CN104919095B - 用于测定髓鞘形成的微柱阵列 - Google Patents

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Abstract

提供了用于测定少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞、少突胶质细胞对微柱的包鞘化和/或包裹的微柱阵列。本文还提供了使用微柱阵列筛选促进少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞、少突胶质细胞对微柱的包鞘化和/或包裹的候选剂的方法。还提供了包含微柱阵列和少突胶质细胞前体细胞的系统。

Description

用于测定髓鞘形成的微柱阵列
交叉引用
本申请要求2012年12月19日提交的美国临时专利申请No.61/739,446(所述申请通过引用以其整体并入本文)的权益。
关于政府资助的研究的声明
本发明是在由美国国家卫生研究院/国家神经疾病研究所颁发的第NS062796号拨款下借助政府资助进行的。政府在本发明中具有一定的权利。
引言
髓磷脂是中枢和外周神经系统的重要组成部分。通过使髓磷脂鞘绝缘对轴突进行系统包裹是在脊椎动物中枢神经系统发育中的重大事件。髓磷脂由70％的脂质和30％的蛋白质组成，其由少突胶质细胞(OL)(在中枢神经系统(CNS)中)和许旺(Schwann)细胞(在外周神经系统(PNS)中)两者形成。通过起绝缘作用，髓磷脂提高神经信号沿神经轴突传播的速度并保持神经信号的完整性，从而允许信号在脑与外周的神经之间长距离来回通过。对髓磷脂鞘的损伤可导致多种具有通常毁灭性后果的神经病学病症。
疾病诸如多发性硬化(MS)中对髓磷脂的损伤导致神经信号的中断、对轴突的损伤以及最终神经元变性。为了有效地治疗这些破坏性病状，必需开发促进修复的新型方法和途径。
迄今为止，还没有用于MS的修复或髓鞘再生的疗法，并且仅这一事实就说明了对于MS患者的最大希望和未满足的需要。对促进髓 鞘再生的小分子或生物制剂的功能性筛选代表对MS的合理疗法的鉴定和开发的主要障碍。
因此，当务之急是要继续在高通量筛选平台的开发中取得可对髓鞘再生的细胞自主机制提供深入了解的技术进步。
发明概述
提供了用于测定髓鞘形成的微柱阵列。所述微柱阵列可用于测定少突胶质细胞前体细胞至少突胶质细胞的分化少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞，和/或提供了少突胶质细胞对微柱的包鞘化和/或包裹。本文中还提供了使用微柱阵列筛选促进少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞和/或少突胶质细胞对微柱的包鞘化和/或包裹的候选剂的方法。还提供了包含微柱阵列和少突胶质细胞前体细胞的系统。
附图简述
图1(a)-1(g)举例说明不同直径的纳米纤维用于研究髓鞘形成的用途。
图2描绘纳米纤维用于研究在候选小分子存在的情况下的髓鞘形成的用途。
图3(a)-3(b)举例说明富马酸喹硫平对纳米纤维的髓鞘形成的作用。
图4A-4C提供使用微柱阵列的髓鞘形成的二元指征的示意图。
图5A-5F描绘微柱的制造和髓鞘形成。
图6A-6C举例说明微柱用于测定髓鞘形成的用途。
图7举例说明根据本发明的实施方案的微柱和96孔板中的微柱 阵列。
图8(a)-8(d)举例说明少突胶质细胞前体细胞(OPC)和少突胶质细胞的双荧光标记的用途。
详述
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明并不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，并且不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求来限定。
当提供数值范围时，要理解的是，该范围的上限与下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小的范围内，并且也被包括在本发明内，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管在实践或测试本发明中也能使用与本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与所述出版物中引用的相关的方法和/或材料。
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个微柱”包括多个这样的微柱，以及提及“腔室”包括提及一个或多个腔室和对本领域技术人员来说是已知的等同物，等等。进一步指出的是，可撰写权 利要求来排除任何任选的元素。因此，该陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语如“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative)”限制的在先基础。
本文所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开内容而提供。此处的任何信息都不应解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于这些出版物。此外，提供的公布的日期可与可能需要独立确认的实际公布日期不同。
