JP2011004612A - 培養基材、培養シート、及び細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】培養基材100は、細胞の接着性や遊走性を制御できるナノピラー103が形成された培養シートを、複数のホール101の低面である培養面に配置したことにより、各ホール101の培養面は、仕切り104を設けた構造となるため、播種された細胞の相互作用を制限することができ、形成される細胞の三次元構造の大きさを均一にすることが可能となる。
【選択図】図1
Description
また、播種された細胞が非接着領域に落ち込んだ場合、培養時の培地交換の際に培地と共に破棄され失われることが必至であり、効率的な培養方法とは言い難い。さらに接着領域に落ち込んだ細胞が回転培養により強制的に組織を形成させられるため、細胞に対するストレスがかかり活性の低下を招くことが懸念されている。
当該培養シートは細胞に悪影響の無い材質で形成され、本例では、ポリスチレンとしている。ただし、材質はポリスチレンに限らないことは云うまでもない。
孔104の底面に保持されている複数の突起物102は、複数の微小突起物103(以下、突起、ピラー、ナノピラーともいう)からなる。また、この孔104の直径をホール径105とする。当該培養シート100において、上記の仕切壁たるホール104と、当該ホール104の内部に形成されている複数の突起102とは同一材料で一体的に形成されている。なお、このホール102は、丸型形状に限定されるものでなく、四角形状等他の形状であっても良い。
さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。
例えばこれらを接着接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。
また溶着接合では、ホール104の内径が細胞形成レベルの極微小領域径のため、目的とする細胞領域を形成しつつ、仕切、突起に損傷を与えずに溶着することはかなり困難である。当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。
直径200μm、深さ70μmの円形の孔が正方配置され、その底面に直径2.0μm、深さ1.0μmの微細孔が4.0μmピッチで形成された金型を、400μmの厚さのポリスチレンフィルムに135℃、圧力2MPaでプレスした。室温に冷却後にプレス装置より取り出し、金型をポリスチレンフィルムから剥離することにより、ホール径が200μmのホールを複数保持し、その底面に複数の突起を有した培養シートが作製できる。
図13(a)は本実施例における培養基材の外観斜視図、上面図、上下側面図である。左右側面図は斜視図よりその形態が明らかであるため図示を省略する。
図13(b)は部分拡大図であり、A−A,B−B部分拡大図と、C−C,D−D部分拡大図を示すものである。
図13(c)は部分拡大図、及び端面図であり、E−E,F−F部分拡大図、G−G線端面図を示すものである。
続いてこの枠体と培養シート100を超音波溶着により接着する。
さらに個々の仕切内において細胞が成長するため、均一な大きさの細胞を形成させることが可能となる。
例えば接着で接合した場合には、培養領域の内部に接着剤成分が混入し、生成細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。
当該仕切や突起に損傷、変形があると、細胞形成過程において細胞に不要なストレスを与えたり、細胞自身の運動に障害となる可能性がある。
図14(a)は本実施例における培養基材の外観斜視図、底面図を示すものである。
図14(b)は培養基材の上面図、上下側面図を示すものである。ここで、左右側面図は外観斜視図よりその形態が明らかであるため、図示省略する。
図14(c)は部分拡大図、部分断面図であり、A−A,B−B部分拡大図と、C−C,D−D部分拡大図と、H−H断面図を示すものである。
図14(d)は部分拡大図、及び端面図であり、E−E,F−F部分拡大図、G−G線端面図を示すものである。
当該接合部1112は穴部111aの外部に設けられており、培養領域にはその溶着の影響がない。
したがって、本例では溶着を例示したが、当該接合方法に限らず、他の接合方法によっても培養領域自体に接合による影響を及ぼすことはないため、他の接合方法を採用することも可能である。
このカット面は必須ではなく、無くても良いことは云うまでもない。当該培養基材にはまた、滑止め1111が形成されており、作業中、作業者が不意に当該基材を揺動、落下等を防ぐことが出来る。
101,124…ホール
102…突起物集合体
103…突起物
104…仕切り
105…ホール径
106…ピラー径
107…ピラーピッチ
108…ピラー高さ
109…チャンバースライド
110…手術用接着剤
111…枠体
111a…枠体に形成された穴部
112…フィルム固定用突起
113…リブ構造
114…培養シート穴
115…細胞培養プレート
116…I型コラーゲン溶液
117…減圧用容器
118…減圧用ポンプ
119…洗浄用生理食塩水(PBS(−))
120…培地
121…肝細胞
122…肝細胞スフェロイド
