-free solution was added to the RNA present in the RNeasy spin column and eluted.
  • cDNA was synthesized from the obtained RNA using PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc., # RR037A).
  • Real-time PCR was performed using the synthesized cDNA, Premix EX Taq (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc., # RR039A), and Taq man Probe (manufactured by Applied Bio Systems).
  • OCT4 was Hs04260367_gH
  • SOX2 was Hs01053049_s1
  • NANOG was Hs04399610_g1
  • CXCR4 was Hs00607978 s1
  • GAPDH was Hs99 using Hs99.
  • the instrument used was a real-time PCR7500. In the analysis, relative values obtained by correcting the value of each target gene with the value of GAPDH were calculated and compared.
  • Test Example 13 bFGF production amount in 3D culture of human fat-derived mesenchymal stem cells using a mixture of chitin nanofiber and chitosan nanofiber or microcarrier
  • a medium composition was prepared by adding the sample 6 obtained above to a mesenchymal stem cell growth medium 2 medium (C-28009, manufactured by Takara Bio Inc.) so as to have a final concentration of 0.05% (w / v). did.
  • 360 mg of Corning low concentration Synthemax II microcarrier (Corning Co., Ltd., 3781) was weighed, hydrated with sterile purified water, and immersed in 10 mL of ethanol for 30 minutes.
  • a mesenchymal stem cell growth medium 2 medium A medium composition in which the above microcarrier was added to 10 mL of the mesenchymal stem cell growth medium 2 medium was prepared as a control (sample 13). Subsequently, 600,000 cultured human fat-derived mesenchymal stem cells (C-12977, manufactured by TAKARA BIO INC.) Were suspended in 40 mL of the above-described nanofiber-containing mesenchymal stem cell growth medium, and the antibody immobilized on a culture bag was used.
  • C-12977 600,000 cultured human fat-derived mesenchymal stem cells
  • bag A After filling in bag A (manufactured by Nipro, 87-362), the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state for 3 days.
  • 600,000 cultured human fat-derived mesenchymal stem cells were suspended in 15 mL of a microcarrier-containing mesenchymal stem cell growth medium, transferred to a Corning 125 mL disposable spinner flask, and placed in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). The cells were cultured for 1 day in a static state.
  • the cells were further cultured for 2 days by shaking at 30 rpm for 15 minutes using a microstar slow-speed magnetic stirrer (W9001B, W900701), and then allowing to stand for 2 hours.
  • a microstar slow-speed magnetic stirrer W9001B, W900701
  • 1 mL was taken out from 40 mL in the culture bag and the spinner flask, transferred to a 1.5 mL tube, and centrifuged at 300 ⁇ g for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, and 2 mL of PBS (-) was added for washing.
  • a mixture of chitosan nanofibers may be referred to as “chitin / chitosan nanofibers prepared by simultaneous defibration” or the like).
  • poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine nanofiber having a specific degree of acetylation (about 50% in this test example) (hereinafter referred to as “N-acetylglucosamine amount-regulated nanofiber”) And the like) may be obtained by heating and refluxing poly (1,4) -N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine in a 30% aqueous sodium hydroxide solution for 4 hours to reduce the amount of N-acetylglucosamine.
  • the chitin / chitosan nanofiber and the N-acetylglucosamine amount-regulated nanofiber prepared by simultaneous defibration thus obtained were each diluted with water for injection (Otsuka distilled water) to 1% (w / w).
  • the aqueous suspension was dispersed by inversion mixing and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes (samples 14 and 15 respectively).
  • Medium composition obtained by adding sample 14 or sample 15 obtained above to a mesenchymal stem cell growth medium 2 medium (C-28009, manufactured by Takara Bio Inc.) so as to have a final concentration of 0.05% (w / v). Was prepared.
  • the cultured human fat-derived mesenchymal stem cells (C-12977, manufactured by TAKARA BIO INC.) are grown in a Petri dish by 2D culture, and the above-mentioned nanofibers are added to the medium composition at 50,000 cells / mL.
  • the solution was dispensed into wells of a 24-well flat-bottom ultra-low adhesion surface microplate (# 3473, manufactured by Corning) at a concentration of 1.2 mL per well. Each plate was cultured in a stationary state in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) and continued for 13 days.
  • the cells were collected on the 8th and 13th days, and 300 ⁇ L of an RLT solution (RNeasy mini kit (QIAGEN, # 74106)) was added to prepare an RNA extraction solution. After adding 300 ⁇ L, the mixture was added to an RNeasy spin column and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds, followed by addition of 600 ⁇ L of the RW1 solution to the RNeasy spin column and centrifugation at 8000 ⁇ g for 15 seconds, followed by addition of 500 ⁇ L RPE solution.
  • RLT solution RNeasy mini kit (QIAGEN, # 74106)
  • RNA from PrimeScript RT reagent CDNA was synthesized using Kit (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc., # RR037A), and the synthesized cDNA and Premix EX Taq (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc., # RR039A), Taq man Probe (Apbe Probe) Real-time PCR was performed using BioSystems, Inc.
  • OCT4 was Hs04260367_gH
  • NANOG was Hs04399610_g1
  • PPIA was Hs99999904_m1 using real-time PCR.
  • relative values obtained by correcting the value of each target gene with the value of PPIA were calculated and compared.
  • a human fat-derived mesenchymal stem cell was prepared using a medium composition containing chitin / chitosan nanofibers or N-acetylglucosamine amount-regulated nanofibers prepared by simultaneous defibration.
  • a medium composition containing chitin / chitosan nanofibers or N-acetylglucosamine amount-regulated nanofibers prepared by simultaneous defibration.
  • Table 22 shows the relative value of NANOG gene expression
  • Table 23 shows the relative value of OCT4 gene expression.
  • Deacylated gellan gum powder (0.8 g) is added to water (100 mL), stirred and dissolved, and then autoclaved (121 ° C., 20 minutes) to give a 0.8% (w / v) deacylated gellan gum aqueous solution.
  • This deacylated gellan gum aqueous solution (12.5 mL) was added to D-PBS (+) (containing Ca and Mg) (27.5 mL) using a medium preparation kit (Nissan Chemical Co. FCeM (registered trademark) -series Preparation Kit).
  • Sample 1 (2 mL) is added to a 0.25% (w / v) deacylated gellan gum divalent cation crosslinked structure dispersion (8 mL) obtained by mixing, and the mixture is mixed by pipetting.
  • a mixture of 2% (w / v) chitin nanofiber and 0.2% (w / v) deacylated gellan gum was prepared (Sample 17).
  • aqueous sodium alginate powder (1.0 g) was added to water (50 mL), stirred and dissolved, and then subjected to autoclave sterilization (121 ° C., 20 minutes) to obtain a 2.0% (w / v) aqueous sodium alginate solution.
  • This aqueous sodium alginate solution (10 mL) is obtained by mixing the resulting solution with D-PBS (+) (containing Ca and Mg) (10 mL) using a medium preparation kit (Nissan Chemical Co. FCeM (registered trademark) -series Preparation Kit).
  • Sample 1 (2 mL) was added to the 1.0% (w / v) alginate divalent cation crosslinked structure dispersion (8 mL) and mixed by pipetting to obtain 0.2% (w / v) chitin nanofiber. And a mixture of 0.8% (w / v) alginic acid was prepared (Sample 18).
  • a mesenchymal stem cell growth medium 2 medium (C-28009, manufactured by Takara Bio Inc.) so that the final concentration was 0.05% (w / v).
  • the final concentrations of chitin nanofibers and chitosan nanofibers or other polysaccharides (methylcellulose, deacylated gellan gum, alginic acid) in the prepared medium composition are as follows:
  • the cultured human fat-derived mesenchymal stem cells (C-12977, manufactured by Takara Bio Inc.) were added to the chitin nanofibers at 13333 cells / mL with chitosan nanofibers or other polysaccharides (methylcellulose, deacyl
  • the gel was seeded on a medium composition containing added gellan gum (alginate) and dispensed into wells of a 24-well flat-bottom ultra-low-adhesion surface microplate (# 3473, manufactured by Corning Incorporated) at a concentration of 1.2 mL per well. Each plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state and continued for 14 days.
  • each culture solution is suspended, 300 ⁇ L is dispensed, and 300 ⁇ L of ATP reagent (CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega) is added and suspended. After allowing the mixture to stand at room temperature for about 10 minutes, the luminescence intensity (RLU value) was measured with FlexStation3 (manufactured by Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone was subtracted to calculate the number of viable cells.
  • ATP reagent CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, Promega
  • the cells were collected on days 7 and 14, and 300 ⁇ L of RLT solution (RNeasy mini kit (QIAGEN, # 74106)) was added to prepare an RNA extraction solution, and 300 ⁇ L of 70% ethanol was added to the RNA extraction solution. Thereafter, the mixture was added to an RNeasy spin column and centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 seconds, followed by addition of 600 ⁇ L of the RW1 solution to the RNeasy spin column and centrifugation at 8000 ⁇ g for 15 seconds, followed by addition of 500 ⁇ L RPE solution and 8000 ⁇ g.
  • RLT solution RNeasy mini kit (QIAGEN, # 74106)
  • RNA present in the RNeasy spin column was added with an RNase-free solution and eluted.
  • PrimeScript ⁇ RT ⁇ reagent CDNA was synthesized using Kit (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc., # RR037A), and the synthesized cDNA and Premix EX Taq (Perfect Real Time) (Takara Bio Inc., # RR039A), Taq man Probe (Apbe). Real-time PCR was carried out using Bio Systems Inc.
  • OCT4 was Hs04260367_gH
  • NANOG was Hs04399610_g1
  • PPIA was Hs999999500_1 using a real-time PCR.
  • relative values obtained by correcting the value of each target gene with the value of PPIA were calculated and compared.
  • the medium composition containing a mixture with chitosan nanofibers has the highest growth potential of human fat-derived mesenchymal stem cells and the undifferentiated OCT4 gene And the expression ability of the NANOG gene was high.
  • a medium composition containing a mixture of chitin nanofibers and any one of polysaccharides of methylcellulose, deacylated gellan gum, and alginic acid also allows human fat-derived mesenchymal stem cells to proliferate and enhance the expression of OCT4 gene and NANOG gene. However, it was weaker than the mixture with chitosan nanofiber.
  • Table 24 shows the results of the number of living cells
  • Table 25 shows the results of NANOG gene expression
  • Table 26 shows the results of OCT4 gene expression.
  • Test Example 16 a mixture of chitin nanofibers and chitosan nanofibers, a mixture of chitin nanofibers and chitosan nanofibers produced by simultaneous defibration, or poly (1,4) -N-acetyl- having a specific degree of acetylation
  • Proliferation of HEK293-IFN ⁇ cells in 3D culture using ⁇ -D-glucosamine nanofiber, maintenance of survival, dispersibility of cell aggregates
  • the sample 1 obtained above was placed in an EMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) containing 10% (v / v) fetal bovine serum at a final concentration of 0.02% (w / v) or 0.1% (w / v).
  • a medium composition added to a concentration was prepared.
  • Sample 6, 14, or 15 was added to an EMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) containing 10% (v / v) fetal bovine serum to a final concentration of 0.02% (w / v).
  • a medium composition was prepared.
  • a non-added medium composition (sample 12) containing no base material was prepared.
  • the final concentration of each nanofiber in the prepared EMEM medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum containing nanofibers is as follows:
  • HEK293-IFM ⁇ cells that stably produce cultured human IFM ⁇ were suspended in each of the above-mentioned medium compositions so as to have a concentration of about 200,000 cells / mL. # 3473) at 1.2 mL / well.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a stationary state for a maximum of 21 days, and the medium was replaced every other day or every two days.
  • each culture solution is suspended, 300 ⁇ L is dispensed, and 300 ⁇ L of ATP reagent (CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) is added.
  • the luminescence intensity was measured with FlexStation3 (Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone was subtracted to calculate the number of viable cells.
  • FlexStation3 Molecular Devices
  • high-quality adherent cells eg, mesenchymal stem cells
  • the cells obtained by the present invention are stem cells, these are very high quality stem cells that maintain characteristics such as undifferentiation and migration in a favorable state. Therefore, the stem cells (eg, mesenchymal stem cells) obtained by the present invention can be preferably used to supplement organs and tissues lost due to diseases and the like. Furthermore, the cell secretion obtained according to the present invention can also be used for treating various diseases. Therefore, the present invention is considered to be extremely useful, for example, in the field of regenerative medicine.

