JP2016504033A - ミエリン形成をアッセイするためのマイクロピラーアレイ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年12月19日に出願された米国仮特許出願第61/739,446号の利益を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所/国立神経疾患研究所によって授与された助成金番号NS062796の下で、政府の支援によってなされた。アメリカ政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
上述するように、ミエリン形成を促進する候補薬剤をスクリーニングする方法における使用に好適なマイクロピラーアレイが提供される。
ミエリン形成を促進する候補薬剤をスクリーニングする方法もまた、本明細書に開示される。特定の実施形態において、方法は、候補薬剤を、複数のマイクロピラーを含む基板および乏突起膠細胞の前駆細胞(OPC)を用いてインキュベートすることと、複数のマイクロピラー上のミエリン形成の存在もしくは不在を判定することと、を含んでもよく、複数のマイクロピラー上のミエリン形成の存在は、候補薬剤がミエリン形成を促進することを示す。
ミエリン形成をアッセイするためのシステムもまた、本明細書に提供される。これらのシステムは、対象の分子がミエリン形成に影響するかどうかを評価するために使用される場合がある。特定の実施形態において、本システムは、ミエリン形成を増加させる、または減少させる候補薬剤を特定するために使用される場合がある。
ミエリン形成は、乏突起膠細胞に対する軸索信号伝達の結果であると長らく考えられてきた(Colello and Pott,Mol.Neurobiol.15,83−100,1997)。したがって、これらの信号の特性を特定することは、修復を促進するために最も重要であり、実際にほとんどのミエリン形成研究の目標である。ミエリン形成の誘導が、何らかの形で軸索直径に密接に関係すること、すなわち、より大きい軸索はミエリン化される一方で、より小さい軸索はミエリン化されないことが、一般的に受け入れられる。軸索標的サイズの増加は、軸索直径の増加およびミエリンの発達の両方と相関する(Voyvodic,Nature342,430−433,1989)。しかしながら、この発見のみでは、軸索直径の増加がミエリン形成を開始するために十分であることを確立せず、代わりに軸索信号がミエリン発達を促進し、外性因子によって調整されることを実証する。我々の最近の発見は、乏突起膠細胞ミエリン形成の開始についての軸索直径の役割に異議を唱える、興味深い、代替の仮説を提供する。我々は、ナノファイバーが、潜在的に乏突起膠細胞ミエリン形成のための好適な足場としての役割を果たし得るかどうかについての調査を可能にする基板として軸索に取って代わる、電子紡糸ポリスチレンナノファイバーを開発した(図1)。
機能的スクリーニングを開発することは、迅速に、堅固、再現可能、かつ定量的な方法で、実験を行う能力を必要とする。ナノファイバー足場が、化合物をスクリーニングする上での前進を示すことを明確に実証している一方で、ファイバーはハイスループットスクリーニングに好適でない。ナノファイバーを小さいウェルにスピニングおよびパターン化することは、大きな困難を伴ってのみ達成することができ、非常に時間がかかる。更に、ミエリン結節間を特定し、定量化するための自動化ソフトウェアは、現在利用可能でない。
データの更なる分析時、我々は、マイクロピラーアレイの仕様が変更される必要があることを判定した。最初は、ピラーのアスペクト比における設計であった。乏突起膠細胞がピラーのより大きい基部直径に巻き付くことができなかったため、我々は、50μmの直径を用いてピラーの基部を設計することを決定した。2μmの頂部ピラー直径を維持しながら、我々は、ピラーの高さを25μmに減少させて、効率的な鞘形成および巻き付きを確保した。乏突起膠細胞によるミエリン膜の同心巻き付きの特定を確保するために、我々は、図5Eに観察されるように、ピラーが徐々に先細になることを維持した。マイクロピラーの離間配置(120μm)を、50μmに最適化して、オリゴデンドログリア細胞の数がマイクロピラーの密度に一致することを確保した。最後に、我々は、アレイが96マイクロウェルプレートに結合するようにパターン化した(図7)。
ミエリン形成の程度および動力学は、ほとんどのミエリン形成のためのスクリーニング計画を実時間で可視化することができないため、解決することが従来困難であった。したがって、我々は、マウス遺伝子を活用して、cre媒介組み換えの前にmemTomatoを、その後にmemEGFPを発現するマウス(pCA−tdTomato、−EGFP、Jackson)と組み合わせて、PLP−creERT2駆動マウスを使用する二重蛍光標識計画を用いる。乏突起膠細胞におけるタモキシフェンでの組み換えを誘導することによって、ミエリン形成を、memTomatoの不在でのmemEGFP陽性環の発現によって可視化し、定量化することができる。スクリーニングは、自動化した様式で経時的顕微鏡検査で実行され、完全なインキュベーションシステム内に封入されることになる。二重蛍光標識計画は、ミエリン形成の動力学および程度に対する影響を決定するための、定量化および分解能を可能にすることになる。二重蛍光標識計画を実施することによって、我々は、プロモーター駆動蛍光強度に基づいてこれらの工程を定量化し、経時的顕微鏡検査によって小分子および生物学的スクリーニングを開始することができる(図8)。蛍光強度における変化を試験し、定量化することによって、我々は、分化およびミエリン形成に対する影響を解決することができるはずである。概念の証明として、この目的において提案されるPLP−creERT2/pCA−tdTomato−EGFPレポーターマウスからのオリゴデンドログリアが、既にインビトロで単離、精製、分析されている(図8)。結果は、我々の仮説と一致し、本アプローチの有効性を説明する。