提供了用于测定髓鞘形成的水平的微柱阵列。所述微柱阵列可用于测定少突胶质细胞前体细胞至少突胶质细胞的分化少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞和/或提供了利用少突胶质细胞对微柱的包鞘化和/或包裹。本文中还提供了使用微柱阵列筛选促进少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞和/或少突胶质细胞对微柱的包鞘化和/或包裹的候选剂的方法。还提供了包含微柱阵列和少突胶质细胞前体细胞的系统。
用于测定髓鞘形成的微柱阵列
如上文中所指出的，提供了适合用于筛选促进髓鞘形成的候选剂的方法的微柱阵列。
所述微柱阵列包括包含多个微柱的衬底。多个微柱包括从衬底垂直伸出的微柱。在某些实施方案中，所述微柱可具有直径从附着于衬底的微柱的基部至远离衬底伸出的微柱的顶端逐渐变细的形状。
一般地，微柱阵列的微柱具有一致的大小。在某些实施方案中，所述微柱具有直径在10μm至150μm的范围内的基部和直径在0.1μm至10μm或0.1μm至8μm的范围内的顶端。在某些情况下，基部的直径范围为25μm至50μm并且顶端的直径范围为1μm至5μm。在某些情况下，基部的直径在25μm至40μm的范围内，诸如约25μm、30μm、35μm或40μm。在某些情况下，顶端的直径在2μm至4μm的范围内。在 某些情况下，顶端的直径为约1μm、2μm、3μm、4μm或5μm。
在某些实施方案中，微柱具有在15μm至50μm的范围内的顶端与基部之间的高度。在某些情况下，顶端与基部之间的高度在25μm至50μm的范围内。在某些情况下，顶端与基部之间的高度为25μm、30μm、35μm或40μm。
一般地，微柱阵列的多个微柱具有同样的形状。微柱的形状，如从侧面(即沿z-轴，如果平面由x-轴和y-轴来定义的话)观看的，可以是圆锥形、截头圆锥形、双圆锥形或抛物面形。
在某些实施方案中，衬底上的多个微柱可彼此间隔相同的距离。因此，在某些情况下，可以以彼此约1mm的距离，诸如800μm、600μm、400μm、200μm、150μm、100μm、50μm或25μm的微柱间间距空间放置微柱。微柱之间的距离可以是微柱的基部之间的距离。微柱之间的距离可以是微柱基部的外周之间的距离。
在某些实施方案中，微柱阵列是可寻址的。“可寻址阵列”包括在衬底上以特定位置(“地址”)放置的多个微柱的任何一维或二维排列。
在某些实施方案中，衬底可包括多个腔室并且多个腔室可各自包括多个微柱。在这类实施方案中，微柱阵列是可寻址的，因为每一个腔室在衬底上的位置是已知的。
在某些情况下，衬底可以是多个微柱从其垂直伸出的大体上平面的衬底。在某些情况下，所述平面衬底可具有二维形状，包括正方形或矩形。然而，所述平面衬底可以是其它形状，诸如圆形、三角形等。如本文中所用，术语“大体上”是指至少70％、80％、90％、99％或100％。例如，短语“大体上平面的衬底”是指为至少70％、80％、90％、99％或100％平面的衬底。
在某些实施方案中，衬底可包括多个腔室，其中多个腔室可在2个-1536个腔室的范围内。在某些情况下，衬底可包括约6、24、96、 384或1536个腔室。腔室的容积可在约1ml-50μl，诸如约500μl-50μl的范围内，诸如约400μl、约350μl、约300μl、约200μl、约100μl或约50μl。如本文中所用，术语“约”是指与指定的值不超过0.1％、不超过0.5％、不超过1％、不超过2％或更多、不超过5％或不超过10％的差异。在某些情况下，多个腔室可以是孔或微孔。
在某些实施方案中，包含微柱的衬底的尺寸可以是标准细胞培养皿的尺寸。这类衬底的使用可有利于使用例如显微镜确定在微柱上髓鞘形成的存在与否。
一般地，腔室在顶部是开放的以提供试剂、细胞、候选剂等至腔室的添加。腔室可被可移动的盖子覆盖。
在某些实施方案中，多个腔室可各自包含多个微柱，其中存在于腔室中的微柱的数目可在10个-200个，诸如20个-200个、30个-150个、40个-120个、50个-100个的范围内，例如，20个、30个、40个、50个、60个、80个、100个、120个、140个、180个或200个。
一般地，微柱由有助于细胞诸如少突胶质细胞前体细胞(OPC)或少突胶质细胞的培养的材料制成。与支持细胞的培养相容的任何材料可用于制造微柱。一般地，可使用细胞培养衬底诸如聚苯乙烯、聚丙烯或二氧化硅。在某些情况下，微柱可由选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、丙烯腈丁二烯苯乙烯、苯乙烯丁二烯共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯和二氧化硅的材料制成。
微柱阵列可通过任何便利的方法来制造。示例性方法包括蚀刻衬底表面以产生微柱、将聚合物沉积在衬底上以制造微柱、注塑成形等。包括多个包含微柱的腔室的衬底可通过多种方法来制造。例如，可将具有多个腔室的预制衬底诸如多孔细胞培养板用于将微柱引入腔室。在另一示例方法中，可将包括被均匀置于衬底上的多个微柱的衬底粘合于网格，从而提供多个腔室。
包括微柱的衬底可以是透明的或半透明的，从而允许存在于衬底上的微柱和细胞可视化。在本说明书中，术语“透明的”是指允许任何询问辐射借此通过而无显著衰减，并且还允许来自特征的信号借此通过而无显著衰减或失真。“无显著衰减”可包括，例如，无超过40％，超过30％，超过20％或超过10％的损失。询问辐射和信号可以例如是可见光、紫外光或红外光。