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Abstract

本発明は、（１）キチンナノファイバー；および（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；を含む、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物を提供する。

Description

接着性細胞の浮遊培養用培地組成物
　本発明は、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物、および接着性細胞の浮遊培養方法に関する。より詳細には、本発明は、キチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを含む接着性細胞の浮遊培養用培地組成物、および、該培地組成物を用いた接着性細胞の浮遊培養方法に関する。
　再生医療の分野では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を用いての臓器再生手段の構築が鋭意検討されている。しかし、ＥＳ細胞の樹立には倫理的な問題を伴い、また、ｉＰＳ細胞は癌化リスクや培養期間の長さが問題として認識されている。そのため、癌化リスクが比較的低い間葉系幹細胞や神経幹細胞などの体性幹細胞、分化誘導期間が比較的短い前駆脂肪細胞や前駆心筋細胞などの前駆細胞、または軟骨細胞などを用いた手段の可能性も並行して模索されている。
　体性幹細胞等を用いた治療手段には、高品質な当該細胞が大量に必要となるため、効率よく高品質な細胞を調製し得る培養方法が求められている。例えば、間葉系幹細胞は、シャーレ中で単層培養（２次元（２Ｄ）培養等とも称される）により比較的容易に増殖させることができることが知られている。
　しかし、ひとつのシャーレ中で培養できる細胞数は限られているため、この方法を用いて細胞を大量に培養する場合、多くのシャーレを積層する等の検討が必要となるため、かかる培養方法は大量生産の観点には不向きである。また、最近の報告では、シャーレによる２次元培養法は、間葉系幹細胞の未分化能や増殖能を低下させる可能性があり、加えて、ホーミング作用を含んだ遊走能や抗炎症作用等の、間葉系幹細胞が有する機能の低下も危惧されている。従って、シャーレによる２次元培養法は、高品質な細胞の生産との観点においても不向きである。
　一方、大量に接着性細胞を培養する方法としては、細胞をマイクロキャリアに接着させた状態で培養し、増殖させる装置が報告されている（特許文献１）。しかしながら、現在一般的に入手可能なマイクロキャリアは、静置条件では培養液中で沈降してしまうことから、培養時に撹拌する必要がある。その撹拌時にキャリア同士の衝突などにより、細胞死が起こるとの課題が指摘されている。さらに、培地交換や培養のスケールアップ等の目的において、マイクロキャリアから細胞を回収する際には、細胞同士や細胞とキャリアとを剥離する必要があるが、当該剥離処理に用いられるトリプシンなどのタンパク質分解酵素により細胞がダメージを受け、その結果として細胞の生存率が低下することも、課題の一つとなっている。
特許第３２７５４１１号公報
　上述した背景から、本発明の課題は、撹拌時のマイクロキャリアの衝突による細胞死、継代培養時におけるタンパク質分解酵素処理による細胞へのダメージ等、従来のマイクロキャリアを用いた接着細胞の浮遊培養における複数の課題を解決し得る、新たな培養方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意工夫を重ねた結果、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは特定の多糖類を特定の比率において液体培地に配合することで、（１）当該液体培地は接着性細胞を浮遊培養することができ、撹拌が不要なため接着性細胞を効率よく増殖させることができること、（２）該液体培地は緩やかに撹拌することでキャリアおよびキャリアに付着している接着性細胞を容易に再分散させることができ、さらにこれを静置すれば再度浮遊培養を連続的に行えること、（３）当該液体培地により増殖させた幹細胞（例、間葉系幹細胞）は、分化能や遊走能を非常に高いレベルで維持していること、（４）該液体培地を用いれば、低血清条件で長期間細胞を維持培養することができ、細胞分泌物を効率よく生産できること、（５）該液体培地を用いれば、スフェアの分散性が長期間維持できること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］（１）キチンナノファイバー；および
　（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；
を含む、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物。
［２］培地組成物がキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含み、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、［１］記載の浮遊培養用培地組成物。
［３］培地組成物がキチンナノファイバーおよび多糖類を含み、多糖類が、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、およびアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、［１］記載の浮遊培養用培地組成物。
［４］接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、［１］～［３］のいずれか記載の浮遊培養用培地組成物。
［５］接着性細胞が、幹細胞である、［１］～［４］のいずれか記載の浮遊培養用培地組成物。
［６］幹細胞が、間葉系幹細胞である、［５］記載の浮遊培養用培地組成物。
［７］浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、［５］または［６］記載の浮遊培養用培地組成物。
［８］接着性細胞を、
　（１）キチンナノファイバー；および
　（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；
を含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、接着性細胞の培養方法。
［９］培地組成物がキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含み、培地組成物中のキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、［８］記載の培養方法。
［１０］培地組成物がキチンナノファイバーおよび多糖類を含み、多糖類が、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、およびアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、［８］記載の培養方法。
［１１］接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、［８］～［１０］のいずれか記載の培養方法。
［１２］接着性細胞が、幹細胞である、［８］～［１１］のいずれか記載の培養方法。
［１３］幹細胞が、間葉系幹細胞である、［１２］記載の培養方法。
［１４］浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、［１２］または［１３］記載の培養方法。
［１５］以下の工程をさらに含む、［８］～［１４］のいずれか記載の培養方法：
　（１）浮遊培養された細胞をキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類から剥離させる処理を行うことなく、［１］～［７］のいずれかに記載の浮遊培養用培地組成物をさらに添加する工程、および
　（２）工程（１）で得られた混合物を浮遊培養に供する工程。
［１６］接着性細胞を、
　（１）キチンナノファイバー；および
　（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；
を含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、細胞分泌物を生産する方法。
［１７］培地組成物がキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含み、培地組成物中のキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、［１６］記載の方法。
［１８］培地組成物がキチンナノファイバーおよび多糖類を含み、多糖類が、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、およびアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、［１６］記載の方法。
［１９］接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、［１６］～［１８］のいずれか記載の方法。
［２０］接着性細胞が、幹細胞である、［１６］～［１９］のいずれか記載の方法。
［２１］幹細胞が、間葉系幹細胞である、［２０］記載の方法。
［２２］培地組成物中の血清の濃度が２％以下である、［１６］～［２１］のいずれか記載の方法。
［２３］細胞分泌物が、低分子化合物、タンパク質、核酸、および細胞分泌小胞からなる群から選択される少なくとも一つである、［１６］～［２２］のいずれか記載の方法。
［２４］特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーであって、該特定のアセチル化度が５～７０％であるナノファイバーを含む、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物。
［２５］培地組成物中の特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、［２４］記載の浮遊培養用培地組成物。
［２６］接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、［２４］または［２５］記載の浮遊培養用培地組成物。
［２７］接着性細胞が、幹細胞である、［２４］～［２６］のいずれか記載の浮遊培養用培地組成物。
［２８］幹細胞が、間葉系幹細胞である、［２７］記載の浮遊培養用培地組成物。
［２９］浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、［２７］または［２８］記載の浮遊培養用培地組成物。
［３０］接着性細胞を、特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーであって、該特定のアセチル化度が５～７０％であるナノファイバーを含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、接着性細胞の培養方法。
［３１］培地組成物中の特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、［３０］記載の培養方法。
［３２］接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、［３０］または［３１］記載の培養方法。
［３３］接着性細胞が、幹細胞である、［３０］～［３２］のいずれか記載の培養方法。
［３４］幹細胞が、間葉系幹細胞である、［３３］記載の培養方法。
［３５］浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、［３３］または［３４］記載の培養方法。
［３６］以下の工程をさらに含む、［３０］～［３５］のいずれか記載の培養方法：
　（１）浮遊培養された細胞を特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーから剥離させる処理を行うことなく、［２４］～［２９］のいずれか記載の浮遊培養用培地組成物をさらに添加する工程、および
　（２）工程（１）で得られた混合物を浮遊培養に供する工程。
［３７］接着性細胞を、特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーであって、該特定のアセチル化度が５～７０％であるナノファイバーを含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、細胞分泌物を生産するための方法。
［３８］培地組成物中の特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、［３７］記載の方法。
［３９］接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、［３７］または［３８］記載の方法。
［４０］接着性細胞が、幹細胞である、［３７］～［３９］のいずれか記載の方法。
［４１］幹細胞が、間葉系幹細胞である、［４０］記載の方法。
［４２］培地組成物中の血清の濃度が２％以下である、［３７］～［４１］のいずれか記載の方法。
［４３］細胞分泌物が、低分子化合物、タンパク質、核酸、および細胞分泌小胞からなる群から選択される少なくとも一つである、［３７］～［４２］のいずれか記載の方法。
　また、一態様において、本発明は以下の通りである。
[１’]キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含む、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物。
[２’]キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、[１’]記載の浮遊培養用培地組成物。
[３’]接着性細胞が幹細胞である、[１’]または[２’]記載の浮遊培養用培地組成物。
[４’]浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、[３’]記載の浮遊培養用培地組成物。
[５’]幹細胞が、間葉系幹細胞である、[４’]記載の浮遊培養用培地組成物。
[６’]接着性細胞を、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、接着性細胞の培養方法。
[７’]培地組成物中のキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、[６’]記載の培養方法。
[８’]接着性細胞が幹細胞である、[６’]または[７’]記載の培養方法。
[９’]浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、[８’]記載の培養方法。
[１０’]幹細胞が、間葉系幹細胞である、[９’]記載の培養方法。
[１１’]以下の工程をさらに含む、[６’]～[１０’]のいずれか記載の培養方法：
　（１）浮遊培養された細胞をキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーから剥離させる処理を行うことなく、[１’]～[５’]のいずれかに記載の浮遊培養用培地組成物をさらに添加する工程、および
　（２）工程（１）で得られた混合物を浮遊培養に供する工程。
［１２’］接着性細胞を、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、細胞分泌物を生産するための方法。
［１３’］培地組成物中のキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、［１２’］記載の方法。
［１４’］培地組成物中の血清の濃度が２％以下である、［１２’］または［１３’］記載の方法。
［１５’］接着性細胞が間葉系幹細胞である、［１２’］～［１４’］のいずれか記載の方法。
［１６’］細胞分泌物が、低分子化合物、タンパク質、核酸、および細胞分泌小胞からなる群から選択される少なくとも一つである、［１２’］～［１５’］のいずれか記載の方法。
　本発明によれば、接着性細胞を非水溶性多糖類からなるナノファイバーに接着した状態で培養することにより、細胞の傷害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を要することなく、静置した状態で浮遊培養することができる。また、本発明を用いて培養される接着性細胞が幹細胞である場合は、幹細胞としての特性（例えば、間葉系幹細胞における分化能や遊走・ホーミング能等）を高いレベルで維持した高品質な幹細胞を効率よく調製することができる。さらに、本発明によれば、トリプシン等のタンパク質分解酵素を用いたキャリアとそれに接着する細胞の剥離操作を行うことなく、ピペッティング等による緩やかな撹拌と新鮮な培地の追加のみにより、簡便に培養のスケールアップを実施することが可能となる。その結果、有用な細胞分泌物を効率良く生産することもできる。
図１は、サンプル１（キチンナノファイバー）、サンプル６（キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの混合物）、サンプル１４（同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバー）、またはサンプル１５（Ｎ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバー（Ｎアセチルグルコサミン量：５０％））を添加した培地組成物を用いてＨＥＫ２９３－ＩＦＮβ細胞を２１日間浮遊培養したときの、経時的な生細胞数を示すグラフである。各サンプルにおける４つの棒グラフは、左から、０日目、７日目、１４日目、２１日目の時点における生細胞数をそれぞれ示す。 図２は、各ナノファイバーを添加した培地組成物を用いてＨＥＫ２９３－ＩＦＮβ細胞を浮遊培養したときの、細胞のスフェア状態（８日目）を示す写真である。 図３は、各ナノファイバーを添加した培地組成物を用いてＨＥＫ２９３－ＩＦＮβ細胞を浮遊培養したときの、細胞のスフェア状態（１５日目）を示す写真である。 図４は、各ナノファイバーを添加した培地組成物を用いてＨＥＫ２９３－ＩＦＮβ細胞を浮遊培養したときの、細胞のスフェア状態（２１日目）を示す写真である。
　以下、本発明について詳述する。
１．接着性細胞の浮遊培養用培地組成物
　本発明は、（１）キチンナノファイバー；および（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類を含む、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物（以下、「本発明の培地組成物」と称することがある）を提供する。本発明の培地組成物は、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類を含有することにより、撹拌や振とう等の操作を行うことなく接着性細胞を浮遊培養することができる。
　本発明において使用する接着性細胞とは、生存や増殖に容器壁等の足場を必要とする細胞である。
　本発明において使用する接着性細胞としては、特に限定されるものではないが、例えば、幹細胞、前駆細胞、体性非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、癌細胞等を挙げることができる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。接着性の幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。間葉系幹細胞とは、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の全て又はいくつかへの分化能を有する幹細胞である。間葉系幹細胞は骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織等の組織中に低頻度で存在し、これらの組織から公知の方法で単離することが出来る。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。接着性の前駆細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、前駆脂肪細胞、前駆心筋細胞、前駆内皮細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞、膵臓前駆細胞、腎臓前駆細胞等を挙げることができる。接着性の体性非幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、繊維芽細胞、骨細胞、骨周皮細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞等が含まれる。初代培養細胞とは、生体から分離した細胞や組織を播種し、第１回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいう。初代培養細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取された細胞であり得る。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞をいう。本発明において使用する接着性細胞は、好ましくは幹細胞又は前駆細胞であり、より好ましくは、間葉系幹細胞である。
　本発明に使用される接着性細胞の由来は特に限定されず、動物および植物のいずれに由来する細胞であってよい。動物としては、限定されるものではないが、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられ、好適には哺乳類である。哺乳類の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等が挙げられる。植物としては、採取した細胞が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。本発明においては、好適には、哺乳類の接着性細胞が用いられる。
　一態様において、接着性細胞は、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞であり得る。浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞には、浮遊培養下でスフェアを形成する細胞が含まれる。浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞としては、例えば、体細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞等が挙げられ、幹細胞としては、間葉系幹細胞、前駆脂肪細胞、ｉＰＳ細胞等が挙げられる。本発明の一態様において、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞は、体細胞としてはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞が好ましく、幹細胞としては間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞が好ましい。
　本発明において使用するキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類は、液体培地中に分散し、該ナノファイバーまたは多糖類に付着した接着性細胞を、該液体培地中に浮遊させる効果を示す。
　本発明において使用するキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類は、液体培地と混合した際、一次繊維径を保ちながら当該ナノファイバーが当該液体中で分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く、ナノファイバーに付着した細胞を実質的に保持し、沈降して培養容器に付着することを防ぐ効果を有する。液体の粘度を実質的に高めないとは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、下記の本発明の培地組成物の粘度）は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類を含む液体の粘度は、例えば、２５℃条件下で音叉振動式粘度測定（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ．）を用いて評価することができる。
　本発明において使用するキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーは、非水溶性多糖類であるキチンおよびキトサン（即ち、キチン質）から構成されるものである。糖類とは、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した糖重合体を意味する。
