WO2022004822A1 - 胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養するための海洋深層水を含む培地 - Google Patents

胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養するための海洋深層水を含む培地 Download PDF

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WO2022004822A1
WO2022004822A1 PCT/JP2021/024849 JP2021024849W WO2022004822A1 WO 2022004822 A1 WO2022004822 A1 WO 2022004822A1 JP 2021024849 W JP2021024849 W JP 2021024849W WO 2022004822 A1 WO2022004822 A1 WO 2022004822A1
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cells
derived
medium
cord blood
sea water
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Application number
PCT/JP2021/024849
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French (fr)
Inventor
▲祐▼輔 相良
Original Assignee
国立大学法人高知大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a medium supplemented with deep sea water and / or fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells for improving the production of nerve regeneration-promoting substances of fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells.
  • a medium supplemented with deep sea water and / or fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells for improving the production of nerve regeneration-promoting substances of fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells.
  • Non-Patent Document 1 Clinical studies are underway to administer umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to patients with cerebral palsy, and improvements in some motor functions have been reported (Non-Patent Document 1). It has also been reported that administration of cord blood-derived cells to neonatal cerebral hemorrhage model mice significantly improves motor dysfunction (Patent Document 1). Furthermore, it has been reported that transplantation of umbilical cord and placenta-derived cells into optic nerve injury model mice promotes optic nerve regrowth (Patent Document 2).
  • Umbilical cord and placenta-derived cells produce neurotrophic factors such as brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and chemokines such as C-XC motif chemokine receptor ligand 1 (CXCL1), which are responsible for nerve regeneration. It has been suggested to promote. Therefore, cells in which the production of these factors is enhanced and the culture supernatant of the cells are expected to have a high nerve regeneration effect.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • CXCL1 C-XC motif chemokine receptor ligand 1
  • the present inventors have conducted a nerve regeneration promoting substance by culturing fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells in a medium supplemented with deep sea water. We have found that the production of blood cells is increased, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following: (1) A medium containing deep sea water for culturing tissue cells derived from fetal appendages and / or umbilical cord blood cells. (2) The medium according to (1), wherein the fetal appendage-derived tissue cells are umbilical cord-derived cells, fetal membrane-derived cells, placenta-derived cells, or a combination thereof. (3) The medium according to (1) or (2), wherein the cells are cord blood-derived mononuclear cells or Walton glial cells. (4) The medium according to any one of (1) to (3), wherein the cells are stem cells. (5) The medium according to any one of (1) to (4) for serum-free culture.
  • the cytokine, chemokine or growth factor is 1 or 2 or more selected from the group of BDNF, CXCL1, CX3CL1, EGF, FGF-9, G-CSF, IL-6, FGF-4, (1) to (1).
  • the medium according to any one of 10).
  • a medium capable of enhancing the production of a nerve regeneration promoting substance of fetal appendage-derived histiocytes and / or umbilical cord blood cells Fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells cultured in this medium, or the culture supernatant of the cells, can be expected to have a high nerve regeneration promoting effect.
  • ⁇ when applied to a numerical value refers to a range of values that are above the specified standard value and within the range below the specified standard value.
  • Fetal appendage-derived tissue cells 1-1) Fetal appendage-derived tissue
  • the "fetal appendage-derived tissue” (also referred to as “postpartum-derived tissue”) means a group of tissues excised during labor. Includes umbilical cord, fetal membrane (consisting of amniotic membrane, chorion, decidua), placenta, etc.
  • the tissue derived from the fetal appendage of the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue collected from a mammal, and is, for example, a tissue derived from a fetal appendage of a primate mammal. More preferably, it is a tissue derived from human fetal appendages.
  • the "umbilical cord” is a white tubular tissue that connects the foetation and the placenta, and means a tissue that does not contain the placenta.
  • the parenchyma of the umbilical cord "Walton's gland,” means connective tissue derived from the extraembryonic mesoderm and protects the umbilical cord by covering the two umbilical arteries and the umbilical vein.
  • the umbilical cord of the present invention is not particularly limited as long as it is an umbilical cord collected from a mammal, and is, for example, an umbilical cord of a primate mammal. More preferably, it is the human umbilical cord.
  • fetal membrane means a membrane that encloses amniotic fluid.
  • the fetal membrane is not a single membrane, but is composed of three layers, the "decidua,” “chorion,” and “amniotic membrane,” which are altered versions of the endometrium.
  • the fetal membrane of the present invention is not particularly limited as long as it is a fetal membrane collected from a mammal, and is, for example, a fetal membrane of a primate mammal. More preferably, it is a human fetal membrane.
  • the amniotic membrane which is the inner layer of the fetal membrane
  • the chorion which is the intermediate layer
  • the dedecidua which is the outer layer
  • these membrane tissues may be used in combination.
  • placenta refers to placenta tissue that can be obtained from the mother after childbirth. Although the placenta can be easily removed after delivery, it is preferable to use the human placenta obtained by obtaining informed consent after collecting the cord blood separately from the cord blood bank. More preferably, the placenta described in detail such as test results for infectious diseases is used.
  • the placenta of the present invention is not particularly limited as long as it is a placenta collected from a mammal, and is, for example, a placenta of a primate mammal. More preferably, it is the human placenta.
  • fetal appendage-derived histiocyte also referred to as “postpartum-derived tissue cell”
  • postpartum-derived tissue cell means a cell obtained from fetal appendage-derived tissue by physical and / or enzymatic treatment, and various cells. It may be a collection of stem cells or isolated stem cells. That is, it is derived from cord blood or fetal appendage-derived tissue, which can be obtained by multi-generational subculture, immunomagnetic separation using an antibody, immunospecific gravity centrifugation, or known cell fractionation by a method using FACS. It may be various stem cells of.
  • fetal appendage-derived tissue is recovered immediately after birth.
  • fetal appendage-derived tissue is recovered after informed consent from a donor or via a cord blood bank. It is preferable to obtain the medical history or test results of the donor's infection and associate it with the tissue derived from the fetal appendage. Such a medical history can be used to limit the use of fetal appendage-derived tissue or fetal appendage-derived histiocytes collected from it.
  • blood in the placenta is collected. This can be done with a conventional blood recovery process.
  • blood is drawn from the placenta using a needle or cannula under infusion (see, eg, Anderson, U.S. Pat. No. 5,372,581; Hessel et al., U.S. Pat. No. 5,415,665). ..
  • the needle or cannula is usually placed in the umbilical vein and the placenta can be lightly massaged to facilitate the outflow of cord blood from the placenta. It is preferred that the placenta bleed by infusion without further manipulation to minimize tissue destruction during cord blood collection.
  • Tissues or parts thereof derived from fetal appendages of mammals can be generally recovered and prepared as described above and then treated by any method known in the art, eg, perfusion, washing, shredding. Can be destroyed or adhered to a culture vessel, for example, after shredding, digested with one or more tissue-destroying enzymes, or adhered to a culture vessel to obtain fetal appendage-derived histiocytes.
  • cells are recovered from a mammalian fetal appendage-derived set by physical destruction of part or all of the organ.
  • fetal appendage-derived tissue or a portion thereof, can be, for example, crushed, sheared, shredded, diced, shredded, shredded, threaded through a mesh, and the like.
  • tissues derived from fetal appendages can be destroyed by immersion in, for example, a medium, physiological saline or other solution that does not impair cell survival. The tissue can then be cultured to obtain a population of adherent fetal appendage-derived histiocytes.
  • Fetal appendage-derived tissue can be cut into individual tissues prior to physical destruction and / or enzymatic digestion and cell recovery.
  • the amniotic membrane, chorion and other fetal membranes, umbilical cord, placental lobe, or any combination thereof can be cut to obtain all or part of them.
  • Fetal appendage-derived histiocytes are preferably obtained from amniotic membrane, chorion, umbilical cord (Walton colloid, etc.) or any combination thereof.
  • fetal appendage-derived tissue cells are small masses of fetal appendage-derived tissue, such as about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40.
  • , 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or about 1000 cubic millimeters can be obtained by destruction of a mass of fetal appendage-derived tissue. ..
  • fetal appendage-derived tissue cells are harvested by physical destruction of fetal appendage-derived tissue, where physical destruction is combined with enzymatic digestion, which involves digestion of one or more tissues. It can be carried out by using an enzyme.
  • Enzymes that can be used to digest tissues derived from fetal appendages include papain, deoxyribonucleases, serine proteases, trypsin, chymotrypsin, collagenase, dispase or elastase. Since serine proteases can be inhibited by alpha 2 microglobulins in serum and the serum contains large amounts of substrate proteins, the medium used for digestion is usually serum-free. Generally, EDTA and / or DNase can be used in the procedure of enzymatic digestion to increase the efficiency of cell recovery.
  • Tissue digestive enzymes can be used in any combination. Typical concentrations for digestion using trypsin include trypsin 0.05% to about 2%, eg, trypsin about 0.05%.
  • Proteases can be used in combination, i.e., two or more proteases in the same digestive reaction, or simultaneously to dissect fetal appendage-derived histiocytes.
  • the placenta, or a portion thereof is first digested with an appropriate amount of collagenase I at, for example, about 1 to about 2 mg / ml for 30 minutes, then at 37 ° C., for example, about 0.25 for 10 minutes.
  • Serine proteases are preferably used sequentially after the use of other enzymes.
  • the digested product is washed with, for example, a culture medium containing serum, and the washed cells are seeded in a culture vessel.
  • the cells are then isolated by differential adhesion to prepare mesenchymal cells.
  • mesenchymal cells For example, umbilical cord Walton collagen-derived mesenchymal cells, fetal membrane amniotic membrane-derived mesenchymal cells, fetal membrane chorion-derived mesenchymal cells, and placenta-derived mesenchymal cells can be prepared.
  • these mesenchymal cells are cultured with serum in the range of multiple times, preferably 1,2,5,8,10,15 or 20 times or more, and 50, 40, 30, 25 times or less. It can be subcultured in a medium.
  • Umbilical cord blood cells refers to fetal blood contained in the umbilical cord
  • human umbilical cord blood refers to blood that can be obtained from the human umbilical cord.
  • Human umbilical cord blood can be prepared from the placenta delivered by vaginal delivery and cesarean section and from the umbilical cord that is appropriately removed and recovered from the puerperal tissue including the placenta.
  • human cord blood can also be obtained from an umbilical cord blood bank such as the Hyogo cord blood bank.
  • the "umbilical cord blood mononuclear cell” refers to a cell that is a mononuclear cell among the cells contained in the cord blood.
  • Cord blood mononuclear cells can be separated from umbilical cord blood, and the separation method includes a specific gravity centrifugation method (for example, Lymophily, Ficoll-Paque, Percoll, Lymphoprep can be used), a method using a cell sorter, and an antibody.