筛选方法
本文中还公开了用于筛选促进髓鞘形成的候选剂的方法。在某些实施方案中，所述方法可包括将候选剂与包含多个微柱和少突胶质细胞前体细胞(OPC)的衬底一起孵育；确定在多个微柱上髓鞘形成的存在与否，其中在多个微柱上髓鞘形成的存在指示所述候选剂促进髓鞘形成。
在某些实施方案中，包含多个微柱的衬底描述于前述部分中。
在某些实施方案中，所述衬底可包括多个腔室，并且多个腔室可各自包括多个微柱和OPC。
在某些实施方案中，所述方法可包括将多种候选剂与包含多个腔室和OPC的衬底一起孵育，其中多个腔室各自包含不同候选剂。
许多方法可用于确定在微柱上髓鞘形成的存在与否。
在某些实施方案中，确定髓鞘形成的存在与否可包括测定OPC分化成髓磷脂生成胶质细胞(诸如少突胶质细胞)，其中所述测定可包括检测少突胶质细胞对多个微柱的包鞘化。
在某些实施方案中，确定髓鞘形成的存在与否可包括测定从OPC产生的少突胶质细胞对多个微柱的同心包裹。
在某些实施方案中，确定髓鞘形成的存在与否可包括确定髓鞘形 成的水平。
如本文中所用，髓鞘形成是指少突胶质细胞对微柱的包鞘化。所述包鞘化可包括一层包裹微柱至少一次的髓磷脂鞘。所述包鞘化可包括完全或部分包裹微柱的区域，其中所述区域位于微柱的顶端或基部或微柱的顶端与基部之间。部分包裹可包括至少60％、或70％、或80％或90％的在微柱的顶端或基部或在微柱的顶端与基部之间的区域的微柱的圆周的包裹。完全包裹是指环绕微柱的圆周的包裹，其中所述包裹为至少约95％、或99％或100％的在微柱的顶端或基部或在微柱的顶端与基部之间的区域的微柱的圆周。因此，完全包裹是指围绕微柱的圆周的髓磷脂环的存在。
围绕微柱的髓磷脂鞘的同心包裹是指包裹基部或顶端的微柱的圆周或顶端与基部之间的区域的微柱的圆周多次，诸如2、3、4、5或更多次。因此，围绕微柱的髓磷脂鞘的同心包裹是指围绕微柱的圆周的两个或更多个髓磷脂环的存在。
如本文中所用，短语髓鞘形成水平是指存在于微柱上的髓磷脂鞘的量。在某些实施方案中，高于背景阈值但低于同心包裹阈值的髓鞘形成水平可指示微柱被包鞘但同心包裹还未发生。在某些实施方案中，高于背景阈值并且处于或高于同心包裹阈值的髓鞘形成水平可指示微柱被包鞘并且同心包裹已发生。高于同心包裹阈值的髓鞘形成水平可指示在微柱上的同心包裹的程度。
可基于阴性和阳性对照设置阈值。例如，可基于用于测定髓鞘形成的方法、OPC的数目和/或微柱的数目设置阈值。背景阈值可基于如下信号来选择：获自包含不分化成少突胶质细胞的细胞的微柱阵列的信号；获自含有与非特异性抗体接触的少突胶质细胞的微柱阵列的信号。阴性对照还可例如在筛选的上下文中提供背景阈值，阴性对照可以是未被候选剂接触的微柱和OPC。
可从阳性对照确定同心包裹阈值。在某些实施方案中，已知促进 髓鞘形成的分子可用于确定同心包裹阈值。分子诸如甲状腺激素或富马酸喹硫平可用于确定同心包裹阈值。
在某些实施方案中，可通过使用处理器和包含指令的存储器来确定髓鞘形成的存在与否和/或水平，当通过处理器来执行时，致使处理器确定在多个微柱上髓鞘形成的存在与否和/或水平。在某些实施方案中，可将确定髓鞘形成的存在与否和/或水平自动化。
在某些实施方案中，可通过检测少突胶质细胞(OL)特异性标志物来确定在微柱上髓鞘形成的存在与否和/或水平。
可使用任何已知的OL特异性标志物。在某些情况下，所述标志物可以是髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP或亲脂素)，或由报告基因编码的标志物，其表达例如由在少突胶质细胞(OL)中驱动表达的OL特异性启动子驱动。可用于提供OL特异性标志物的表达的示例性启动子包括MBP、PLP等的启动子。在某些实施方案中，在本文中公开的方法和系统中使用的OL可以是经遗传修饰的OL，其从可操作地连接于OL特异性启动子的基因编码荧光蛋白或生物发光蛋白。“可操作地连接的”是指单个核酸片段上的核酸序列的结合，使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能性RNA的表达(即，所述编码序列或功能性RNA在所述启动子的转录控制之下)时，所述启动子与该编码序列或功能性RNA可操作地连接。包括MBP启动子并驱动可操作地连接于该启动子的基因表达以及提供OL的标志物的表达盒描述于WO2011084281A1(其通过引用以其整体并入本文)中。
在某些情况下，可以以高通量方式，利用包含含有多个腔室(包含多个微柱)的衬底的微柱阵列进行候选剂的筛选。可将目标候选剂与添加至不同腔室的OPC一起孵育。OPC和候选剂的添加可在某些情况下通过机器来进行。可使用显微镜来监控微柱阵列，并且获自腔室的信号可使用处理器和包含指令的存储器来分析，当由处理器执行 时，致使处理器确定在多个微柱上髓鞘形成的存在与否和/或水平。所述指令可包括背景阈值水平、同心包裹阈值水平等。
在某些情况下，可在候选剂与包含多个微柱和OPC的衬底的孵育过程中在不同的时间点上，检测确定微柱上髓鞘形成的存在与否和/或水平。因此，初始确定可揭示候选剂是否促进OPC至OL的转化。在后一阶段进行的确定可揭示OL是否能够将微柱包鞘。在更后时间点上进行的确定可揭示OL是否能够同心包裹微柱。
可将一种或多种候选剂与包含多个微柱和OPC的衬底的孵育在1天至30天的范围内进行一段时期。在某些情况下，可进行所述孵育，持续诸如至少约1天、2天、4天、6天、1周、10天、2周、18天、3周、25天、4周或更长时间。可在孵育步骤开始后的任何天数确定髓鞘形成的存在与否。在某些情况下，可使用延时显微镜，诸如荧光延时显微镜来监测髓鞘形成的存在与否和/或髓鞘形成的水平。