125a,125b,127a,127b,129a,129b,129c…突起物配列パターン
1111…滑止め部
1112…接合部
1113…カット面。
Claims (23)
- 細胞を培養する培養基材であって、
培養シートと、前記培養シートを保持する培養シート保持部とを備え、
前記培養シートは培養領域を有し、前記培養領域内に複数の突起が形成され、前記培養領域を仕切る、前記突起よりも高い仕切りが形成されている、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
前記培養シートを囲む枠を少なくとも一つ有する、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項2に記載の培養基材であって、
前記枠は、前記培養シート保持部に当接されている、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
前記シート保持部は、少なくとも一つの穴部を有し、前記穴部の底面に前記培養シートが構成されている、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項4に記載の培養基材であって、
前記シート保持部は、その底部に突部が形成され、当該突部と、前記培養シートが溶着されている、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項2に記載の培養基材であって、
前記枠は四角形状もしくは丸型形状である、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項4に記載の培養基材であって、
前記穴部は四角形状もしくは丸型形状である、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
前記培養シートは、前記培養領域を複数有する、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
前記培養領域内に第一の領域と第二の領域とを有し、前記第一の領域における前記突起の幅/直径と、前記第二の領域における前記突起の幅/直径とが異なる、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
前記突起の幅/直径が多段階である、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
前記培養領域内に第一の領域と第二の領域とを有し、前記第一の領域における前記突起のピッチと、前記第二の領域における前記突起のピッチとが異なる、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
複数の前記突起のピッチが多段階である、
ことを特徴とする培養基材。 - 請求項1に記載の培養基材の、前記培養領域内の複数の突起において、当該領域内の第一の領域における突起の高さと、第二の領域における突起の高さとが異なることを特徴とする培養基材。
- 請求項1に記載の培養基材であって、
前記突起の高さが多段階に構成された、
ことを特徴とする培養基材。 - 細胞を培養する培養シートであって、
複数の培養領域と、
前記培養領域各々に形成された複数の突起と、
前記培養領域各々を仕切る、前記突起より高い高さを有する仕切りを備えた、
ことを特徴とする培養シート。 - 請求項15に記載の培養シートであって、
前記培養領域は、第一の領域と第二の領域を有し、前記第一の領域における前記突起の幅/直径と、前記第二の領域における前記突起の幅/直径とが異なる、
ことを特徴とする培養シート。 - 請求項15に記載の培養シートであって、
前記培養領域は、第一の領域と第二の領域を有し、前記第一の領域における前記突起のピッチと、前記第二の領域における前記突起のピッチとが異なる、
ことを特徴とする培養シート。 - 培養基材を用いた細胞培養方法であって、
前記培養基材は、その内部に複数の突起を有し、その周囲に前記突起より高い仕切りを有する培養領域が複数形成された培養シートを備え、
複数の前記培養領域各々に培養対象の細胞を播種することにより、前記培養領域各々で前記細胞の三次元組織を形成する、
ことを特徴とする細胞培養方法。 - 請求項18に記載の細胞培養方法であって、
前記細胞は胚性肝細胞、iPS細胞、および肝細胞を含む、
ことを特徴とする細胞培養方法 - 請求項18に記載の細胞培養方法であって、
前記培養基材は、前記培養シートを囲む枠体を有する、
ことを特徴とする細胞培養方法。 - 請求項1に記載の培養基材であって、
前記培養シートにおける前記仕切り及び複数の前記突起は、同一素材で一体的に形成されていることを特徴とする培養基材。 - 請求項15に記載の培養シートであって、
前記仕切り及び複数の前記突起は、同一素材で一体的に形成されていることを特徴とする培養シート。 - 請求項18に記載の細胞培養方法であって、
前記培養シートにおける前記仕切り及び複数の前記突起は、同一素材で一体的に形成されていることを特徴とする細胞培養方法。
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