　キチン質とは、キチンおよびキトサンからなる群より選ばれる１以上の糖質をいう。キチン及びキトサンを構成する主要な糖単位は、それぞれ、Ｎ－アセチルグルコサミン及びグルコサミンであり、一般的に、Ｎ－アセチルグルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し難溶性であるものがキチン、グルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し可溶性であるものがキトサンとされる。本明細書においては、便宜上、構成糖に占めるＮ－アセチルグルコサミンの割合が５０％以上のものをキチン、５０％未満のものをキトサンと呼ぶことがある。一態様において、キチンを構成する糖単位に占めるＮ－アセチルグルコサミンの割合は、８０％以上、９０％以上、９８％以上、または１００％であり得る。また、一態様において、キトサンを構成する糖単位に占めるＮ－アセチルグルコサミンの割合は、４０％以下、３０％以下、２０％以下、または１０％以下であり得る。
　キチンの原料としては、例えば、エビ、カニ、昆虫、貝、キノコなど、多くの生物資源を用いることができる。本発明に用いるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。カニやエビの外殻は産業廃棄物として扱われることが多く、入手容易でしかも有効利用の観点から原料として好ましいが、不純物として含まれるタンパク質や灰分等の除去のために脱タンパク工程および脱灰工程が必要となる。そこで、本発明においては、既に脱マトリクス処理が施された精製キチンを用いることが好ましい。精製キチンは、市販されている。本発明に用いられるキチンナノファイバーの原料としては、α型およびβ型のいずれの結晶構造を有するキチンであってもよいが、α型キチンが好ましい。
　また、キトサンは、キチンを濃アルカリ（例、濃ＮａＯＨ水溶液等）中で煮沸処理を行う等により脱アセチル化することにより製造することができる。キトサンもまた、市販されているものを用いればよい。
　上述のキチンおよびキトサンを粉砕（ナノファイバー化または解繊と称することもある）することにより、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを得ることができる。粉砕方法は限定されないが、本発明の目的に合う繊維径・繊維長にまで微細化するには、高圧ホモジナイザー、グラインダー（石臼）、あるいはビーズミルなどの媒体撹拌ミルといった、強いせん断力が得られる方法が好ましい。本発明において用いられるキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの混合物は、個々に解繊されたキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを混合することにより調製してもよく、キチン粉末とキトサン粉末を混合し、この混合物を同時に解繊することにより調製してもよい。
　これらの中でも高圧ホモジナイザーを用いて微細化することが好ましく、例えば特開２００５－２７０８９１号公報や特許第５２３２９７６号に開示されるような湿式粉砕法を用いて微細化（粉砕化）することが望ましい。具体的には、原料を分散させた分散液を、一対のノズルから高圧でそれぞれ噴射して衝突させることにより、原料を粉砕するものであって、例えばスターバーストシステム（（株）スギノマシン製の高圧粉砕装置）やナノヴェイタ（吉田機械興業（株）の高圧粉砕装置）を用いることにより実施できる。
　前述の高圧ホモジナイザーを用いて原料を微細化（粉砕化）する際、微細化や均質化の程度は、高圧ホモジナイザーの超高圧チャンバーへ圧送する圧力と、超高圧チャンバーに通過させる回数（処理回数）、及び水分散液中の原料の濃度に依存することとなる。圧送圧力（処理圧力）は、特に限定されないが、通常５０～２５０ＭＰａであり、好ましくは１００～２００ＭＰａである。
　また、微細化処理時の水分散液中の原料の濃度は、特に限定されないが、通常０．１質量％～３０質量％、好ましくは１質量％～１０質量％である。微細化（粉砕化）の処理回数は、特に限定されず、前記水分散液中の原料の濃度にもよるが、原料の濃度が０．１～１質量％の場合には処理回数は１０～１００回程度で充分に微細化されるが、１～１０質量％では１０～１０００回程度必要となる場合がある。
　前記微細化処理時の水分散液の粘度は特に制限されないが、例えば、αキチンの場合、該水分散液の粘度の範囲は、１～１００ｍＰａ・Ｓ、好ましくは１～８５ｍＰａ・Ｓ（２５℃条件下での音叉振動式粘度測定（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ．）による）である。また、キトサンの場合、該水分散液の粘度の範囲は、０．７～３０ｍＰａ・Ｓ、好ましくは０．７～１０ｍＰａ・Ｓ（２５℃条件下での音叉振動式粘度測定（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ．）による）である。また、微細化処理時の水分散液中のキチンまたはキトサンの粒子径も特に制限されないが、例えば、αキチンの場合、該水分散液中のαキチンの平均粒子径の範囲は、０．５～２００μｍ、好ましくは３０～１５０μｍ（レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ－９６０（堀場製作所）による）である。また、キトサンの場合、該水分散液中のキトサンの平均粒子径の範囲は、０．５～３００μｍ、好ましくは５０～１００μｍ（レーザー回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ－９６０（堀場製作所）による）である。
　ナノファイバーの調製方法については、ＷＯ２０１５／１１１６８６Ａ１等に記載されている。
　本発明の培地組成物には多糖類が添加され得る。本明細書において、多糖類とは、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した糖重合体を意味する。
　非水溶性多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース等のセルロース類；キチン、キトサン等のキチン質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　水溶性多糖類としては、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。アニオン性の官能基を有する酸性多糖類としては、特に制限されないが、例えば、構造中にウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類；構造中に硫酸又はリン酸を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類等が挙げられる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸、アルギン酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。
　ここでいう塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩；アンモニウム塩；テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、メチルトリブチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ベンジルメチルヘキシルデシルアンモニウム、コリン等の四級アンモニウム塩；ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジオラミン、トロメタミン、メグルミン、プロカイン、クロロプロカイン等の有機アミンとの塩；グリシン、アラニン、バリン等のアミノ酸との塩等が挙げられる。
　一態様において、多糖類として、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、アルギン酸、キサンタンガム、カラギーナン、ダイユータンガム、ローカストビーンガム、タマリンドシードガム、ペクチン、およびカルボキシメチルセルロース又はそれらの塩が好ましく用いられ得る。
　本発明の培地組成物において所望の効果が奏されるためには、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの配合割合が重要であり得る。まず、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを、比率（重量）において、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０（好ましくはキチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～１０、より好ましくはキチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．７～９、さらに好ましくはキチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：１～８、よりさらに好ましくはキチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：２～７、特に好ましくはキチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：３～６）でブレンドする。得られたキチンナノファイバー／キトサンナノファイバーの混合物を、培地組成物中に含有される総ナノファイバー（キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、通常０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００６～０．０５％（ｗ／ｖ）となるように液体培地に配合することができる。或いは、液体培地に、必要量のキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを別々に添加し、良く撹拌することによって本発明の培地組成物を調製してもよい。一態様において、本発明の培地組成物は、ナノファイバーの濃度に関して、次の条件を満たす：
（１）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有されるキチンナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．５～２０（好ましくは、１：０．５～１０、１：０．７～９、１：１～８、１：２～７、または１：３～６）；
（２）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有されるキチンナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．５～２０（好ましくは、１：０．５～１０、１：０．７～９、１：１～８、１：２～７、または１：３～６）；
（３）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有されるキチンナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．５～２０（好ましくは、１：０．５～１０、１：０．７～９、１：１～８、１：２～７、または１：３～６）；
または、
（４）培地組成物中に含有される総ナノファイバー（キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバー）の濃度が、０．００６～０．０５％（ｗ／ｖ）であり、且つ、該培地組成物中に含有されるキチンナノファイバー：キトサンナノファイバーの重量比が１：０．５～２０（好ましくは、１：０．５～１０、１：０．７～９、１：１～８、１：２～７、または１：３～６）。
　また、キチンナノファイバーと多糖類を使用する場合は、次の濃度が例示され得るがこれらに限定されない：
　キチンナノファイバー：メチルセルロース＝０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）：０．０００４～０．４（ｗ／ｖ）（より好ましくは、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）：０．００１～０．０４％（ｗ／ｖ））
　キチンナノファイバー：脱アシル化ジェランガム＝０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）：０．０００１～０．１（ｗ／ｖ）（より好ましくは、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）：０．００１～０．０１％（ｗ／ｖ））
　キチンナノファイバー：アルギン酸ナトリウム＝０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）：０．０００４～０．４（ｗ／ｖ）（より好ましくは、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）：０．００１～０．０４％（ｗ／ｖ））
　キチンナノファイバー：タマリンドシードガム＝０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）：０．０００４～０．４％（ｗ／ｖ）（より好ましくは、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）：０．００１～０．０４％（ｗ／ｖ））
　キチンナノファイバー：ペクチン＝０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）：０．０００４～０．４％（ｗ／ｖ）（より好ましくは、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）：０．００１～０．０４％（ｗ／ｖ））
　キチンナノファイバー：カルボキシメチルセルロース＝０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）：０．０００４～０．４％（ｗ／ｖ）（より好ましくは、０．００１～０．０５％（ｗ／ｖ）：０．００１～０．０４％（ｗ／ｖ））
　また、理論に拘束されることを望むものではないが、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの配合割合が本発明の所望の効果を得るために重要であるとの事実は、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバー中のアセチル化されたグルコサミンの総量が重要であることを示唆していると考えられる。従って、本発明の一態様においては、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの２種類のナノファイバーの混合物を用いる代わりに、当該２種類のナノファイバー混合物中のアセチル基数に対応するアセチル基数を有する、アセチル化度が最適化された単一のポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンから調製されたナノファイバー（以下、「Ｎ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバー」等と称することがある）を用いることも可能である。従って、本発明は一態様において、特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーを含む、接着性細胞の浮遊培養用培地をも提供する。かかるポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンの特定のアセチル化度としては、通常５～７０％、好ましくは９～７０％、より好ましくは１１～５５％、さらに好ましくは１４～５０％、さらに好ましくは１６～５０％、特に好ましくは２２～３３％であり得るが、所望の効果を得られる限りこれらに限定されない。
　上述のような特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンは自体公知の方法により製造することができる。一例としては、アセチル化の割合が比較的高い（例、９０％以上）キチンを、アルカリ（例、濃ＮａＯＨ水溶液等）中で煮沸処理する等により脱アセチル化することで、所望のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンを製造する方法が挙げられるが、これに限定されない。
　かくして得られた特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンを、上述した方法により微細化（ナノファイバー化または解繊と称することもある）することにより、特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーを調製することができる。
　本発明の一態様において、Ｎ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーが液体培地組成物に添加され得る。Ｎ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーの液体培地組成物における濃度は、培地組成物中に含有される該ナノファイバーの濃度が、通常０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０００５～０．１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．００１～０．１％（ｗ／ｖ）、特に好ましくは０．００６～０．０６％（ｗ／ｖ）となるように液体培地に添加することができるが、所望の効果を得られる限りこれらに限定されない。
　本発明の培地組成物中に含まれる培地は、使用する接着性細胞の種類等により適宜選択することが可能であり、例えば、哺乳類の接着性細胞の培養を目的とする場合、哺乳類細胞の培養に一般的に使用される培地を、本発明の培地組成物に含まれる培地として使用することができる。哺乳類細胞用の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
　上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。哺乳類細胞の培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。哺乳類細胞用の培地に添加され得る成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加され得るサイトカインとしては、例えばインターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　培地に添加され得るホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　培地に添加され得る増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、マクロファージ炎症蛋白質－１α（ＭＩＰ－１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子－１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ－１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
　また、遺伝子組換え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、ＩＬ－６／可溶性ＩＬ－６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ　ＩＬ－６（ＩＬ－６と可溶性ＩＬ－６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。
　各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ラミニン－１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。
　培地に添加され得る抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β－ブロモペニシラン酸、β－クロロペニシラン酸、６－アセチルメチレン－ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノカルディシン、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。
　尚、上述した通り、本発明の培地組成物には血清および／または血清代替物を添加してもよいが、本発明の培地組成物を用いれば、培地中の血清および／または血清代替物を通常用いられる濃度（例、１０重量％）よりも低い濃度としても、細胞の維持および／または拡大が可能となる。本発明の培地組成物に添加する血清の濃度は、細胞の種類、培養条件、培養目的等により適宜設定すればよいが、一態様としては、本発明の培地組成物中の血清（及び／又は血清代替物）の濃度は、１５重量％以下、１０重量％以下、９重量％以下、８重量％以下、７重量％以下、６重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下、０．９重量％以下、０．８重量％以下、０．７重量％以下、０．６重量％以下、０．５重量％以下、０．４重量％以下、または０．３重量％以下とすることができる。尚、血清の濃度は、培養期間中、一定の濃度としてもよく、必要に応じて、培地交換時等に濃度を増減させてもよい。
　一態様において、細胞培養の目的が再生医療用の細胞分泌物の生産等である場合は、血清リスクを低減させるため本発明の培地組成物中の血清濃度を低く設定することが好ましい場合がある。かかる態様においては、本発明の培地組成物中の血清の濃度は、例えば、２重量％以下、１重量％以下、０．９重量％以下、０．８重量％以下、０．７重量％以下、０．６重量％以下、０．５重量％以下、０．４重量％以下、または０．３重量％以下とすることができる。
　別の一態様において、低血清濃度下において、維持・拡大培養する細胞数を最大化する場合、血清濃度は、通常０．０５～２．０重量％、好ましくは０．１～２．０重量％、さらに好ましくは０．２～２．０重量％、特に好ましくは０．２～１．０重量％とすることができる。
　また、別の一態様において、細胞分泌物の収量を最大化する場合の血清濃度の範囲としては、通常０．０５～２．０重量％、好ましくは０．１～１．５重量％、さらに好ましくは０．２～０．９重量％、特に好ましくは０．４～１．０重量％とすることができる。
　尚、低血清培地において細胞を維持培養および／または拡大培養する期間は、細胞の種類、培養条件、または培養目的に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１日以上、３日以上、５日以上、７日以上、９日以上、１１日以上、１３日以上、１５日以上、２０日以上、２５日以上、３０日以上、４０日以上、５０日以上、６０日以上、８０日以上、または１００日以上とすることができる。
　一態様において、培養期間は、１～２００日、１～１００日、１～８０日、１～６０日、１～５０日、１～４０日、１～３０日、１～２５日、１～２０日、１～１５日、１～１３日、１～１１日、１～９日、１～７日、１～５日、または１～３日とすることができる。より好ましい一態様において、培養期間は、好ましくは１０～６０日、より好ましくは１５～５０日、さらに好ましくは、２０日～５０日、特に好ましくは２５日～４０日とすることができる。
　上記キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類を、該培地組成物を用いて接着性細胞を浮遊培養に供した場合に、該接着性細胞を浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度となるように、適切な液体培地と混合することにより、上記本発明の培地組成物を製造することができる。
　好ましい態様において、上記キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類の水性溶媒中の分散液と、液体培地とを混合することにより、本発明の培地組成物を調製することができる。該分散液は、滅菌（オートクレーブ、ガンマ線滅菌等）されていてもよい。あるいは、該分散液と、粉末培地を水に溶かして調製した液体培地（培地の水溶液）とを混合した後に、滅菌して使用してもよい。該分散液と液体培地の滅菌は、混合する前に、別々に行ってもよい。水性溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。水性溶媒としては、水が好ましい。水性溶媒中には、適切な緩衝剤や塩が含まれていてもよい。上記ナノファイバーの分散液は、本発明の培地組成物を調製するための培地添加剤として有用である。
　混合比率は、特に限定されることはないが、ナノファイバーの分散液：液体培地（培地の水溶液）（体積比）が、通常１：９９～９９：１、好ましくは１０：９０～９０：１０、より好ましくは、２０：８０～８０：２０である。