可在适合OPC、OL、胶质细胞、许旺细胞等的培养条件下进行孵育。合适的细胞培养条件对于本领域普通技术人员来说是已知的。合适的细胞培养条件可以基于OPC、OL等的类型来进行优化。各种培养基可商购获得，并且可根据细胞的性质来使用，包括达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、汉克平衡盐溶液(HBSS)、达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、RPMI、Iscove氏培养基，所述培养基可补充以生长因子和支持细胞活力的其它补充剂。
多种OPC可用于本文中公开的方法和系统。如本文中所用，少突胶质细胞前体细胞(OPC)可以是致力于分化并产生髓磷脂生成胶质细胞，诸如少突胶质细胞(OL或少突神经胶质或少突胶质细胞)的细胞。例如，所述OPC可获自任何物种诸如鼠、马、猪、牛、犬、猫、绵羊或其它物种的受试者。在某些情况下，所述OPC可获自人。在某些情况下，所述OPC可从多能细胞诸如诱导的多能细胞、胚胎多能细胞诸如胚胎干细胞、间充质干细胞(MSC)产生。在某些情况下， 所述OPC可从多能细胞产生。在某些情况下，所述OPC可分化成OL和/或许旺细胞。
在某些实施方案中，微柱阵列可使用倒置显微镜从底部读数。在某些情况下，微柱阵列可从顶部读数。微柱阵列的底部是微柱不存在于其上的衬底的一侧。因此，微柱阵列的顶侧是微柱存在于其上的衬底的一侧。
在某些实施方案中，所述方法可包括使用髓鞘形成的二元指征筛选候选剂，即髓鞘形成是否存在基于特异于少突胶质细胞的标志物的存在与否。
在某些实施方案中，所述方法可以包括孵育候选剂与包含多个微柱和少突胶质细胞前体细胞(OPC)的衬底，其中OPC的数量在20,000-100,000的范围内。待用于所述方法的OPC的数量可基于测定的类型、微柱的数量、衬底的大小、腔室的大小等来确定。
在某些情况下，所述方法可包括孵育候选剂与包含含有多个腔室的衬底的微柱阵列，每一个腔室包含多个微柱和多个OPC。微柱阵列还可包含多个缺乏微柱和/或OPC的腔室，所述腔室可用作用于确定髓鞘形成的存在与否和/或髓鞘形成水平的对照。在某些实施方案中，包含在腔室中的OPC的数量可基于腔室的大小和/或腔室中微柱的数量。在某些情况下，每一个腔室可包括约100,000个、80,000个、60,000个、40,000个、20,000个、10,000个、5,000个、3000个、1000个、300个、200个、100个、80个、60个、50个、30个、20个、10个或更少的OPC。
在某些情况下，用于筛选的目标候选剂包括许多化学类别的生物活性剂，主要是有机分子，尽管在一些情况下包括无机分子、有机金属分子、免疫球蛋白等。目标还有有机小分子，其包含与蛋白质结构相互作用(特别是氢键合)所必需的官能团，并且通常包括至少胺基、羰基、羟基或羧基，通常至少两种所述化学官能团。所述候选剂通常 包含被一种或多种上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳香族或聚芳香族结构。也在生物分子中发现了候选剂，包括肽、多核苷酸、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。
化合物可从许多来源，包括合成或天然化合物的文库来获得。例如，许多装置可用于多种有机化合物，包括生物分子的随机和定向合成，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。或者，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物的文库是可用的或容易产生的。此外，天然或合成产生的文库和化合物可通过常规化学、物理和生物化学方法来容易地修饰，并且可用于产生组合文库。可将已知的药理学试剂经历定向或随机化学修饰，诸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
可以以不同的浓度平行运行多个测定以获得对各种浓度的差异响应。正如本领域已知的，确定试剂的有效浓度通常使用以1:10或其它对数比例稀释所得的浓度的范围。必要时可通过第二系列的稀释进一步精细化浓度。通常地，这些浓度之一用作阴性对照，即在0浓度或低于试剂的检测水平下或在不给出髓鞘形成的可检测存在的试剂的浓度或低于所述浓度下。
一般地，本文中描述的方法和系统不需要神经元。因此，本文中提供的方法和系统不包括大量神经元。在某些实施方案中，所述OPC可能具有少量污染性神经元。一般地，可存在于OPC群体(存在于本文中公开的方法和系统中的)中的神经元的百分比可以小于30％，小于20％，小于10％，小于5％，小于1％或小于0.5％。在某些实施方案中，可存在于OPC群体(存在于本文中公开的方法和系统中的)中的神经元的百分比可以是0％。
