CN103261393A - 培养器材以及培养片材 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种培养片材，其使不需在培养器材表面涂布化学物质即可形成直径齐整的三维组织的技术成为可能。在培养器材的培养片材150上形成多个空穴152，在作为各个空穴152的底面的培养面上形成可控制细胞的粘接性、游走性的纳米柱状物153。各空穴151的培养面成为设置有隔壁152的结构，且内部的纳米柱状物153形成于各空穴151的中心附近，因而可限制所接种的细胞的相互作用，可使所形成的细胞的三维结构的尺寸为均匀。

Description

培养器材以及培养片材
技术领域
本发明涉及使用培养器材对动植物细胞进行培养，图状形成细胞的球状组织(三维组织)以及单层组织(二维平面组织)的技术。
背景技术
在药品开发工艺中，替代动物实验，要求开发出利用了细胞的体外(in vitro)试验。特别是应用于药物候选物质的筛选、毒性、代谢试验的动向变得活跃。
基于这样的背景，大力地尝试了代替以往的动物实验的利用了细胞的代替法的方法，但是大多在预测临床反应方面存在局限。可认为这是因为，在这些培养法中，细胞没有采取模拟了实际在生物体内的结构的结构(非专利文献1)。因此，目前为止尝试了构建发挥更接近生物体的功能的三维组织，成功地由各种各样的细胞种类形成三维组织。
作为用于形成细胞的三维组织的器材，开发了在规则排列的片材表面形成有极微细的均匀突起的用于培养的片材(纳米柱状物片材)，但是存在有所形成的三维组织从器材上的剥离性高(专利文献1)，在培养基交换的过程中丢失这样的问题。另外无法控制所形成的三维组织的直径，因而具有尺寸不均匀，各个三维组织的性能不均这样的问题，作为实用的形成法而言仍然不成熟。
因此，目前为止开发了在培养器材上设置微小的空腔结构，在每个该空腔中形成一个三维组织的技术(细胞组织体微芯片)(专利文献2、非专利文献2)。该技术的特征在于，在空腔底面的中央附近，将具有粘接性的物质涂布于规定区域，由此规定细胞粘接区域和细胞非粘接区域，利用旋转驱动装置等使空腔本身旋转，实行旋转培养从而将培养细胞保持在作为细胞粘接区域的空腔底面的中央附近。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-312343号公报
专利文献2：日本特开2006-121991号公报
非专利文献
非专利文献1：”The Use of3-D Cultures for High-Throughput Screening：The Multicellular Spheroid Model”Leoni A.Kunz-Schughart,James P.Freyer,Ferdinand Hofstaedter,and Reinhard Ebner J Biomol Screen,9：273-285(2004)
非专利文献2：”Orderly arrangement of hepatocyte spheroids on amicrofabricated chip.”J Fukuda and K Nakazawa Tissue Eng,11：1254-62(2005)
非专利文献3：”Formation of Hepatocyte Spheroids with Structural Polarityand Functional Bile Canaliculi Using Nanopillar Sheets.”R Takahashi,H Sonoda,Y Tabata and A Hisada,Tissue Eng Part A,1-45(Mar4,2010)
发明内容
发明要解决的问题
虽然是具有这样的特点的细胞组织体微芯片，但由于将细胞强制性地粘接于器材表面的特定部分，因此必须在器材表面涂布化学合成出的物质来规定细胞粘接区域和细胞非粘接区域，由此列举出几个问题。
首先，不仅存在有所涂布的这些化学物质对细胞的成长造成不良影响的可能性，而且由于该操作需要将化学物质涂布或粘接于极微小的区域，因而操作变得非常繁杂，制造成本也增高。
另外，所接种的细胞落入非粘接区域的情况下，必然会在培养时的交换培养基之时与培养基一同被破坏而失去，很难说是有效率的培养方法。而且，由于落入粘接区域的细胞通过旋转培养而强制性地形成组织，因而有可能对细胞造成应激并招致活性的降低。
另一方面，在以往的纳米柱状物片材中，存在有在器材面上不易控制细胞运动，无法控制所形成的三维组织的尺寸、直径这样的问题。另外也同时存在有无法将所形成的三维组织保持于目标部位这样的问题。
本发明的目的在于提供不需在培养器材的表面涂布化学物质即可形成直径齐整的三维组织，而且能够将三维组织保持于目标位置的培养片材、培养器材以及使用其的细胞培养方法。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供一种培养器材以及培养片材，其具有培养区域，在培养区域内形成多个突起，在培养区域的周围形成将培养区域隔开且比突起高的隔壁，且突起在该培养区域中所占的构成比率为20％～75％的范围。
另外，为了实现上述目的，本发明提供一种培养器材以及培养片材，其具有培养区域，在培养区域内形成多个突起，在培养区域的周围形成将培养区域隔开且比突起高的隔壁，且突起在该培养区域中所占的构成比率为40％～50％的范围。
发明的效果
