KR20150096659A

KR20150096659A - 수초화를 검정하기 위한 마이크로필라 어레이

Info

Publication number: KR20150096659A
Application number: KR1020157015647A
Authority: KR
Inventors: 조나 알. 챈; 선옥 이
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2015-08-25
Also published as: CA2892687A1; WO2014100199A1; EP2935663A1; JP6363096B2; US20150316539A1; KR102112071B1; EP2935663A4; CA2892687C; EP2935663B1; CN104919095A; JP2016504033A; US10180423B2; CN104919095B

Abstract

희소돌기아교세포 전구체 세포의 희소돌기아교세포로의 분화, 외피화, 및/또는 희소돌기아교세포에 의한 마이크로필라의 포장을 검정하기 위한 마이크로필라 어레이가 제공된다. 희소돌기아교세포 전구체 세포의 희소돌기아교세포로의 분화, 외피화, 및/또는 희소돌기아교세포에 의한 마이크로필라의 포장을 증진하는 후보 작용제의 선별검사를 위해 마이크로필라 어레이를 이용하는 방법 역시 본원에서 제공된다. 마이크로필라 어레이 및 희소돌기아교세포 전구체 세포를 포함하는 시스템 역시 제공된다.

Description

수초화를 검정하기 위한 마이크로필라 어레이{MICROPILLAR ARRAYS FOR ASSAYING MYELINATION}

교차 참조

본 출원은 2012년 12월 19일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/739,446에 우선권을 주장하고, 상기 출원은 본원에서 참조로서 편입된다.

연방 정부의 지원을 받은 연구에 관한 진술

본 발명은 US National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders에 의해 수여된 보조금 번호 NS062796 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.

도입

미엘린은 중추신경계와 말초신경계의 절대로 필요한 성분이다. 미엘린초를 절연함으로써 축삭돌기의 체계적인 포장은 척추동물 중추신경계의 발달에서 주목할 만한 이벤트이다. 70% 지질 및 30% 단백질로 구성되는 미엘린은 중추신경계 (CNS)에서 희소돌기아교세포 (OLs) 및 말초신경계 (PNS)에서 슈반 세포 둘 모두에 의해 형성된다. 절연체로서 작동하는 미엘린은 신경 축삭돌기 아래로 신경 신호 전파의 속도와 통합성을 증강하고, 신호가 장거리에 걸쳐 뇌와 말초의 신경 사이에 앞뒤로 통과하는 것을 가능하게 한다. 미엘린초에 손상은 종종 치명적인 결과를 갖는 다양한 신경 질환을 야기할 수 있다.

질환, 예를 들면, 다발성 경화증 (MS)에서 미엘린에 대한 손상은 신경 신호의 교란, 축삭돌기에 손상, 그리고 최종적으로 뉴런 변성을 유발한다. 이들 치명적인 질환을 효과적으로 치료하기 위해, 수복을 증진하는 신규한 방법론과 접근법을 개발하는 것이 필수적이다.

현재까지, MS에서 수복 또는 재수초화를 위한 요법이 없고, 그리고 이러한 사실만으로도 MS 환자에 대한 최대 희망과 충족되지 않은 요구를 예증한다. 재수초화를 증진하는 소형 분자 또는 생물학적 제제에 대한 기능적 선별검사는 MS에 대한 합리적인 치료제의 확인과 개발에 주요 장애물을 대표한다.

이런 이유로, 재수초화에 대한 세포 자율 기전에 통찰력을 제공하는 높은-처리량 선별검사 플랫폼의 개발에서 기술적인 진전을 계속하여 만들어내는 것이 긴급하다.

발명의 요약

수초화를 검정하기 위한 마이크로필라 어레이가 제공된다. 이들 마이크로필라 어레이는 희소돌기아교세포 전구체 세포의 희소돌기아교세포로의 분화, 및/또는 외피화, 및/또는 희소돌기아교세포에 의한 마이크로필라의 포장을 검정하는데 이용될 수 있다. 희소돌기아교세포 전구체 세포의 희소돌기아교세포로의 분화, 및/또는 외피화, 및/또는 희소돌기아교세포에 의한 마이크로필라의 포장을 증진하는 후보 작용제의 선별검사를 위해 마이크로필라 어레이를 이용하는 방법 역시 본원에서 제공된다. 마이크로필라 어레이 및 희소돌기아교세포 전구체 세포를 포함하는 시스템 역시 제공된다.

도면의 간단한 설명
도면 1(a)-1(g)는 수초화를 연구하기 위한 상이한 직경의 나노섬유의 이용을 도시한다.
도면 2는 후보 소형 분자의 존재에서 수초화를 연구하기 위한 나노섬유의 이용을 묘사한다.
도면 3(a)-3(b)는 나노섬유의 수초화에 대한 쿠에티아핀 푸마르산염의 효과를 도시한다.
도면 4A-4C는 마이크로필라 어레이를 이용하여 수초화를 위한 이진수 지시물의 계통도를 제공한다.
도면 5A-5F는 마이크로필라와 수초화의 제작을 묘사한다.
도면 6A-6C는 수초화를 검정하기 위한 마이크로필라의 이용을 도시한다.
도면 7은 본 발명의 구체예에 따라 96 웰 평판 내에 마이크로필라 및 마이크로필라 어레이를 도시한다.
도면 8(a)-8(d)는 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs)와 희소돌기아교세포의 이중-형광 표지화의 이용을 도시한다.

상세한 설명

본 발명을 더욱 설명하기에 앞서, 본 발명은 설명된 특정 구체예에 한정되지 않고, 따라서 당연히 변할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문이다.

값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 상기 범위의 상한선과 하한선 사이에 하한선의 단위의 1/10까지 각 개재성 값, 그리고 언급된 범위에서 임의의 다른 언급된 또는 개재성 값은 본 발명의 범위 안에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 더욱 작은 범위의 상하선과 하한선은 더욱 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있고, 그리고 또한, 본 발명의 범위 안에 포괄되고, 언급된 범위 내에 임의의 특이적으로 배제된 한계에 종속된다. 언급된 범위가 한계 중에서 한쪽 또는 양쪽을 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계의 한쪽 또는 양쪽을 배제하는 범위 역시 본 발명에서 포함된다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 재료 역시 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 바람직한 방법과 재료가 하기에 설명된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 이들 간행물이 관련하여 인용되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참조로서 편입된다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 달리 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함하는 것으로 명기되어야 한다. 따라서, 예로서, "마이크로필라"에 대한 언급은 복수의 이런 마이크로필라를 포함하고, 그리고 "챔버"에 대한 언급은 하나 또는 그 이상의 챔버 및 당업자에게 공지된 이의 등가물에 대한 언급을 포함하고, 기타 등등이다. 청구항은 임의의 임의선택적 원소를 배제하도록 작성될 수 있는 것으로 더욱 명기된다. 따라서, 이러한 진술은 청구항 원소의 열거와 관련하여 "오로지", "단독으로" 등과 같은 배타적 용어의 이용, 또는 "부정적인" 제한의 이용에 대한 선행 기초로서 역할하는 것으로 의도된다.

본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 오로지 그들의 개시 목적으로만 제공된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해서 이런 공개보다 선행할 권리가 없다는 것을 시인하는 것으로 해석되지 않는다. 게다가, 제공된 공개의 일자는 실제 공개 일자와 상이할 수 있고, 이것은 독립적으로 확증될 필요가 있을 수 있다.