鉴定为促进髓鞘形成的候选剂可通过分析在孵育所述试剂与微柱阵列和OPC后包围微柱的髓磷脂鞘的密度来进行进一步表征。使用髓鞘形成的标准体外测定来进一步验证所述候选剂。可在与髓鞘形 成的丧失(脱髓鞘)相关的疾病的动物模型中进一步测试体外经验证的候选剂。随后在具有与轴突髓鞘形成的丧失或缺乏相关的病状的受试者中测试体内被验证为髓鞘形成的促进剂的候选剂。在一些实施方案中，轴突为CNS轴突。这样的条件可以包括创伤、毒素暴露、窒息或缺氧性缺血、围产期缺氧缺血性损伤、中枢神经系统的白质的损伤或中枢神经系统的白质的疾病、急性脑损伤，克-雅氏病(Creutzfeld-Jakobdisease)、慢性神经变性疾病和脱髓鞘病。多发性硬化是特别值得注意的。脱髓鞘疾病和病症可包括急性播散性脑脊髓炎、视神经炎、横贯性脊髓炎、德维克病(Devic's disease)、白血球营养不良症、进行性多灶性白质脑病和脑桥中央髓鞘溶解。
慢性脱髓鞘病状可包括慢性免疫脱髓鞘多神经病(CIDP)、多灶性CIDP、多灶性运动神经病(MMN)、抗MAG综合征、galop综合征、抗硫脂抗体综合征(具有血清M蛋白)、抗GM2抗体综合征、POEMS综合征、神经束膜炎等。
用于测定髓鞘形成的系统
本文中还提供了用于测定髓鞘形成的系统。这些系统可以用来评估目标分子是否影响髓鞘形成。在某些实施方案中，可使用该系统来鉴定增加或减少髓鞘形成的候选剂。
所述系统可包括包含多个微柱的衬底；和少突胶质细胞前体细胞(OPC)，其中所述多个微柱包括从衬底垂直伸出的微柱，并且包含直径从附着于衬底的微柱的基部至远离衬底伸出的微柱的顶端逐渐变细的形状。
在先前部分中提供了包含多个微柱的衬底。
因此，在某些实施方案中，所述衬底可包括多个腔室，并且其中多个腔室包含多个微柱和OPC。
在先前的部分中描述了可包括在系统中的OPC。
在某些情况下，所述系统还可包括处理器和包含指令的存储器，当通过处理器执行时，致使处理器确定在多个微柱上髓鞘形成的存在与否和/或水平。
说明书可包括关于用于确定髓鞘形成存在与否的阈值、用于确定髓鞘形成的水平的阈值等的信息。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何完成和使用本发明的完整公开内容与说明，这些实施例不旨在限制发明人视为的发明范围，也不旨在表示下文的实验是所执行的全部或唯一实验。已经做出努力以确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的正确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数均为重量份，分子量均为重均分子量，温度均为摄氏度，以及压力均为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内(地)；i.p.，腹膜内(地)；s.c.，皮下(地)等。
实施例1:纳米纤维支持髓鞘形成
长期以来一直认为髓鞘形成是至少突胶质细胞的轴突信号传导的结果(Colello和Pott,Mol.Neurobiol.15,83–100,1997)。因此，鉴定这些信号的性质对于促进修复是至关重要的，并且确实为大多数髓鞘形成研究的目标。人们普遍认为髓鞘形成的诱导以某种方式与轴突直径密切相关；较大的轴突是有髓鞘的，而较小的轴突没有髓鞘。轴突目标大小的增加与轴突直径的增加和髓磷脂的产生两者相关(Voyvodic,Nature 342,430–433,1989)。然而，单独的这一发现没有建立轴突直径的增加足以启动髓鞘形成，而是相反地表明轴突信号促进髓磷脂的发生并且受外在因素调节。我们最近的发现提供了挑战轴突直径对少突胶质细胞髓鞘形成的启动的作用的吸引人的替代假说。我 们工程化电子自旋聚苯乙烯纳米纤维以替代轴突作为衬底，从而允许研究纳米纤维是否能潜在地用作少突胶质细胞髓鞘形成的合适支架(图1)。
图1(a)产生直径在0.2-0.4μm的范围内和(b)2-4μm的范围内的聚苯乙烯纳米纤维，并对其成像。将纯化的少突神经胶质涂铺在纤维上，并且被观察到将大纤维包鞘和包裹大纤维。将培养物的髓磷脂免疫染色(红色)，并将其与纤维的相差图像合并。(e-g)通过电子显微镜观察到膜的紧凑包裹，表明髓鞘形成。
我们的发现表明纤维直径确实足以启动由少突胶质细胞进行的包裹，并且在轴突不存在的情况下的髓鞘形成代表最低程度的容许环境，一个理想地适合于分析髓鞘形成所必需和足够的细胞自主机制的环境(Lee等人，Nature Methods,9(9):917-922,2012)。该最近的发现使我们能够开始小规模筛选努力。我们的纳米纤维的设计中的精致灵活性保证实验设计中的纤维的恒定均匀度和密度，并且来自测试的化合物的任何作用可仅仅归因于对少突神经胶质的直接影响(图2)，而不混淆来自神经元的影响。
图2将纳米纤维图案化并沉积至24孔格式中，并且将其置于具有孵育室的自动化荧光显微镜下。在加入少突神经胶质和小分子后，可就对增殖、存活、分化以及髓鞘形成的影响实时分析用纳米纤维培养的细胞。在轴突不存在的情况下的髓鞘形成代表最小程度的容许环境，一个理想地适合于分析在髓鞘形成之前并且导致髓鞘形成的过程所必需的和足够的细胞自主机制的环境。底部图框举例说明可在纳米纤维上培养少突胶质细胞前体细胞(绿色)和少突胶质细胞(红色)并且可鉴定髓鞘形成(红色)的原理论证。