  • a specific gravity centrifugation method for example, Lymophily, Ficoll-Paque, Percoll, Lymphoprep can be used
  • a method using a cell sorter for example, a specific gravity centrifugation method, a method using a cell sorter, and an antibody.
  • a dialysis membrane may be used to separate mononuclear cells from cord blood.
  • a pure cell select system for whole blood mononuclear cell concentration (registered trademark, PALL), a purifier for removing blood cells (cellsova E, registered trademark, Asahi Kasei), and a leukocyte removal filter for platelet preparation (sepacell PL, registered trademark, PLX-5B-SCD, Asahi Kasei) and the like can also be used, but are not particularly limited.
  • Cord blood mononuclear cells may be a collection of various cells or may be isolated stem cells.
  • cord blood or fetal appendage-derived tissue which can be obtained by multi-generational subculture, immunomagnetic separation using an antibody, immunospecific gravity centrifugation, or known cell fractionation by a method using FACS. It may be various stem cells of.
  • a “stem cell” is an undifferentiated group of cells, in which a single cell has the ability to self-regenerate and a group of progenitor cells that differentiate and progenitor cells (progenitor cells that self-regenerate, progenitor cells that cannot self-regenerate, and final differentiated cells. Is defined by the ability to produce).
  • the stem cells in the present disclosure are stem cells derived from fetal appendages or umbilical cord blood, and are hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, non-limiting body cell stem cells, embryo-like stem cells, pluripotent stem cells, endothelial precursor cells, and Walton. Glue-derived mesenchymal stem cells are included (Boluczkowski et al., Int J Mol Sci. 2019; 20 (10), p2433.).
  • the fetal appendage-derived tissue-derived stem cells in the present disclosure include, but are not limited to, umbilical cord blood-derived stem cells, umbilical cord-derived stem cells, egg membrane-derived stem cells, and placenta-derived stem cells, and hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells.
  • Non-limiting body cell stem cells, embryo-like stem cells, pluripotent stem cells, endothelial precursor cells, and Walton gall-derived mesenchymal stem cells are suitable. These stem cells can be prepared by known methods.
  • the animal species are not particularly limited, and those derived from any animal such as humans, mice, rats, guinea pigs, hamsters, monkeys, cows, pigs, goats, sheep, dogs, and cats can be used.
  • placenta-derived cells examples include acceptance numbers PTA-6074, PTA-6075, and PTA-6079 entrusted to the American Culture Cell Lineage Conservation Agency (ATCC), and examples of umbilical cord-derived cells include acceptance number PTA-. Examples include 6067 and PTA-6068.
  • FC-0020 LifeLine
  • FC-0020 is an umbilical cord-derived mesenchymal stem cell (Umbilical Cord driven Mesenchymal Stem Cell's Wharton's Jelly), or the like is commercially available.
  • Fetal appendage-derived histiocytes and / or umbilical cord blood cells in the present disclosure can be subcultured to increase the number of cells or to maintain the state of the cells.
  • the subculture is not particularly limited as long as it is a general culture method, and the same method as before is used.
  • a CO2 incubator using a basal medium (Dalveco's modified Eagle's medium (DMEM), DMEM / F12 medium, RPMI-1640 medium, etc.) supplemented with serum (bovine fetal serum, human serum, horse serum, sheep serum, etc.)
  • DMEM Dalveco's modified Eagle's medium
  • serum bovine fetal serum, human serum, horse serum, sheep serum, etc.
  • the culture temperature is adjusted to 30 ° C to 40 ° C, preferably 37 ° C
  • the carbon dioxide gas concentration is adjusted to 0.03% to 40%, preferably 5 to 10%, and more preferably 5%. can.
  • the basic medium in the present disclosure refers to a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, etc., which are essential for culturing fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells.
  • the culture medium for tissue cells derived from fetal appendages and / or umbilical cord blood cells can use the cells obtained by culturing and the culture supernatant thereof for the treatment of diseases of animals (including humans). Considering the sex, it is preferable to use a medium containing as little biological material as possible (for example, a serum-free medium).
  • the culture medium for fetal appendage-derived histiocytes and / or umbilical cord blood cells contains deep sea water, and if necessary, a trace effective substance of a micronutrient promoter may be added.
  • a basic medium a medium for culturing animal cells known to those skilled in the art can be used.
  • minimum essential medium such as Eagle's medium, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), minimum essential medium ⁇ (MEM- ⁇ ), mesenchymal cell basal medium (MSCBM), Ham's F- 12 and F-10 medium, DMEM / F12 medium, Williams medium E, RPMI-1640 medium, MCDB medium, 199 medium, Fisher medium, Iscove-modified Dalveco medium (IMDM), McCoy-modified medium, etc. Be done.
  • RPMI-1640 medium, DMEM medium or DMEM / F12 medium is particularly preferably used, but is not limited thereto.
  • Culture media for tissue cells derived from fetal appendages and / or umbilical cord blood cells include amino acids / proteins, inorganic salts, buffers (HEPES, etc.), vitamins, indicators (phenol red, etc.) and carbon sources (glucose, etc.). ) And additives such as antibiotics can be added.
  • concentration of these additives used is not particularly limited, and can be used at the concentration used for ordinary animal cell media.
  • amino acids examples include glycine, L-alanine, L-arginine, L-aspartin, L-aspartic acid, L-cysteine, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-histidine, and L-isoleucine.
  • inorganic salts examples include calcium chloride, copper sulfate, iron (III) nitrate, iron sulfate, magnesium chloride, magnesium sulfate, potassium chloride, sodium hydrogen carbonate, sodium chloride, disodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate and the like. Can be mentioned.
  • vitamins examples include choline, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B4, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B12, vitamin B13, vitamin B15, vitamin B17, vitamin Bh, and vitamin Bt. , Vitamin Bx, Vitamin C (ascorbic acid), Vitamin D, Vitamin E, Vitamin F, Vitamin K, Vitamin M, Vitamin P and the like.
  • antibiotics such as penicillin, streptomycin, gentamycin, canamycin
  • carbon sources such as albumin, galactose, fructose, sucrose
  • stem cell differentiation inducers such as ⁇ -glycerophosphate, dexamethasone, rosiglitazone, isobutylmethylxanthin, 5-azacitidine
  • antioxidants such as 2-mercaptoethanol, catalase, superoxide dismutase, N-acetylcysteine Adenosine 5'-monophosphate, corticosterone, ethanolamine, insulin, reduced glutathione, lipoic acid, melatonin, hypoxanthin, phenol red, progesterone, putresin, pyruvate, thymidine, triiodotyronin, transfera
  • the culture medium for fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells in the present disclosure for example, a medium obtained by adding deep sea water, antibiotics, etc. to DMEM / F-12 medium; RPMI-1640 medium. , Deep sea water, medium to which antibiotics and the like are added, medium to which deep sea water, antibiotics and the like are added to DMEM medium and the like.
  • the method for preparing the medium of the present invention is not particularly limited, and the medium can be prepared according to a conventionally known method.
  • the medium can be prepared according to a conventionally known method. For example, dissolve the basic medium powder for animal cell culture in water containing deep ocean water (distilled water, deionized water, etc.), and add each of the above-mentioned additive components at room temperature or by heating as necessary. It is obtained by mixing and treating with high pressure steam sterilization or filtration sterilization.
  • the concentration of sodium ion and / or potassium ion can be adjusted in order to prevent the osmotic pressure from increasing due to the addition of deep sea water.
  • the medium of the present invention is preferably liquid, but may be gelled or may be a solid medium such as an agar medium, if necessary. According to the medium of the present invention, mesenchymal stem cells can be seeded and incubated in a culture vessel or a culture carrier whose culture surface has not been surface-treated.
  • Deep sea water the culture medium for fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells contains deep sea water.
  • "Deep ocean water” is generally seawater deeper than 200 meters, and begins with a vertically sinking global ocean current called “plume” caused by salinity differences around Greenland. It is seawater that is said to have traveled around the earth for centuries without ever touching the atmosphere. This deep sea water is in a state of low temperature and high pressure with almost no sunlight, so it has few bacteria and contains abundant inorganic nutrients (minerals).
  • the inclusion of deep sea water can enhance the production of nerve regeneration-promoting substances in fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells.
  • the concentration (v / v) of deep sea water contained in the medium is, for example, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15 %, 20%, 25%, 30%, 40%, 41%, 50%, 60%, 70%, 73%, 80% or 81% or more, and 90%, 81%, 80%, 73%.
  • the hardness of the medium containing deep sea water in the present disclosure is, for example, 150, 156, 200, 250, 300, 350, 400, 447, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 739, 750, 800, 812. Or 850 mg / L or more, and 900, 850, 812, 800, 750, 739, 700, 650, 600, 550, 500, 460, 447, 400, 350, 300 or 250 mg / L or less, 150 to 900, 200-900, 300-900, 400-900, 500-900, 600-900, 700-900, 800-900, 150-850, 200-850, 300-850, 400-850, 500-850, 600-850, 700-850, 150-800, 200-800, 300-800, 400-800, 500-800, 600-800, 700-800, 150-700, 200-700, 300-700, 400- 700, 500-700, 600-700, 150-600, 200-600, 300-600, 400-600, 500-600
  • the calcium ion Ca2 + concentration of the medium containing deep sea water in the present disclosure is, for example, 20, 21, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 54 or 55 mg / L or more, and 100, 90, 80, 70, 60, 58, 55, 54, 50, 45, 40, 37, 35, 30, 25 or 21 mg / L or less, 20-60, 20-58, 20-54, 20-50, 20 ⁇ 45, 20-40, 20-37, 20-35, 20-30, 20-25, 21-60, 21-58, 21-54, 21-50, 21-45, 21-40, 21-37 , 21-35, 21-30, 21-25, 30-60, 30-58, 30-54, 30-50, 30-45, 30-40, 30-37, 30-35, 37-60, 37 ⁇ 58, 37 ⁇ 54, 37 ⁇ 50, 37 ⁇ 45, 37 ⁇ 40, 40 ⁇ 60, 40 ⁇ 58, 40 ⁇ 54, 40 ⁇ 50, 40 ⁇ 45, 50 ⁇ 60, 50 ⁇ 58, 50 ⁇
  • the magnesium ion Mg2 + concentration of the medium containing deep sea water in the present disclosure is, for example, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 86, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 147 or 150 mg / L or more, and 200, 190, 180, 170, 163, 160, 150, 147, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 86, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25 or 20 mg / L or less, 20 to 200, 20 to 180, 20 to 163, 20 to 160, 20 to 147, 20 to 140, 20 to 120.
  • the elemental concentrations of iron in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.002 to 0.021, 0.01 to 0.021, 0.019 to 0.021, 0.002 to 0.019, 0. It is 01 to 0.019, or 0.002 to 0.01 ug / L.