通过适用本发明，通过仅使用单一原材料，可在促进作为细胞本来的功能的细胞运动并维持活性的状态下在应激少的环境下形成三维组织。
另外，通过利用相同原材料一体地设置称为隔壁的限定区域，使得接种于该限定区域内的细胞全部与一个三维组织形成相关，不仅是非常有效率的培养方法，而且形成于各个限定区域的多个三维组织的尺寸均匀、均质，可期待对细胞试验有效。
进一步，可期待将三维组织保持于称为隔壁的限定区域内的目标位置。进一步，也可根据目的形成二维平面组织。对于二维平面组织也可期待同样的效果。
附图说明
图1所示为第1实施例的培养片材和培养片材内的空穴结构(ホール構造)的图。
图2所示为第1实施例的纳米柱状物结构的放大图。
图3所示为贴附了第1实施例的培养片材的腔室玻片的图。
图4所示为第2实施例的板框体的结构的图。
图5所示为用于说明第2实施例的板和培养片材的超声波焊接流程的图。
图6所示为第3实施例的肝细胞培养的流程图的图。
图7所示为第3实施例的肝细胞培养流程中利用培养片材而得到的肝细胞三维组织照片的图。
图8所示为第4实施例的二段、多段纳米柱状物培养片材的图。
图9所示为各实施例的纳米柱状物的排列图案的种类的图。
图10A所示为在使用了图9所示的柱状物直径不同的培养片材的情况下的细胞培养结果(细胞的样子)的图。
图10B所示为在使用了图9所示的柱状物直径不同的培养片材的情况下的细胞培养结果(形成细胞数)的图。
图11所示为作为培养片材的实施例4的变形例的倾斜纳米柱状物培养片材的图。
图12所示为培养片材的实施例的变形例4的避免表面张力的图案培养片材的1孔的图。
图13A所示为实施例1中的培养器材的外观立体图、俯视图、上下侧视图的图。
图13B所示为实施例1中的培养器材的部分放大图，是A-A、B-B部分放大图和C-C、D-D部分放大图的图。
图13C所示为实施例1中的培养器材的部分放大图以及端面图，是E-E、F-F部分放大图、G-G线端面图的图。
图14A所示为实施例2中的培养器材的外观立体图、仰视图的图。
图14B所示为实施例2中的培养器材的俯视图、上下侧视图的图。
图14C所示为实施例2中的培养器材的部分放大图、部分剖视图，是A-A、B-B部分放大图和C-C、D-D部分放大图以及H-H剖视图的图。
图14D所示为实施例2中的培养器材的部分放大图以及端面图，是E-E、F-F部分放大图、G-G线端面图的图。
图15A所示为第5、6的实施例的培养片材和培养片材内的空穴结构的图。
图15B所示为第5、6的实施例的不同的直径的突起部集合体的模式图。
图15C所示为第5、6的实施例的突起部集合体的直径为80μm的培养片材的SEM图像的图。
图15D所示为第5、6的实施例的突起部集合体的直径为20μm的培养片材的SEM图像的图。
图16A所示为第7实施例的肝细胞培养流程中利用培养片材而得到的肝细胞三维组织的中心与空穴结构的中心之间的距离的一个例子的图。
图16B所示为第7实施例的肝细胞培养流程中利用培养片材而得到的肝细胞三维组织的中心与空穴结构的中心之间的距离的其它的例子的图。
图16C所示为第7实施例的肝细胞培养流程中利用培养片材而得到的肝细胞三维组织的中心与空穴结构的中心之间的距离的其它的例子的图。
图16D所示为第7实施例的肝细胞培养流程中利用培养片材而得到的肝细胞三维组织的中心与空穴结构的中心之间的距离的其它的例子的图。
图17所示为第7实施例的肝细胞培养流程中利用培养片材而得到的肝细胞三维组织照片的一个例子的图。
图18所示为肝细胞培养流程中利用培养片材而得到的肝细胞三维组织照片的一个例子的图。
具体实施方式
使用培养片材对细胞进行培养，以下详细说明用于实现作为细胞块的三维组织或者二维平面组织的形成方法的最佳实施方式。
实施例1
在实施例1中示出，将培养片材适用于作为培养片材保持构件的腔室玻片的例子。以下，将具有相对于以往的纳米柱状物片材而形成本发明的培养区域的隔壁结构、并且在该隔壁结构的内部形成有多个突起物的片材，记作培养片材。
该培养片材由对细胞没有不良影响的材质形成，在本例中为聚苯乙烯。但是，自不用言材质不限定于聚苯乙烯。
图1为由本实施例制成了的培养片材100的扫描型电子显微镜照片的模式图。另外，同时示出每1张培养片材中多个存在的由隔壁结构102构成的孔101(以下，空穴)中的一个孔的结构。该空穴101的内部构成细胞组织形成单元中的培养区域。
保持于空穴101的底面的多个突起物102由多个微小突起物103(以下亦称为突起、柱状物、纳米柱状物)形成。另外，将该空穴101的直径称为空穴直径105。该培养片材100中，具备上述的隔壁102的空穴101与在该空穴101的内部形成的多个突起103由相同材料一体地形成。予以说明，该空穴101不限定于圆形形状，也可以为四边形状等其它的形状。
这样地利用对细胞没有不良影响的单一材料，将具备有隔壁102的空穴101和在该空穴101的内部形成的多个突起103一体地形成为培养片材100，从而可在培养工序中在异物不会粘接到细胞的状态下使细胞生长。进一步由于在各个隔壁内细胞生长，因而可形成尺寸均匀的细胞。
另外，由于在包围配置的隔壁102的内部设置有多个突起，因而促进作为细胞原本保持的能力的细胞运动，通过该运动而生长，从而不受由旋转培养等导致的干扰(应激)的影响，可进行维持了细胞活性的细胞培养。
想要将这些空穴101和突起集合体103作为分体而形成培养区域时，则需要通过将它们粘接、焊接而接合。
例如在将它们粘接接合的情况下，存在有将粘接剂成分混入培养区域的内部，对生成细胞造成不良影响的可能性。