为了启动筛选，编制被认为在促进少突胶质细胞分化和髓鞘形成中起作用的已知分子和化学抑制剂的候选物列表，并应用各种FDA批准的化合物治疗精神障碍。由于多个研究已使髓磷脂超微结构的异 常与精神障碍如精神分裂症的程度相关联，因此筛选非典型抗精神病药物和多巴胺受体拮抗剂(Hakak等人，PNAS,98(8):4746-4751,2001；McDonald等人，2005)。我们发现化合物富马酸喹硫平(思瑞康(Seroquel))大大增强了少突胶质细胞的分化和纳米纤维的髓鞘形成(图3a)。为了验证这些结果，我们分析了喹硫平对与纯化的神经元共培养的纯化的少突神经胶质的影响。富马酸喹硫平显著增强分化和神经元轴突的髓鞘形成(图3b)。在共培养中，髓磷脂结间体可通过由少突胶质细胞形成的“管状”结构(针对髓磷脂特异性蛋白的免疫染色)来常规地鉴定。同心和紧凑的膜包裹物也可以通过电子显微镜来检测(Chan等人，Neuron 43,183–191,2004)。总体而言，共培养系统概括了少突胶质细胞发育和体内髓鞘形成的时机，并且代表验证促进和抑制少突胶质细胞发育的化合物和因素的强大工具。有趣地是，由于喹硫平最初被开发作为多巴胺-2(D2)受体拮抗剂，因此其它D2拮抗剂不引发相同的对少突胶质细胞的作用。这一发现的意义是鉴定具有在多发性硬化中促进修复的潜能的候选分子。此外，定量少突胶质细胞的分化和髓鞘形成的功能读出的能力为解除轴突对髓鞘形成的贡献提供了独特的机会。
图3.在我们的纳米纤维平台上检查少突胶质细胞分化和髓鞘形成(a)。富马酸喹硫平大大增强了我们的纤维的分化和髓鞘形成。(b)建立少突胶质细胞-DRG神经元共培养物以验证富马酸喹硫平(100nM)的作用。在体外进行7天之后，对培养物进行免疫染色并分析髓磷脂碱性蛋白(红色)。如图中所指示的，少突胶质细胞分化和髓鞘形成均被显著加速。
该发现提供了该方法的基本原理，并为可促进发育、稳定性和修复的其它化合物和生物制品的鉴定提供有价值的见解。然而，小分子和化合物的高通量分析仍然实现不了，因为纳米纤维不能被轻易地图案化成微孔。此外，自动成像系统不能以快速和可重现的方式鉴定“髓磷脂段”，这使高通量分析成为不可能。为了克服这些限制，我们试图在微孔平台中开发二元系统来鉴定少突胶质细胞髓鞘形成，从而使 得能够进行小分子和化合物的高通量分析。
实施例2:用于测定髓鞘形成的微柱阵列
开发功能性筛选必需具有以稳健的、可重现的和定量的方式快速进行实验的能力。虽然我们已经清楚地表明，该纳米纤维支架代表筛选化合物中的进步，但所述纤维不适合于高通量筛选。将纳米纤维旋转并图案化至小孔只能非常困难地实现，并且极其耗时。此外，鉴定和量化髓磷脂结间体的自动化软件目前是不可获得的。
微柱阵列由压缩的二氧化硅(由Trianja Technologies制造的)制造。在芯片上设计适合用于96孔格式的阵列，从而允许更高效和快速的实验设计。微柱允许在横截面上使髓鞘形成可视化，一个可允许检测髓磷脂的“环”的特征(图4)。由于可将微柱制造成任意大小和方向，我们已设计了用于微柱的模板，其高度为约50μm(Lee等人，同上)，并且柱顶部的直径为2μm(允许髓鞘形成；Lee等人，同上)，基部直径为150μm。该格式将允许分析最佳的柱子规格。微柱以120μm的间隔相隔，从而允许合理数量的少突神经胶质附着于柱子之间。通过使用由Zeiss提供的Axiovision软件，我们可将髓磷脂环数的检测和定量自动化而无任何与所述纳米纤维相关的混淆问题(即，结间体的长度，干扰细胞过程，细胞体等)。从本质上讲，少突胶质细胞前体细胞(OPC)将被可视化为绿色环，而少突胶质细胞被显示为红色环(图4C)。
图4.使用微柱测定的髓鞘形成的二元指征。(a)纳米纤维的少突胶质细胞包裹可从侧面被可视化为髓鞘的“环”(红，MBP阳性染色)。(b)微柱可被制造成任意大小和方向。我们已经制造微柱的模板，其高度为约50μm，直径为2μm。微柱以100μm的间隔相隔，以允许细胞附着于表面。(c)通过利用倒置荧光显微镜，可从底部对所述柱子成像，并且髓磷脂的“环”的鉴定可被用作功能性髓鞘形成的二元指征。
为了在此方法中证明原理论证，我们制造了微柱，分析了尺寸，并在阵列中培养原代OPC(图5)。所述OPC沿整个长度将微柱包鞘(图5C，D)。此外，在分化成少突胶质细胞后，MBP阳性细胞同心包裹柱子(图5E，F)。包裹的定量举例说明少突胶质细胞不能包裹柱子的基部(150μm)，但优先包裹柱子的较小直径的顶部。这些结果表明，减小柱子的直径将优化少突胶质细胞的包裹。
图5.用于髓鞘形成的微柱阵列的制造。(A，B)微柱阵列由压缩的二氧化硅制成，并且被蚀刻成允许包鞘化和包裹的尺寸。微柱的尺寸定量和分布。(C，D)用微柱培养OPC(绿色)，并且OPC沿它们的整个长度将柱子包鞘。(E，F)少突胶质细胞(红色)以螺旋方式包裹柱子，表明髓鞘形成。
为了分析将微柱用作筛选平台的可能性和有效性，我们将OPC涂铺在阵列上，并添加先前已示出促进分化和包裹的分子，即富马酸喹硫平和甲状腺激素(图3，6)。作为一个原理验证，富马酸喹硫平和甲状腺激素显著增强了“髓磷脂环”在微柱平台上的产生。少突胶质细胞的分化和髓鞘形成的定量验证了我们先前关于纳米纤维和共培养物的发现，并且表明所述微柱阵列代表用于鉴定促进分化和包裹的化合物的有效筛选平台。
图6.举例说明髓鞘形成测定的二元指征(BIMA)标识少突胶质细胞髓鞘形成的增强的原理实验的验证。(A-C)由围绕微柱的少突胶质细胞(红色，MBP阳性染色)产生的髓鞘形成的免疫染色。在微柱上培养少突胶质细胞，进行总共6天体外(div)，并且在4div接受已知增强分化的化合物，进行2天。相较于(A)对照，(B)1μM的富马酸喹硫平或(C)30ng/mL的甲状腺激素的添加增加了由少突胶质细胞产生的红色“髓磷脂环”的数目。在6div获取图像。比例尺，50μm。
实施例实验3:微柱阵列的优化
在进一步分析数据后，我们确定需要改变微柱阵列的规格。首先 是柱子的纵横比的设计。由于少突胶质细胞不能包裹柱子的大的基部直径，因此我们决定设计具有50μm的直径的柱子的基部。保持2μm的顶部柱直径，我们将柱子的高度降至25μm，以确保高效包鞘化和包裹。为了确保少突胶质细胞的髓磷脂膜的同心包裹的鉴定，我们使柱子逐渐变细，如在图5E中观察到的。将微柱的间隔(120μm)优化成50μm，以确保少突胶质细胞的数量与微柱的密度相匹配。最后，我们将阵列图案化以粘结至96微孔板中(图7)。