수초화의 수준을 검정하기 위한 마이크로필라 어레이가 제공된다. 이들 마이크로필라 어레이는 희소돌기아교세포 전구체 세포의 희소돌기아교세포로의 분화, 및/또는 외피화, 및/또는 희소돌기아교세포에 의한 마이크로필라의 포장을 검정하는데 이용될 수 있다. 희소돌기아교세포 전구체 세포의 희소돌기아교세포로의 분화, 및/또는 외피화, 및/또는 희소돌기아교세포에 의한 마이크로필라의 포장을 증진하는 후보 작용제의 선별검사를 위해 마이크로필라 어레이를 이용하는 방법 역시 본원에서 제공된다. 마이크로필라 어레이 및 희소돌기아교세포 전구체 세포를 포함하는 시스템 역시 제공된다.

수초화를 검정하기 위한 마이크로필라 어레이

전술한 바와 같이, 수초화를 증진하는 후보 작용제를 선별검사하기 위한 방법에서 이용하기에 적합한 마이크로필라 어레이가 제공된다.

마이크로필라 어레이는 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질을 포함한다. 복수의 마이크로필라는 기질로부터 수직으로 돌출하는 마이크로필라를 포함한다. 일정한 구체예에서, 마이크로필라는 기질에 부착된 마이크로필라의 기부로부터 기질로부터 멀리 떨어져 돌출한 마이크로필라의 첨단으로 직경에서 점점 줄어드는 모양을 가질 수 있다.

일반적으로, 마이크로필라 어레이의 마이크로필라는 균일한 크기를 갖는다. 일정한 구체예에서, 마이크로필라는 직경에서 10 μm 내지 150 μm 범위에서 변하는 기부 및 직경에서 0.1 μm 내지 8 μm 범위에서 변하는 첨단을 갖는다. 일정한 경우에, 기부는 직경에서 25 μm 내지 50 μm 범위에서 변하고, 그리고 첨단은 직경에서 1 μm 내지 5 μm 범위에서 변한다. 일정한 경우에, 기부는 직경에서 25 μm 내지 40 μm 범위에서 변한다, 예를 들면, 약 25 μm, 30 μm, 35 μm, 또는 40 μm이다. 일정한 경우에, 첨단은 직경에서 2 μm 내지 4 μm 범위에서 변한다. 일정한 경우에, 첨단의 직경은 약 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 또는 5 μm이다.

일정한 구체예에서, 마이크로필라는 15 μm 내지 50 μm 범위에서 변하는, 첨단과 기부 사이에 높이를 갖는다. 일정한 경우에, 첨단과 기부 사이에 높이는 25 μm 내지 50 μm 범위에서 변한다. 일정한 경우에, 첨단과 기부 사이에 높이는 25 μm, 30 μm, 35 μm, 또는 40 μm이다.

일반적으로, 마이크로필라 어레이의 복수의 마이크로필라는 균일한 모양을 갖는다. 마이크로필라의 모양은 측면으로부터 (즉, 평면이 x-와 y-축에 의해 규정되면 z-축을 따라서) 개관될 때, 원뿔형, 절단된 원뿔형, 쌍원뿔형, 또는 포물형일 수 있다.

일정한 구체예에서, 기질 상에서 복수의 마이크로필라는 균일한 거리에 의해 서로로부터 분리될 수 있다. 따라서, 일정한 경우에, 마이크로필라는 서로로부터 약 1 mm의 거리에서, 예를 들면, 마이크로필라 사이에 800 μm, 600 μm, 400 μm, 200 μm, 150 μm, 100 μm, 50 μm, 또는 25 μm의 개재성 공간에서 배치될 수 있다. 마이크로필라 사이에서 거리는 마이크로필라의 기부 사이에 거리일 수 있다. 마이크로필라 사이에서 거리는 마이크로필라의 기부의 주변 사이에 거리일 수 있다.

일정한 구체예에서, 마이크로필라 어레이는 주소 지정 가능하다. "주소 지정 가능한 어레이"는 기질 상에서 특정 위치 ("주소")에서 배치된 복수의 마이크로필라의 임의의 1차원 또는 2차원 배열을 포함한다.

일정한 구체예에서, 기질은 복수의 챔버를 포함할 수 있고, 그리고 이들 복수의 챔버는 복수의 마이크로필라를 각각 포함한다. 이런 구체예에서, 마이크로필라 어레이는 주소 지정 가능한데, 그 이유는 기질 상에서 각 챔버의 위치가 알려져 있기 때문이다.

일정한 경우에, 기질은 복수의 마이크로필라가 수직으로 돌출하는 실제적으로 평면적 기질일 수 있다. 일정한 경우에, 평면적 기질은 사각형, 또는 직사각형을 비롯한 2차원 모양을 가질 수 있다. 하지만, 평면적 기질은 다른 모양, 예를 들면, 환상, 삼각형 등일 수 있다. 용어 "실제적으로"는 본원에서 이용된 바와 같이, 최소한 70%, 80%, 90%, 99%, 또는 100%를 지칭한다. 가령, 관용구 "실제적으로 평면적 기질"은 최소한 70%, 80%, 90%, 99%, 또는 100% 평면적인 기질을 지칭한다.

일정한 구체예에서, 기질은 복수의 챔버를 포함할 수 있고, 여기서 이들 복수의 챔버는 2 내지 1536개 챔버 범위에서 변할 수 있다. 일정한 경우에, 기질은 약 6, 24, 96, 384 또는 1536개 챔버를 포함할 수 있다. 챔버의 부피는 약 1 ml 내지 50 μl, 예를 들면, 약 500 μl 내지 50 μl 범위에서 변할 수 있다, 예를 들면, 약 400 μl, 약 350 μl, 약 300 μl, 약 200 μl, 약 100 μl, 또는 약 50 μl일 수 있다. 용어 "약"은 본원에서 이용된 바와 같이, 특정된 값으로부터 0.1% 이내, 0.5% 이내, 1% 이내, 2% 또는 그 이상 이내, 5% 이내, 또는 10% 이내의 차이를 지칭한다. 일정한 경우에, 복수의 챔버는 웰 또는 마이크로웰일 수 있다.

일정한 구체예에서, 마이크로필라를 포함하는 기질의 치수는 표준 세포 배양 접시의 치수일 수 있다. 이런 기질의 이용은 예로서, 현미경을 이용하여, 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 용이하게 할 수 있다.

일반적으로, 챔버는 시약, 세포, 후보 작용제, 기타 등등의 첨가를 챔버에 제공하기 위해 상부에서 개방성일 수 있다. 챔버는 제거가능한 뚜껑에 의해 덮일 수 있다.

일정한 구체예에서, 복수의 챔버는 복수의 마이크로필라를 각각 내포할 수 있고, 여기서 챔버 내에 존재하는 마이크로필라의 숫자는 10-200, 예를 들면, 20-200, 30-150, 40-120, 50-100 범위에서 변할 수 있다, 예를 들면, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 180, 또는 200일 수 있다.

일반적으로, 마이크로필라는 세포, 예를 들면, 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs) 또는 희소돌기아교세포의 배양에 도움이 되는 물질로부터 만들어진다. 세포의 배양을 뒷받침하는 것과 양립하는 임의의 물질이 마이크로필라를 제조하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양 기질, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 또는 실리카가 이용될 수 있다. 일정한 경우에, 마이크로필라는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리비닐 염화물, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 스티렌 부타디엔 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈염산, 그리고 실리카로 구성된 군에서 선택되는 물질로부터 만들어질 수 있다.

마이크로필라 어레이는 임의의 편의한 방법에 의해 제작될 수 있다. 예시적인 방법은 마이크로필라를 생산하기 위해 기질 표면의 에칭, 마이크로필라를 제작하기 위해 기질 상에서 중합체의 침적, 사출 성형, 기타 등등을 포함한다. 마이크로필라를 포함하는 복수의 챔버를 포함하는 기질은 다양한 방법에 의해 제작될 수 있다. 가령, 복수의 챔버를 갖는 조립식 기질, 예를 들면, 다중웰 세포 배양 평판이 마이크로필라를 챔버 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 다른 예시적인 방법에서, 기질 상에 균일하게 배치되는 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질은 복수의 챔버를 제공하는 격자에 결합될 수 있다.