另外在焊接接合中，由于空穴101的内径是细胞形成水平的极微小区域的直径，因而很难在形成作为目标的细胞区域的同时在不对隔壁、突起造成损伤的情况下进行焊接。在该隔壁或突起中具有损伤、变形时，则存在有在细胞形成过程中对细胞造成不需要的应激，或对细胞自身的运动造成障碍的可能性。
因此，优选将构成形成培养区域的空穴101的空穴底面104、隔壁102以及突起103一体地形成。通过这样地一体形成，从而可实行排除了细胞培养所必需的成分以外的不需要成分的影响的培养，因而优选。
接着，将突起103的放大图示于图2。柱状物直径是指突起物顶端部的直径106。柱状物间距是指从突起物顶端部的中心到相邻的突起物顶端部的中心的距离107。柱状物高度是指从纳米柱状物的顶端部到底部的高度108。图2的(a)、图2的(b)分别表示本实施例的纳米柱状物的正方配置、三角配置。
在本实施例中，使用了柱状物直径、柱状物间距、柱状物高度分别为2.0μm、4.0μm、1.0μm的柱状物，但是如后所述，也可以是它们以外的培养片材。在本实施例中隔壁结构的高度为70μm，但是不限于此值，优选为所形成的细胞不超过隔壁的程度的高度即可。
本实施例中的培养片材100通过以下叙述的方法而制作。
将正方配置直径200μm、深度70μm的圆形的孔并且在其底面以4.0μm间距形成有直径2.0μm、深度1.0μm的微细孔的模具，在135℃、压力2MPa下压制于400μm厚度的聚苯乙烯薄膜中。在冷却为室温后从压制装置取出，将模具从聚苯乙烯薄膜剥离，从而可制作保持有多个空穴直径为200μm的空穴并且在其底面具有多个突起的培养片材。
此处模具材料是硅片，为了防止在制作培养片材时与聚苯乙烯薄膜的粘接，预先通过氟系的脱模剂实施了脱模处理。在本实施例中将模具材料设为硅片，但是也可以是其它金属材料等的模具。
如图3所示那样，将这样地由单一原材料进行一体成型而制作的培养片材100在本例中切割为2cm见方，在腔室玻片109的玻璃底面涂布手术用粘接剂110进行粘接，从而制作出贴附有培养片材100的腔室玻片109。予以说明，在图3中，109a表示将各培养片材100区分的框。该框109a例如由塑料材料等形成。予以说明，该框109a等框体的形状不限于四边形状，也可以为圆形形状等其它的形状。
图13A、13B、13C中示出本实施例的贴附有培养片材的腔室玻片的整体结构图以及重要部分剖视图。
图13A是本实施例中的培养器材的外观立体图、俯视图、上下侧视图。左右侧视图根据立体图可知其形态，因而省略图示。
图13B是部分放大图，表示A-A、B-B部分放大图和C-C、D-D部分放大图。
图13C是部分放大图以及端面图，表示E-E、F-F部分放大图、G-G线端面图。
图13A-13C中示出的该物品是对人、动物、植物等的细胞进行培养的培养器材(培养容器)，由培养片材100和将培养片材100保持的保持部(腔室玻片)109构成，在培养片材100的表面形成有多个隔壁部102，设置在形成于保持部109的筒状的孔穴部109a的内部底面。
进一步各个地形成出在该隔壁部的内部具有多个微细的突起部103的培养区域。按照添加于形成隔壁部102内的培养区域的片材面的方式，将要培养的目标细胞添加于孔穴部109a内时，则被多个微细的突起部103保持而培养该目标细胞。
实施例2
接着，根据图4、图5说明第2实施例。在实施例2中示出带有培养片材的多孔板的构成、以及其制作例。图4的(a)为构成多孔板的框体111的仰视图。在作为培养片材保持构件的框体111的宽度约125mm、长度约80mm、高度约20mm之中，在纵列成型有4孔穴，在横列成型有6孔穴，合计成型有24孔穴的筒状的孔穴部111a。原材料使用了聚苯乙烯。
形成于框体中的孔穴的数量通常为6孔穴至1536孔穴，根据用途分别使用，因而该框体也不限定于孔穴的数量为24孔穴。另外框的原材料也不受限于聚苯乙烯。
在该培养器材的制作中，通过超声波焊接将框体111与培养片材100接合。
对框体111预先实施以下的处理。首先第一个是，为了防止因在将框体111与培养片材100焊接时施加的超声波的振动而导致细胞培养片材与板发生错位，在框体111的底面加工出薄膜固定用突起112。第二个是，为了用超声波将培养片材焊接，预先设置凸缘结构113。
图4的(b)、(c)分别表示图4的(a)的B-B’、A-A’的剖视图。另外，在将两者重叠时的相同位置上，按照薄膜用固定突起嵌入的方式预先在培养片材中设置相同直径的孔穴114。接着通过超声波焊接将该框体与培养片材100粘接。
将该工序示于图5。首先将框体的薄膜固定用突起和培养片材的孔穴对合，将两者重叠(图5的(a))。接着，由超声波振荡器，介由变频器、升压器、以及焊头(horn)，从培养片材侧产生超声波，将两者焊接(图5的(b))。焊头是指将恰当的能量的超声波照射于恰当的位置而焊接的装置，制作出按照沿着凸缘结构的位置而恰当地产生超声波的方式设计得到的专用装置而使用。115表示通过这样操作而制作的板的俯视图。
在本实施例中，使用超声波焊接将框体与培养片材接合，但是自不用言不限定于此方法。在超声波焊接中，可在不夹杂对细胞造成影响的粘接剂那样的有机物的情况下实现板化，因而没有对细胞的不良影响，自不用言是不仅可适用于新药开发工艺中的毒性、代谢试验、而且也可适用于面向再生医疗的组织体形成的有用的培养片材。
予以说明，自不用言，在实施例1中例示出的腔室玻片形状的培养器材中，也可在框109a的底部设置多个凸缘结构，利用该凸缘结构进行与培养片材100的焊接，从而基于与本实施例同样的接合方法制成培养器材。