　本発明において、細胞の浮遊とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態（非接着）であることをいい、細胞が沈降しているか否かは問わない。さらに、本発明において、細胞を培養する際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞が当該液体培地組成物中で分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、少なくとも５分以上、好ましくは、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、６日以上、２１日以上であるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
　好ましい態様において、本発明の培地組成物は、細胞の培養が可能な温度範囲（例えば、０～４０℃）の少なくとも１点において、細胞の浮遊静置が可能である。本発明の培地組成物は、好ましくは２５～３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞の浮遊静置が可能である。
　接着性細胞をキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類に付着した状態で培養することにより、接着性細胞を浮遊培養することができる。該浮遊培養は、上記本発明の培地組成物中で、接着性細胞を培養することにより実施することができる。キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類は、該ナノファイバーまたは多糖類に付着した細胞を培地中で浮遊させる効果（好ましくは浮遊静置させる効果）を示す。本発明の培地組成物において、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類は、溶解することも、培養容器に付着することもなく分散するので、該培地組成物中で接着性細胞を培養すると、接着性細胞は該ナノファイバーまたは多糖類に付着し、該培地組成物中に浮遊する。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞数を増やして培養することが可能である。また、従来の回転や振とう操作を伴う浮遊培養においては、細胞に対するせん断力が働くため、細胞の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合があるが、本発明の培地組成物を用いることにより振とう等の操作を要することなく細胞を分散した状態で培養し得るので、目的とする接着性細胞を細胞機能の損失無く容易かつ大量に浮遊培養することが期待できる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞を浮遊培養する際、細胞の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合があるが、本発明の培地組成物を用いることにより、浮遊培養した細胞を、その機能を損なうこと無く観察し、回収することが期待できる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合があるが、本発明の培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することが期待できる。
　キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類を用いて接着性細胞を浮遊培養する場合、本発明の培地組成物に対して別途調製した接着性細胞を添加し、均一に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は、得られた細胞懸濁液を静置状態にて培養してもよいし、必要に応じて回転、振とう或いは撹拌しながら培養してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。例えば、接着性細胞を継代培養から回収し、適切な細胞解離液を用いて単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、分散された接着性細胞を、本発明の培地組成物中に懸濁し、これを浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）に付す。
　細胞を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５～３９℃、好ましくは３３～３９℃（例、３７℃）である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４～１０体積％であり、４～６体積％が好ましい。培養期間は、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
　本発明の培地組成物中での接着性細胞の培養は、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。ナノファイバーに付着した接着性細胞が、培養容器へ接着しないよう、これらの培養容器は細胞低接着性であることが望ましい。細胞低接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、あるいは培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。
　培地交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより細胞を分離した後、新鮮な培地もしくは本発明の培地組成物を該細胞に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞を適宜濃縮した後、新鮮な培地もしくは本発明の培地組成物をこの濃縮液に添加すればよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。
　接着性細胞の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
　接着性細胞を、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類に付着させた状態において浮遊培養すると、接着性細胞が効率よく増殖するため、該浮遊培養は、接着性細胞の増殖方法として優れている。接着性細胞を、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類に付着させた状態において浮遊培養すると、接着性細胞は、培養容器の底面のみに偏在せずに、三次元的な広がりをもって分散し、増殖が促進される。その結果、増殖した細胞が、ぶどうの房状にナノファイバーまたは多糖類上に連なる状態となる。この増殖促進効果には、接着性細胞を浮遊させる（即ち、接着性細胞の培養容器への接着を回避する）のに十分な濃度のナノファイバーが培地組成物中に含まれていればよく、浮遊静置（即ち、外部からの圧力、振動、振とう、回転操作等を伴わずに細胞が液体培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にあること）が可能であることは必須ではない。
　接着性細胞を、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類に付着した状態で、浮遊培養し、該細胞を増殖する場合、該浮遊培養に用いる本発明の培地組成物中に含まれる培地として、該接着性細胞の形質を維持しながら、該細胞を増殖することができる培地が用いられる。該培地は、接着性細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。
　一態様において、哺乳動物の幹細胞（例、間葉系幹細胞）をキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類に付着させた状態において浮遊培養することにより、該細胞を増殖させる。該浮遊培養により、哺乳動物の幹細胞（例、間葉系幹細胞）を、その分化能やホーミング・遊走能を維持させながら増殖させることができる。従って、本発明の培地組成物を用いれば、高品質な幹細胞を調製することができる。なお、幹細胞が分化能や遊走能等の特性を維持しているかは、自体公知の方法によって判別することができる。簡潔には、幹細胞における未分化性に関する細胞マーカー（例、ＯＣＴ４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子等）や、遊走性に関する細胞マーカー（例、ＣＸＣＲ４遺伝子等）の発現量を、ｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質量レベルで決定することにより容易に判別することができる。
　接着性細胞を、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類に付着させた状態において浮遊培養する場合、培養容器からの細胞の剥離操作を要することなく、新鮮な培地もしくは本発明の培地組成物を当該浮遊培養物に単に添加するか、新鮮な培地もしくは本発明の培地組成物へ、当該浮遊培養物の全部又は一部を添加することのみで接着性細胞を継代することが可能である。この継代培養方法を用いることにより、接着性細胞を、培養容器からの細胞の剥離操作を行うことなく、継代培養することができる。また、この継代培養方法を用いることにより、培養容器からの細胞の剥離操作を行うことなく、接着性細胞の培養スケールを拡大することができる。培養容器からの細胞の剥離操作としては、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）及び／又はタンパク質分解酵素（例、トリプシン、コラゲナーゼ）による処理が挙げられる。上記継代培養方法は、培養容器からの細胞の剥離操作に感受性が高い接着性細胞（例えば、剥離操作により生存性が低下する接着性細胞、剥離操作により形質が変わりやすい接着性細胞）の継代培養に有利である。培養容器からの細胞の剥離操作に感受性が高い接着性細胞としては、幹細胞（例、間葉系幹細胞）、前駆細胞（例、前駆脂肪細胞）、初代培養細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の培地組成物を用いて増殖させた接着性細胞は、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β－１，３－グルカナーゼ等の分解酵素の１種以上を使用してキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを分解することで、該ナノファイバーと接着性細胞を剥離させた後に回収することができる。尚、Ｙａｔａｌａｓｅ（タカラバイオ）は、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、及びβ－１，３－グルカナーゼを含む混合物であり、キチンおよびキトサンの分解酵素として好適に用いることができる。
　例えば、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーに付着させた接着性細胞の懸濁液に対して、キチンおよびキトサンの分解酵素を添加し、混合物を、接着性細胞の剥離に十分な時間、インキュベートする。キチンおよびキトサンの分解酵素によるインキュベーション温度は、通常、２０℃～３７℃である。インキュベーション時間は、酵素の種類等にもよるが、通常、５～６０分である。
　ナノファイバーが分解し、接着性細胞がナノファイバーから剥離したら、懸濁液を遠心分離に付すことにより、剥離した接着性細胞を回収することができる。
　このようにして回収した接着性細胞は、ダメージが最小限に抑制されているので、機能解析や、移植等に好適に使用することができる。
２．接着性細胞の培養方法
　本発明はまた、接着性細胞を、（１）キチンナノファイバー；および（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；を含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、接着性細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」と称することがある）を提供する。
　本発明の培養方法は、上述した本発明の培地組成物を用いて接着性細胞を培養することを特徴とする。従って、本発明の培養方法における培地組成物、接着性細胞、培養条件等は、本発明の培地組成物で説明したものと同様である。尚、上述した通り、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを使用する態様は、当該２種類のナノファイバーの代わりにＮ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーを使用してもよい。
３．細胞分泌物を生産する方法
　本発明はまた、接着性細胞を、（１）キチンナノファイバー；および（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；を含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、細胞分泌物を生産する方法（以下、「本発明の生産方法」と称することがある）を提供する。尚、上述した通り、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを使用する態様は、当該２種類のナノファイバーの代わりにＮ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーを使用してもよい。
　本発明の生産方法は、上述した本発明の培地組成物を用いて接着性細胞を培養することを特徴とする。従って、本発明の培養方法における培地組成物、接着性細胞、培養条件等は、本発明の培地組成物で説明したものと同様である。
　本発明の生産方法において用いられる接着性細胞は、細胞分泌物を生産するものであれば特に限定されないが、一態様において、接着性細胞は間葉系幹細胞であり得る。尚、かかる間葉系幹細胞の由来は、骨髄、脂肪細胞、臍帯、及び歯髄等のいずれであってもよい。
　本発明の生産方法における細胞分泌物は、低分子化合物、タンパク質、核酸（ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ等）、及び、細胞分泌小胞（以下参照）等の細胞が分泌するあらゆる物質が含まれ得る。
　本発明の生産方法により生産される細胞分泌物には、例えば、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、塩基性線維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)、Tumor necrosis factor-stimulated gene-6 (ＴＳＧ－６)、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)、トランスフォーミング増殖因子β(ＴＧＦ－β)、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子(ＩＧＦ)、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ)、神経成長因子（ＮＧＦ）、アンジオポエチン－１等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、細胞分泌小胞とは、典型的には細胞から放出される、電子顕微鏡で確認することができるサイズを有する小胞を意味する。かかる細胞分泌小胞のサイズは、平均粒子径において、１～１，０００ｎｍ、１０～５００ｎｍ、または３０～２００ｎｍであり得る。ここで、平均粒子径とは、動的光散乱法または電子顕微鏡での測定による各粒子の直径の平均値である。かかる細胞分泌小胞は生体分子を囲む脂質二重層から構成され得る。
　かかる細胞分泌小胞の具体例としては、例えば、膜粒子、膜小胞、微小胞、ナノ小胞、微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ、平均粒子径３０～１，０００ｎｍ）、エクソソーム様小胞、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ、平均粒子径３０～２００ｎｍ）、エクトソーム様小胞、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）またはエキソベシクル等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の生産方法の好ましい一態様において、細胞分泌小胞はエクソソームであり得る。
　尚、本発明の生産方法の一態様において、細胞分泌物の生産を開始および/または促進するための化合物を添加してもよい。細胞分泌物の生産を開始および/または促進するための化合物は、生産しようとする細胞分泌物に合わせて公知の物を選択すればよい。かかる化合物には、ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γ、及びインターロイキン-１β(ＩＬ－１β)が含まれるが、これらに限定されない。一例としては、細胞分泌物がＰＧＥ２またはＴＳＧ－６である場合は、ＴＮＦ－αを培地組成物に添加することが好適であり得る。また、細胞分泌物がＰＧＥ２やＩＤＯである場合は、ＩＦＮ－γを培地組成物に添加することが好適であり得る。尚、細胞分泌物の生産を開始および/または促進するための化合物の培地組成物への添加濃度は、所望の効果を得られる限り特に限定されず、生産しようとする細胞分泌物と該化合物の組み合わせ等に基づいて、適宜決定すればよい。
　また、本発明の生産方法の別の一態様において、細胞分泌物の生産量を増加させるために、本発明の生産方法において用いられる細胞や培養条件を適宜最適化してもよい。一例としては、低酸素条件に暴露された接着細胞(例、間葉系幹細胞)を本発明の製造方法に用いることが好適である場合がある(J Cell Mol Med. 2018 Mar;22(3):1428-1442を参照)。細胞および/または培養条件のかかる最適化は自体公知のいかなる技術を用いてもよい。
　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
（試験例１：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いた３Ｄ培養におけるヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の増殖）
　ＷＯ２０１５／１１１６８６に開示される製造方法に準じて調製したαキチンナノファイバー（Ｎ－アセチルグルコサミンの割合：９５％以上）またはキトサンナノファイバー（Ｎ－アセチルグルコサミンの割合：２０％以下）（バイオマスナノファイバーＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス）２質量％、株式会社スギノマシン）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、転倒混和により分散し、本水溶液を１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。用いたαキチンナノファイバーは、２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したαキチンナノファイバー（サンプル１）である。また、キトサンナノファイバーは、２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したキトサンナノファイバー（サンプル２）である。さらにサンプル１とサンプル２の比率（体積）が、５０％：５０％（サンプル３）、３３％：６７％（サンプル４）、２５％：７５％（サンプル５）、２０％：８０％（サンプル６）、１５％：８５％（サンプル７）、１０％：９０％（サンプル８）、５％：９５％（サンプル９）、１％：９９％（サンプル１０）になるようにサンプル１とサンプル２を混合し、キチンナノファイバー／キトサンナノファイバー混合物（サンプル３～１０）を得た。
　血清培地である間葉系幹細胞増殖培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル１～１０を様々な終濃度（終濃度：０．０００６％（ｗ／ｖ）、０．００２％（ｗ／ｖ）、０．００６％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ））で添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１１）を調製した。引き続き、培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）を、１３３３３細胞／ｍＬとなるように上記の各培地組成物に懸濁した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）に１５０μＬ／ウェルで播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で１０日間培養した。播種後４、８日目の時点の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（３点の平均値）を算出した。
　その結果、αキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を含む培地組成物を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞を９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレートで培養すると、培地組成物中に含有されるαキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの総量のうち、αキチンナノファイバーが５重量％以上であれば、細胞増殖促進効果を示した。また、培地組成物中に含有されるαキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの総量のうち、αキチンナノファイバーが２５重量％以上である場合、αキチンナノファイバー単独添加の場合と比較して、同等レベルの細胞増殖促進効果を示した。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表１、表２および表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（試験例２：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いた３Ｄ培養におけるヒト骨髄組織由来間葉系幹細胞の増殖）
　ＷＯ２０１５／１１１６８６に準じて調製したαキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー（バイオマスナノファイバーＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス）２質量％、株式会社スギノマシン）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、転倒混和により分散し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。用いたαキチンナノファイバーは、２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したαキチンナノファイバー（サンプル１）である。またキトサンナノファイバーは、２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したキトサンナノファイバー（サンプル２）である。さらにサンプル１とサンプル２の比率（体積）が、５０％：５０％（サンプル３）、３３％：６７％（サンプル４）、２０％：８０％（サンプル６）になるようにサンプル１とサンプル２を混合し、キチンナノファイバー／キトサンナノファイバー混合物（サンプル３、４、６）を得た。
　血清培地である間葉系幹細胞増殖培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル１～４、６を様々な終濃度（終濃度：０．０００６％（ｗ／ｖ）、０．００２％（ｗ／ｖ）、０．００６％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ））で添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１１）を調製した。引き続き、培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）を、１３３３３細胞／ｍＬとなるように上記の各培地組成物に懸濁した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）に１５０μＬ／ウェルで播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で１０日間培養した。７日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（３点の平均値）を算出した。