마이크로필라를 포함하는 기질은 투명하거나 또는 반투명하고 기질 상에 존재하는 마이크로필라와 세포의 가시화를 허용할 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 "투명한"은 임의의 심문 방사가 실제적인 약화 없이 그것을 통해서 통과하도록 허용하고, 그리고 또한, 특질로부터 신호가 실제적인 약화 또는 왜곡 없이 그것을 통해서 통과하도록 허용하는 것을 지칭한다. "실제적인 약화가 없는"은 예로서, 40%보다 많은, 30%보다 많은, 20%보다 많은 또는 10%보다 많은 손실 없음을 포함할 수 있다. 심문 방사와 신호는 예로서, 가시광선, 자외선 또는 적외선일 수 있다.

선별검사 방법

수초화를 증진하는 후보 작용제를 선별검사하기 위한 방법 역시 본원에서 개시된다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 후보 작용제를 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질 및 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs)와 함께 배양하고; 복수의 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 복수의 마이크로필라 상에서 수초화의 존재는 후보 작용제가 수초화를 증진한다는 것을 지시한다.

일정한 구체예에서, 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질은 전술한 섹션에서 설명된 바와 같다.

일정한 구체예에서, 기질은 복수의 챔버를 포함할 수 있고, 그리고 이들 복수의 챔버는 복수의 마이크로필라 및 OPC를 각각 포함한다.

일정한 구체예에서, 상기 방법은 복수의 후보 작용제를 복수의 챔버를 포함하는 기질 및 OPC와 함께 배양하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 이들 복수의 챔버는 상이한 후보 작용제를 각각 포함한다.

마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 무수한 방법이 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 OPC의 미엘린 생산 신경교세포, 예를 들면, 희소돌기아교세포로의 분화를 검정하는 것을 수반할 수 있고, 여기서 상기 검정하는 것은 희소돌기아교세포에 의한 복수의 마이크로필라의 외피화의 검출을 포함할 수 있다.

일정한 구체예에서, 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 OPC로부터 산출된 희소돌기아교세포에 의한 복수의 마이크로필라 상에서 동심성 포장을 검정하는 것을 수반할 수 있다.

일정한 구체예에서, 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 수초화의 수준을 결정하는 것을 포함할 수 있다.

본원에서 이용된 바와 같이, 수초화는 희소돌기아교세포에 의한 마이크로필라의 외피화를 지칭한다. 외피화는 최소한 1회 마이크로필라 주변에 미엘린초 포장의 층을 포함할 수 있다. 외피화는 마이크로필라의 영역 주변에 완전한 또는 부분적인 포장을 포괄할 수 있고, 여기서 상기 영역은 마이크로필라의 첨단 또는 기부에서 또는 마이크로필라의 첨단과 기부 사이에 있다. 부분적인 포장은 마이크로필라의 첨단 또는 기부에서 또는 마이크로필라의 첨단과 기부 사이의 영역에서 마이크로필라의 둘레의 최소한 60%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%의 포장을 포함할 수 있다. 완전한 포장은 마이크로필라의 둘레 주변에 포장을 지칭하고, 여기서 포장은 마이크로필라의 첨단 또는 기부에서 또는 마이크로필라의 첨단과 기부 사이의 영역에서 마이크로필라의 둘레의 최소한 약 95%, 또는 99%, 또는 100%이다. 따라서, 완전한 포장은 마이크로필라의 둘레 주변에 미엘린 고리의 존재를 지칭한다.

마이크로필라 주변에 미엘린초의 동심성 포장은 기부 또는 첨단에서, 또는 첨단과 기부 사이의 영역에서, 복수의 횟수, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상 횟수에서 마이크로필라의 둘레의 포장을 지칭한다. 따라서, 마이크로필라 주변에 미엘린초의 동심성 포장은 마이크로필라의 둘레 주변에 2개 또는 그 이상의 미엘린 고리의 존재를 지칭한다.

관용구, 수초화의 수준은 본원에서 이용된 바와 같이, 마이크로필라 상에 존재하는 미엘린초의 양을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 배경 역치 초과, 하지만 동심성 포장 역치 미만에서 수초화의 수준은 마이크로필라가 외피화되었지만 동심성 포장이 일어나지 않았다는 것을 지시할 수 있다. 일정한 구체예에서, 배경 역치 초과 및 동심성 포장 역치에서 또는 초과에서 수초화의 수준은 마이크로필라가 외피화되고 동심성 포장이 일어났다는 것을 지시할 수 있다. 동심성 포장 역치 초과에서 수초화의 수준은 마이크로필라 상에서 동심성 포장의 정도를 지시할 수 있다.

역치는 음성과 양성 대조에 기초하여 설정될 수 있다. 가령, 역치는 수초화, OPC의 숫자, 및/또는 마이크로필라의 숫자를 검정하기 위한 방법에 기초하여 설정될 수 있다. 배경 역치는 희소돌기아교세포로 분화하지 못하는 세포를 포함하는 마이크로필라 어레이로부터 획득된 신호에 기초하여 선별될 수 있다; 비특이적 항체와 접촉된 희소돌기아교세포를 내포하는 마이크로필라 어레이로부터 획득된 신호. 음성 대조 역시 배경 역치를 제공할 수 있다 - 예로서, 스크린의 문맥에서, 음성 대조는 후보 작용제와 접촉되지 않은 마이크로필라 및 OPC일 수 있다.

동심성 포장 역치는 양성 대조로부터 결정될 수 있다. 일정한 구체예에서, 수초화를 증진하는 것으로 공지된 분자가 동심성 포장 역치를 결정하는데 이용될 수 있다. 분자, 예를 들면, 갑상선 호르몬 또는 쿠에티아핀 푸마르산염이 동심성 포장 역치를 결정하는데 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 결정하는 것은 프로세서 및 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 복수의 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 결정하도록 유발하는 명령을 포함하는 메모리를 이용함으로써 수행될 수 있다. 일정한 구체예에서, 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 결정하는 것은 자동화될 수 있다.

일정한 구체예에서, 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 결정하는 것은 희소돌기아교세포 (OL) 특정한 마커를 검출함으로써 수행될 수 있다.

임의의 공지된 OL 특정한 마커가 이용될 수 있다. 일정한 경우에, 마커는 예로서, 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 단백지질 단백질 (PLP 또는 리포필린), 또는 희소돌기아교세포 (OLs)에서 발현을 주동하는 OL 특정한 프로모터에 의해 발현이 주동되는 리포터 유전자에 의해 인코딩된 마커일 수 있다. OL 특정한 마커의 발현을 제공하는데 활용될 수 있는 예시적인 프로모터는 MBP, PLP 등에 대한 프로모터를 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법과 시스템에서 이용된 OL은 OL 특정한 프로모터에 작동가능하게-연결된 유전자로부터 형광 단백질 또는 생물발광 단백질을 인코딩하는 유전적으로 변형된 OL일 수 있다. "작동가능하게-연결된"은 한쪽의 기능이 다른 쪽에 의해 영향을 받도록, 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열의 연관을 지칭한다. 가령, 프로모터는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현에 영향을 줄 수 있을 때 (즉, 코딩 서열 또는 기능적 RNA가 프로모터의 전사 제어 하에 있다), 상기 코딩 서열 또는 기능적 RNA와 작동가능하게-연결된다. MBP 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터에 작동가능하게-연결된 유전자의 발현을 주동하고, 그리고 OL에 대한 마커를 제공하는 발현 카세트는 WO2011084281A1에서 설명되고, 이것은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.