在通过这样操作而制成出的培养器材中，在形成于框体111的底面的培养片材100上形成多个空穴101，在该空穴底面104构成的多个突起物由多个微小突起物103(以下亦称为突起、柱状物、纳米柱状物)形成。另外，将该空穴101的直径设为空穴直径105。在该培养片材100中，具备有上述的隔壁102的空穴101与在该空穴101的内部形成的多个突起103由相同材料一体地形成。予以说明，该空穴101不限定于圆形形状，也可以为四边形状等其它的形状。
这样地利用对细胞没有不良影响的单一材料，将具备有隔壁102的空穴101和在该空穴101的内部形成的多个突起103一体地形成为培养片材，从而可在培养工序中在异物不粘接于细胞的情况下使细胞生长。进而，细胞在各个隔壁内生长，因而可形成尺寸均匀的细胞。
另外，在包围地配置的隔壁的内部设置有多个突起，因而促进作为细胞本来保持的能力的细胞运动，通过该运动而生长，从而不受由旋转培养等导致的干扰(应激)的影响，可以进行维持了细胞活性的细胞培养。
想要将这些空穴101和突起集合体103作为分体而形成培养区域时，则需要通过将它们粘接、焊接而接合。例如在通过粘接进行接合的情况下，存在有将粘接剂成分混入培养区域的内部，对生成细胞造成不良影响的可能性。
另外，想要焊接时，由于空穴101内部的直径是细胞形成水平的极微小区域，因而很难在形成作为目标的细胞区域的同时在不对隔壁、突起造成损伤的情况下进行焊接。在该隔壁、突起中具有损伤、变形时，则存在有在细胞形成过程中对细胞造成不需要的应激，或对细胞自身的运动造成障碍的可能性。
因此，优选将形成培养区域的空穴101与突起103一体地形成。通过这样地一体地形成，从而可进行排除了细胞培养所必需的成分以外的不需要成分的影响的培养，因而优选。
此处在图14A、14B、14C、14D中，示出本实施例的带有培养片材的多孔板的整体结构图以及重要部分剖视图。
图14A表示本实施例中的培养器材的外观立体图、仰视图。
图14B表示培养器材的俯视图、上下侧视图。此处，左右侧视图根据外观立体图可知其形态，因而省略图示。
图14C是部分放大图、部分剖视图，表示A-A、B-B部分放大图、C-C、D-D部分放大图、H-H剖视图。
图14D是部分放大图以及端面图，表示E-E、F-F部分放大图、G-G线端面图。
图14A、14B、14C、14D中示出的该物品是对人或动物或植物等的细胞进行培养的培养器材(培养容器)，由培养片材100和将培养片材100保持的保持部(框体)111构成。
在培养片材100的表面形成有多个空穴101，设置在形成于保持部的筒状的孔穴部111a的内部底面。
进一步在该隔壁部的内部分别形成有具有多个微细的突起部103的培养区域。按照添加于形成空穴101内的培养区域的片材面的方式，将要培养的目标细胞添加于孔穴部111a内时，则被多个微细的突起部103保持而培养该目标细胞。
另外，本例的培养器材表示的是从框体111的里面焊接培养片材的例子，作为保持部的框体111与培养片材100介由接合部1112而焊接。
该接合部1112设置于孔穴部111a的外部，该焊接对培养区域没有影响。
因此，在本例中例示出焊接，但是不限于该接合方法，通过其它的接合方法也不会对培养区域自身造成由接合导致的影响，因而也可采用其它的接合方法。
进一步，本例的器材中，该框体111形成着四角状的形态，其4个顶点之内至少1点被切割。通过形成该切割面1113，从而具有使进行培养的操作者容易确定器材孔穴部的位置这样的效果。
自不用言该切割面并非必需，也可没有。该培养器材中，另外形成有防滑部1111，可防止操作者在操作中意外地将该器材摇动、掉落等。
实施例3
在实施例3中示出利用由实施例1和2制作的培养器材而得到的细胞组织培养的适用例。在新药开发中，反映生物体功能的三维组织的构建对于利用代替动物实验的细胞而进行的各种各样的评价是需要的。进一步，将这样形成的三维组织供给于药物的筛选或者新药开发中的各种试验时，需要事前验证三维组织是否保持有仅仅可耐受试验的活性。在此情况下，所形成的球状体(spheroid)重现性良好地保持于规定的位置时，则可期待进行高通量的筛选、各种试验。
另外，在培养人工多功能干细胞(Induced pluripotent stem cells：iPS细胞)、胚胎干细胞(Embryonic stem cells：ES细胞)而分化为目标细胞之前，必须形成三维组织，因而在再生医疗领域中也期望着简便地构建三维组织的技术。由这样的背景出发，此处特别示出使用腔室玻片形成三维组织的例子，但即使是多孔板，细胞培养的本质上的部分也没有特别变化。在本实施例中示出使用了大鼠肝细胞的例子，但是如上述那样可适用于各种各样的动植物的细胞种类，细胞种类没有特别限定。
肝细胞的制备按照原位(in situ)胶原酶灌注法进行。详细而言如以下那样。在戊巴比妥麻醉下将Fisher344系雄大鼠(7～10周龄)剖腹，向门静脉中插入导管而注入前灌注液(不含Ca2＋和Mg2＋、包含EGTA的Hanks液)。
同时将肝脏下部的下腔静脉切开而放出血液。接着打开胸腔，将进入右心房的下腔静脉切开，用套结将肝脏下部的下腔静脉止住而进行灌注。确认出充分地进行了肝脏的脱血之后停止灌注。将灌注液替代为胶原酶溶液而进行灌注。