图7.获得少突胶质细胞的高效包鞘化和包裹的BIMA设计的优化。改变柱子的纵横比，使基部直径为50μm，并且顶端直径为2μm。柱子高度被降至25μm。微柱经制造粘结至96微孔板中。每个柱子将间隔50μm，以确保实现细胞对柱子的最佳密度。
实施例4:微柱阵列用于研究髓鞘形成的动力学的用途
髓鞘形成的程度和动力学历来难以解决，因为大多数髓鞘形成的筛选策略不能被实时可视化。因此，我们将利用小鼠遗传学来使用与表达memTomato(在cre介导的重组之前)和表达memEGFP(在cre介导的重组之后)的小鼠(pCA-tdTomato,-EGFP,Jackson)组合的PLP-creERT2驱动小鼠应用双荧光标记策略。通过利用他莫西芬诱导少突胶质细胞的重组，可使髓鞘形成可视化，并通过在memTomato不存在的情况下memEGFP阳性环的表达来定量所述髓鞘形成。在延时显微镜下以自动化方式进行筛选，并将所述筛选封闭在完整的孵育系统中。双荧光标记策略将允许定量和分辨，以确定对髓鞘形成的动力学和程度的作用。通过实施双荧光标记策略，我们可基于启动子驱动的荧光强度来定量这些过程，并通过延时显微镜启动小分子和生物制品筛选(图8)。通过检查和定量荧光强度的变化，我们应该能够分辨对分化和髓鞘形成的作用。作为概念验证，已在体外分离、纯化和分析来自在该目标中提出的PLP-creERT2/pCA-tdTomato-EGFP报告小鼠的少突神经胶质(图8)。这些结果与我们的假设是一致的，并说明了该方法的有效性。
图8.举例说明OPC和少突胶质细胞的双荧光标记的效用的概念实验的验证。(a、b和d)在1mM他莫西芬存在的情况下在DRG神经元上培养10天的来自PLP/CreERT2XpCA-tdmTomato-mEGFP小鼠的OPC(红色；Tomato)和少突胶质细胞(绿色；EGFP)。将转基因OPC与野生型OPC混合以建立少突神经胶质的稀疏标记。(c和d)有髓鞘的少突胶质细胞(白色)通过MBP的免疫染色来鉴定。细胞核(蓝色)通过DAPI染色来指示。注意未成熟OPC(白色箭头)缺乏EGFP和MBP染色。C和D上的EGFP阴性白色髓磷脂段源自添加至培养物中的野生型少突胶质细胞。
我们的微柱的设计中的精致的灵活性和均匀度保证恒定的和可重现的实验设计。96孔格式中的筛选可被定量，并仅归因于对少突神经胶质的直接影响。通过实施双荧光标记策略，我们可基于启动子驱动的荧光强度定量髓鞘形成的程度和动力学，以及通过延时显微镜启动小分子和生物制品筛选。该方法将为用于脱髓鞘病状的髓鞘再生的治疗性分子和策略的鉴定提供有价值的见解。
虽然本发明已经参照其具体实施方案进行了描述，但本领域普通技术人员应理解，可进行各种变化并且可替代等同物而不背离本发明的真实精神和范围。此外，可作出许多修改来使具体情况、材料、物质组合物、方法、方法步骤或步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这类修改意在所附的权利要求的范围之内。

Claims (20)

1.一种用于筛选促进髓鞘形成的候选剂的方法，所述方法包括：
将候选剂与包含多个微柱和少突胶质细胞前体细胞(OPC)的衬底一起孵育；和
通过从微柱的顶部或底物光学地查测微柱，使微柱周长周围的髓磷脂环可视化，由此确定在所述多个微柱上髓鞘形成的存在与否，
其中所述多个微柱的髓鞘形成的存在指示所述候选剂促进髓鞘形成，
其中所述多个微柱包括从所述衬底垂直伸出的微柱并且包括直径从附着于所述衬底的所述微柱的基部至远离所述衬底伸出的所述微柱的顶端逐渐变细的形状。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衬底包含多个腔室并且其中所述多个腔室各自包含多个微柱和所述OPC。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述孵育包括孵育多种候选剂与包含所述多个腔室和所述OPC的所述衬底，其中所述多个腔室各自包含不同的候选剂。
4.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，其中所述确定髓鞘形成的存在与否包括测定OPC分化成少突胶质细胞，其中所述测定包括检测所述少突胶质细胞对所述多个微柱的包鞘化。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述确定髓鞘形成的存在与否包括测定从所述OPC产生的少突胶质细胞对所述多个微柱的同心包裹。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述确定髓鞘形成的存在与否包括确定微柱上存在的髓磷脂包鞘的量。
7.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，其中所述微柱包含直径在10μm至150μm的范围内的基部和直径在0.1μm至10μm的范围内的顶端。
8.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，其中所述微柱包含在15μm至50μm的范围内的所述顶端与所述基部之间的高度。