일정한 경우에, 후보 작용제의 선별검사는 복수의 마이크로필라를 포함하는 복수의 챔버를 포함하는 기질을 포함하는 마이크로필라 어레이를 활용하는 높은-처리량 방식으로 수행될 수 있다. 관심되는 후보 작용제는 상이한 챔버에 첨가된 OPC와 함께 배양될 수 있다. OPC 및 후보 작용제의 첨가는 일정한 경우에 로봇으로 수행될 수 있다. 마이크로필라 어레이는 현미경을 이용하여 모니터링될 수 있고, 그리고 챔버로부터 획득된 신호는 프로세서 및 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 복수의 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 결정하도록 유발하는 명령을 포함하는 메모리를 이용하여 분석될 수 있다. 명령은 배경 역치 수준, 동심성 포장 역치 수준 등을 포함할 수 있다.

일정한 경우에, 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 검출 결정하는 것은 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질 및 OPC와 함께 후보 작용제의 배양 동안 상이한 시점에서 수행될 수 있다. 따라서, 초기 결정은 후보 작용제가 OPC의 OL로의 전환을 증진하는 지를 드러낼 수 있다. 추후 시기에서 수행된 결정은 OL이 마이크로필라를 외피화할 수 있는 지를 드러낼 수 있다. 더욱 추후 시점에서 수행된 결정은 OL이 마이크로필라를 동심원으로 포장할 수 있는 지를 드러낼 수 있다.

복수의 마이크로필라를 포함하는 기질 및 OPC와 함께 하나 또는 그 이상의 후보 작용제의 배양은 1 일 내지 30 일 범위에서 변하는 기간 동안 수행될 수 있다. 일정한 경우에, 배양은 예로서, 최소한 약 1 일, 2 일, 4 일, 6 일, 1 주, 10 일, 2 주, 18 일, 3 주, 25 일, 4 주, 또는 그 이상 동안 완료될 수 있다. 수초화의 존재 또는 부재의 결정은 배양 단계가 시작된 후, 많은 일자(들)에서 수행될 수 있다. 일정한 경우에, 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수초화의 수준은 저속도 현미경, 예를 들면, 형광 저속도 현미경을 이용하여 모니터링될 수 있다.

배양은 OPC, OL, 신경아교세포, 슈반 세포 등의 배양에 적합한 조건 하에 수행될 수 있다. 적합한 세포 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 세포 배양 조건은 OPC, OL 등의 유형에 기초하여 최적화될 수 있다. 다양한 배지가 상업적으로 가용하고, 그리고 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM), Hank의 균형 염 용액 (HBSS), Dulbecco의 인산염 완충된 식염수 (DPBS), RPMI, Iscove의 배지를 비롯하여, 세포의 성격에 따라 이용될 수 있는데, 이들은 이들 세포의 생존력을 지원하는 성장 인자 및 다른 보충물로 보충될 수 있다.

다양한 OPC가 본원에서 개시된 방법과 시스템에서 이용될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPC)는 미엘린 생산 신경아교세포, 예를 들면, 희소돌기아교세포 (OLs 또는 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포 세포)로 분화하고 이들을 산출하도록 수임된 세포일 수 있다. 가령, OPC는 임의의 종, 예를 들면, 뮤린, 말, 돼지, 소, 개, 고양이, 양 또는 다른 종의 개체로부터 획득될 수 있다. 일정한 경우에, OPC는 인간으로부터 획득될 수 있다. 일정한 경우에, OPC는 만능성 세포, 예를 들면, 유도된 만능성 세포, 배아 만능성 세포, 예를 들면 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSCs)로부터 산출될 수 있다. 일정한 경우에, OPC는 다능성 세포로부터 산출될 수 있다. 일정한 경우에, OPC는 OL 및/또는 슈반 세포로 분화할 수 있다.

일정한 구체예에서, 마이크로필라 어레이는 도립현미경을 이용하여 하부로부터 판독될 수 있다. 일정한 경우에, 마이크로필라 어레이는 상부로부터 판독될 수 있다. 마이크로필라 어레이의 하부는 마이크로필라가 존재하지 않는 기질의 면이다. 따라서, 마이크로필라 어레이의 위쪽은 마이크로필라가 존재하는 기질의 면이다.

일정한 구체예에서, 상기 방법은 희소돌기아교세포에 특이적인 마커의 존재 또는 부재에 기초하여 수초화의 이진수 지시물, 다시 말하면, 수초화가 존재하는 지의 여부를 이용함으로써 후보 작용제에 대한 선별검사를 수반할 수 있다.

일정한 구체예에서, 상기 방법은 후보 작용제를 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질 및 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs)와 함께 배양하는 것을 수반할 수 있고, 여기서 OPC의 숫자는 20,000-100,000 범위에서 변한다. 상기 방법에서 이용되는 OPC의 숫자는 검정의 유형, 마이크로필라의 숫자, 기질의 크기, 챔버의 크기, 기타 등등에 기초하여 확인될 수 있다.

일정한 경우에, 상기 방법은 후보 작용제를 복수의 챔버를 포함하는 기질을 포함하는 마이크로필라 어레이와 함께 배양하는 것을 수반할 수 있고, 각 챔버는 복수의 마이크로필라 및 복수의 OPC를 포함한다. 마이크로필라 어레이는 또한, 마이크로필라 및/또는 OPC를 결여하는 복수의 챔버를 포함할 수 있고, 이들 챔버는 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수초화의 수준의 결정을 위한 대조로서 역할할 수 있다. 일정한 구체예에서, 챔버 내에 포함된 OPC의 숫자는 챔버의 크기 및/또는 챔버 내에 마이크로필라의 숫자에 기초될 수 있다. 일정한 경우에, 각 챔버는 약 100,000; 80,000; 60,000; 40,000; 20,000; 10,000; 5,000; 3000; 1000; 300; 200; 100; 80; 60; 50; 30; 20; 10; 또는 그 이하 OPC를 포함할 수 있다.

일정한 경우에, 선별검사를 위한 관심되는 후보 작용제는 비록 일부 경우에 무기 분자, 유기금속 분자, 면역글로불린 등을 포함하지만, 다양한 화학적 부류, 일차적으로 유기 분자의 생물학적으로 활성 작용제를 포함한다. 작은 유기 분자가 또한 관심되는데, 이들은 단백질과의 구조적 상호작용에 필요한 기능기, 특히 수소 결합을 포함하고, 그리고 전형적으로 최소한 하나의 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실 기, 빈번하게는 최소한 2개의 기능적 화학적 기를 포함한다. 후보 작용제는 종종, 상기 기능기 중에서 하나 또는 그 이상으로 치환된 순환적 탄소 또는 헤테로환상 구조 및/또는 방향족 또는 다환방향족 구조를 포함한다. 후보 작용제는 또한, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 이들의 조합을 비롯한 생체분자 사이에서 발견된다.

화합물은 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 비롯한 매우 다양한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 가령, 무작위화된 올리고뉴클레오티드와 올리고펩티드의 발현을 비롯하여, 생체분자를 비롯한 매우 다양한 유기 화합물의 무작위 합성과 지향된 합성을 위한 다양한 수단이 가용하다. 대안으로, 세균, 진균, 식물과 동물 추출물의 형태에서 자연 화합물의 라이브러리는 가용하거나 또는 쉽게 생산된다. 부가적으로, 자연 또는 합성적으로 생산된 라이브러리와 화합물은 전통적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형되고, 그리고 조합 라이브러리를 생산하는데 이용될 수 있다. 공지된 약리학적 작용제는 구조적 유사체를 생산하기 위해, 지향된 또는 무작위 화학적 변형, 예를 들면, 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미디피케이션 등에 종속될 수 있다.