　その結果、αキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を含む培地組成物を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞を９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレートで培養すると、培地組成物中に含有されるαキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの総量のうち、αキチンナノファイバーが２０重量％以上であれば、αキチンナノファイバーのみの場合（即ち、サンプル１）と比較して、同等の細胞増殖促進効果を示した。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（試験例３：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いた３Ｄ培養におけるヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞の連続拡大培養）
　ＷＯ２０１５／１１１６８６に準じて調製したαキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー（バイオマスナノファイバーＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス）２質量％、株式会社スギノマシン）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、転倒混和により分散し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。ブレンドに用いたのは、２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したαキチンナノファイバー（サンプル１）と２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したキトサンナノファイバー（サンプル２）である。さらにサンプル１とサンプル２の比率（体積）が、５０％：５０％（サンプル３）、２５％：７５％（サンプル４）、２０％：８０％（サンプル６）、１５％：８５％（サンプル７）になるようにサンプル１とサンプル２を混合し、キチンナノファイバー／キトサンナノファイバー混合物（サンプル３、４、６、７）を得た。
　血清培地である間葉系幹細胞増殖培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル１～４、６、７を、０．００６％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した。なお、調製した培地組成物中のキチンナノファイバー及び／又はキトサンナノファイバーの終濃度は次の通りである：
　（１）サンプル１を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．００６％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０％（ｗ／ｖ））
　（２）サンプル２を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．００６％（ｗ／ｖ））
　（３）サンプル３を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．００３％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．００３％（ｗ／ｖ））
　（４）サンプル４を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．００１５％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．００４５％（ｗ／ｖ））
　（５）サンプル６を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．００１２％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．００４８％（ｗ／ｖ））
　（６）サンプル７を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０００９％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．００５１％（ｗ／ｖ））
　引き続き、培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）を、１３３３３細胞／ｍＬとなるように上記の各培地組成物に懸濁した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）に１５０μＬ／ウェルで播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で５日間培養した。播種時（０日目）と播種後５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（３点の平均値）を算出した。
　播種後５日目において、ピペッティングによる細胞が接着したナノファイバーを分散させ、その懸濁液を９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレートからそれぞれ回収し、新しい各サンプル（０．００６％）を含んだ間葉系幹細胞増殖培地６００μＬにピペッティングで混合し、２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７３）に全量／ウェルで播種した（２４ウェルマイクロプレート播種０日目）。２４ウェルマイクロプレート播種後５日目と１０日目の細胞培養液は、１.５ｍＬチューブにそれぞれ回収し、２８００ｇ、３分間遠心することで、細胞・ナノファイバー部分を沈降させた。細胞・ナノファイバーのペレットに対し、間葉系幹細胞増殖培地１５０μＬとＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（３点の平均値）を算出した。
　２４ウェルマイクロプレート播種後１０日目において、ピペッティングによる細胞が接着したナノファイバーを分散させ、その懸濁液を２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレートからそれぞれ回収し、新しい各サンプル（０．００６％）を含んだ間葉系幹細胞増殖培地３０００μＬにピペッティングで混合し、６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７１）に全量／ウェルで播種した（６ウェルマイクロプレート播種０日目）。
　６ウェルマイクロプレート播種後８日目の細胞培養液は、ピペッティングにより懸濁させ、蒸発分も考慮して間葉系幹細胞増殖培地を添加することで３５００μＬに全量を合わせた。５００μＬの細胞培養液とＡＴＰ試薬５００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（３点の平均値）を算出した。また最終的なＡＴＰ値は全量の３５００μＬになるように換算した。
　その結果、培地組成物中に含有されるαキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの総量のうち、αキチンナノファイバーが１５重量％～５０重量％である、αキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを含有する培地組成物を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞を培養すると、ファイバー同士の緩やかな凝集とピペッティングによる分散を繰り返すことが可能であった。また新鮮なαキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを含有する培地組成物を加えることで、トリプシンを使用せず拡大培養が可能であった。特に培地組成物中に含有されるαキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの総量のうち、αキチンナノファイバーが１５重量％～２０重量％の場合は、連続拡大培養時においてナノファイバー上でのヒト脂肪由来間葉系幹細胞凝集化による細胞増殖速度低下が起こりにくく、６穴プレートでも良好な増殖促進作用を示した。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（試験例４：キトサンナノファイバーもしくはキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いた３Ｄ培養におけるヒト脂肪由来間葉系幹細胞の幹細胞マーカー発現変動）
　ＷＯ２０１５／１１１６８６に準じて調製したαキチンナノファイバーまたはキトサンナノファイバー（バイオマスナノファイバーＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス）２質量％、株式会社スギノマシン）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、転倒混和により分散し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。用いたαキチンナノファイバーは、２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したαキチンナノファイバー（サンプル１）である。またキトサンナノファイバーは、２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化したキトサンナノファイバー（サンプル２）である。さらにサンプル１とサンプル２の比率（体積）が、５０％：５０％（サンプル３）、３３％：６７％（サンプル４）、２５％：７５％（サンプル５）になるようにサンプル１とサンプル２を混合し、キチンナノファイバー／キトサンナノファイバー混合物（サンプル３～５）を得た。間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル１～５を、０．０１５％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１１）を調製した。なお、調製した培地組成物中のキチンナノファイバー及び／又はキトサンナノファイバーの終濃度は次の通りである：
　（１）サンプル１を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０１５％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０％（ｗ／ｖ））
　（２）サンプル２を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．０１５％（ｗ／ｖ））
　（３）サンプル３を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．００７５％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．００７５％（ｗ／ｖ））
　（４）サンプル４を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．００５％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．０１％（ｗ／ｖ））
　（５）サンプル５を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．００３７５％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．０１１２５％（ｗ／ｖ））
　引き続き、培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）を、５００００細胞／ｍＬとなるように上記のキチン及び／又はキトサンナノファイバーを添加した培地組成物あるいは未添加培地組成物に播種した後、６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７１、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり２ｍＬになるように分注した。また、比較対象として２５０００細胞／ｍＬを未添加培地組成物に播種した後、６ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５１６、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり２ｍＬになるように分注した（サンプル１２）。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、６日間継続した。６日目に細胞を回収し、ＲＬＴ溶液を３５０μＬ（ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃７４１０６）を添加し、ＲＮＡ抽出溶液とした。ＲＮＡ抽出溶液に７０％エタノールを３５０μＬ加えた後、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。さらに５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで２分間遠心した。ＲＮｅａｓｙスピンカラム中に存在するＲＮＡにＲＮａｓｅフリー溶液を添加し、溶出させた。次に、得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３７Ａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡとＰｒｅｍｉｘ　ＥＸ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３９Ａ）、Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）としては、ＯＣＴ４はＨｓ０４２６０３６７＿ｇＨ、ＳＯＸ２はＨｓ０１０５３０４９＿ｓ１、ＮＡＮＯＧはＨｓ０４３９９６１０＿ｇ１、ＣＸＣＲ４はＨｓ００６０７９７８　ｓ１，ＧＡＰＤＨはＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１を用いた。機器はリアルタイムＰＣＲ７５００を使用した。解析は各目的遺伝子の値をＧＡＰＤＨの値で補正した相対値を算出し、比較した。
　その結果、キトサンナノファイバーおよびαキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を含む培地組成物を用いて、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を６ウェル平底超低接着表面マイクロプレートで培養することで未分化性を示すＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ遺伝子とホーミングに関わる遊走性を示すＣＸＣＲ４遺伝子の相対的な発現量の上昇が認められた。一方、接着プレートで単層培養した条件や、キチンナノファイバーのみを用いて低接着プレートで３Ｄ培養した条件では、これら遺伝子の明確な発現量の増加は認めなかった。各遺伝子発現の相対値を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　尚、試験例１～４（および、後述する試験例５、６、７）で使用した各種解繊条件（圧力・解砕回数）で調製されるαキチンナノファイバー分散液およびキトサンナノファイバー分散液の物性値（αキチンまたはキトサンの実測濃度、粘度、メジアン粒子径、平均粒子径等）を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（試験例５：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いた３Ｄ培養におけるヒト臍帯由来間葉系幹細胞の連続拡大培養）
　血清培地である間葉系幹細胞増殖培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル６を、０．０５％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した（ここで調製した培地組成物を、以下、「ナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地」と称することがある）。なお、調製したナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地中のキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーの終濃度は次の通りである：キチンナノファイバー：０．０１％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．０４％（ｗ／ｖ）。
　引き続き、培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７１、タカラバイオ社製）を、１５０００細胞／ｍＬとなるように上記のナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地に懸濁した後、６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７１）に１０ｍＬ／ウェルで播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。培養の際、ナノファイバーと接着した細胞は、培養ウェルの底に沈殿したが、培養ウェルの表面との接着は生じていなかった。３日目に、ナノファイバー/細胞の沈殿物を実質的に含まないウェル中の培地上清を約５ｍＬ除去し、新鮮なナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地を５ｍＬ添加し、ピペットにより懸濁して、培養を７日目まで継続した。播種時（０日目）と播種後７日目の培養液３００μＬに対してＡＴＰ試薬３００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（２点の平均値）を算出した。
　播種後７日目において、ピペッティングにより細胞が接着したナノファイバーを分散させ、その懸濁液を６ウェル平底超低接着表面マイクロプレートから回収し、新鮮なナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地（４０ｍＬ）にピペッティングで混合し、１２５ｍＬフラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｃ社製、４１１５－０１２５）に全量／フラスコで播種し培養した。１０日目にフラスコ中の培地を約２５ｍＬ除去し、新鮮なナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地を２５ｍＬ添加しピペットにより懸濁し、培養を播種後１４日目まで継続した。１２５ｍＬフラスコ拡大後７日目の細胞培養液５００μＬに対してＡＴＰ試薬５００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（２点の平均値）を算出した。またフラスコにおける最終的なＡＴＰ値は、６ウェルからフラスコへの拡大比率（５倍）を用いて換算した。
　その結果、αキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを含有する培地組成物を用いてヒト臍帯由来間葉系幹細胞を培養すると、ファイバー同士の緩やかな凝集とピペッティングによる分散を繰り返すことが可能であった。また新鮮なαキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを含有する培地組成物を加えることで、トリプシンを使用せず拡大培養が可能であった。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（試験例６：キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含有する培地組成物を用いたヒト臍帯由来間葉系幹細胞の低血清濃度での浮遊培養と、連続的な細胞分泌物の回収１）
　試験例５において、αキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを含有する培地組成物（即ち、ナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地）を用いてヒト臍帯由来間葉系幹細胞を培養した１４日目の１２５ｍＬフラスコ培養液を使用した。１４日目にフラスコ中のナノファイバー/細胞の沈殿物を実質的に含まない培地上清を約２５ｍＬ除去し、新鮮なＤＭＥＭ培地（０４４－２９７６５、富士フイルム和光純薬株式会社、ナノファイバーおよび血清を含まない）を２５ｍＬ添加し、ピペットにより懸濁し、培養を１７日目まで継続した。さらに１７日目にフラスコ中のナノファイバー/細胞の沈殿物を実質的に含まない培地上清を約２５ｍＬ回収し、ウェルに新鮮なＤＭＥＭ培地（０４４－２９７６５、富士フイルム和光純薬株式会社、ナノファイバーおよび血清を含まない）を２５ｍＬ添加し、ピペットにより懸濁し、培養を２１日目まで継続した。その後は２４、２８、３１、３５日目に、フラスコ中の培地上清を約２５ｍＬ回収し、ウェルに新鮮なＤＭＥＭ培地：間葉系幹細胞増殖培地（３：１）（いずれの培地もナノファイバーを含まない）を２５ｍＬ添加し、ピペットにより懸濁し培養を３５日目まで継続した。
　２１、２４、２８、３１、３５日目において、回収した培地上清は遠心(４００ｇ、３分間)後、培養上清を回収した。回収した培養上清は使用時まで－８０℃に保管した。また遠心後のペレット（ナノファイバー／細胞等）は細胞培養中のフラスコに戻し、フラスコによる培養を継続した。即ち、上記される全工程を通して、培地中のナノファイバー濃度は常に一定である。
　１４、２１、２８、３５日目において、１２５ｍＬフラスコの細胞培養液５００μＬに対してＡＴＰ試薬５００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（２点の平均値）を算出した。
［酵素抗体法によるエクソソーム産生量の測定］
　各培養上清中（１７、２１、２４、２８、３１、３５日目）のエクソソーム産生量を酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）を用いて測定した。測定にはＰＳ　ＣａｐｔｕｒｅTM　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（和光純薬社製、＃２９７－７９２０１）を用いた。Eｘｏｓｏｍｅ　Ｃａｐｔｕｒｅ　９６　Ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を３回繰り返した。10倍希釈した培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、マイクロプレート振とう器を用いて室温で２時間反応させた。反応終了後、反応液を捨て、各ウェルに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を３回繰り返した。検出用コントロール抗ＣＤ６３抗体反応液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、マイクロプレート振とう器を用いて室温で１時間反応させた。反応終了後、反応液を捨て、各ウェルに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を３回繰り返した。検出用２次抗体反応液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、マイクロプレート振とう器を用いて室温で１時間反応させた。反応終了後、反応液を捨て、各ウェルに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を５回繰り返した。ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で３０分反応させた。反応後、Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプルの吸光度値は４５０ｎｍの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を減じた値（△Abs）とした。