  • the elemental concentrations of zinc in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.017 to 0.172, 0.086 to 0.172, 0.155 to 0.172, 0.017 to 0.155, 0. It is 086 to 0.155, or 0.017 to 0.086 ug / L.
  • the elemental concentrations of copper in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.008 to 0.083, 0.041 to 0.083, 0.075 to 0.083, 0.008 to 0.075, 0. It is 041 to 0.075, or 0.008 to 0.041 ug / L.
  • the elemental concentrations of iodine in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.739 to 7.391, 3.695 to 7.391, 6.651 to 7.391, 0.739 to 6.651, 3. It is 695 to 6.651, or 0.739 to 3.695 ug / L.
  • the elemental concentrations of phosphorus in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.193 to 1.927, 0.964 to 1.927, 1.735 to 1.927, 0.193 to 1.735, 0. It is 964 to 1.735, or 0.193 to 0.964 ug / L.
  • the elemental concentration of selenium in the medium containing deep sea water in the present disclosure is 0.001 to 0.003 ug / L.
  • the elemental concentrations of manganese in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.002 to 0.015, 0.008 to 0.015, 0.014 to 0.015, 0.002 to 0.014, 0. It is 008 to 0.014, or 0.002 to 0.008 ug / L.
  • the elemental concentrations of chromium in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.004 to 0.04, 0.02 to 0.04, 0.036 to 0.04, 0.004 to 0.036, 0. It is 02 to 0.036, or 0.004 to 0.02 ug / L.
  • the elemental concentrations of molybdenum in the medium containing deep sea water in the present disclosure are 0.163 to 1.627, 0.814 to 1.627, 1.464 to 1.627, 0.163 to 1.464, 0. It is 814 to 1.464, or 0.163 to 0.814 ug / L.
  • the "nerve regeneration promoting substance” refers to a substance produced by tissue cells derived from fetal appendages and / or umbilical cord blood cells, which directly or indirectly promotes nerve regeneration. Factors include chemokine, cytokines, growth factors and the like.
  • the nerve regeneration promoting substance can be confirmed by a known method. For example, optic nerve regrowth (Patent Document 2) can be evaluated in vivo, and proliferation, viability, or axonal elongation of neural progenitor cells can be measured and evaluated in vitro.
  • the neural progenitor cell may be a cell collected from a living body or a cell differentiated from a stem cell such as iPS, and may be a cell line (for example, A172, B65, C6, KS-1, N2A, PC12, SH-SY5Y, SKN-BE2). , T98G, U251, U87, YH-13, etc.) may be used.
  • TNF Superfamily Member 14 also called LIGHT
  • Interleukin (IL) -1a Interleukin (IL) -1a
  • IL-1b Interleukin-1b
  • IL-2 Interleukin-2
  • IL-3 Interleukin-4
  • IL-5 Interleukin-7
  • IL-10 Interleukin-12p40 / 70
  • IL-13 Interleukin-15
  • IFN Interferon
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • CXC Chemokine Ligand (CXCL) 1/2/3 also called GROa / b / g
  • CXCL6, CXCL9 also called MIG
  • CXCL10 also called IP-10
  • CXCL12 also called SDF-1) CXCL13
  • the nerve regeneration promoting substance includes some or all of the following factors. : 1) Factors that promote the proliferation and survival of neural progenitor cells such as BDNF, CCL5, CXCL1, CXCL7, CXCL8, CX3CL1, EGF, FGF-9, G-CSF, IGF-1, IL-6, OPN; 2) Differentiation of neural progenitor cells such as BDNF, CCL11, CXCL1, CXCL7, CXCL9, CXCL12, CX3CL1, FGF-4, FGF-9, GDNF, GM-CSF, IL-1b, LIF, OPN, SCF, TGF-b3 ⁇ Factors that promote maturation; 3) Factors that promote the migration of neural progenitor cells such as CCL2, CCL11, CCL20, CXCL1, CXCL7, CXCL8, CXCL12, EGF, and IGF-1; 4) Neurotrophic factors such as GDNF, NGF, NT-4 /
  • preferred nerve regeneration promoting substances include BDNF, CCL5, CXCL1, CX3CL1, EGF, FGF-9, G-CSF, IL-6, OPN, FGF-4, GM-CSF, IL-1b, OPN, and the like.
  • One or more substances selected from the SCF group can be mentioned, and more preferable nerve regeneration promoting substances include the group of BDNF, CXCL1, CX3CL1, EGF, FGF-9, G-CSF, IL-6, and FGF-4.
  • One or more substances selected from are mentioned. 4.
  • the "culture" of fetal appendage-derived tissue cells and / or umbilical cord blood cells can be carried out according to a conventional method, for example, as follows. can.
  • tissue cells derived from fetal appendages and / or umbilical cord blood cells are added to the medium containing the above-mentioned deep sea water, and the culture temperature is 30 ° C to 40 ° C, preferably 37 ° C in a CO2 incubator.
  • the carbon dioxide gas concentration is adjusted to 0.03% to 40%, preferably 5 to 10%, and more preferably 5% for culturing.
  • the culture period can range from a short period of several hours to 1 day, 1.5 days, 2 days, 3 days, 5 days and 7 days.
  • the medium of fetal appendage-derived histiocytes and / or umbilical cord blood cells preferably does not contain serum.
  • serum-free medium serum-free medium
  • the culture time of fetal appendage-derived histiocytes and / or umbilical cord blood cells is not particularly limited as long as the production of nerve regeneration promoting substances is enhanced, and for example, 5 hours to 7 days, 1 day to 6 days, 1 day to 5 Days, 1 to 4 days, 1 to 3 days or 1 to 2 days, 0.5 days, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days or 7 days Is.
  • the culture temperature is, for example, 36 ° C to 38 ° C, for example 37 ° C, and the CO2 concentration is 4 to 6%, for example 5%.
  • the oxygen concentration may be the same as in the atmosphere or may be lower (1 to 20%).
  • the oxygen concentration is 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% and 20%.
  • the culture may be carried out by, for example, three-dimensional culture under non-adhesive conditions, for example, suspension culture (for example, dispersion culture, agglutination suspension culture, etc.).
  • the density of tissue cells derived from fetal appendages and / or umbilical cord blood cells at the start of culture is, for example, 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells / mL, 5 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • 1, 1 x 10 5 to 5 x 10 6 pieces / mL, 2 x 10 5 to 5 x 10 6 pieces / mL, 5 x 10 5 to 5 x 10 6 pieces / mL or 1 x 10 6 to 5 x 10 6 pieces / ML may be 2 ⁇ 10 5 pieces / mL, 3 ⁇ 10 5 pieces / mL, 4 ⁇ 10 5 pieces / mL, 5 ⁇ 10 5 pieces / mL, 6 ⁇ 10 5 pieces / mL, 7 ⁇ 10 5 pieces / mL, 8 x 10 5 pieces / mL, 9 x 10 5 pieces / mL, 1 x 10 6 pieces / mL, 2 x 10 6 pieces / mL, 3 x 10 6 pieces / mL, 4 x 10 6 Pieces / mL, 5 x 10 6 pieces / mL, 6 x 10 6 pieces / mL, 7 x 10 6 pieces / mL,
  • Example 1 Preparation of cells 1) Preparation of human cord blood mononuclear cells
  • Umbilical cord blood mononuclear cells were prepared as follows. That is, 1 mL of heparin sodium injection (1,000 U / mL) was placed in a 50-mL polypropylene tube, and about 30 mL of human umbilical cord blood donated by an informed outlet from the Department of Obstetrics and Gynecology, Kochi University Hospital was placed in this tube. Collected. The collected human umbilical cord blood was diluted 3-fold with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • Diluted cord blood was carefully layered on a 50-mL polypropylene tube pre-added with 15 mL Lympholite-H (Cedarlane) and centrifuged at 800 xg for 20 minutes. The separated mononuclear cell layers were collected, HBSS was added, and the cells were washed by centrifugation at 300 xg for 10 minutes.
  • a cell cryopreservation solution STEM-CELL BANKER manufactured by TAKARABIO
  • the cryopreserved cells were frozen and thawed at the start of use, and then washed with HBSS or various cell cultures supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) depending on the purpose of the experiment.
  • FBS fetal bovine serum
  • the human umbilical cord was immersed in 70% ethanol for several seconds to sterilize it, and a phosphate buffer solution (D-PBS) was used to wash and remove blood and the like adhering to the surroundings.
  • D-PBS phosphate buffer solution
  • the umbilical cord was then incised to remove the umbilical vein and umbilical artery, and the Walton umbilical cord was separated from the periumbilical cord membrane. After chopping Walton colloid, 2 g of tissue pieces were lined up on a 10 cm plastic petri dish.
  • amniotic connective tissue was immersed in a [2.4 mg / L Collagenase, 0.0 l mg / mL DNase] enzyme solution and reacted at 37 ° C. for 1.5 hours to disperse the amniotic connective tissue.
  • the amniotic membrane-bound woven dispersion was passed through a 70 ⁇ m cell strainer, and the passed solution was subjected to centrifugation, removal of supernatant, and D-PBS resuspension operation twice to remove the enzyme solution, and MEM ⁇ (10%) was added to the obtained cells.
  • FBS, 100u / mL Pencillin, including 100 ⁇ g / mL Streptomycin) was added and cultured at 37 ° C. under 5% CO2.
  • the cells obtained by subculturing the proliferated cells 2 to 5 times were designated as amniotic membrane-derived mesenchymal cells.
  • the human fetal membrane was immersed in 70% ethanol for several seconds to sterilize it, and the membrane was peeled off by a manual method.
  • the second layer from the fetal side of the fetal membrane was recovered as a chorionic connective tissue, and the membrane structure was confirmed by Hematoxylin-Eosin staining.
  • the chorionic connective tissue was immersed in a [2.4 mg / L Collagenase, 0.0 l mg / mL DNase] enzyme solution and reacted at 37 ° C. for 1.5 hours to disperse the chorionic connective tissue.
  • the chorionic connective tissue dispersion was passed through a 100 ⁇ m cell strainer, and the passed solution was subjected to centrifugation, removal of the supernatant, and D-PBS resuspension operation twice. Further, the mixture was immersed in a [0.05% Trypsin / 0.2 mM EDTA] solution, reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and then MEM ⁇ (including 10% FBS, 100u / mL Penicillin, 100 ⁇ g / mL Streptomycin) was added to carry out the reaction. I stopped it.
  • the dispersion solution by Trypsin was passed through a 70 ⁇ m cell strainer, and the passed solution was subjected to centrifugation, supernatant removal, and D-PBS resuspension operation twice to remove the enzyme solution, and MEM ⁇ (10%) was added to the obtained cells.
  • FBS 100u / mL Penicillin, including 100 ⁇ g / mL Streptomycin
  • Chorion-derived mesenchymal cells were defined as cells that were passaged 2-5 times from the proliferated cells.