다양한 농도에 대한 차별적 반응을 획득하기 위해, 복수의 검정이 상이한 농도에서 병렬적으로 실행될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 작용제의 효과적인 농도를 결정하는 것은 1:10, 또는 다른 로그 규모, 희석으로부터 발생하는 농도의 범위를 전형적으로 이용한다. 이들 농도는 필요하면, 이차 계열의 희석으로 더욱 정밀화될 수 있다. 전형적으로, 이들 농도 중에서 한 가지는 음성 대조로서 역할한다, 다시 말하면, 제로 농도에서 또는 작용제의 검출 수준 미만에서 또는 수초화의 검출가능한 존재를 제공하지 못하는 작용제의 농도에서 또는 그 미만에서 있다.

일반적으로, 본원에서 설명된 방법과 시스템은 뉴런을 필요로 하지 않는다. 따라서, 본원에서 제공된 방법과 시스템은 실제적인 숫자의 뉴런을 포함하지 않는다. 일정한 구체예에서, OPC는 작은 숫자의 오염 뉴런을 가질 수 있다. 일반적으로, 본원에서 개시된 방법과 시스템에서 존재하는 OPC 개체군 내에 존재할 수 있는 뉴런의 퍼센트는 30%보다 적거나, 20%보다 적거나, 10%보다 적거나, 5%보다 적거나, 1%보다 적거나, 또는 0.5%보다 적을 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 방법과 시스템에서 존재하는 OPC 개체군 내에 존재할 수 있는 뉴런의 퍼센트는 0 %일 수 있다.

수초화를 증진하는 것으로 확인된 후보 작용제는 작용제를 마이크로필라 어레이 및 OPC와 함께 배양할 때, 마이크로필라 주변에 포장된 미엘린초의 밀도를 분석함으로써 더욱 특징화될 수 있다. 후보 작용제(들)는 수초화에 대한 표준 시험관내 검정을 이용하여 더욱 검증될 수 있다. 시험관내에서 검증된 후보 작용제는 수초화의 손실 (탈수초화)과 연관된 질환에 대한 동물 모델에서 더욱 검사될 수 있다. 생체내에서 수초화의 프로모터로서 검증된 후보 작용제는 이후, 축삭돌기 수초화의 손실 또는 결여와 연관된 질환을 앓는 개체에서 검사될 수 있다. 일부 구체예에서, 축삭돌기는 CNS 축삭돌기이다. 이런 질환은 외상, 독소 노출, 질식 또는 저산소증-허혈, 출생전후 저산소-허혈 손상, 중추신경계의 백색질에 손상 또는 이의 질환, 급성 뇌 손상, 크로이츠펠트야콥병, 만성 신경변성 질환, 그리고 탈수초성 질환을 포함할 수 있다. 다발성 경화증이 특히 관심된다. 탈수초성 질환과 장애는 급성 파종성 뇌척수염, 시신경염, 횡단성 척수염, 데빅병, 백질이영양증, 진행성 다초점 백질뇌증, 그리고 중심 뇌교 수초용해를 포함할 수 있다.

만성 탈수초성 질환은 만성 면역 탈수초성 다발신경병증 (CIDP); 다병소성 CIDP; 다병소성 운동 신경병증 (MMN), 항-MAG 증후군; 갤롭 증후군; 항-술파티드 항체 증후군 (혈청 M-단백질 동반); 항- GM2 항체 증후군; POEMS 증후군; 신경주위염; 기타 등등을 포함할 수 있다.

수초화를 검정하기 위한 시스템

수초화를 검정하기 위한 시스템 역시 본원에서 제공된다. 이들 시스템은 관심되는 분자가 수초화에 영향을 주는 지를 사정하는데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 이러한 시스템은 수초화를 증가 또는 감소시키는 후보 작용제를 확인하는데 이용될 수 있다.

상기 시스템은 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질; 그리고 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs)를 포함할 수 있고, 여기서 복수의 마이크로필라는 기질로부터 수직으로 돌출하고, 그리고 기질에 부착된 마이크로필라의 기부로부터 기질로부터 멀리 떨어져 돌출한 마이크로필라의 첨단으로 직경에서 점점 줄어드는 모양을 포함하는 마이크로필라를 포함한다.

복수의 마이크로필라를 포함하는 기질은 선행하는 섹션에서 제공된다.

따라서, 일정한 구체예에서, 기질은 복수의 챔버를 포함할 수 있고, 그리고 이들 복수의 챔버는 복수의 마이크로필라 및 OPC를 포함한다.

상기 시스템 내에 포함될 수 있는 OPC는 선행하는 섹션에서 설명된다.

일정한 경우에, 상기 시스템은 프로세서; 그리고 상기 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 복수의 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 결정하도록 유발하는 명령을 포함하는 메모리를 더욱 포함할 수 있다.

상기 명령은 수초화의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 역치(들); 수초화의 수준을 결정하기 위한 역치(들); 기타 등등에 관한 정보를 포함할 수 있다.

실시예

다음 실시예는 당업자에게 본 발명을 만들고 이용하는 방법에 관한 완전한 개시와 설명을 제공하기 위해 제안되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않고, 또한 이들은 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 분율은 중량에 의한 분율이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 그리고 압력은 대기압 또는 이에 가깝다. 표준 약어가 이용될 수 있다, 예를 들면, bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분(들); h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오티드(들); i.m., 근육내; i.p., 복막내; s.c., 피하; 기타 등등.

실시예 1: 나노섬유는 수초화를 지원한다

수초화는 희소돌기아교세포에 축삭돌기 신호전달의 결과인 것으로 오랫동안 생각되었다 (Colello and Pott, Mol. Neurobiol. 15, 83 - 100, 1997). 이런 이유로, 이들 신호의 성격을 확인하는 것은 수복을 증진하는데 있어서 가장 중요하고, 그리고 실제로, 대부분의 수초화 연구의 목적이다. 수초화의 유도는 축삭돌기 직경에 그런대로 친밀히 관련된 것으로 일반적으로 인정된다; 더욱 큰 축삭돌기는 수초화되는 반면, 더욱 작은 것들은 그렇지 않다. 축삭돌기 표적 크기에서 증가는 축삭돌기 직경에서 증가 및 미엘린의 발달 둘 모두와 상관한다 (Voyvodic, Nature 342, 430 - 433, 1989). 하지만, 이러한 발견만으로는 축삭돌기 직경에서 증가가 수초화를 개시하는데 충분한 지를 확립하지 못하지만, 대신에 축삭돌기 신호가 미엘린 발달을 고무하고 외인성 인자에 의해 조절된다는 것을 증명한다. 우리의 최근 조사 결과는 희소돌기아교세포 수초화의 개시에서 축삭돌기 직경의 역할에 도전하는 흥미로운 대안적 가설을 제공한다. 우리는 나노섬유가 희소돌기아교세포 수초화를 위한 적합한 골격으로서 잠재적으로 기능할 수 있는 지의 조사를 허용하는 기질로서 축삭돌기를 대체하기 위해 전자-회전된 폴리스티렌 나노섬유를 가공하였다 (도면 1).

도면 1 직경에서 (a) 0.2-0.4 μm 및 (b) 2-4 μm 범위에서 변하는 폴리스티렌 나노섬유가 산출되고 영상화되었다. 정제된 희소돌기아교세포는 섬유 위에 도말되고, 그리고 큰 섬유를 외피화하고 포장하는 것으로 관찰되었다. 배양액은 미엘린 (적색)에 대해 면역염색되고 섬유의 위상 대조 이미지와 합병되었다. (e-g) 수초화를 지시하는 막의 치밀한 포장이 전자 검경에 의해 관찰되었다.