　その結果、αキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを含有する培地組成物上で増殖したヒト臍帯由来間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞培地の比率が２５％である低血清培地でも３５日目まで生細胞数が維持していた。また各培養上清中のＣＤ６３値（エクソソーム）は、間葉系幹細胞培地の比率が５０％であるよりも２５％にしたほうが生産量は高かった。また２５％の低血清培地で培養を継続するほど生産量が増加していた。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表９に、CD63による△Abs値を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（試験例７：キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含有する培地組成物を用いたヒト臍帯由来間葉系幹細胞の段階的な低血清化における浮遊培養と、細胞分泌物の回収２）
　血清培地である間葉系幹細胞増殖培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル３および６を、０．０５％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した（ここで調製した培地組成物を、以下、「ナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地」と称することがある）。なお、調製したナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地中のキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーの終濃度は次の通りである：
　（１）サンプル３を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０２５％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．０２５％（ｗ／ｖ））
　（２）サンプル６を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０１％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．０４％（ｗ／ｖ））
　引き続き、培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７１、タカラバイオ社製）を、１５０００細胞／ｍＬとなるように上記のナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地に懸濁した後、２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７３）に１．２ｍＬ／ウェルで播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。培養の際、ナノファイバーと接着した細胞は、培養ウェルの底に沈殿したが、培養ウェルの表面との接着は生じていなかった。３日目にウェル中のナノファイバー/細胞の沈殿物を実質的に含まない培地上清を約０．６ｍＬ除去し、間葉系幹細胞増殖培地を０．６ｍＬ添加し、ピペットにより懸濁して、培養を６日目まで継続した。播種後６日目において、ピペッティングにより細胞が接着したナノファイバーを分散させ、その懸濁液を２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレートから回収し、新鮮なナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地（８．４ｍＬ）にピペッティングで混合し、６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７３）に９．６ｍＬ／ウェルで播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で４日間培養した。１０日目にウェル中の培地上清を約５ｍＬ除去し、間葉系幹細胞増殖培地（ナノファイバーを含まない）を５ｍＬ添加しピペットにより懸濁し培養を１４日目まで継続した。播種後１４日目において、ピペッティングにより細胞が接着したナノファイバーを分散させ、その懸濁液を６ウェル平底超低接着表面マイクロプレートから回収し、新鮮なナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地（約４０ｍＬ）にピペッティングで混合し、１２５ｍＬフラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｃ社製、４１１５－０１２５）に全量／フラスコで播種し培養した。１７日目にフラスコ中の培地上清を約２５ｍＬ除去し、新鮮な間葉系幹細胞増殖培地（ナノファイバーを含まない）を２５ｍＬ添加しピペットにより懸濁し、培養を播種後２０日目まで継続した。
　２０日目にフラスコ中の培地上清を約２５ｍＬ除去し、新鮮なＤＭＥＭ培地（０４４－２９７６５、富士フイルム和光純薬株式会社、ナノファイバーおよび血清を含まない）を２５ｍＬ添加し、ピペットにより懸濁し、培養を２３日目まで継続した。さらに２３日目にフラスコ中の培地上清を約２５ｍＬ回収し、ウェルに新鮮なＤＭＥＭ培地（０４４－２９７６５、富士フイルム和光純薬株式会社、ナノファイバーおよび血清を含まない）を２５ｍＬ添加しピペットにより懸濁し、培養を２６日目まで継続した。その後は２９、３２、３５日目にフラスコ中の培地上清を約２５ｍＬ回収し、ウェルに新鮮なＤＭＥＭ培地（ナノファイバーおよび血清を含まない）を２５ｍＬ添加しピペットにより懸濁し培養を３５日目まで継続した。
　２６、２９、３２、３５日目において、回収した培地は遠心(４００ｇ、３分間)後、培養上清を回収した。回収した培養上清は使用時まで－８０℃に保管した。また遠心後のペレット（ナノファイバー／細胞等）は細胞培養中のフラスコに戻し、フラスコによる培養を継続した。即ち、上記される全工程を通して、培地中のナノファイバー濃度は常に一定である。
　２６、２９、３２、３５日目において、１２５ｍＬフラスコの細胞培養液５００μＬに対してＡＴＰ試薬５００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数（２点の平均値）を算出した。
［酵素抗体法によるエクソソーム産生量の測定］
　各培養上清中（２６、２９、３２、３５日目）のエクソソーム産生量を酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）を用いて測定した。測定にはＰＳ　ＣａｐｔｕｒｅTM　Ｅｘｏｓｏｍｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（和光純薬社製、＃２９７－７９２０１）を用いた。Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｃａｐｔｕｒｅ　９６　Ｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を３回繰り返した。１０倍希釈した培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、マイクロプレート振とう器を用いて室温で２時間反応させた。反応終了後、反応液を捨て、各ウェルに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を３回繰り返した。検出用コントロール抗CD６３抗体反応液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、マイクロプレート振とう器を用いて室温で１時間反応させた。反応終了後、反応液を捨て、各ウェルに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を３回繰り返した。検出用２次抗体反応液を１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、マイクロプレート振とう器を用いて室温で１時間反応させた。反応終了後、反応液を捨て、各ウェルに反応/洗浄液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加する操作を５回繰り返した。ＴＭＢ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で３０分反応させた。反応後、Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４５０ｎｍ及び６２０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプルの吸光度値は４５０ｎｍの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を減じた値（△Abs）とした。
　その結果、αキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーを含有する培地組成物上で増殖したヒト臍帯由来間葉系幹細胞に対し、段階的にＤＭＥＭ培地添加により低血清培地にすると、血清を含む間葉系幹細胞培地の比率が６．２５％になると生細胞数は低下していた。一方、各培養上清中のＣＤ６３値（エクソソーム）に関しては、低血清化になるほど生産量は減少しており、間葉系幹細胞培地の比率が２５％（即ち、血清濃度が０．５重量％）の条件が最も生産量は高かった。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表１１に、ＣＤ６３による△Abs値を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（試験例８：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いたヒト骨髄由来及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞の３Ｄ培養におけるＰＧＥ２産生量）
　間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）にキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物（終濃度：０．０５％（ｗ／ｖ））（サンプル６）、そして上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１２）を調製した。引き続き、培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７４、タカラバイオ社製）を４００００細胞／ｍＬ、また、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７１、タカラバイオ社製）を８００００細胞／ｍＬとなるように上記のキチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物あるいは未添加培地組成物に播種した後、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。また、比較対象として２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）もしくは６ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５１６、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬもしくは２ｍＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、２日間継続した。２日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を回収した。培養上清を除いた後、１ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地もしくは終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（＃２１０－ＴＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を含む間葉系幹細胞増殖培地２培地を１５ｍＬチューブに添加し、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに戻した。２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）は培地を除去後に１ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地もしくは終濃度１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを含む間葉系幹細胞増殖培地２培地を添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１日間継続した。１日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を回収した。この際に細胞数の評価を行うために、ＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を培養上清回収後の各サンプルに添加して懸濁させ、１０分間室温で静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。続いて、回収した培養上清中に含まれるＰＧＥ２に関して、ＰＧＥ２　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（＃ＡＤＩ－９００－００１、Ｅｎｚｏライフサイエンス社製）を用いて定量を行った。Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈したｓｔａｎｄａｒｄ及び培養上清１００μＬをキットに付属の９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。続いて、５０μＬのｂｌｕｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅを各ウェルに添加した。さらに５０μＬのｙｅｌｌｏｗ　ａｎｔｉｂｏｄｙを各ウェルに添加し、室温条件下で２時間振とうした。引き続き、溶液を捨て、ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを４００μＬ／ｗｅｌｌで添加した後、溶液を捨てた。上記操作を３回繰り返した。２００μＬのｐＮｐｐ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに添加し、室温条件下で４５分間振とうした。最後に５０μＬのｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して反応を止め、４０５ｎｍの吸光度を測定した。各サンプル中に含まれるＰＧＥ２濃度は検量線の４パラメーターロジスティック回帰より算出した。細胞数あたりの分泌量を算出するために、算出されたＰＧＥ２量を発光強度で除した相対値を算出した。
　その結果、キチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物と低接着プレートを組み合わせた３Ｄ培養の方が、未添加培地組成物と接着プレートで単層培養した場合と比較してＰＧＥ２分泌量の相対値が増加した。また、ＴＮＦ－α処置を比較した場合においてもキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物で低接着プレートと組み合わせた３Ｄ培養の方が、未添加培地組成物と接着プレートで単層培養した場合よりも多かった。ヒト骨髄由来及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞の各サンプルにおける相対値を表１３及び表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（試験例９：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いたヒト骨髄由来及びヒト脂肪由来間葉系幹細胞の３Ｄ培養におけるｂＦＧＦ産生量）
　間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）にキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物（終濃度：０．０５％（ｗ／ｖ））（サンプル６）、そして上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１２）を調製した。引き続き、培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７４、タカラバイオ社製）を８００００細胞／ｍＬ、また、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）を１０００００細胞／ｍＬとなるように上記のキチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物あるいは未添加培地組成物に播種した後、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。また、比較対象として２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、２日間継続した。２日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を除いた。続いて１ｍＬの１７％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地を添加し、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに戻した。未添加培地組成物は間葉系幹細胞増殖培地２培地を除去後に１ｍＬの１７％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地を２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）に添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１日間継続した。１日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を回収した。この際に細胞数の評価を行うために、ＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を培養上清回収後の各サンプルに添加して懸濁させ、１０分間室温で静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。続いて、回収した培養上清中に含まれるｂＦＧＦに関して、ｂＦＧＦ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（＃ＥＬＨ－ｂＦＧＦ－１、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて定量を行った。１００μＬのｓｔａｎｄａｒｄもしくはサンプル溶液をｗｅｌｌに添加し、２．５時間室温で振とうした。引き続き、溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を４回繰り返した。１００μＬの１ｘ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙを添加し、１時間室温で振とうした。溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を４回繰り返した。１００μＬのＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、４５分間室温で振とうした。続いて、溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を４回繰り返した。１００μＬのＴＭＢ　Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｒｅａｇｅｎｔを添加し、３０分間室温、暗所で振とうした。最後に５０μＬのｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプル中に含まれるｂＦＧＦ濃度は検量線の４パラメーターロジスティック回帰より算出した。細胞数あたりの分泌量を算出するために、算出されたｂＦＧＦ量を発光強度で除した相対値を算出した。
　その結果、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞もしくはヒト脂肪由来間葉系幹細胞いずれにおいても、キチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物と低接着プレートを組み合わせた３Ｄ培養の方が、未添加培地組成物と接着プレートで単層培養した場合と比較してｂＦＧＦ分泌量の相対値が増加した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞もしくはヒト脂肪由来間葉系幹細胞における相対値を表１５及び表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（試験例１０：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いたヒト骨髄由来及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞の３Ｄ培養におけるＴＳＧ－６産生量）
　間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）にキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物（終濃度：０．０５％（ｗ／ｖ））（サンプル６）、そして上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１２）を調製した。引き続き、培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７４、タカラバイオ社製）を、８００００細胞／ｍＬ、また、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７１、タカラバイオ社製）を４００００細胞／ｍＬとなるように上記のキチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物あるいは未添加培地組成物に播種した後、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。また、比較対象として６ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５１６、コーニング社製）もしくは２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、２日間継続した。２日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を除いた。培養上清を除いた後、１ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地もしくは終濃度１０ｎｇ／ｍＬもしくは２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－α（＃２１０－ＴＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）を含む間葉系幹細胞増殖培地２培地を１５ｍＬチューブに添加し、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに戻した。２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）は培地を除去後に１ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地もしくは終濃度１０ｎｇ／ｍＬもしくは２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを含む間葉系幹細胞増殖培地２培地を添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１日間継続した。１日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を回収した。この際に細胞数の評価を行うために、ＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を培養上清回収後の各サンプルに添加して懸濁させ、１０分間室温で静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。続いて、回収した培養上清中に含まれるＴＳＧ－６に関して、ＥＬＩＳＡを用いて定量を行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ　ｆｌａｔ　ｂｏｔｔｏｍ（＃４４－２４０４－２１、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に０．２Ｍ炭酸―重炭酸緩衝液（ｐＨ９．２）で１０μｇ／ｍＬに希釈したＴＳＧ－６抗体（＃ｓｃ－６５８８６、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）を５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で２４時間静置した。２４時間後、Ｄ－ＰＢＳ（－）（＃０４３－２９７９１、富士フイルム和光純薬株社製）にＴｗｅｅｎ‐２０（＃Ｐ７９４９、シグマアルドリッチ社製）を終濃度０．０５％（ｖ／ｖ）となるように添加したＰＢＳＴ溶液を３００μＬ添加後、除去した。本操作を３回繰り返した。ＢＳＡ（＃Ａ２１５３、シグマアルドリッチ社製）を５％含有させたＰＢＳＴ溶液を１００μＬ添加し、室温で３０分間静置した。溶液を廃棄後、３００μＬのＰＢＳＴ溶液を添加、除去した。本操作を３回繰り返した。続いて、検量線用に調製したＴＳＧ－６（＃２１０４－ＴＳ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び評価サンプルを５０μＬ各ウェルに添加し、室温で２時間静置した。溶液を廃棄後、３００μＬのＰＢＳＴ溶液を添加し、除去した。本操作を３回繰り返した。ＰＢＳＴで５μｇ／ｍＬに希釈したＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ａｎｔｉ　ｈｕｍａｎ　ＴＳＧ－６抗体（＃ＢＡＦ２１０４、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）の溶液を５０μＬ添加し、室温で１２０分間静置した。溶液を廃棄後、３００μＬのＰＢＳＴ溶液を添加し、除去した。本操作を３回繰り返した。ＰＢＳＴ溶液で２００ｎｇ／ｍＬに希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（＃ａｂ７４０３、Ａｂｃａｍ社製）の溶液を５０μＬ添加し、室温で３０分間静置した。溶液を廃棄後、３００μＬのＰＢＳＴ溶液を添加し、除去した。本操作を３回繰り返した。１００μＬのｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃５２－００－０３、ＫＰＬ社製）を添加し、１５分間室温で静置した。最後に１００μＬのｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（＃５０－８５－０６、ＫＰＬ社製）を添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプル中に含まれるＴＳＧ－６濃度は検量線の４パラメーターロジスティック回帰より算出した。細胞数あたりの分泌量を算出するために、算出されたＴＳＧ－６量を発光強度で除した相対値を算出した。