  • Example 2 Assay Quantification of secreted proteins The concentrations of various proteins secreted by postpartum-derived cells into the culture supernatant were quantified by an antibody array (Human Cytokine Array C5, manufactured by RayBiotech). The relative expression intensities of the following secretory components were measured according to the protocol specified by the manufacturer: BDNF, CCL5, CXCL1, CX3CL1, EGF, FGF-4, FGF-9, G-CSF, GM-CSF, IL-1b, IL-6, OPN, SCF.
  • Progenitor Cell Proliferation Human neuroblastoma strain (SH-SY5Y) cells (ATCC, No. CRL-2226) were seeded in DMEM culture medium at 2x10 5 cells / mL in 100 ⁇ L increments on 96-well plastic plates. 100 ⁇ L of various culture supernatants were added, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO2 for 7 days.
  • PrestoBlue cell vivability Reagent manufactured by Invitrogen
  • the fluorescence intensity (570 nm / 600 nm) of the culture solution was measured and divided by the value measured before the addition of the supernatant to calculate the doubling number of the cells proliferated by the addition of the culture supernatant.
  • Is a differentiation and maturation neural progenitors neural progenitor cells seeded human neuroblastoma strains SH-SY5Y (ATCC, No. CRL-2226) in 96-well plastic film blowing at 2xl0 5 cells / mL in DMEM culture solution by 100 ⁇ L did. 100 ⁇ L of various culture supernatants were added, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO2 for 5 days. After culturing, the images were taken with a phase-contrast microscope, and the length of the neurites was measured using the analysis software ImageJ (NIH).
  • Example 3 Medium with deep sea water RPMI1640 medium
  • deep sea water is 0, 8, 41, 73.
  • a medium containing 81% was prepared (Table 1). The concentrations of sodium and potassium ions were adjusted to prevent the osmotic pressure from increasing due to the addition of deep sea water.
  • "Tenkai no Mizu 1000" manufactured by Ako Kasei Co., Ltd. taken from offshore of Muroto, Kochi Prefecture was used.
  • Example 4 Culture of cord blood mononuclear cells Cell viability Suspension of cord blood mononuclear cells at a density of 2 ⁇ 10 6 cells / mL in RPMI1640 medium and deep sea water at 0, 8, They were added at 41, 73, 81% concentrations and cultured at 37 ° C. under 5% CO2 for 24 or 48 hours.
  • the survival rate of cells was measured using NucleoCounter NC-100 (manufactured by ChemoMetec), the survival rate decreased slightly with time, but it was good, and no significant difference was found with the addition or non-addition of deep sea water. Not (88% or more under any condition).
  • BDNF BDNF, CXCL1, CX3CL1, FGF-4, FGF-9, GM-CSF, IL-1b, which are factors involved in the proliferation and survival of neural progenitor cells with a peak of 41 to 81% due to the addition of deep sea water.
  • SCF, OPN in the culture supernatant increased. From the above, it was found that deep sea water added to the medium has the effect of enhancing the production of various factors related to nerve regeneration from cord blood mononuclear cells.
  • the culture supernatant of cord blood mononuclear cells promoted axon outgrowth of neural progenitor cells SH-SY5Y against the control RPMI 1640 medium (243%: 40 um vs 97 um).
  • the culture supernatant containing 73% or more of the deep sea water causes the axons of the neural progenitor cells to grow in a concentration-dependent manner of the deep sea water with respect to the corresponding medium containing 73% or more of the deep sea water. Promoted (275% -594%).
  • Example 5 Wharton's jelly from cultured cells) secretion Wharton's jelly-derived mesenchymal cells various proteins were suspended in RPMI1640 medium at a density of 2 ⁇ 10 5 cells / mL, the deep sea water is not added or 73% The cells were added at a concentration and cultured at 37 ° C. under 5% CO2 for 24 hours. The culture supernatant of Walton's gland-derived mesenchymal cells was collected, and the concentrations of various secreted proteins were measured by an antibody array.
  • the deep-sea water added to the medium enhances the production of nerve regeneration-promoting substances in cord blood mononuclear cells and fetal appendage-derived tissue cells such as Walton collagen-derived cells, and proliferates neural progenitor cells.
  • nerve regeneration-promoting substances in cord blood mononuclear cells and fetal appendage-derived tissue cells such as Walton collagen-derived cells, and proliferates neural progenitor cells.
  • -It was found that it promotes survival and / or differentiation / maturation, that is, enhances nerve regeneration.

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Abstract

胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の神経再生促進物質の産生に適した培地を提供する。

Description

胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養するための海洋深層水を含む培地
本発明は、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の神経再生促進物質産生向上のための、海洋深層水を添加した培地及びこれを利用した胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の培養方法に関する。
臍帯由来間葉系幹細胞を脳性麻痺患者へ投与する臨床研究が進められており、一部の運動機能においての改善が報告されている（非特許文献１）。また、臍帯血由来細胞を新生児脳出血モデルマウスに投与することにより、運動機能障害が有意に改善することが報告されている（特許文献１）。さらに、臍帯及び胎盤由来細胞を視神経傷害モデルマウスに移植することにより、視神経の再成長が促進されることが報告されている（特許文献２）。
臍帯及び胎盤由来細胞は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）等の神経栄養因子、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体リガンド１（ＣＸＣＬ１）等のケモカインを産生しており、これらの因子は神経再生を促進することが示唆されている。したがって、これらの因子の産生が高められた細胞や該細胞の培養上清には高い神経再生効果が期待される。
海洋深層水を添加した培地でヒト正常線維芽細胞を培養した場合、１０～２０重量％の濃度では細胞の増殖が促進されるが、４０～７０重量％濃度の海洋深層水を含む培地では、細胞が死滅することが報告されている（特許文献３）。
Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ　２０１５　１７（２）：　２２４－２３１
国際公開第２０１７／２０４２３１号 特表２００７－５２１７９３号公報 特開２００３－３３４０６６号公報
　　脳出血や虚血、神経細胞死、脊髄損傷等を起因とする神経障害を治療等するためには、当該原因により障害を受けた神経細胞等の保護または再生を促進する必要がある。このような神経細胞等の保護または再生のため臍帯由来細胞を投与することが考えられているが、効果が十分とは言えない。臍帯由来細胞や胎盤由来細胞などの胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞からの神経再生促進物質の産生を高めるための培地を提供することを課題とする。
　　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を、海洋深層水を添加した培地で培養することにより、神経再生促進物質の産生が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
　　すなわち、本発明は、下記に関するものである：
（１）胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養するための、海洋深層水を含む培地。
（２）胎児付属物由来組織細胞が、臍帯由来細胞、卵膜由来細胞、胎盤由来細胞またはこれらの組み合わせの細胞である、（１）に記載の培地。
（３）前記細胞が臍帯血由来単核球細胞又はワルトン膠質細胞である、（１）または（２）に記載の培地。
（４）前記細胞が幹細胞である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の培地。
（５）無血清培養のための、（１）～（４）のいずれか１項に記載の培地。
（６）培地の硬度が、１５０～８５０ｍｇ／Ｌである、（１）～（５）のいずれか１項に記載の培地。
（７）海洋深層水の濃度（ｖ／ｖ）が、５～８５％である、（１）～（６）のいずれか１項に記載の培地。
（８）前記細胞から神経再生促進物質を産生させるための、（１）～（７）のいずれか１項に記載の培地。
（９）神経再生促進物質の産生が高められた前記細胞を調製するための、（１）～（８）のいずれか１項に記載の培地。
（１０）神経再生促進物質がサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子である、（１）～（９）のいずれか１項に記載の培地。