우리의 조사 결과는 섬유 직경이 희소돌기아교세포에 의한 포장을 개시하는데 실제로 충분하고, 그리고 축삭돌기의 부재에서 수초화가 수초화를 위해 필요하고 충분한 세포 자율 기전을 분석하는데 이상적으로 적합한 최소한으로 허용적 환경을 나타낸다는 것을 증명한다 (Lee et al., Nature Methods, 9 (9): 917-922, 2012). 이러한 최근 발견은 소규모 선별검사 노력을 개시하는 것을 허용하였다. 우리의 나노섬유의 설계에서 정교한 유연성은 실험 설계에서 섬유의 일정한 균일성과 밀도를 보증하고, 그리고 검사된 화합물로부터 임의의 효과는 뉴런으로부터 혼란스러운 효과 없이, 희소돌기아교세포에 대한 직접적인 영향 (도면 2)에만 오로지 기인할 수 있었다.

도면 2. 나노섬유는 패턴화되고, 24-웰 형식 내로 침적되고, 그리고 배양 챔버가 달린 자동화 형광 현미경 하에 배치되었다. 희소돌기아교세포와 소형 분자의 첨가 시에, 나노섬유와 함께 배양된 세포는 증식, 생존, 분화, 그리고 수초화에 대한 효과에 대해 실시간으로 분석될 수 있다. 축삭돌기의 부재에서 수초화는 수초화를 선행하고 야기하는 과정을 위해 필요하고 충분한 세포 자율 기전을 분석하는데 이상적으로 적합한 최소한으로 허용적 환경을 나타낸다. 아래쪽 패널은 희소돌기아교세포 전구체 세포 (녹색) 및 희소돌기아교세포 (적색)가 나노섬유 상에서 배양될 수 있고, 그리고 수초화 (적색)가 확인될 수 있다는 원리의 증거를 예증한다.

스크린을 개시하기 위해, 희소돌기아교세포 분화와 수초화를 증진하는데 있어서 일정한 역할을 하는 것으로 생각되는 공지된 분자와 화학적 저해제의 후보 목록이 편집되고, 그리고 정신의학 장애의 치료에서 다양한 FDA 승인된 화합물이 적용되었다. 복수의 연구가 정신분열증과 같은 정신 장애에서 미엘린 초미세구조와 정도에서 비정상을 상관시켰기 때문에, 비정형성 항정신병약 및 도파민 수용체 길항제가 선별검사되었다 (Hakak et al., PNAS, 98 (8): 4746-4751, 2001; McDonald et al., 2005). 우리는 화합물 쿠에티아핀 푸마르산염 (세로켈)이 희소돌기아교세포의 분화 및 나노섬유의 수초화를 크게 증강시킨다는 것을 것을 발견하였다 (도면 3a). 이들 조사 결과를 검증하기 위해, 우리는 정제된 뉴런과 공동배양된 정제된 희소돌기아교세포에 대한 쿠에티아핀의 효과를 분석하였다. 쿠에티아핀 푸마르산염은 뉴런 축삭돌기의 분화와 수초화를 유의미하게 증강한다 (도면 3b). 공동배양에서, 미엘린 절간은 희소돌기아교세포에 의해 형성된 "튜브-유사" 구조 (미엘린-특정한 단백질에 대해 면역염색됨)에 의해 일과적으로 확인될 수 있다. 동심성의 치밀한 막 포장 역시 전자 검경에 의해 검출될 수 있다 (Chan et al., Neuron 43, 183 - 191, 2004). 전반적으로, 공동배양 시스템은 생체내에서 희소돌기아교세포 발달과 수초화의 시기를 개괄하고, 그리고 희소돌기아교세포 발달을 증진할 뿐만 아니라 저해할 수 있는 화합물과 인자를 검증하기 위한 강력한 도구를 나타낸다. 흥미롭게도, 쿠에티아핀이 도파민-2 (D2) 수용체 길항제로서 최초 개발되었기 때문에, 다른 D2 길항제는 희소돌기아교세포에 대한 동일한 효과를 이끌어내지 못하였다. 이러한 발견의 유의성은 다발성 경화증에서 수복을 증진하는 잠재력을 갖는 후보 분자의 확인이다. 부가적으로, 희소돌기아교세포에 의한 분화와 수초화에 대한 기능적 판독을 정량하는 능력은 수초화에서 축삭돌기 기여를 분리시키는 독특한 기회를 제공한다.

도면 3. 희소돌기아교세포 분화와 수초화가 우리의 나노섬유 플랫폼 (a)에서 조사되었다. 쿠에티아핀 푸마르산염은 우리의 섬유의 분화와 수초화를 크게 증강시켰다. (b) 희소돌기아교세포-DRG 뉴런 공동배양이 쿠에티아핀 푸마르산염 (100 nM)의 효과를 검증하기 위해 확립되었다. 배양액은 시험관내에서 7 일 후 면역염색되고, 그리고 미엘린 염기성 단백질 (적색)에 대해 분석되었다. 상기 도면에 의해 지시된 바와 같이, 희소돌기아교세포 분화와 수초화가 유의미하게 가속되었다.

이러한 발견은 이러한 접근법에 대한 이론적 근거를 제공하고, 그리고 발달, 안정성과 수복을 증진할 수 있는 추가 화합물과 생물학적 제제의 확인에 귀중한 통찰력을 부여할 것이다. 하지만, 소형 분자와 화합물의 고처리량 분석은 달성불가능한 것으로 남아있는데, 그 이유는 이들 나노섬유가 큰 어려움 없이 마이크로웰로 패턴화될 수 없기 때문이다. 부가적으로, 자동화 영상화 시스템은 "미엘린 분절"을 신속하고 재현가능한 방식으로 확인할 수 없고, 고처리량 분석을 불가능하게 만든다. 이들 제한을 극복하기 위해, 우리는 소형 분자와 화합물의 고처리량 분석을 허용하는 희소돌기아교세포 수초화를 확인하기 위해 마이크로웰 플랫폼에서 이진수 시스템을 개발하려 하였다.

실시예 2: 수초화를 검정하기 위한 마이크로필라 어레이

기능적 스크린을 개발하는 것은 실험을 견실하고 재현가능한 정량적 방식으로 신속하게 수행하는 능력을 필요하게 만든다. 나노섬유 골격이 화합물을 선별검사하는데 있어서 진전을 나타낸다는 것이 명확하게 증명되긴 했지만, 이들 섬유는 높은-처리량 선별검사에 적합하지 않다. 나노섬유를 회전시키고 작은 웰로 패턴화하는 것은 많은 어려움이 있어야만 달성될 수 있고 극히 시간 소모적이다. 부가적으로, 미엘린 절간을 확인하고 정량하는 자동화된 소프트웨어는 현재 가용하지 않다.

마이크로필라 어레이가 압축된 실리카로부터 제작되었다 (Trianja Technologies에 의해 제작됨). 이들 어레이는 더욱 효율적이고 신속한 실험 설계를 허용하는 96-웰 형식에 적합한 칩에서 설계되었다. 마이크로필라는 미엘린의 "고리"의 검출을 허용하는 특질인, 횡단면에서 수초화의 가시화를 허용한다 (도면 4). 마이크로필라가 임의의 크기와 방향으로 제작될 수 있기 때문에, 우리는 높이에서 대략 50 μm (Lee et al., 상기), 필라의 위쪽에 직경에서 2 μm (수초화에 대해 허용적; Lee et al., 상기), 그리고 150 μm의 기부를 갖는 마이크로필라에 대한 원형을 설계하였다. 이러한 형식은 최적 필라 명세서의 분석을 허용할 것이다. 마이크로필라는 필라 사이에 부착되는 희소돌기아교세포의 합리적인 숫자를 허용하기 위해 120 μm 간격에서 이격된다. Zeiss에 의한 Axiovision 소프트웨어를 이용하여, 우리는 나노섬유와 연관된 혼란스러운 문제점 (즉, 절간의 길이, 간섭 세포 공정, 세포체 등) 중에서 한 가지도 없이 미엘린 고리의 검출과 숫자의 정량을 자동화할 수 있다. 본질적으로, 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs)는 녹색 고리로서 가시화될 것인 반면, 희소돌기아교세포는 적색 고리로서 표시된다 (도면 4C).