　その結果、キチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物と低接着プレートを組み合わせた３Ｄ培養の方が、未添加培地組成物と接着プレートで単層培養した場合と比較してＴＳＧ－６分泌量の相対値が増加した。また、各サンプルにおけるｃｏｎｔｒｏｌとＴＮＦ－α処置を比較した際の増加率もキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物で低接着プレートと組み合わせた３Ｄ培養の方が、未添加培地組成物と接着プレートで単層培養した場合よりも多かった。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞及びヒト臍帯由来間葉系幹細胞の各サンプルにおける相対値を表１７及び表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（試験例１１：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を用いたヒト骨髄由来の３Ｄ培養におけるＶＥＧＦ産生量）
　間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）にキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物（終濃度：０．０５％（ｗ／ｖ））（サンプル６）、そして上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１２）を調製した。引き続き、培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７４、タカラバイオ社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記のキチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物あるいは未添加培地組成物に播種した後、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）に、未添加培地組成物は２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、２日間継続した。２日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を除いた。続いて１ｍＬの１７％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地を添加し、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物は２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに戻した。未添加培地組成物は間葉系幹細胞増殖培地２培地を除去後に１ｍＬの１７％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地を２４ウェル平底接着表面マイクロプレート（＃３５２６、コーニング社製）に添加した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１日間継続した。１日目にそれぞれのウェルから、キチン及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物及び未添加培地組成物を１５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心したのち培養上清を回収した。この際に細胞数の評価を行うために、ＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を培養上清回収後の各サンプルに添加して懸濁させ、１０分間室温で静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。続いて、回収した培養上清中に含まれるＶＥＧＦに関して、ＶＥＧＦ１６５　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ，　Ｈｕｍａｎ（＃ＥＮＺ－ＫＩＴ１５６－０００１、Ｅｎｚｏライフサイエンス社製）を用いて定量を行った。１００μＬのｓｔａｎｄａｒｄもしくはサンプル溶液をｗｅｌｌに添加し、室温で６０分間振とうした。引き続き、溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を３回繰り返した。１００μＬのＶＥＧＦ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ａｎｔｉｂｏｄｙを添加し、３０分間室温で振とうした。溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を３回繰り返した。１００μＬのＶＥＧＦ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　（ｂｌｕｅ）を添加し、３０分間室温で振とうした。続いて、溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を４回繰り返した。１００μＬのＴＭＢ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、３０分間室温振とうした。最後に１００μＬのｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ２を添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプル中に含まれるＶＥＧＦ濃度は検量線の４パラメーターロジスティック回帰より算出した。細胞数あたりの分泌量を算出するために、算出されたＶＥＧＦ量を発光強度で除した相対値を算出した。
　その結果、キチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物で培養した場合の方が、未添加培地組成物で培養した場合と比較して細胞あたりのＶＥＧＦ産生量が増加した。各サンプルにおける相対値を表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（試験例１２：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物又はマイクロキャリアを用いた３Ｄ培養におけるヒト臍帯由来間葉系幹細胞の幹細胞マーカー発現変動）
　間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル６を、０．０５％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した。また、Ｃｏｒｎｉｎｇ低濃度ＳｙｎｔｈｅｍａｘIIマイクロキャリア（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３７８１）を３６０ｍｇ秤量し、滅菌精製水で水和後に、１０ｍＬのエタノールに３０分間浸漬させた。その後、エタノールを除去し、３０ｍＬのＰＢＳ（‐）で２回洗浄し、最後に１０ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地で洗浄した。上記のマイクロキャリアを１０ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地に添加した培地組成物を比較対照として調製した（サンプル１３）。引き続き、培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７１、タカラバイオ社製）６０００００細胞を、上記のナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地４０ｍＬに懸濁し、培養バッグとして用いた抗体固相化バッグＡ（ニプロ社製、８７－３６２）に充填した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。また、培養したヒト臍帯由来間葉系幹細胞６０００００細胞をマイクロキャリア含有間葉系幹細胞増殖培地１５ｍＬに懸濁した後、Ｃｏｒｎｉｎｇ　１２５ｍＬ　ディスポーザブルスピナーフラスコに移し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で１日間培養した。１日後にマイクロスタースロースピードマグネチックスターラー（ＷＨＥＡＴＯＮ社製、Ｗ９００７０１－Ｂ）を用いて、３０ｒｐｍで１５分間の振とう、その後２時間静置する方法でさらに２日間培養した。３日後、抗体固相化バッグＡ及びディスポーザブルスピナーフラスコで培養した細胞は半量培地交換を行い、さらに上記と同様の条件で４日間培養した。４日後、４０ｍＬから１ｍＬを取り出して１．５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心した。上清を除いた後、３５０μＬのＲＬＴ溶液（ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製、＃７４１０６）を添加し、ＲＮＡ抽出溶液とした。引き続き、ＲＮＡ抽出溶液に７０％エタノールを３５０μＬ加えた後、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに７００μＬのＲＷ１溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。さらに５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで２分間遠心した。ＲＮｅａｓｙスピンカラム中に存在するＲＮＡにＲＮａｓｅフリー溶液を添加し、溶出させた。次に、得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３７Ａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡとＰｒｅｍｉｘ　ＥＸ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３９Ａ）、Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）としては、ＯＣＴ４はＨｓ０４２６０３６７＿ｇＨ、ＳＯＸ２はＨｓ０１０５３０４９＿ｓ１、ＮＡＮＯＧはＨｓ０４３９９６１０＿ｇ１、ＣＸＣＲ４はＨｓ００６０７９７８　ｓ１，ＧＡＰＤＨはＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１を用いた。機器はリアルタイムＰＣＲ７５００を使用した。解析は各目的遺伝子の値をＧＡＰＤＨの値で補正した相対値を算出し、比較した。
　その結果、キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物を含む培地組成物を用いて、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞を培養バッグで培養することで、未分化性を示すＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ遺伝子とホーミングに関わる遊走性を示すＣＸＣＲ４遺伝子の相対的な発現量の上昇が認められた。一方、Ｃｏｒｎｉｎｇ低濃度ＳｙｎｔｈｅｍａｘIIマイクロキャリアで培養した条件では、これら遺伝子の明確な発現量の増加は認めなかった。各遺伝子発現の相対値を表２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（試験例１３：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物又はマイクロキャリアを用いたヒト脂肪由来間葉系幹細胞の３Ｄ培養におけるｂＦＧＦ産生量）
　間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル６を、０．０５％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した。また、Ｃｏｒｎｉｎｇ低濃度ＳｙｎｔｈｅｍａｘIIマイクロキャリア（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３７８１）を３６０ｍｇ秤量し、滅菌精製水で水和後に、１０ｍＬのエタノールに３０分間浸漬させた。その後、エタノールを除去し、３０ｍＬのＰＢＳ（‐）で２回洗浄し、最後に１０ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地で洗浄した。上記のマイクロキャリアを１０ｍＬの間葉系幹細胞増殖培地２培地に添加した培地組成物を比較対照として調製した（サンプル１３）。引き続き、培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）６０００００細胞を、上記のナノファイバー含有間葉系幹細胞増殖培地４０ｍＬに懸濁し、培養バッグとして用いた抗体固相化バッグＡ（ニプロ社製、８７－３６２）に充填した後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。また、培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞６０００００細胞をマイクロキャリア含有間葉系幹細胞増殖培地１５ｍＬに懸濁した後、Ｃｏｒｎｉｎｇ　１２５ｍＬ　ディスポーザブルスピナーフラスコに移し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で１日間培養した。１日後にマイクロスタースロースピードマグネチックスターラー（ＷＨＥＡＴＯＮ社製、Ｗ９００７０１－Ｂ）を用いて、３０ｒｐｍで１５分間の振とう、その後２時間静置する方法でさらに２日間培養した。３日後、培養バッグ及びスピナーフラスコ中の４０ｍＬから１ｍＬを取り出して１．５ｍＬチューブに移し、３００ｘｇで３分間遠心した。遠心後、上清を除去し、２ｍＬのＰＢＳ（－）を添加して洗浄した。洗浄後、３００ｘｇで３分間遠心し、ＰＢＳ（－）を除去後、１７％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地（富士フイルム和光純薬社製、１３５－１５１７５）１ｍＬで懸濁後、２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）に添加し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で１日間培養した。１日後に培養液を取り出して１．５ｍＬチューブに移した後、３００ｘｇで３分間遠心し、培養上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収した。この際に、細胞数の評価を行うために、ＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を培養上清回収後の各サンプルに添加して懸濁し、１０分間室温で静置した後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。続いて、回収した培養上清中に含まれるｂＦＧＦに関して、ｂＦＧＦ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（＃ＥＬＨ－ｂＦＧＦ－１、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて定量を行った。１００μＬのｓｔａｎｄａｒｄもしくはサンプル溶液をｗｅｌｌに添加し、２．５時間室温で振とうした。引き続き、溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を４回繰り返した。１００μＬの１ｘ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙを添加し、１時間室温で振とうした。溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を４回繰り返した。１００μＬのＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、４５分間室温で振とうした。続いて、溶液を捨て、３００μＬの１ｘ　ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後に、除去した。上記操作を４回繰り返した。１００μＬのＴＭＢ　Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｒｅａｇｅｎｔを添加し、３０分間室温、暗所で振とうした。最後に５０μＬのｓｔｏｐ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプル中に含まれるｂＦＧＦ濃度は検量線の４パラメーターロジスティック回帰より算出した。細胞数あたりの分泌量を算出するために、算出されたｂＦＧＦ量を発光強度で除した相対値を算出した。
　その結果、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞をキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物で実施した３Ｄ培養の方が、マイクロキャリアを添加した培地組成物で実施した３Ｄ培養と比較してｂＦＧＦ分泌量の相対値が増加した。結果を表２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
（試験例１４：同時解繊により製造したキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物又は特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーを用いた３Ｄ培養におけるヒト脂肪由来間葉系幹細胞の幹細胞マーカー発現変動）　
　キチン粉末およびキトサン粉末を重量比１：４で混合し、この混合物を２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化することでαキチン/キトサンナノファイバーを調製した（以下、本方法で製造したキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーの混合物を、「同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバー」等と称することがある）。また、特定のアセチル化度（本試験例においては約５０％）を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバー（以下、「Ｎ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバー」等と称することがある）は、ポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンを３０％水酸化ナトリウム水溶液中で４時間加熱還流処理することによって、Ｎ－アセチルグルコサミン量を約５０％に調節し、さらにこれを２００ＭＰａ、ｐａｓｓ５回条件でナノファイバー化することによって調製した。かくして得られた同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバーとＮ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーは、それぞれ、１％（ｗ／ｗ）となるように注射用水（大塚蒸留水）で希釈後、転倒混和により分散し、本水懸濁液を１２１℃で２０分オートクレーム滅菌処理した（それぞれ、サンプル１４およびサンプル１５）。間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル１４又はサンプル１５を、０．０５％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した。
　（１）サンプル１４を添加した培地組成物（同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバー：０．０５％（ｗ／ｖ））
（２）サンプル１５を添加した培地組成物（Ｎ－アセチルグルコサミン量調節（５０％）ナノファイバー：０．０５％（ｗ／ｖ））
　引き続き、培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）を、シャーレにて２Ｄ培養により増殖させ、５００００細胞／ｍＬとなるように上記のナノファイバーを添加した培地組成物あるいは未添加培地組成物に播種した後、２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１．２ｍＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１３日間継続した。播種時、８日目および１３日目に細胞を回収し、ＲＬＴ溶液を３００μＬ（ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃７４１０６）を添加し、ＲＮＡ抽出溶液とした。ＲＮＡ抽出溶液に７０％エタノールを３００μＬ加えた後、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに６００μＬのＲＷ１溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。さらに５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで２分間遠心した。ＲＮｅａｓｙスピンカラム中に存在するＲＮＡにＲＮａｓｅフリー溶液を添加し、溶出させた。次に、得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３７Ａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡとＰｒｅｍｉｘ　ＥＸ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３９Ａ）、Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）としては、ＯＣＴ４はＨｓ０４２６０３６７＿ｇＨ、ＮＡＮＯＧはＨｓ０４３９９６１０＿ｇ１，ＰＰＩＡはＨｓ９９９９９９０４＿ｍ１を用いた。機器はリアルタイムＰＣＲ７５００を使用した。解析は各目的遺伝子の値をＰＰＩＡの値で補正した相対値を算出し、比較した。