（１１）サイトカイン、ケモカインまたは増殖因子がＢＤＮＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦ、ＦＧＦ－９、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＦＧＦ－４の群から選ばれる１又は２以上である、（１）～（１０）のいずれか１項に記載の培地。
（１２）（１）～（１１）のいずれか１項に記載の培地を用いて、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養する方法。
本発明によれば、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の神経再生促進物質の産生を高めることができる培地を提供することが可能となる。本培地で培養した胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞、または当該細胞の培養上清は、高い神経再生促進効果が期待できる。
　以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
　なお、本開示で引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許文献等は、何れもその全体が援用により、あらゆる目的において本開示に組み込まれるものとする。
　本開示において、数値に対して適用された場合の「～」とは、規定された基準値以上で、かつ規定された基準値以下の範囲に入る値の範囲を指す。
１．胎児付属物由来組織細胞
１－１）胎児付属物由来組織
本開示において「胎児付属物由来組織」（「分娩後由来組織」ともいう）とは、分娩時に摘出される一群の組織を意味し、臍帯、卵膜（羊膜、絨毛膜、脱落膜からなる）、胎盤などを含む。本発明の胎児付属物由来組織は、哺乳類から採取された組織であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の胎児付属物由来組織である。より好ましくは、ヒトの胎児付属物由来組織である。
　本開示において「臍帯」とは、胎児と胎盤を繋ぐ白色の管状組織であり、胎盤を含まない組織を意味する。臍帯の実質部分である「ワルトン膠質」は、胚外中胚葉由来の結合組織を意味し、２つの臍動脈と臍静脈とを覆うことによって臍帯を保護する。本発明の臍帯は、哺乳類から採取された臍帯であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の臍帯である。より好ましくは、ヒトの臍帯である。
　本開示において「卵膜」とは、羊水を包んでいる膜のことを意味する。卵膜は一枚の膜ではなく、子宮内膜の変化したものである「脱落膜」、「絨毛膜」及び「羊膜」の３層から構成されている。本発明の卵膜は、哺乳類から採取された卵膜であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の卵膜である。より好ましくは、ヒトの卵膜である。また、卵膜の内層である羊膜、中間層である絨毛膜、外層である脱落膜をそれぞれ分離して使用してもよく、これらの膜組織を組み合わせて使用してもよい。
　本開示において「胎盤」とは、出産後の母体から得ることができる胎盤組織を示す。胎盤は分娩後容易に摘出することができるが、臍帯血バンクで臍帯血分離採取後、インフォームドコンセントを得て入手したヒト胎盤を用いるのが好ましい。より好ましくは、感染症等の検査結果等の詳細を把握した上記胎盤を用いる。本発明の胎盤は、哺乳類から採取された胎盤であれば特に限定されないが、例えば、霊長類哺乳動物の胎盤である。より好ましくは、ヒトの胎盤である。
本開示において「胎児付属物由来組織細胞」（「分娩後由来組織細胞」ともいう）とは、胎児付属物由来組織から、物理的及び／又は酵素的処理により得られる細胞を意味し、各種細胞の集合であってもよく、単離された幹細胞であってもよい。すなわち、多世代にわたる継代培養や、抗体を用いる免疫磁気分離法、免疫比重遠心法、ＦＡＣＳを利用した方法などによる公知の細胞分画により得ることができる、臍帯血や胎児付属物由来組織由来の各種幹細胞であってもよい。
１－２）胎児付属物由来組織の回収および処理
　　一般に、胎児付属物由来組織は生後のその娩出直後に回収する。好ましい実施形態では、胎児付属物由来組織は、インフォームドコンセント後にドナーから、又は臍帯血バンクを介して回収する。ドナーの感染症等の病歴または検査結果を得て胎児付属物由来組織と関連付けることが好ましい。このような病歴を使用して、胎児付属物由来組織またはそこから採取した胎児付属物由来組織細胞の使用を制限することができる。
　　胎児付属物由来組織細胞を回収する前に、臍帯血および胎盤血等の血液を除去及び／または洗浄することが好ましい。特定の実施形態では、例えば、胎盤中の血液を回収する。これには従来の血液回収プロセスを施すことができる。典型的には、流注下でニードルまたはカニューレを使用して胎盤から採血する（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、米国特許第５，３７２，５８１号；Ｈｅｓｓｅｌら、米国特許第５，４１５，６６５号を参照）。ニードルまたはカニューレは通常臍静脈中に配置し、胎盤を軽くマッサージして胎盤からの臍帯血の流出を容易にすることができる。胎盤はさらなる操作なしで流注により出血して、臍帯血回収の際の組織破壊を最小にすることが好ましい。
　　哺乳動物の胎児付属物由来組織またはその一部分は、概して前述のように回収し調製した後、任意の当技術分野で知られている方法で処理することができる、例えば、灌流、洗浄、細切、破壊または培養容器へ接着することができ、例えば、細切後、１つまたは複数の組織破壊酵素で消化、または培養容器へ接着して胎児付属物由来組織細胞を得ることができる。
一実施形態では、器官の一部または全部の物理的破壊によって、哺乳動物胎児付属物由来組から細胞を回収する。例えば、胎児付属物由来組織、またはその一部分は、例えば、破砕する、せん断する、細分する、さいの目に切る、細切れにする、細かく砕く、メッシュに通すなどすることができる。典型的には、胎児付属物由来組織は、例えば、培地、生理食塩水等の細胞の生存を害しない溶液に浸して破壊することができる。次いで組織を培養して、接着性の胎児付属物由来組織細胞の集団を得ることができる。
　　物理的破壊および／または酵素による消化および細胞回収の前に、胎児付属物由来組織を個別の組織に切断することができる。例えば、羊膜、絨毛膜等の卵膜、臍帯、胎盤葉、またはこれらの任意の組合せの全部または一部を得るように切断することができる。胎児付属物由来組織細胞は、羊膜、絨毛膜、臍帯（ワルトン膠質等）またはこれらの任意の組み合わせから得ることが好ましい。典型的には、胎児付属物由来組織細胞は、胎児付属物由来組織の小さな塊、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または約１０００立方ミリメートル体積である胎児付属物由来組織の塊の破壊によって得ることができる。例えばトリパンブルー色素排除試験法により測定して、破壊法が複数、より好ましくは大部分、およびより好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の前記胎児付属物由来組織中の細胞を生存状態にするという条件で、任意の物理的破壊法を使用することができる。
　　別の特定の実施形態では、胎児付属物由来組織細胞は胎児付属物由来組織の物理的破壊によって回収し、この場合物理的破壊は酵素による消化を併用し、これは１つまたは複数の組織消化酵素を使用することによって実施することができる。胎児付属物由来組織を消化するために使用することができる酵素には、パパイン、デオキシリボヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼまたはエラスターゼなどがある。セリンプロテアーゼは血清中でアルファ２マイクログロブリンによって阻害される可能性があり、また血清中には基質となるタンパク質が大量に含まれるため、消化に使用する培地は通常無血清である。一般にＥＤＴＡおよび／またはＤＮａｓｅを酵素による消化の手順中で使用して、細胞回収の効率を増大させることができる。
　　組織消化酵素は任意の組合せとして使用することができる。トリプシンを使用する消化に関する典型的な濃度は、トリプシン０．０５％～約２％、例えば、トリプシン約０．０５％を含む。プロテアーゼは組合せで、すなわち２つ以上のプロテアーゼを同じ消化反応中で使用することができ、または同時に使用して胎児付属物由来組織細胞を切り離すことができる。例えば、一実施形態では、胎盤、またはその一部分を、例えば３０分間約１～約２ｍｇ／ｍｌで適量のコラゲナーゼＩを用いて最初に消化して、次に３７℃において例えば１０分間約０．２５％の濃度で、トリプシンを用いて消化する。セリンプロテアーゼは、他の酵素の使用後に連続して使用することが好ましい。
　　消化後、消化物を例えば血清を含む培養培地で洗浄し、洗浄した細胞は培養容器に播種する。次いで細胞は差次的接着によって単離し、間葉系細胞を調製する。例えば、臍帯のワルトン膠質由来間葉系細胞、卵膜の羊膜由来間葉系細胞、卵膜の絨毛膜由来間葉系細胞、及び胎盤由来間葉系細胞を調製することができる。さらに、これらの間葉系細胞は、複数回、好ましくは１，２，５，８，１０，１５又は２０回以上、また、５０、４０、３０、２５回以下の範囲で、血清を含む培養培地で継代培養することができる。
１－３）臍帯血細胞
　本開示において「臍帯血」とは、臍帯の中に含まれる胎児血のことをいい、「ヒト臍帯血」とは、ヒトの臍帯から取得できる血液のことをいう。ヒト臍帯血は、経膣分娩および帝王切開にて娩出された胎盤および臍帯を含む産褥組織から適宜胎盤を取り除き回収する臍帯から調製することができる。また、ヒト臍帯血は例えば、兵庫臍帯血バンク等の臍帯血バンクから取得することもできる。
本開示において「臍帯血単核球細胞」とは、臍帯血に含まれる細胞のうち、単核である細胞をいう。臍帯血単核球細胞は臍帯血から分離することができ、該分離方法には、比重遠心法（例えば、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｅ、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐが使用できる）、セルソーターを用いた方法、更に抗体を用いる免疫磁気分離法、免疫比重遠心法、ＦＡＣＳを利用した方法などがある。さらに、透析膜を使用して、臍帯血から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ－５Ｂ－ＳＣＤ、旭化成）等も使用可能であるが、特に限定されない。臍帯血単核球細胞は各種細胞の集合であってもよく、単離された幹細胞であってもよい。すなわち、多世代にわたる継代培養や、抗体を用いる免疫磁気分離法、免疫比重遠心法、ＦＡＣＳを利用した方法などによる公知の細胞分画により得ることができる、臍帯血や胎児付属物由来組織由来の各種幹細胞であってもよい。
１－４）幹細胞
　「幹細胞」は、未分化の細胞群であって、単一の細胞が、自己再生できる能力と、分化
して子孫細胞群（自己再生する前駆細胞と、自己再生できない前駆細胞と、最終分化細胞を含む）を産生する能力によって定義される。本開示における幹細胞は、胎児付属物由来組織細胞又は臍帯血に含まれる幹細胞であり、造血幹細胞、間葉系幹細胞、非限定体細胞幹細胞、胚様幹細胞、多能性幹細胞、内皮前駆細胞、ワルトン膠由来間葉系幹細胞が含まれる（Ｂｏｒｕｃｚｋｏｗｓｋｉら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｓｃｉ．　２０１９；２０（１０）、ｐ２４３３．）。
本開示における胎児付属物由来組織由来幹細胞としては、特に限定されるものではないが、臍帯血由来幹細胞、臍帯由来幹細胞、卵膜由来幹細胞、胎盤由来幹細胞が含まれ、造血幹細胞、間葉系幹細胞、非限定体細胞幹細胞、胚様幹細胞、多能性幹細胞、内皮前駆細胞、ワルトン膠由来間葉系幹細胞が好適である。これらの幹細胞は公知の方法で調製することができる。動物種も特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等のいずれの動物由来のものも使用できる。
　胎盤由来細胞としては、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に預けられている、受入れ番号ＰＴＡ－６０７４、ＰＴＡ－６０７５、ＰＴＡ－６０７９があげられ、臍帯由来細胞としては、受入れ番号ＰＴＡ－６０６７、ＰＴＡ－６０６８があげられる。また、ワルトン膠質由来間葉系幹細胞としては、臍帯由来間葉系幹細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｃｏｒｄ　ｄｅｒｉｖｅｄ　　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　　Ｓｔｅｍ　　Ｃｅｌｌｓ　　Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ　　Ｊｅｌｌｙ）であるＦＣ－００２０（ＬｉｆｅＬｉｎｅ社）等が市販されている。
本開示における胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞は、細胞数を増加させるため、または細胞の状態を維持するために、継代培養することができる。継代培養は、一般的な培養方法であれば特に限定されず、従来と同様の方法が用いられる。例えば、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、ウマ血清、ヒツジ血清等）を添加した基本培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地等）を使用して、ＣＯ２インキュベーター内で、培養温度を３０℃～４０℃、好ましくは３７℃で、二酸化炭素ガス濃度を０．０３％～４０％、好ましくは５～１０％、さらに好ましくは５％に調節して行うことができる。
２．培地
２－１）基本培地
本開示における基本培地とは、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の培養に必須の炭素源、窒素源及び無機塩等を含有させた培地をいう。本開示における胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞のための培養用基本培地は、培養して得られる細胞やその培養上清を動物（ヒトを含む）の疾患の治療のために用いる可能性を考慮すると、できるだけ生物由来原料を含まない培地（例えば、無血清培地）であることが好ましい。胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞のための培養用基本培地には海洋深層水が含まれ、さらに必要に応じて、微量栄養促進物質の微量有効物質を配合してもよい。このような基本培地としては、当業者に公知の動物細胞培養用培地を使用することができる。具体的には、イーグル培地のような最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α（ＭＥＭ－α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ　　Ｆ－１２及びＦ－１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等、これらの混合培地等が挙げられる。胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞のための培養用基本培地として用いる場合には、特にはＲＰＭＩ－１６４０培地、ＤＭＥＭ培地またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地が好ましく用いられるが、これに限定されない。
胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞のための培養用培地には、アミノ酸・タンパク質類、無機塩類、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、ビタミン類、指示薬（フェノールレッド等）及び炭素源（グルコース等）や抗生物質等の添加剤を添加することができる。これらの添加剤の使用濃度は特に限定されず、通常の動物細胞用培地に用いられる濃度で用いることができる。
アミノ酸類としては、例えば、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、ジペプチド（Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン等）が挙げられる。
無機塩類としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられる。
ビタミン類としては、例えば、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ１３、ビタミンＢ１５、ビタミンＢ１７、ビタミンＢｈ、ビタミンＢｔ、ビタミンＢｘ、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＫ、ビタミンＭ、ビタミンＰ等が挙げられる。
その他、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン等の抗生物質；グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等の炭素源；マグネシウム、鉄、亜鉛、カルシウム、カリウム、ナトリウム、銅、セレン、コバルト、スズ、モリブデン、ニッケル、ケイ素等の微量金属；β－グリセロリン酸、デキサメタゾン、ロシグリタゾン、イソブチルメチルキサンチン、５－アザシチジン等の幹細胞分化誘導剤；２－メルカプトエタノール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ－アセチルシステイン等の抗酸化剤；アデノシン５’－一リン酸、コルチコステロン、エタノールアミン、インスリン、還元型グルタチオン、リポ酸、メラトニン、ヒポキサンチン、フェノールレッド、プロゲステロン、プトレシン、ピルビン酸、チミジン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、ラクトフェリン、アルブミン（ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、オボアルブミン等）、牛血清由来Ｆｅｔｕｉｎ、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、Ｌｉｐｉｄ混合物、ＩＴＳＥ（インスリン、トランスフェリン、セレニウム、及びエタノールアミン）混合物、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔなど）、各種コンディションド培地等を添加してもよい。
本開示における胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞のための培養用培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に、海洋深層水、抗生物質等を加えた培地；ＲＰＭＩ－１６４０培地に、海洋深層水、抗生物質等を加えた培地、ＤＭＥＭ培地に、海洋深層水、抗生物質等を加えた培地等が挙げられる。
本発明の培地の調製方法は、特に限定されず、従来公知の方法に従って調製することができる。例えば、海洋深層水を含む水（蒸留水、脱イオン水等）に動物細胞培養用基本培地粉末を溶解し、室温で、又は必要に応じて加温して、上述した各添加成分を添加・混合し、高圧蒸気滅菌またはろ過滅菌等で処理して得られる。なお、海洋深層水の添加により浸透圧が上昇するのを防止するために、ナトリウムイオン及び／又はカリウムイオン等の濃度を調整することができる。
本発明の培地は液体であることが好ましいが、必要に応じてゲル状としたり、寒天培地等の固形培地としてもよい。本発明の培地によれば、培養表面が表面処理されていない培養容器又は培養用担体に間葉系幹細胞を播種してインキュベートすることができる。
２－２）海洋深層水
　本開示において、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞のための培養用培地は、海洋深層水を含む。「海洋深層水」とは、一般的に深度２００メートルより深いところの海水であって、グリーンランド周辺において、塩分濃度差によって生じた「プルーム」と呼ばれる垂直に沈む地球規模の海流が始まりとなって、一度も大気に触れる事なく、何世紀もの歳月をかけて地球を回っているといわれる海水である。この海洋深層水は、太陽光線がほとんど届かず、しかも低温高圧の状態にあるので、細菌が少なく、無機栄養塩（ミネラル）等を豊富に含んでいる。海洋深層水を含むことにより、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の神経再生促進物質の産生を高めることができる。培地中に含まれる海洋深層水の濃度（ｖ／ｖ）は、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４１％、５０％、６０％、７０％、７３％、８０％または８１％以上であり、また９０％、８１％、８０％、７３％、７０％、６０％、５０％、４５％、４１％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または８％以下であり、１～８５％、５～８５％、１０％～８５％、１５％～８５％、２０％～８５％、２５％～８５％、３０％～８５％、４０％～８５％、５０％～８５％、６０％～８５％、７０％～８５％、８０％～８５％、１～７５％、５～７５％、１０％～７５％、１５％～７５％、２０％～７５％、２５％～７５％、３０％～７５％、４０％～７５％、５０％～７５％、６０％～７５％、７０％～７５％、１～４５％、５～４５％、１０％～４５％、１５％～４５％、２０％～４５％、２５％～４５％、３０％～４５％、４０％～４５％、１～１０％、５～１０％、８～８１％、８～７３％、８～４１％、４１～８１％、４１～７３％または７３％～８１％である。
本開示における海洋深層水を含む培地の硬度は、例えば、１５０、１５６、２００、２５０、３００、３５０、４００、４４７、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７３９、７５０、８００、８１２または８５０ｍｇ／Ｌ以上であり、また９００、８５０、８１２、８００、７５０、７３９、７００、６５０、６００、５５０、５００、４６０、４４７、４００、３５０、３００または２５０ｍｇ／Ｌ以下であり、１５０～９００、２００～９００、３００～９００、４００～９００、５００～９００、６００～９００、７００～９００、８００～９００、１５０～８５０、２００～８５０、３００～８５０、４００～８５０、５００～８５０、６００～８５０、７００～８５０、１５０～８００、２００～８００、３００～８００、４００～８００、５００～８００、６００～８００、７００～８００、１５０～７００、２００～７００、３００～７００、４００～７００、５００～７００、６００～７００、１５０～６００、２００～６００、３００～６００、４００～６００、５００～６００、１５０～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００、１５０～４００、２００～４００、３００～４００、１５６～８１２、１５６～７３９、１５６～４４７、４４７～８１２、４４７～７３９または７３９～８１２ｍｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のカルシウムイオンＣａ２＋濃度は、例えば、２０、２１、２５、３０、３５、３７、４０、４５、５０、５４または５５ｍｇ／Ｌ以上であり、また１００、９０、８０、７０、６０、５８、５５、５４、５０、４５、４０、３７、３５、３０、２５または２１ｍｇ／Ｌ以下であり、２０～６０、２０～５８、２０～５４、２０～５０、２０～４５、２０～４０、２０～３７、２０～３５、２０～３０、２０～２５、２１～６０、２１～５８、２１～５４、２１～５０、２１～４５、２１～４０、２１～３７、２１～３５、２１～３０、２１～２５、３０～６０、３０～５８、３０～５４、３０～５０、３０～４５、３０～４０、３０～３７、３０～３５、３７～６０、３７～５８、３７～５４、３７～５０、３７～４５、３７～４０、４０～６０、４０～５８、４０～５４、４０～５０、４０～４５、５０～６０、５０～５８、５０～５４、５４～６０または５４～５８ｍｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のマグネシウムイオンＭｇ２＋濃度は、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８６、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４７または１５０ｍｇ／Ｌ以上であり、また２００、１９０、１８０、１７０、１６３、１６０、１５０、１４７、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８６、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５または２０ｍｇ／Ｌ以下であり、２０～２００、２０～１８０、２０～１６３、２０～１６０、２０～１４７、２０～１４０、２０～１２０、２０～１００、２０～８６、２０～８０、２０～６０、２０～４０、２０～３０、２５～２００、２５～１８０、２５～１６３、２５～１６０、２５～１４７、２５～１４０、２５～１２０、２５～１００、２５～８６、２５～８０、２５～６０、２５～４０、２５～３０、４０～２００、４０～１８０、４０～１６３、４０～１６０、４０～１４７、４０～１４０、４０～１２０、４０～１００、４０～８６、４０～８０、４０～６０、４０～５０、５０～２００、５０～１８０、５０～１６３、５０～１６０、５０～１４７、５０～１４０、５０～１２０、５０～１００、５０～８６、５０～８０、５０～６０、６０～２００、６０～１８０、６０～１６３、６０～１６０、６０～１４７、６０～１４０、６０～１２０、６０～１００、６０～８６、６０～８０、８０～２００、８０～１８０、８０～１６３、８０～１６０、８０～１４７、８０～１４０、８０～１２０、８０～１００、８０～８６、８６～２００、８６～１８０、８６～１６３、８６～１６０、８６～１４７、８６～１４０、８６～１２０、８６～１００、１００～２００、１００～１８０、１００～１６３、１００～１６０、１００～１４７、１００～１４０、１００～１２０、１００～１１０、１２０～２００、１２０～１８０、１２０～１６３、１２０～１６０、１２０～１４７、１２０～１４０、１４７～２００、１４７～１８０、１４７～１６３、１４７～１６０または１５０～２００ｍｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地の鉄の元素濃度は、０．００２～０．０２１、０．０１～０．０２１、０．０１９～０．０２１、０．００２～０．０１９、０．０１～０．０１９、または０．００２～０．０１ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地の亜鉛の元素濃度は、０．０１７～０．１７２、０．０８６～０．１７２、０．１５５～０．１７２、０．０１７～０．１５５、０．０８６～０．１５５、または０．０１７～０．０８６ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地の銅の元素濃度は、０．００８～０．０８３、０．０４１～０．０８３、０．０７５～０．０８３、０．００８～０．０７５、０．０４１～０．０７５、または０．００８～０．０４１ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のヨウ素の元素濃度は、０．７３９～７．３９１、３．６９５～７．３９１、６．６５１～７．３９１、０．７３９～６．６５１、３．６９５～６．６５１、または０．７３９～３．６９５ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のリンの元素濃度は、０．１９３～１．９２７、０．９６４～１．９２７、１．７３５～１．９２７、０．１９３～１．７３５、０．９６４～１．７３５、または０．１９３～０．９６４ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のセレンの元素濃度は、０．００１～０．００３ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のマンガンの元素濃度は、０．００２～０．０１５、０．００８～０．０１５、０．０１４～０．０１５、０．００２～０．０１４、０．００８～０．０１４、または０．００２～０．００８ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のクロムの元素濃度は、０．００４～０．０４、０．０２～０．０４、０．０３６～０．０４、０．００４～０．０３６、０．０２～０．０３６、または０．００４～０．０２ｕｇ／Ｌである。
本開示における海洋深層水を含む培地のモリブデンの元素濃度は、０．１６３～１．６２７、０．８１４～１．６２７、１．４６４～１．６２７、０．１６３～１．４６４、０．８１４～１．４６４、または０．１６３～０．８１４ｕｇ／Ｌである。
３．神経再生促進物質
本開示において、「神経再生促進物質」とは、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞が産生する物質のうち、神経再生を直接的または間接的に促進する因子であり、ケモカイン、サイトカイン、増殖因子等があげられる。神経再生促進物質は、公知の方法で確認することができる。例えば、視神経の再成長（特許文献２）をｉｎ　ｖｉｖｏで評価することができ、また、神経前駆細胞の増殖、生存率、または軸索伸長を測定してｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価することもできる。神経前駆細胞は生体から採取した細胞でもよく、ｉＰＳ等の幹細胞から分化させた細胞でもよく、細胞株（例えば、Ａ１７２，Ｂ６５，Ｃ６，ＫＳ－１，Ｎ２Ａ，ＰＣ１２，ＳＨ－ＳＹ５Ｙ，ＳＫＮ－ＢＥ２，Ｔ９８Ｇ，Ｕ２５１，Ｕ８７，ＹＨ－１３等）を用いてもよい。
胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞は、以下の因子の一部または全部を産生するが、神経再生促進物質としては、例えば、これらの因子のうち神経再生を直接又は間接的に促進する物質があげられる：
ＴＮＦ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　Ｍｅｍｂｅｒ　１４（ＬＩＧＨＴともいう），Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）－１ａ，ＩＬ－１ｂ，ＩＬ－２，ＩＬ－３，ＩＬ－４，ＩＬ－５，ＩＬ－７，ＩＬ－１０，ＩＬ－１２ｐ４０／７０，ＩＬ－１３，ＩＬ－１５，ＩＬ－１６，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ）－ｇ，Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＴＮＦ）－ａ，ＴＮＦ－ｂなどのサイトカイン；
Ｃ－Ｘ－Ｃ　Ｍｏｔｉｆ　Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸＣＬ）１／２／３（ＧＲＯａ／ｂ／ｇともいう），ＣＸＣＬ６，ＣＸＣＬ９（ＭＩＧともいう），ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０ともいう），ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ－１ともいう），ＣＸＣＬ１３，Ｃ－Ｃ　Ｍｏｔｉｆ　Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　Ｌｉｇａｎｄ（ＣＣＬ）１，ＣＣＬ４，ＣＣＬ５，ＣＣＬ７，ＣＣＬ８，ＣＣＬ１１，ＣＣＬ１３，ＣＣＬ１５，ＣＣＬ１７，ＣＣＬ１８，ＣＣＬ２０（ＬＡＲＣともいう），ＣＣＬ２２，ＣＣＬ２３，ＣＣＬ２４，ＣＣＬ２６，Ｃ－Ｘ３－Ｃ　Ｍｏｔｉｆ　Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　Ｌｉｇａｎｄ（ＣＸ３ＣＬ）１（ＦＫＮともいう）などのケモカイン；
Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，Ｂｒａｉｎ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ），Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ），Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）－４，ＦＧＦ－６，ＦＧＦ－７，ＦＧＦ－９，Ｆｍｓ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　３　Ｌｉｇａｎｄ（ＦＬＴ－３Ｌ），Ｇｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ），Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｃｏｌｏｎｙ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ－ＣＳＦ），Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ　Ｃｏｌｏｎｙ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ（Ｇ－ＣＳＦ），　Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ），Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）－１，Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｌｉｋｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＧＦＢＰ）－２，ＩＧＦＢＰ－１，ＩＧＦＢＰ－４，ＩＧＦＢＰ－３，Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）－ＢＢ，Ｐｌａｃｅｎｔａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＰＬＧＦ），Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）－ｂ１，ＴＧＦ－ｂ２，ＴＧＦ－ｂ３，Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ），Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ），Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｃｏｌｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ（Ｍ－ＣＳＦ），Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＮＴ）－３，ＮＴ－４，　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）－Ａなどの増殖因子／関連因子；
Ｌｅｐｔｉｎ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ），　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ），Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ（ＯＰＮ），Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ），Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ　Ｍ（ＯＳＭ），　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ（ＴＩＭＰ）－１，ＴＩＭＰ－２などのその他メディエーターなど。
本開示において、神経再生促進物質には以下の因子の一部又は全部が含まれる。：
１）ＢＤＮＦ，ＣＣＬ５，ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，ＣＸ３ＣＬ１，ＥＧＦ，ＦＧＦ－９，Ｇ－ＣＳＦ，ＩＧＦ－１，ＩＬ－６，ＯＰＮ等の神経前駆細胞の増殖・生存を促進する因子；
２）ＢＤＮＦ，　ＣＣＬ１１，ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ９，ＣＸＣＬ１２，ＣＸ３ＣＬ１，ＦＧＦ－４，ＦＧＦ－９，ＧＤＮＦ，ＧＭ－ＣＳＦ，ＩＬ－１ｂ，ＬＩＦ，ＯＰＮ，ＳＣＦ，ＴＧＦ－ｂ３等の神経前駆細胞の分化・成熟を促進する因子；
３）ＣＣＬ２，ＣＣＬ１１，ＣＣＬ２０，ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，ＣＸＣＬ１２，ＥＧＦ，ＩＧＦ－１等の神経前駆細胞の遊走を促進する因子；
４）ＧＤＮＦ，ＮＧＦ，ＮＴ－４／５等の神経栄養因子；
５）ＢＤＮＦ，ＩＦＮ－ｇ，ＩＬ－１ａ，ＩＬ－１ｂ等のアストロサイトを活性する因子；
６）ＣＣＬ１７，ＣＸＣＬ１０，Ｌｅｐｔｉｎ等のミクログリア細胞を活性化する因子；
７）ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，ＣＸＣＬ１２，ＣＸ３ＣＬ１，ＥＧＦ，Ｍ－ＣＳＦ，ＮＴ－４，ＩＧＦＢＰ－４等のオリゴデンドロサイト再生促進因子；
８）Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ５，ＣＸＣＬ６，ＣＸＣＬ７，ＣＸＣＬ８，Ｇｒｏａ／ｂ／ｇ，ＨＧＦ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－６、ＶＥＧＦ，ＳＣＦの血管新生因子；
９）ＣＣＬ４，ＩＬ－１０，ＩＬ－１３，ＴＧＦ－ｂ２等の抗炎症因子。
本開示において、好ましい神経再生促進物質としては、ＢＤＮＦ、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦ、ＦＧＦ－９、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＯＰＮ、ＦＧＦ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１ｂ、ＯＰＮ、ＳＣＦの群から選ばれる１又は２以上の物質があげられ、さらに好ましい神経再生促進物質としては、ＢＤＮＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦ、ＦＧＦ－９、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＦＧＦ－４の群から選ばれる１又は２以上の物質があげられる。
４．　胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の培養方法
胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の「培養」とは、常法に従って、例えば、以下のように実施することができる。培養容器中で、前記した海洋深層水を含む培地中に胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を加えて、ＣＯ２インキュベーター内で、培養温度を３０℃～４０℃、好ましくは３７℃で、二酸化炭素ガス濃度を０．０３％～４０％、好ましくは５～１０％、さらに好ましくは５％に調節して培養する。培養期間は、数時間レベルの短期間のものから、１日、１．５日、２日、３日、５日、７日間までを挙げることができる。
　本開示において胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の培地は、血清を含まないものであることが好ましい。血清を含まないことでプリオン等の感染のリスクや、ウシ血清アルブミン等の異種タンパク質の混入を防ぐことができ、対象において神経再生を促進する際の安全性が高められる。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養することによって、安全性の高い胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞や該細胞の培養上清を調製することができる。
胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の培養時間としては、神経再生促進物質の産生が高められれば特に限定されず、例えば、５時間～７日間、１日～６日間、１日～５日間、１日～４日間、１日～３日間または１日～２日間であってもよく、０．５日間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間である。培養温度は例えば、３６℃～３８℃、例えば３７℃、であり、ＣＯ２濃度は４～６％、例えば５％である。酸素濃度は大気中と同じ濃度であってもよく、より低濃度（１～２０％）であってもよい。例えば、酸素濃度は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％である。また、培養は、例えば非接着性条件下での三次元培養、例えば浮遊培養（例えば、分散培養、凝集浮遊培養など）により行ってもよい。
　胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞の培養開始時の該細胞の密度としては、例えば、１×１０４～１×１０７個／ｍＬ、５×１０４～５×１０６個／ｍＬ、１×１０５～５×１０６個／ｍＬ、２×１０５～５×１０６個／ｍＬ、５×１０５～５×１０６個／ｍＬまたは１×１０６～５×１０６個／ｍＬであってもよく、２×１０５個／ｍＬ、３×１０５個／ｍＬ、４×１０５個／ｍＬ、５×１０５個／ｍＬ、６×１０５個／ｍＬ、７×１０５個／ｍＬ、８×１０５個／ｍＬ、９×１０５個／ｍＬ、１×１０６個／ｍＬ、２×１０６個／ｍＬ、３×１０６個／ｍＬ、４×１０６個／ｍＬ、５×１０６個／ｍＬ、６×１０６個／ｍＬ、７×１０６個／ｍＬ、８×１０６個／ｍＬ、７×１０６個／ｍＬ、８×１０６個／ｍＬ、９×１０６個／ｍＬまたは１×１０７個／ｍＬである。　
　次に実施例によって本発明を更に詳細に説明する。なお，本発明はこれにより限定されるものではない。
　実施例１：細胞の調製
１）ヒト臍帯血単核球細胞の調製
臍帯血単核球細胞を以下のように調製した。すなわち、５０－ｍＬポリプロピレン製チューブにヘパリンナトリウム注射液（１，０００Ｕ／ｍＬ）１ｍＬを入れ、ここに高知大学医学部附属病院産婦人科からインフォームドコンセントにて供与された、ヒト臍帯血３０ｍＬ程度を採取した。採取したヒト臍帯血を、Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）により３倍に希釈した。あらかじめ１５ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ－Ｈ　（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ社製）を加えた５０－ｍＬポリプロピレン製チュ一ブに、希釈した臍帯血を慎重に重層し、８００ｘｇで２０分間遠心分離した。分離された単核球細胞層を集め、ＨＢＳＳを加えて３００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞を洗浄した。得られた単核球細胞に、１ｍＬの細胞凍結保存液ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬ　ＢＡＮＫＥＲ（ＴＡＫＡＲＡＢＩＯ社製）を加えて懸濁し、－８０℃の超低温冷凍庫にて凍結保存した。凍結保存細胞を、使用開始時に凍結融解後、実験の目的に応じてＨＢＳＳまたは１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加各種細胞培養液にて洗浄して使用した。
２）ワルトン膠質由来細胞の調製
高知大学医学部附属病院産婦人科からインフォームドコンセントにて供与された、ヒト臍帯を７０％エタノールに数秒浸漬させ滅菌し、リン酸緩衝液（Ｄ－ＰＢＳ）を用い、周囲に付着した血液等を洗浄除去した。その後、臍帯を切開して臍静脈及び臍動脈を除去し、ワルトン膠質を臍帯周囲膜から切り離した。ワルトン膠質を細切後、［２．４ｍｇ／Ｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、０．０ｌｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ］酵素溶液に浸漬させ、３７℃で３時間ワルトン膠質組織を分散させた。未消化の組織片を取り除き、「ワルトン膠質分散細胞」を調製した。