도면 4. 마이크로필라 어레이를 이용하여 수초화에 대한 이진수 지시물. (a) 나노섬유의 희소돌기아교세포 포장은 미엘린의 "고리"로서 측면으로부터 가시화될 수 있다 (적색, MBP 양성 염색). (b) 마이크로필라는 임의의 크기와 방향으로 제작될 수 있다. 우리는 대략 50 μm의 높이 및 2 μm의 직경을 갖는 마이크로필라에 대한 원형을 제작하였다. 마이크로필라는 세포가 표면에 부착되도록 허용하기 위해 100 μm 간격에서 이격된다. (c) 도립 형광 현미경을 이용하여, 이들 필라는 아래쪽으로부터 영상화될 것이고, 그리고 미엘린의 "고리"의 확인은 기능적 수초화에 대한 이진수 지시물로서 이용될 것이다.

이러한 접근법에서 원리의 증거를 증명하기 위해, 우리는 마이크로필라를 제작하고, 치수를 분석하고, 그리고 일차성 OPC를 어레이에서 배양하였다 (도면 5). 이들 OPC는 전체 길이를 따라 마이크로필라를 외피화하였다 (도면 5C, D). 부가적으로, 희소돌기아교세포로의 분화 시에, MBP 양성 세포는 이들 필라를 동심원으로 포장한다 (도면 5E, F). 포장의 정량은 희소돌기아교세포가 필라의 기부 (150 μm)를 포장할 수는 없었지만 이들 필라의 더욱 작은 직경 위쪽 부분을 선호한다는 것을 예증한다. 이들 결과는 필라의 직경을 축소하는 것이 희소돌기아교세포 세포의 포장을 최적화할 것이라는 것을 암시한다.

도면 5. 수초화를 위한 마이크로필라 어레이의 제작. (A, B) 마이크로필라 어레이는 압축된 실리카로부터 제작되고, 그리고 외피화와 포장을 허용하는 치수까지 에칭되었다. 마이크로필라의 크기와 분포의 정량. (C, D) OPC (녹색)는 마이크로필라와 함께 배양되고 그들의 전체 길이 따라서 이들 필라를 외피화하였다. (E, F) 희소돌기아교세포 (적색)는 수초화를 지시하는 나선형 방식으로 이들 필라를 포장하였다.

마이크로필라를 선별검사 플랫폼으로서 이용하는 가능성과 유용성을 분석하기 위해, 우리는 OPC를 어레이 위에 도말하고, 그리고 분화와 포장을 증진하는 것으로 이전에 밝혀진 분자, 다시 말하면, 쿠에티아핀 푸마르산염 및 갑상선 호르몬을 첨가하였다 (도면 3, 6). 원리의 증거로서, 쿠에티아핀 푸마르산염 및 갑상선 호르몬은 마이크로필라 플랫폼 상에서 "미엘린 고리"의 산출을 유의미하게 증강시켰다. 희소돌기아교세포의 분화와 수초화의 정량은 나노섬유와 공동배양액에서 우리의 이전 조사 결과를 검증하였고, 그리고 이들 마이크로필라 어레이가 분화와 포장을 증진하는 화합물을 확인하기 위한 효과적인 선별검사 플랫폼을 나타낸다는 것을 암시한다.

도면 6. 수초화 검정의 이진수 지시물 (BIMA)이 희소돌기아교세포 수초화에서 증강을 확인한다는 것을 예시하는 원리 실험의 증거. (A-C) 마이크로필라를 둘러싸는 희소돌기아교세포 (적색, MBP 양성 염색)에 의한 수초화에 대한 면역염색. 희소돌기아교세포는 총 6 일 시험관내 (div) 동안 마이크로필라에서 배양되었고 2 일 동안 4 div에서 분화를 증강하는 것으로 공지된 화합물을 받았다. (A) 대조와 비교하여, (B) 1 μM 쿠에티아핀 푸마르산염 또는 (C) 30 ng/mL 갑상선 호르몬의 첨가는 희소돌기아교세포에 의해 산출된 적색 "미엘린 고리"의 숫자를 증가시켰다. 이미지는 6 div에서 획득되었다. 눈금자, 50 μm.

실시예 3: 마이크로필라 어레이의 최적화

데이터의 추가 분석 시에, 우리는 마이크로필라 어레이의 명세가 변경될 필요가 있다고 결정하였다. 첫 번째는 필라의 형상비에서 설계이었다. 희소돌기아교세포가 이들 필라의 큰 기부 직경을 포장할 수 없었기 때문에, 우리는 50 μm의 직경을 갖는 필라의 기부를 설계하기로 결정하였다. 2 μm의 위쪽 필라 직경을 유지하면서, 우리는 효율적인 외피화와 포장을 담보하기 위해 이들 필라의 높이를 25 μm까지 감소시켰다. 희소돌기아교세포에 의한 미엘린 막의 동심성 포장의 확인을 담보하기 위해, 우리는 도면 5E에서 관찰된 바와 같이, 이들 필라의 점진적인 점감을 유지하였다. 마이크로필라 (120 μm)의 이격은 희소돌기아교세포 세포의 숫자가 마이크로필라의 밀도에 정합되도록 담보하기 위해, 50 μm까지 최적화되었다. 최종적으로, 우리는 96-마이크로웰 평판 내로 결합되도록 어레이를 패턴화하였다 (도면 7).

도면 7. 희소돌기아교세포 세포에 의한 효율적인 외피화와 포장을 획득하기 위한 BIMA 설계의 최적화. 이들 필라의 형상비는 50 μm의 기부 직경 및 2 μm의 위쪽 직경으로 변형되었다. 이들 필라의 높이는 25 μm까지 감소되었다. 이들 마이크로필라는 96 마이크로웰 평판 내로 결합되도록 제작되었다. 이들 필라 각각은 세포 대 필라의 최적 밀도가 달성되도록 담보하기 위해 50 μm에서 이격될 것이다.

실시예 4: 수초화의 동역학을 연구하기 위한 마이크로필라 어레이의 이용

수초화의 정도와 동역학은 전통적으로 해결하기 어려웠는데, 그 이유는 수초화에 대한 대부분의 선별검사 전략이 실시간으로 가시화될 수 없기 때문이다. 우리는 이런 이유로, cre-매개된 재조합 이전에 memTomato 및 이후에 memEGFP를 발현하는 생쥐 (pCA-tdTomato, -EGFP, Jackson)와 조합으로, PLP-creERT2 드라이버 생쥐를 이용하는 이중 형광 표지화 전략을 이용하는 생쥐 유전학을 활용할 것이다. 희소돌기아교세포에서 재조합을 타목시펜으로 유도함으로써, 수초화는 memTomato의 부재에서 memEGFP-양성 고리의 발현에 의해 가시화되고 정량될 수 있다. 스크린은 저속도 검경 하에 자동화된 방식으로 수행되고 완전한 배양 시스템에 넣어질 것이다. 이중-형광 표지화 전략은 수초화의 동역학과 정도에 대한 효과를 결정하기 위한 정량과 분석력을 허용할 것이다. 이중-형광 표지화 전략을 실행함으로써, 우리는 프로모터-주동된 형광 강도에 기초된 이들 과정을 정량하고 저속도 검경을 통해 소형 분자와 생물학적 스크린을 개시할 수 있다 (도면 8). 형광 강도에서 변화를 조사하고 정량함으로써, 우리는 분화와 수초화에 대한 효과를 해결할 수 있을 것이다. 개념의 증거로서, 이러한 목적에서 제안된 PLP-creERT2/pCA-tdTomato-EGFP 리포터 생쥐로부터 희소돌기아교세포는 이미 단리되고, 정제되고, 그리고 시험관내에서 분석되었다 (도면 8). 결과는 우리의 가설과 일치하고 이러한 접근법의 유용성을 예증한다.