　その結果、播種時の２Ｄ培養条件と比較して、同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバー又はＮ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーを含む培地組成物を用いて、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレートで３Ｄ培養することで、未分化性を示すＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４遺伝子の相対的な発現量の上昇が認められた。ＮＡＮＯＧ遺伝子発現の相対値を表２２に、ＯＣＴ４遺伝子発現の相対値を表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
（試験例１５：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物またはキチンナノファイバーと他の多糖類の混合物を用いた３Ｄ培養におけるヒト脂肪由来間葉系幹細胞の増殖および幹細胞マーカー発現変動）
　メチルセルロース粉末（１．０ｇ）を水（１００ｍＬ）に加え撹拌し懸濁後、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分間）することで得られた１．０％（ｗ／ｖ）のメチルセルロース水溶液（８ｍＬ）に、サンプル１（２ｍＬ）を加えピペッティングにより混合することで０．２％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバーと０．８％（ｗ／ｖ）メチルセルロースの混合物を調製した（サンプル１６）。
　脱アシル化ジェランガム粉末（０．８ｇ）を水（１００ｍＬ）に加え撹拌し溶解後、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分間）することで０．８％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム水溶液を得た。この脱アシル化ジェランガム水溶液（１２．５ｍＬ）をＤ－ＰＢＳ（＋）（Ｃａ, Ｍｇ含有）（２７．５ｍＬ）に培地作製キット（日産化学　ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を使用して混合することで得られた０．２５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム２価カチオン架橋構造体分散液（８ｍＬ）に、サンプル１（２ｍＬ）を加えピペッティングにより混合することで０．２％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバーと０．２％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガムの混合物を調製した（サンプル１７）。
　アルギン酸ナトリウム粉末（１．０ｇ）を水（５０ｍＬ）に加え撹拌し溶解後、オートクレーブ滅菌処理（１２１℃、２０分間）することで２．０％（ｗ／ｖ）のアルギン酸ナトリウム水溶液を得た。このアルギン酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）をＤ－ＰＢＳ（＋）（Ｃａ, Ｍｇ含有）（１０ｍＬ）に培地作製キット（日産化学　ＦＣｅＭ（登録商標）－ｓｅｒｉｅｓ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）を使用して混合することで得られた１．０％（ｗ／ｖ）アルギン酸２価カチオン架橋構造体分散液（８ｍＬ）に、サンプル１（２ｍＬ）を加えピペッティングにより混合することで０．２％（ｗ／ｖ）キチンナノファイバーと０．８％（ｗ／ｖ）アルギン酸の混合物を調製した（サンプル１８）。
　つぎに、間葉系幹細胞増殖培地２培地（Ｃ－２８００９、タカラバイオ社製）に上記で得たサンプル６、１６、１７および１８を０．０５％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した。なお、調製した培地組成物中のキチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーあるいは他の多糖類（メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、アルギン酸）の終濃度は次の通りである：
　（１）サンプル６を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０１％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０.０４％（ｗ／ｖ））
　（２）サンプル１６を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０１％（ｗ／ｖ）、メチルセルロース：０．０４％（ｗ／ｖ））
　（３）サンプル１７を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０１％（ｗ／ｖ）、脱アシル化ジェランガム：０．０４％（ｗ／ｖ））
　（４）サンプル１８を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０１％（ｗ／ｖ）、アルギン酸：０．０４％（ｗ／ｖ））
　引き続き、培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７７、タカラバイオ社製）を、１３３３３細胞／ｍＬとなるように上記のキチンナノファイバーにキトサンナノファイバーあるいは他の多糖類（メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、アルギン酸）を添加した培地組成物に播種した後、２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（＃３４７３、コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１．２ｍＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１４日間継続した。播種時（０日目）と播種後７、１４日目において、各培養液を懸濁し３００μＬ分注しさらにＡＴＰ試薬３００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数を算出した。
　７日目および１４日目に細胞を回収し、ＲＬＴ溶液を３００μＬ（ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃７４１０６）を添加し、ＲＮＡ抽出溶液とした。ＲＮＡ抽出溶液に７０％エタノールを３００μＬ加えた後、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、ＲＮｅａｓｙスピンカラムに６００μＬのＲＷ１溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。続いて、５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで１５秒間遠心した。さらに５００μＬのＲＰＥ溶液を添加し、８０００ｘｇで２分間遠心した。ＲＮｅａｓｙスピンカラム中に存在するＲＮＡにＲＮａｓｅフリー溶液を添加し、溶出させた。次に、得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３７Ａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡとＰｒｅｍｉｘ　ＥＸ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製、＃ＲＲ０３９Ａ）、Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。Ｔａｑ　ｍａｎ　Ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）としては、ＯＣＴ４はＨｓ０４２６０３６７＿ｇＨ、ＮＡＮＯＧはＨｓ０４３９９６１０＿ｇ１，ＰＰＩＡはＨｓ９９９９９９０４＿ｍ１を用いた。機器はリアルタイムＰＣＲ７５００を使用した。解析は各目的遺伝子の値をＰＰＩＡの値で補正した相対値を算出し、比較した。
　その結果、αキチンナノファイバーと組み合わせた多糖類のなかで、キトサンナノファイバーとの混合物を含む培地組成物が最もヒト脂肪由来間葉系幹細胞の増殖能が高く、かつ未分化性を示すＯＣＴ４遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子の発現能が高かった。キチンナノファイバーと、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、アルギン酸のいずれかの多糖類との混合物を含む培地組成物も、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を増殖させ、ＯＣＴ４遺伝子およびＮＡＮＯＧ遺伝子の発現亢進作用を認めたが、キトサンナノファイバーとの混合物に比べ弱かった。生細胞数の結果は表２４に、ＮＡＮＯＧ遺伝子発現の結果を表２５に、ＯＣＴ４遺伝子発現の結果を表２６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
（試験例１６：キチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物、同時解繊により製造したキチンナノファイバーとキトサンナノファイバーの混合物、又は特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーを用いた３Ｄ培養におけるＨＥＫ２９３－ＩＦＮβ細胞の増殖、生存維持、細胞凝集塊の分散性）
　１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（和光純薬社製）に上記で得たサンプル１を０．０２％（ｗ／ｖ）又は０．１％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した。また、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（和光純薬社製）にサンプル６、１４又は１５を、０．０２％（ｗ／ｖ）の終濃度となるように添加した培地組成物を調製した。さらに、上記基材を含まない未添加培地組成物（サンプル１２）を調製した。なお、調製したナノファイバー含有１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地中の各ナノファイバーの終濃度は次の通りである：
　（１）サンプル１を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０２％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０％（ｗ／ｖ））
　（２）サンプル１を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．１％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０％（ｗ／ｖ））
　（３）サンプル６を添加した培地組成物（キチンナノファイバー：０．０２％（ｗ／ｖ）、キトサンナノファイバー：０．０８％（ｗ／ｖ））
　（４）サンプル１４を添加した培地組成物（同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバー：０．１％（ｗ／ｖ））
　（５）サンプル１５を添加した培地組成物（Ｎ－アセチルグルコサミン量調節（５０％）ナノファイバー：０．１％（ｗ／ｖ））
　引き続き、培養したヒトＩＦＭβを安定的に産生させるＨＥＫ２９３－ＩＦＭβ細胞を、約２０００００細胞／ｍＬとなるように上記の各培地組成物に懸濁した後、２４ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７３）に１.２ｍＬ／ウェルで播種した。細胞をＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で最大２１日間培養し、培地交換は１あるいは２日おきに実施した。播種時（０日目）と播種後７、１４、２１日目において、各培養液を懸濁し３００μＬ分注しさらにＡＴＰ試薬３００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き、生細胞の数を算出した。また播種後８日目、１５日目、２１日目に写真撮影を実施し、細胞スフェア塊の分散性を確認した。
　その結果、未添加の条件と比較して、各基材を添加したすべての条件で増殖および生存維持効果が認められた。また、同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバー又はＮ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーを含む培地組成物を用いると、キチンナノファイバー単独より高い細胞密度を示した。また継時的な観察により、未添加では８日目に大きな細胞凝集塊が見られ、キチンナノファイバー単独（サンプル１）でも細胞凝集体が徐々に大きくなりまた凝集体の数が減っていた。これらの条件では細胞凝集体同士のさらなる凝集化が起こっているものと考えられた。一方、キチンナノファイバー及びキトサンナノファイバーを添加した培地組成物および同時解繊により調製したキチン／キトサンナノファイバーを含む培地組成物を用いると、細胞凝集体同士の凝集化を抑制していた。特にＮ－アセチルグルコサミン量調節ナノファイバーを含む培地組成物を用いると、２１日目の時点でも小さな細胞凝集体が分散する傾向を維持していた。生細胞数の結果を図１に、写真観察の結果を図２（８日目）、図３（１５日目）、図４（２１日目）に示す。
　本発明によれば、高品質な接着性細胞（例、間葉系幹細胞）を効率よく生産することが可能となる。本発明により得られた細胞が幹細胞である場合、これらは未分化性や遊走性等の特性を好ましい状態で維持している、非常に品質の高い幹細胞である。従って、本発明により得られた幹細胞（例、間葉系幹細胞）は、疾患等により失われた器官や組織を補うために好ましく使用可能である。さらに、本発明により得られた細胞分泌物もまた、種々の疾患の治療に用い得る。従って、本発明は例えば再生医療分野において極めて有用であると考えられる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１８－１６４０４２（出願日：２０１８年８月３１日）および特願２０１９－１３４０５８（出願日：２０１９年７月１９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (43)

  1. 　（１）キチンナノファイバー；および
    　（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；
    を含む、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物。
  2. 　培地組成物がキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含み、キチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、請求項１記載の浮遊培養用培地組成物。
  3. 　培地組成物がキチンナノファイバーおよび多糖類を含み、多糖類が、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、およびアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１記載の浮遊培養用培地組成物。
  4. 　接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、請求項１～３のいずれか一項記載の浮遊培養用培地組成物。
  5. 　接着性細胞が、幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載の浮遊培養用培地組成物。
  6. 　幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項５記載の浮遊培養用培地組成物。
  7. 　浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、請求項５または６記載の浮遊培養用培地組成物。
  8. 　接着性細胞を、
    　（１）キチンナノファイバー；および
    　（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；
    を含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、接着性細胞の培養方法。
  9. 　培地組成物がキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含み、培地組成物中のキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、請求項８記載の培養方法。
  10. 　培地組成物がキチンナノファイバーおよび多糖類を含み、多糖類が、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、およびアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項８記載の培養方法。
  11. 　接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、請求項８～１０のいずれか一項記載の培養方法。
  12. 　接着性細胞が、幹細胞である、請求項８～１１のいずれか一項記載の培養方法。
  13. 　幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１２記載の培養方法。
  14. 　浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、請求項１２または１３記載の培養方法。
  15. 　以下の工程をさらに含む、請求項８～１４のいずれか一項記載の培養方法：
    　（１）浮遊培養された細胞をキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーまたは多糖類から剥離させる処理を行うことなく、請求項１～７のいずれか一項に記載の浮遊培養用培地組成物をさらに添加する工程、および
    　（２）工程（１）で得られた混合物を浮遊培養に供する工程。
  16. 　接着性細胞を、
    　（１）キチンナノファイバー；および
    　（２）キトサンナノファイバーまたは多糖類；
    を含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、細胞分泌物を生産する方法。
  17. 　培地組成物がキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーを含み、培地組成物中のキチンナノファイバーおよびキトサンナノファイバーの比率が、キチンナノファイバー：キトサンナノファイバー＝１：０．５～２０である、請求項１６記載の方法。
  18. 　培地組成物がキチンナノファイバーおよび多糖類を含み、多糖類が、メチルセルロース、脱アシル化ジェランガム、およびアルギン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
  19. 　接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、請求項１６～１８のいずれか一項記載の方法。
  20. 　接着性細胞が、幹細胞である、請求項１６～１９のいずれか一項記載の方法。
  21. 　幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項２０記載の方法。
  22. 　培地組成物中の血清の濃度が２％以下である、請求項１６～２１のいずれか一項記載の方法。
  23. 　細胞分泌物が、低分子化合物、タンパク質、核酸、および細胞分泌小胞からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１６～２２のいずれか一項記載の方法。
  24. 　特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーであって、該特定のアセチル化度が５～７０％であるナノファイバーを含む、接着性細胞の浮遊培養用培地組成物。
  25. 　培地組成物中の特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項２４記載の浮遊培養用培地組成物。
  26. 　接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、請求項２４または２５記載の浮遊培養用培地組成物。
  27. 　接着性細胞が、幹細胞である、請求項２４～２６のいずれか一項記載の浮遊培養用培地組成物。
  28. 　幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項２７記載の浮遊培養用培地組成物。
  29. 　浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、請求項２７または２８記載の浮遊培養用培地組成物。
  30. 　接着性細胞を、特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーであって、該特定のアセチル化度が５～７０％であるナノファイバーを含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、接着性細胞の培養方法。
  31. 　培地組成物中の特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項３０記載の培養方法。
  32. 　接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、請求項３０または３１記載の培養方法。
  33. 　接着性細胞が、幹細胞である、請求項３０～３２のいずれか一項記載の培養方法。
  34. 　幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項３３記載の培養方法。
  35. 　浮遊培養が、幹細胞の増殖、且つ、幹細胞の多能性および遊走性の維持のためのものである、請求項３３または３４記載の培養方法。
  36. 　以下の工程をさらに含む、請求項３０～３５のいずれか一項記載の培養方法：
    　（１）浮遊培養された細胞を特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーから剥離させる処理を行うことなく、請求項２４～２９のいずれか一項記載の浮遊培養用培地組成物をさらに添加する工程、および
    　（２）工程（１）で得られた混合物を浮遊培養に供する工程。
  37. 　接着性細胞を、特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーであって、該特定のアセチル化度が５～７０％であるナノファイバーを含む培地組成物中において浮遊培養する工程を含む、細胞分泌物を生産するための方法。
  38. 　培地組成物中の特定のアセチル化度を有するポリ（１，４）－Ｎ－アセチル-β-Ｄ-グルコサミンナノファイバーの濃度が、０．０００１～０．２％（ｗ／ｖ）である、請求項３７記載の方法。
  39. 　接着性細胞が、浮遊培養下で自己凝集する接着性細胞である、請求項３７または３８記載の方法。
  40. 　接着性細胞が、幹細胞である、請求項３７～３９のいずれか一項記載の方法。
  41. 　幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項４０記載の方法。
  42. 　培地組成物中の血清の濃度が２％以下である、請求項３７～４１のいずれか一項記載の方法。
  43. 　細胞分泌物が、低分子化合物、タンパク質、核酸、および細胞分泌小胞からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項３７～４２のいずれか一項記載の方法。
     
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