Claims (20)
- ミエリン形成を促進する候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、
候補薬剤を、複数のマイクロピラーを含む基板および乏突起膠細胞の前駆細胞(OPC)を用いてインキュベートすることと、
前記複数のマイクロピラー上のミエリン形成の存在もしくは不在を判定することと、を含み、
前記複数のマイクロピラーのミエリン形成の前記存在が、前記候補薬剤がミエリン形成を促進することを示し、
前記複数のマイクロピラーが、前記基板から垂直に突出し、かつ前記基板に付着した前記マイクロピラーの基部から、前記基板から突出する前記マイクロピラーの先端部へと直径が先細になる形状を含むマイクロピラーを含む、方法。 - 前記基板が複数の室を含み、前記複数の室がそれぞれ複数のマイクロピラーおよび前記OPCを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記インキュベートすることが、複数の候補薬剤を、前記複数の室を含む前記基板および前記OPCを用いてインキュベートすることを含み、前記複数の室がそれぞれ異なる候補薬剤を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ミエリン形成の存在または不在を判定することが、OPCの乏突起膠細胞への分化をアッセイすることを含み、前記アッセイが、前記乏突起膠細胞による前記複数のマイクロピラーの鞘形成を検出することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミエリン形成の存在もしくは不在を判定することが、前記OPCから発生した乏突起膠細胞による前記複数のマイクロピラーの同心巻き付きをアッセイすることを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミエリン形成の存在もしくは不在を判定することが、ミエリン形成のレベルを判定することを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロピラーが、10μm〜150μmの範囲の直径の基部、および0.1μm〜10μmの範囲の直径の先端部を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロピラーが、15μm〜50μmの範囲の前記先端部と前記基部との間の高さを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記形状が、円錐形状、円錐台形状、双円錐形状、または放物線形状を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基部が25μm〜50μmの範囲の直径であり、前記先端部が1μm〜5μmの範囲の直径であり、前記先端部と前記基部との間の前記高さが25μm〜50μmの範囲である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の室がそれぞれ約10〜約200の前記マイクロピラーを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ミエリン形成を促進する候補薬剤をスクリーニングするためのシステムであって、
複数のマイクロピラーを含む基板と、
乏突起膠細胞の前駆細胞(OPC)と、を含み、
前記複数のマイクロピラーが、前記基板から垂直に突出し、かつ前記基板に付着した前記マイクロピラーの基部から、前記基板から突出する前記マイクロピラーの先端部へと直径が先細になる形状を含むマイクロピラーを含む、システム。 - 前記マイクロピラーが、10μm〜150μmの範囲の直径の基部、および0.1μm〜10μmの範囲の直径の先端部を含む、請求項12に記載のシステム。
- 前記マイクロピラーが、15μm〜50μmの範囲の前記先端部と前記基部との間の高さを含む、請求項12又は13に記載のシステム。
- 前記基板が複数の室を含み、前記複数の室が前記複数のマイクロピラーおよび前記OPCを含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載のシステム。
- プロセッサと、
前記プロセッサによって実行される際、前記プロセッサに、前記複数のマイクロピラー上のミエリン形成の存在もしくは不在、および/またはレベルを判定させる命令を含むメモリと、を更に含む、請求項12〜15のいずれか一項に記載のシステム。 - 前記基部が、25μm〜50μmの範囲の直径であり、前記先端部が1μm〜5μmの範囲の直径であり、頂部と前記基部との間の前記高さが25μm〜50μmの範囲である、請求項12〜16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記マイクロピラーが、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびシリカからなる群から選択される材料を含む、請求項12〜17のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記複数の室が約10〜約200の前記マイクロピラーをそれぞれ含む、請求項13〜18のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記形状が、円錐形状、円錐台形状、双円錐形状、または放物線形状を含む、請求項12〜19のいずれか一項に記載のシステム。
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