在本实施例中使用包含0.05％胶原酶的Hanks液而进行灌注，但是不限于此。确认出细胞间组织被胶原酶消化后，停止灌注。将肝脏切离，在冰镇的Hanks液中切细，通过移液而分散至细胞。接着通过纱布过滤去除未消化的组织。将细胞悬浮液反复进行数次50G、1分钟的离心分离从而将非实质细胞去除。接着使用等渗Percoll液通过500G、5分钟的离心分离将具有损伤的肝细胞去除。所获得的肝细胞的生存率通过锥虫蓝排除法计量，将生存率85％以上的肝细胞用于培养。此处，将生存率85％以上的肝细胞用于培养，但是自不用言并不限定于该条件。另外，肝细胞的制备并不限于原位胶原酶灌注法。
将使用了通过这样操作而获得的肝细胞的培养流程图示于图6。
在图6的流程中，首先，在实施例1中制作的腔室玻片型的培养片材上涂布I型胶原116。将由杀菌水将溶解于弱酸性溶液的I型胶原稀释至规定的浓度的稀释液1-1.5mL添加于上述的腔室玻片(该图的(a))。接着，为了使所添加的I型胶原完全地吸附于纳米柱状物片材100，实施减压操作(该图的(b))。减压操作通过使用减压用容器117和减压泵118，在0.04个大气压以下进行。减压时间没有特别限定，但是在本实施例中进行10分钟。用于减压的装置结构没有特别限定。此处稀释液的规定浓度的范围为100(ng/ml)以上10(μg/ml)以下。并不限定于该范围，但是该范围是形成球状的三维组织所优选使用的范围。最后，将剩余的I型胶原去除，加入PBS(-)119(该图的(c))。进行3次此操作，将剩余的I型胶原洗涤。
将如上述那样通过原位胶原酶灌注法制备出的肝细胞120悬浮于培养基121中，接种于同样地如上述那样准备出的涂布有I型胶原的NP片材(该图的(d))。培养基没有特别限定，但是使用包含含有血清(FCS)、胰岛素、地塞米松的培养基(以下，培养基(包含10％FCS))的Williams E培养基。在本实施例中，特别使用包含10％FCS、8.6nM胰岛素、255nM地塞米松的Williams E培养基。接种后，使用CO2培养箱在5％CO2、37℃的条件下开始培养，在经过了18小时以上之后，进行最初的培养基交换，其后每24小时进行培养基交换。接种后第18小时以后的培养中使用的培养基没有特别限定，但是在本实施例中，使用从培养基(包含10％FCS)中去除了FCS的培养基(以下，培养基(不包含FCS))。
另外，关于肝细胞的接种密度，在本实施例中设为1×105cells/ml，但是不限定于此浓度。此处，用于培养的培养片材100使用了柱状物高度、柱状物直径、柱状物间距分别为1.0μm、2.0μm、4.0μm的培养片材，但是不限定于此值。
另外，关于添加于培养片材的I型胶原的浓度，在本实施例中设为100(ng/ml)但是也可以为除此以外的浓度。根据细胞的条件，即使是除了此浓度以外的浓度也会形成球状体。培养共计96小时，形成三维组织122(该图的(e))。
图7示出使用空穴直径为200μm的上述培养片材而实际上培养肝细胞的结果的照片。根据图7可知，在培养片材表面没有涂布特别的化学物质的状态下，且利用对细胞的应激少的静置培养，这样地使尺寸齐整的球状的三维组织71形成于空穴70内。这可认为不会丧失本来保持的细胞的活性，因而对于细胞试验等而言是有效的培养方法。
实施例4
图8示出作为实施例4的上述的培养片材100的实施例的变形例。首先示出如下的例子：对于培养片材123引起细胞的游走性、粘接性的差异的突起物的排列图案，如同图的(a)那样，按照由第二排列图案125b将第一排列图案125a的周围包围起来的方式以二段式配置，从而在第一排列图案125a上(例如空穴的中心近旁)形成三维组织或者二维平面组织。
另外示出如下例子：相反，如该图的(b)那样，按照由第一排列图案125a将第二排列图案125b的周围包围的方式而以二段式配置，从而在第二排列图案125b上(例如空穴边缘部)形成三维组织或者二维平面组织。予以说明，124与之前的实施例同样，表示空穴。虚线表示图案的边界。
另外，并不限于空穴124内的中央部，也可如该图的(c)的培养片材126那样配置，例如由第二排列图案127a将4个位置的第一排列图案127b包围，在第一排列图案127b上形成尺寸齐整的组织。这样地，柱状物直径、柱状物间距、配置图案的组合可根据目的而配置最优的图案，进行培养。同样地，该图的(d)表示将排列图案设为多段图案129c、129b、129a的培养片材128。
接着，使用图9，说明上述的实施例中的突起物的排列图案(以下称为柱状物图案)的种类。如图9所示那样例示出11种排列图案。从该图明显可知，柱状物直径和柱状物间距分别为0.18～20.0μm、0.36～40.0μm等11种，但是不限于此。
在图10A、10B中示出在这些柱状物图案之下进行培养的肝细胞的一个例子。
予以说明，在没有柱状物图案的平整平面下的培养中，在培养过程中的培养基交换之时大量细胞与培养基一同排出，因此无法有效地取得所希望的培养细胞。由此，在图10A中没有图示。
图10A所示为使用相对于柱状物直径为2倍间距的培养片材100而进行了培养时的细胞的样子的图。其结果是，柱状物直径为0.18μm、0.5μm、1.0μm时，并非球状的平坦的组织粘接于器材底面，另一方面，在2.0μm、5.0μm时形成了相对于器材呈球状的三维组织。
另外，尝试对在2.0μm、5.0μm的器材上形成的球状细胞进行比较时，可知，在2.0μm器材上细胞粘接于器材，是稳定的状态。即，关于细胞粘接性，可知：柱状物直径越大，则显现越低的粘接性，促进了细胞的移动。
图10B表示，对于由各柱状物直径的片材形成出的肝细胞的三维组织(球状体：spheroid)的数量，按照其形成的直径逐一地总结得到的结果的图。片材面积为4平方cm(2cm×2cm)。