9.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，其中所述形状包括圆锥形、截头圆锥形、双圆锥形或抛物面形。
10.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，其中所述基部的直径在25μm至50μm的范围内，所述顶端的直径在1μm至5μm的范围内，并且所述顶端与所述基部之间的所述高度在25μm至50μm的范围内。
11.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，其中所述多个腔室各自包含10个至200个所述微柱。
12.一种用于筛选促进髓鞘形成的候选剂的系统，所述系统包含：
包含多个微柱的衬底；
少突胶质细胞前体细胞(OPC)，
其中所述多个微柱包括从所述衬底垂直伸出的微柱并且包括直径从附着于所述衬底的所述微柱的基部至远离所述衬底伸出的所述微柱的顶端逐渐变细的形状；和
被构造成通过从微柱的顶部或底物光学地查测微柱、使微柱周长周围的髓磷脂环可视化的显微镜。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述微柱包含直径在10μm至150μm的范围内的基部和直径在0.1μm至10μm的范围内的顶端。
14.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述微柱包含在15μm至50μm的范围内的所述顶端与所述基部之间的高度。
15.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述衬底包含多个腔室并且其中所述多个腔室包含所述多个微柱和所述OPC。
16.根据权利要求12或13所述的系统，其还包含：
处理器；和
包含指令的存储器，所述指令当通过所述处理器执行时，致使所述处理器确定在所述多个微柱上髓鞘形成的存在与否和/或存在的髓磷脂包鞘的量。
17.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述基部的直径在25μm至50μm的范围内，所述顶端的直径在1μm至5μm的范围内，并且所述顶部与所述基部之间的所述高度在25μm至50μm的范围内。
18.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述微柱包含选自聚苯乙烯、聚丙烯和二氧化硅的材料。
19.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述多个腔室各自包含10个至200个所述微柱。
20.根据权利要求12或13所述的系统，其中所述形状包括圆锥形、截头圆锥形、双圆锥形或抛物面形。
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A culture system to study oligodendrocyte myelination processes using engineered nanofibers;Seonok Lee等;《Nature Methods（Epub）》;20120715;第9卷(第9期);摘要，918页左栏第1-2段，919页附图2-3及其注释，920页右栏最后1段-921页左栏第1段，921页左栏第3段，online meethods第1页右栏2-3段，第2页左栏第3段 *
Central nervous system remyelination in culture-a tool for multiple sclerosis ressearch;Zhang等;《Exp Neurol》;20111231;第230卷(第1期);第138-148页 *
Chemical inducers and transcriptional markers of oligodendrocyte differenitiation;Joubert等;《J Neurosci Res》;20101231;第88卷(第12期);第2546-2557页 *
Deconstructing myelination: it all comes down to size;Karadottir等;《Nature Methods》;20120930;第9卷(第9期);第883-884页 *
Directional neurite outgrowth on superaligned carbon nanotube yarn patterned substrate;Fan等;《Nano Lett》;20120618;第12卷(第7期);第3668-3673页 *
Enhancing remyelination in disease-can we wrap up?;Kotter等;《Brain》;20111231;第134卷;第1882-1900页 *
Highly oriented electrospun polycaprolactone micro/nanofibers prepared by a field-controllable electrode and rotating collector;Hyeongjin Lee等;《Applied Physics A》;20090825;第97卷;第559-565页 *

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