前記ヒト臍帯を７０％エタノールに数秒浸漬させ滅菌し、リン酸緩衝液（Ｄ－ＰＢＳ）を用い、周囲に付着した血液等を洗浄除去した。その後、臍帯を切開して臍静脈及び臍動脈を除去し、ワルトン膠質を臍帯周囲膜から切り離した。ワルトン膠質を細切後、１０ｃｍプラスチックシャーレ上に２ｇの組織片を並べた。組織片の上から細胞培養メッシュＣｅｌｌａｍｉｇｏ（登録商標）（ＴＳＵＢＡＫＩＭＯＴＯ　ＣＨＡＩＮ社製）を乗せ、ＭＥＭα（１０％　ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。組織片から遊走及び増殖した細胞を２～５回継代した細胞を「ワルトン膠質由来間葉系細胞」とした。
３）羊膜由来間葉系細胞の調製
高知大学医学部附属病院産婦人科からインフォームドコンセントにて供与された、ヒト卵膜を７０％エタノールに数秒浸漬させ滅菌し、用手法により膜の剥離を行った。卵膜胎児側から１層目を羊膜として回収し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ染色により膜構造の確認を行った。［０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ］溶液に浸漬させ、３７℃で１．５時間反応させて羊膜上皮組織を分散させた。残った羊膜結合織に対して［２．４ｍｇ／Ｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、０．０ｌ　ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ］酵素溶液に浸漬させ、３７℃で１．５時間反応させて羊膜結合織を分散させた。羊膜結合織分散液は７０μｍセルストレーナーを通過させ、通過した液に対し遠心分離及び上清除去、Ｄ－ＰＢＳ再浮遊操作を２回繰り返して酵素溶液を除き、得られた細胞にＭＥＭα（１０％　ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し、３７℃　、５％ＣＯ２下で培養した。増殖した細胞を２－５回継代した細胞を羊膜由来間葉系細胞とした。
４）絨毛膜由来間葉系細胞
前記ヒト卵膜を７０％エタノールに数秒浸漬させ滅菌し、用手法により膜の剥離を行った。卵膜胎児側から２層目を絨毛膜結合織として回収し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ染色により膜構造の確認を行った。絨毛膜結合織に対して［２．４ｍｇ／Ｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、０．０ｌ　ｍｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ］酵素溶液に浸漬させ、３７℃　で１．５時間反応させて絨毛膜結合織を分散させた。絨毛膜結合織分散液は１００μｍセルストレーナーを通過させ、通過した液に対し遠心分離及び上清除去、Ｄ－ＰＢＳ再浮遊操作を２回繰り返した。さらに［０．０５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．２　ｍＭ　ＥＤＴＡ］溶液に浸漬させ、３７℃で５分間反応後、ＭＥＭα（１０％　ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し反応を停止させた。Ｔｒｙｐｓｉｎによる分散液は、７０μｍセルストレーナーを通過させ、通過した液に対し遠心分離及び上清除去、Ｄ－ＰＢＳ再浮遊操作を２回繰り返して酵素溶液を除き、得られた細胞にＭＥＭα（１０％　ＦＢＳ，１００ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含む）を添加し、３７℃、５％　ＣＯ２下で培養した。増殖した細胞を２－５回継代した細胞を絨毛膜由来間葉系細胞とした。
　実施例２：アッセイ
分泌タンパク質の定量
分娩後由来細胞が培養上清中に分泌した各種タンパク質の濃度を抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製、Ｈｕｍａｎ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ａｒｒａｙ　Ｃ５）により定量した。メーカー指定のプロトコールに従い、以下の分泌因子の相対的発現強度を測定した：
ＢＤＮＦ、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦ、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－９、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＯＰＮ、ＳＣＦ。
神経前駆細胞の増殖
ヒト神経芽細胞腫株（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）細胞（ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ－２２２６）をＤＭＥＭ培養液にて２ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬで９６ウェルプラスチックプレートに１００μＬずつ播種した。各種培養上清を１００μＬ添加し、３７℃、５％　ＣＯ２下で７日間培養した。培養液にＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ　ｃｅｌｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を培養液の１０％（ｖ／ｖ）量添加し、３７℃、５％　ＣＯ２下で２時間インキュベートした。培養液の蛍光強度（５７０ｎｍ／６００ｎｍ）を測定し、上清添加前に測定した値で除して培養上清の添加により増殖した細胞の倍加数を算出した。
神経前駆細胞の分化・成熟
神経前駆細胞である、ヒト神経芽細胞腫株ＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ－２２２６）をＤＭＥＭ培養液にて２ｘｌ０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで９６ウェルプラスチックフレートに１００μＬずつ播種した。各種培養上清を１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養した。培養後位相差顕微鏡にて撮影し、解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用し神経突起の長さを測定した。
　実施例３：海洋深層水入り培地
ＲＰＭＩ１６４０培地粉末を海洋深層水に溶解したもの（１００％海洋深層水入り培地）を、ＲＰＭＩ１６４０培地と混合することにより、海洋深層水を０、８、４１、７３又は８１％含有する培地を調製した（表1）。海洋深層水の添加により浸透圧が上昇するのを防止するために、ナトリウムイオン及びカリウムイオンの濃度を調整した。海洋深層水としては、高知県室戸の沖合から取水した「天海の水　１０００」（赤穂化成社製）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 （NA: Not Assayed）
　実施例４：臍帯血単核球細胞の培養
細胞生存率
臍帯血単核球細胞を２×１０６細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、海洋深層水を０、８、４１、７３、８１％の濃度で添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で２４又は４８時間培養した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ　ＮＣ－１００（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製）を用いて細胞の生存率を測定したところ、経時的に生存率はわずかに低下するものの良好であり、海洋深層水の添加、非添加により有意な差は見られなかった（いずれの条件でも８８％以上）。
２）各種タンパク質の分泌
臍帯血単核球細胞の２４時間培養後の培養上清を回収して、各種分泌タンパク質の濃度を抗体アレイにより測定した。表２に示すように、海洋深層水の添加により、４１～８１％をピークに神経前駆細胞の増殖・生存にかかわる因子である、ＢＤＮＦ，ＣＣＬ５，ＣＸＣＬ１，ＣＸ３ＣＬ１，ＥＧＦ，ＦＧＦ－９，Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＯＰＮの培養上清中の濃度が増加した。また、海洋深層水の添加により、４１～８１％をピークに神経前駆細胞の増殖・生存にかかわる因子である、ＢＤＮＦ，ＣＸＣＬ１，ＣＸ３ＣＬ１，ＦＧＦ－４，ＦＧＦ－９、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１ｂ、ＳＣＦ，　ＯＰＮの培養上清中の濃度が増加した。以上のことから、培地に添加した海洋深層水には、臍帯血単核球細胞からの神経再生に関連する各種因子の産生を高める効果があることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
神経前駆細胞への効果
海洋深層水を添加して培養した臍帯血単核球細胞の培養上清が、ヒト神経芽細胞腫株ＳＨ－ＳＹ５Ｙの増殖、分化／成熟に効果があるかについて調べた（表３）。臍帯血単核球細胞の培養上清は、対照となる培地に対して、神経前駆細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙの増殖を促進した（３２５％）。海洋深層水を含む培地の添加は、濃度依存的に神経前駆細胞の増殖を抑制したものの、対応する培養上清は、海洋深層水の濃度依存的に神経前駆細胞の増殖を促進した（３５２％～１４７５％）。
臍帯血単核球細胞の培養上清は、対照となるＲＰＭＩ１６４０培地に対して、神経前駆細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙの軸索の伸展を促進した（２４３％：４０ｕｍ　ｖｓ　９７ｕｍ）。また、７３％以上の海洋深層水を含む培養上清は、対応する、７３％以上の海洋深層水を含む培地に対して、海洋深層水の濃度依存的に神経前駆細胞の軸索の伸展を促進した（２７５％～５９４％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例５：ワルトン膠質由来細胞の培養
１）各種タンパク質の分泌
ワルトン膠質由来間葉系細胞を２×１０５細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、海洋深層水を未添加又は７３％の濃度で添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。ワルトン膠質由来間葉系細胞の培養上清を回収して、各種分泌タンパク質の濃度を抗体アレイにより測定した。表４に示すように、７３％の海洋深層水の添加により、神経前駆細胞の増殖・生存にかかわる因子である、ＢＤＮＦ，ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦ、ＦＧＦ－９、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６の培養上清中の濃度が増加した。また、７３％の海洋深層水の添加により、神経前駆細胞の増殖・生存にかかわる因子である、ＢＤＮＦ，ＣＸＣＬ１，ＣＸ３ＣＬ１，ＦＧＦ－４，ＦＧＦ－９の培養上清中の濃度が増加した。
以上のことから、培地に添加した海洋深層水には、ワルトン膠質由来間葉系細胞からの神経再生に関連する各種因子の産生を高める効果があることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
神経前駆細胞への効果
海洋深層水を添加して培養したワルトン膠質分散細胞の培養上清が、ヒト神経芽細胞腫株ＳＨ－ＳＹ５Ｙの分化・成熟に効果があるかについて調べた。ワルトン膠質分散細胞の培養上清は、対照となるＲＰＭＩ１６４０培地に対して、神経前駆細胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙの軸索の伸展を促進した（１０５％：４２ｕｍ　ｖｓ　４０ｕｍ）。７３％の海洋深層水を含む培養上清は、対応する、７３％の海洋深層水を含む培地に対して、神経前駆細胞の軸索の伸展を促進した（２１９％：７０ｕｍ　ｖｓ　３２ｕｍ）。
以上のことから、培地に添加した海洋深層水には、ワルトン膠質細胞の神経再生促進物質の産生を高め、神経分化・成熟作用、すなわち神経再生を高める作用があることが分かった。
以上のことから、培地に添加した海洋深層水には、臍帯血単核球細胞、及びワルトン膠質由来細胞等の胎児付属物由来組織細胞の神経再生促進物質の産生を高め、神経前駆細胞の増殖・生存、及び／又は分化・成熟を促進し、すなわち神経再生を高めることが分かった。

Claims (12)

  1. 　胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養するための、海洋深層水を含む培地。
  2.  胎児付属物由来組織細胞が、臍帯由来細胞、卵膜由来細胞、胎盤由来細胞またはこれらの組み合わせの細胞である、請求項１に記載の培地。
  3.  前記細胞が臍帯血由来単核球細胞又はワルトン膠質細胞である、請求項１または２に記載の培地。
  4.  前記細胞が幹細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の培地。
  5.  無血清培養のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の培地。
  6.  培地の硬度が、１５０～８５０ｍｇ／Ｌである、請求項１～５のいずれか１項に記載の培地。
  7.  海洋深層水の濃度（ｖ／ｖ）が、５～８５％である、請求項１～６のいずれか１項に記載の培地。
  8.  前記細胞から神経再生促進物質を産生させるための、請求項１～７のいずれか１項に記載の培地。
  9.  神経再生促進物質の産生が高められた前記細胞を調製するための、請求項１～８のいずれか１項に記載の培地。
  10.  神経再生促進物質がサイトカイン、ケモカインまたは増殖因子である、請求項１～９のいずれか１項に記載の培地。
  11.  サイトカイン、ケモカインまたは増殖因子がＢＤＮＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＥＧＦ、ＦＧＦ－９、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＦＧＦ－４の群から選ばれる１又は２以上である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の培地。
  12.  請求項１～１１のいずれか１項に記載の培地を用いて、胎児付属物由来組織細胞及び／又は臍帯血細胞を培養する方法。
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