在肝细胞的三维组织中，在替代创新药物领域中的动物实验的药物筛选、以毒性、代谢试验作为目的的细胞试验中，优选为50-100微米直径的细胞，在本例中可知在柱状物直径为2.0μm的器材的情况下该尺寸的细胞形成数最多因而优选。
然而，经过上述研究可知，为了形成50-100微米直径的细胞，优选柱状物直径为2.0μm，但是不限于此，在本研究中使用的全部的柱状物直径中，与没有形成柱状物的平整的状态相比，形成很多形状稳定的细胞。这样地，通过柱状物图案的差异，可以自如地改变细胞或者由细胞形成的组织的形态、或者对器材的粘接性。
应用上述结果，如图8的实施例说明的那样，按照由柱状物直径(柱状物间距)大的第二排列图案将柱状物直径(柱状物间距)小的第一排列图案的周围包围起来的方式以二段式配置，或者以多段式配置，利用细胞粘接性以及细胞自身的运动特性，从而可在空穴内的目标位置处形成目标形状的组织。
另外，也可通过使具有相同尺寸的柱状物直径的纳米柱状物的高度从空穴的边缘部朝中心部降低，按照倾斜的方式阶段性地设置高度上的差异，按照在重力的作用下集中于中心部的方式促进细胞的运动，形成组织。
图11的(a)示出了阶段性地在纳米柱状物的高度上设置了差异的变形例的培养片材130。此时，与通常的U字型的培养容器不同，通过存在柱状物，从而具有将细胞保持于中央的效果。进一步，也可如该图(b)的培养片材131那样，在倾斜的同时还设置在柱状物直径上的差异，从而促进上述的效果。
在图11的变形例中，按照倾斜变为平滑的方式阶段性地使高度变化，但是也可以为阶梯状地顺次地在高度上具有变化的构成。
另外，多个空穴集合而形成培养面(在腔室玻片的情况下是四边形状、板的情况下是圆形形状)，但是在培养时由于表面张力的影响，在培养面中央部和边缘部处，在形成三维组织方面产生差异。即，尽管在培养面中央部形成了三维组织，但在边缘部在表面张力的作用下该部分的培养基量增加，氧供给量降低，或者施加高的水压，基于这样的理由，因而存在有产生不形成三维组织的情况的可能性。为了避免此现象，也可制作图12的(a)、(b)所示那样的仅在培养面的中央部保持有空穴结构的培养片材132、133。
通过这样地形成培养片材，从而可实现培养效率高且制造负荷少的培养器材。
实施例5
图15A、图15B、图15C、图15D示出了第5实施例的培养片材。在实施例5中表示：将在图8的实施例4所示的各种变形例之中第一排列图案125a为平整结构并且在空穴的中心部排列有突起的图案的培养片材适用于作为培养片材保持构件的腔室玻片的例子。即，在本实施例中，培养区域分别包含第一区域、将其包围的第二区域，通过制成仅在第一区域排列突起、在第二区域不形成突起的结构的培养片材，从而将作为直径齐整的三维组织的球状体保持于与第一区域对应的培养区域的中心部，从而可保持于目标位置。
此处示出在培养区域内的中心近旁排列有突起的例子，但自不用言并不一定需要包含中心，在培养区域内的所希望的区域排列突起即可。另外，示出形成大致菱形形状、圆形形状的突起区域的例子，但是自不用言此外也可以为四边形、多边形。
图15A示出由本实施例制成了的培养片材的一个例子。图15A表示每1张培养片材存在多个的由隔壁结构152构成的空穴151中的一个空穴的结构。在空穴101的内部，构成由隔壁隔开的细胞组织形成单元中的培养区域的情况与上述的实施例同样。保持于空穴151的底面154的多个突起物153由多个微小突起物形成。另外，使该空穴151的直径为空穴直径155。优选为，在培养片材150中，具备上述的隔壁152的空穴151与在空穴151的内部形成的多个突起153由相同材料一体地形成。予以说明，该空穴151不限定于圆形形状，也可以为四边形状等其它的形状，这与上述的实施例同样。
本实施例的优选实施方式中，如图15B的培养片材150a所示那样，可使用柱状物高度、柱状物直径、柱状物间距分别为1.0μm、1.0μm、2.0μm和，1.0μm、2.0μm、4.0μm并且突起部集合体的直径为200μm(整面纳米柱状物)、150μm、120μm、100μm、80μm、60μm、40μm、20μm的培养片材。
如图15B的放大部150b所示那样提供培养器材，所述培养器材以多段式构成在空穴内的、即、在由隔壁隔开的细胞组织形成单元中的突起的形成区域(构成比率)，其作为在后述的实施例7中用于掌握最优的突起区域的形成比例的测试器材是有效的。也存在有因作为培养目标的细胞种类、所希望的尺寸而导致最优的构成比率不相同的可能性，因此事前使用这样的培养器材进行培养试验，这即使对其后的培养效率也有影响，因而有用。予以说明，空穴151a表示没有形成突起的空穴。
该培养片材150a由对细胞没有不良影响的材质形成，在本例中为聚苯乙烯。但自不用言，材质不限定于聚苯乙烯。
作为主要的代表例，图15C例示了突起部集合体的直径为80μm的培养片材的SEM图像，图15D例示了20μm的培养片材的SEM图像。在图15C和图15D的各个图中，156和158表示空穴，157、159表示突起物集合体。
这样地利用对细胞没有不良影响的单一材料，具备有隔壁152的空穴151和在该空穴151的内部形成的多个突起153一体地形成作为培养片材150、150a，从而可在培养工序中在异物不粘接于细胞的情况下使细胞生长。
进一步由于细胞在各个隔壁内生长，因而可形成尺寸均匀的细胞。
另外，由于在包围地配置的隔壁152的内部设置有多个突起，因而促进作为细胞本来保持的能力的细胞运动，通过该运动而生长，从而不受由旋转培养等导致的干扰(应激)的影响，可以进行维持了细胞活性的细胞培养。
想要将这些空穴151与突起集合体153作为分体而形成培养区域时，则需要通过将它们粘接、焊接而接合。例如在将它们粘接接合的情况下，存在有将粘接剂成分混入培养区域的内部，对生成细胞造成不良影响的可能性。另外在焊接接合中，由于空穴151的内径是细胞形成水平的极微小区域的直径，因而很难在形成作为目标的细胞区域的同时在不对隔壁、突起造成损伤的情况下焊接。在该隔壁或突起中具有损伤、变形时，则存在有在细胞形成过程中对细胞造成不需要的应激，或对细胞自身的运动造成障碍的可能性。
因此，在本实施例中，也如上述那样，优选将构成形成培养区域的空穴151的空穴底面154、隔壁152以及突起153一体地形成。通过这样地一体地形成，从而可进行排除了细胞培养所必需的成分以外的不需要成分的影响的培养，因而优选。
在本实施例中，使用了柱状物直径、柱状物间距、柱状物高度分别为1.0μm或2.0μm、2.0μm或4.0μm、1.0μm的柱状物，但是如后所述，也可以是它们以外的培养片材。在本实施例中隔壁结构的高度为70μm，但是不限于此值，优选所形成的细胞为不超过隔壁的程度的高度即可。
本实施例中的培养片材150、150a通过与实施例1同样的方法制作，因而在此处省略制作法的详细的说明。进一步，自不用言，在本实施例中，也可制作图3所示那样的贴附有培养片材150的腔室玻片109，可获得具有与图13A、图13B、图13C同样的整体结构以及重要部分剖面的腔室玻片，此处省略说明。
实施例6
接着，根据图4、图5说明第6实施例。本实施例是表示使用了由第5实施例说明的培养片材150、150a的带有培养片材的多孔板的构成及其制作例的实施例。多孔板的构成及其制作例由图4、图5详细说明，但是在本实施例中，除了使用培养片材150、150a来替代实施例2中使用了的培养片材100以外，基本上与实施例2同样。
图4的(a)为构成多孔板的框体111的仰视图。在作为培养片材保持构件的框体111的宽度约125mm、长度约80mm、高度约20mm之中，在纵列成型有4孔穴，在横列成型有6孔穴，共计成型有24孔穴的筒状的孔穴部111a。原材料使用了聚苯乙烯。
形成于框体中的孔穴的数量通常为6孔穴至1536孔穴，根据用途分别使用，因而该框体的孔穴的数量也不限定于24孔穴。另外框的原材料也不受限于聚苯乙烯。
在该培养器材的制作中，通过超声波焊接将框体111与图15A、图15B的培养片材150、150a接合。以下的处理和构成与实施例2同样，因而在此处省略说明。
在通过这样操作而制成出的培养器材中，在代替形成于框体111的底面的培养片材100的培养片材150、150a上形成多个空穴151，构成于该空穴底面154的多个突起物由多个微小突起物153形成。在该培养片材150、150a中，具备有上述隔壁152的空穴151与在该空穴151的内部形成的多个突起153由相同材料一体地形成。予以说明，该空穴151不限定于圆形形状，也可以为四边形状等其它的形状。
这样地利用对细胞没有不良影响的单一材料，将具备有隔壁152的空穴151与在该空穴151的内部形成的多个突起153一体地形成为培养片材，从而可在培养工序中在异物不粘接于细胞的情况下使细胞生长。进而，细胞在各个隔壁内生长，因而可形成尺寸均匀的细胞。另外，在包围地配置的隔壁的内部设置有多个突起，因而促进作为细胞本来保持的能力的细胞运动，通过该运动而生长，从而不受由旋转培养等导致的干扰(应激)的影响，可以进行维持了细胞活性的细胞培养。
如上述那样，在本实施例中，也优选将形成培养区域的空穴151与突起153一体地形成。通过这样地一体地形成，从而可进行排除了细胞培养所必需的成分以外的不需要成分的影响的培养，因而优选。
本实施例的带有培养片材的多孔板的整体结构图、以及重要部分剖视图也与实施例2同样，如图14A、14B、14C、14D所示，因而在此处省略说明。
实施例7
接着，作为第7实施例，示出利用了由实施例5及6制作的培养器材的细胞在组织培养中的适用例。首先，作为实施例3，使用图6、图7，示出了利用了由实施例1和2制作的培养器材的细胞在组织培养中的适用例，但是本实施例和实施例3的不同点在于，采用使用了培养片材150、150a的培养器材来替代培养片材100。除此以外的地方的说明是通用的因而在此处省略说明。
予以说明，在本实施例中，肝细胞的接种密度设为5×105cells/ml，但是不限定于此浓度。此处，关于用于培养的培养片材150、150a，如前面说明的那样，使用了柱状物高度、柱状物直径、柱状物间距分别为1.0μm、1.0μm、2.0μm和，1.0μm、2.0μm、4.0μm的柱状物，但是不限定于此值。
另外，添加于培养片材150、150a的I型胶原的浓度在本实施例中设为实施例100(ng/ml)，但也可以为除此以外的浓度。根据细胞的条件，即使是此浓度以外的浓度也会形成球状体。在本实施例中，如图15B所示那样，使用了柱状物高度、柱状物直径、柱状物间距分别为1.0μm、1.0μm、2.0μm和，1.0μm、2.0μm、4.0μm并且空穴直径为200μm、突起部集合体的直径为200μm(整面纳米柱状物)、150μm、120μm、100μm、80μm、60μm、40μm、20μm的培养片材。无需赘言，空穴直径以及突起部集合体的直径不限定于此值。
图16A、16B、16C、16D示出使用这些图案的培养片材培养共计96小时而得到的结果。即，表示的是通过测定空穴的中心与球状体的中心之间的距离，对球状体的空穴中心保持率进行验证而得到的结果的图。如图示那样，图16A、16B、16C、16D分别对应于柱状物直径2.0μm的正方配置、柱状物直径2.0μm的三角配置、柱状物直径1.0μm的正方配置、柱状物直径1.0μm的三角配置。
在各图的横轴上将空穴中心与球状体中心的间距划分为0-19μm、20-39μm、40μm以上这3段进行表示，纵轴表示了占在各范围中的球状体数在全体球状体数中所占的比例。其结果明显可知，在此次研究了的全部的图案中，利用突起部集合体的直径为100μm、或者80μm的片材，球状体保持于偏中心(より中心)的比例高。
而且示出了，突起部集合体的直径相对于空穴直径的最优比例为40％至50％，但因细胞种类、培养条件而不限于此值。根据实验结果，即使在比例为20％至75％的情况下，其半数以上的空穴中心与球状体的中心的间距也为20-39μm范围内，因而也可以为该20％～75％范围。
关于图17、图18，作为本实施例的培养片材的培养结果的相位差显微镜图像的代表例，分别示出柱状物高度、柱状物直径、柱状物间距为1.0μm、2.0μm、4.0μm并且突起部集合体的直径分别为80μm、20μm的结果。图中的，空穴156、158中的数字编号170、180表示球状体。如图17所示那样，在突起部集合体的直径为80μm时，直径大致齐整的球状体170保持于空穴156的中心部。另一方面，如图18所示那样，在突起部集合体的直径为20μm的片材中，球状体180没有保持于中心部。
由以上的结果明显可知，根据本发明的培养器材、培养片材，不需在培养片材表面涂布特别的化学物质，且利用对细胞的应激少的静置培养，这样地形成尺寸齐整的球状的三维组织，并且使空穴直径与突起部集合体的直径为恰当从而将尺寸齐整的球状体保持于空穴的中心部。
符号说明
100、123、126、128、130、131、132、133、150、150a培养片材
101、124、151、156、158空穴
102、152隔壁
103、153、157、159突起物/突起物集合体
104、154空穴底面
105、155空穴直径
106   柱状物直径
107   柱状物间距
108   柱状物高度
109   腔室玻片
110   手术用粘接剂
111   框体
111a  形成于框体中的孔穴部
112   薄膜固定用突起
113   凸缘结构
114   培养片材孔穴
115   细胞培养板
116I  型胶原溶液
117   减压用容器
118   减压用泵
119   洗涤用生理食盐水(PBS(-))
120   培养基
121   肝细胞
122   肝细胞球状体
125a、125b、127a、127b、129a、129b、129c突起物排列图案
1111  防滑部
1112  接合部
1113  切割面。

Claims (15)

1.一种培养器材，其特征在于，其为对细胞进行培养的培养器材，具备培养片材和保持所述培养片材的培养片材保持部，所述培养片材具有培养区域，在所述培养区域内形成多个突起，并且形成将所述培养区域隔开且比所述突起高的隔壁，突起在该培养区域中所占的构成比率为20％～75％的范围。
2.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，具有至少一个将所述培养片材包围的框。
3.根据权利要求2所述的培养器材，其特征在于，所述框抵接于所述培养片材保持部。
4.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述片材保持部具有至少一个孔穴部，在所述孔穴部的底面构成有所述培养片材。
5.根据权利要求4所述的培养器材，其特征在于，所述片材保持部在其底部形成有突部，该突部与所述培养片材焊接在一起。
6.根据权利要求2所述的培养器材，其特征在于，所述框体为四边形状或圆形形状。
7.根据权利要求4所述的培养器材，其特征在于，所述孔穴部为四边形状或圆形形状。
8.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述培养片材具有多个所述培养区域。
9.一种培养片材，其特征在于，其为对细胞进行培养的培养片材，具备多个培养区域、形成于各个所述培养区域的多个突起、将各个所述培养区域隔开且具有比所述突起高的高度的隔壁，并且突起在该培养区域中所占的构成比率为20％～75％的范围。
10.根据权利要求9所述的培养片材，其特征在于，所述培养区域具有第一区域和第二区域，所述第一区域中的所述突起的宽度/直径与所述第二区域中的所述突起的宽度/直径不同。
11.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，所述培养片材中的所述隔壁以及多个所述突起由相同原材料一体地形成。
12.根据权利要求9所述的培养片材，其特征在于，所述隔壁以及多个所述突起由相同原材料一体地形成。
13.根据权利要求1所述的培养器材，其特征在于，突起在所述培养区域中所占的构成比率为40％～50％的范围。
14.根据权利要求9所述的培养片材，其特征在于，突起在所述培养区域中所占的构成比率为40％～50％的范围。
15.根据权利要求9所述的培养片材，其特征在于，在由所述隔壁隔开的各个所述培养区域中，配置有所述突起的构成比率在20％～75％的范围相互不同的培养区域。
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