도면 8. OPC와 희소돌기아교세포의 이중-형광 표지화의 유용성을 예증하는 개념 실험의 증거. (a, b와 d) 10 일 동안 1mM 타목시펜의 존재에서 DRG 뉴런에서 배양된 PLP/CreERT2XpCA-tdmTomato-mEGFP 생쥐로부터 OPC (적색; Tomato)와 희소돌기아교세포 (녹색; EGFP)의 형광 현미경적 이미지. 유전자도입 OPC는 희소돌기아교세포의 희소한 표지화를 확립하기 위해 야생형 OPC와 혼합되었다. (c와 d) 수초성 희소돌기아교세포 (백색)는 MBP에 대한 면역염색에 의해 확인되었다. 핵 (청색)은 DAPI 염색에 의해 표시된다. 주목할 점은 미성숙 OPC (백색 화살표)가 EGFP와 MBP 염색 둘 모두를 결여한다는 것이다. C와 D에서 EGFP-음성 백색 미엘린 분절은 배양액에 첨가된 야생형 희소돌기아교세포로부터 기원한다.

우리의 마이크로필라의 설계에서 정교한 유연성과 균일성은 일정하고 재현가능한 실험 설계를 보증한다. 96-웰 형식에서 선별검사는 정량되고, 그리고 희소돌기아교세포에 대한 직접적인 영향에만 기인될 수 있다. 이중-형광 표지화 전략을 실행함으로써, 우리는 프로모터-주동된 형광 강도에 기초하여 수초화의 정도와 동역학을 정량하고 저속도 검경을 통해 소형 분자와 생물학적 스크린을 개시할 수 있다. 이러한 접근법은 탈수초성 질환에서 치료적 분자의 확인 및 재수초화를 위한 전략에 귀중한 통찰력을 부여할 것이다.

본 발명이 특정한 구체예에 관하여 설명되긴 했지만, 다양한 변화가 만들어질 수 있고, 그리고 등가물이 발명의 진정한 사상과 범위로부터 벗어남 없이 치환될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해되어야 하다. 이에 더하여, 특정 환경, 물질, 물질 조성물, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상과 범위에 적합하게 하는 많은 변형이 만들어질 수 있다. 이런 모든 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

수초화를 증진하는 후보 작용제를 선별검사하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
후보 작용제를 복수의 마이크로필라를 포함하는 기질 및 희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs)와 함께 배양하고; 그리고
복수의 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재를 결정하고,
여기서 복수의 마이크로필라의 수초화의 존재는 후보 작용제가 수초화를 증진한다는 것을 지시하고,
여기서 복수의 마이크로필라는 기질로부터 수직으로 돌출하고, 그리고 기질에 부착된 마이크로필라의 기부로부터 기질로부터 멀리 떨어져 돌출한 마이크로필라의 첨단으로 직경에서 점점 줄어드는 모양을 포함하는 마이크로필라를 포함한다.
전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 기질은 복수의 챔버를 포함하고, 그리고 이들 복수의 챔버는 복수의 마이크로필라 및 OPC를 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 2에 있어서, 배양하는 것은 복수의 후보 작용제를 복수의 챔버를 포함하는 기질 및 OPC와 함께 배양하는 것을 포함하고, 여기서 이들 복수의 챔버는 상이한 후보 작용제를 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 OPC의 희소돌기아교세포로의 분화를 검정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 검정하는 것은 희소돌기아교세포에 의한 복수의 마이크로필라의 외피화를 검출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 OPC로부터 산출된 희소돌기아교세포에 의한 복수의 마이크로필라의 동심성 포장을 검정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 수초화의 존재 또는 부재를 결정하는 것은 수초화의 수준을 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 마이크로필라는 직경에서 10 μm 내지 150 μm 범위에서 변하는 기부 및 직경에서 0.1 μm 내지 10 μm 범위에서 변하는 첨단을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 마이크로필라는 15 μm 내지 50 μm 범위에서 변하는, 첨단과 기부 사이에 높이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 모양은 원뿔형 모양, 절단된 원뿔형 모양, 쌍원뿔형 모양, 또는 포물형 모양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 기부는 직경에서 25 μm 내지 50 μm 범위에서 변하고, 첨단은 직경에서 1 μm 내지 5 μm 범위에서 변하고, 그리고 첨단과 기부 사이에 높이는 25 μm 내지 50 μm 범위에서 변하는 것을 특징으로 하는 방법.
전술한 청구항 중에서 어느 한 항에 있어서, 복수의 챔버는 약 10 내지 약 200개의 마이크로필라를 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
수초화를 증진하는 후보 작용제를 선별검사하기 위한 시스템에 있어서, 상기 시스템은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템:
복수의 마이크로필라를 포함하는 기질; 그리고
희소돌기아교세포 전구체 세포 (OPCs),
여기서 복수의 마이크로필라는 기질로부터 수직으로 돌출하고, 그리고 기질에 부착된 마이크로필라의 기부로부터 기질로부터 멀리 떨어져 돌출한 마이크로필라의 첨단으로 직경에서 점점 줄어드는 모양을 포함하는 마이크로필라를 포함한다.
청구항 12에 있어서, 마이크로필라는 직경에서 10 μm 내지 150 μm 범위에서 변하는 기부 및 직경에서 0.1 μm 내지 10 μm 범위에서 변하는 첨단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
청구항 12 내지 13 중에서 어느 한 항에 있어서, 마이크로필라는 15 μm 내지 50 μm 범위에서 변하는, 첨단과 기부 사이에 높이를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
청구항 12 내지 14 중에서 어느 한 항에 있어서, 기질은 복수의 챔버를 포함하고, 그리고 이들 복수의 챔버는 복수의 마이크로필라 및 OPC를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
청구항 12 내지 15 중에서 어느 한 항에 있어서, 다음을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템:
프로세서; 그리고
상기 프로세서에 의해 실행될 때, 프로세서가 복수의 마이크로필라 상에서 수초화의 존재 또는 부재 및/또는 수준을 결정하도록 유발하는 명령을 포함하는 메모리.
청구항 12 내지 16 중에서 어느 한 항에 있어서, 기부는 직경에서 25 μm 내지 50 μm 범위에서 변하고, 첨단은 직경에서 1 μm 내지 5 μm 범위에서 변하고, 그리고 첨단과 기부 사이에 높이는 25 μm 내지 50 μm 범위에서 변하는 것을 특징으로 하는 시스템.
청구항 12 내지 17 중에서 어느 한 항에 있어서, 마이크로필라는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 그리고 실리카로 구성된 군에서 선택되는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
청구항 13 내지 18 중에서 어느 한 항에 있어서, 복수의 챔버는 약 10 내지 약 200개의 마이크로필라를 각각 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
청구항 12 내지 19 중에서 어느 한 항에 있어서, 모양은 원뿔형 모양, 절단된 원뿔형 모양, 쌍원뿔형 모양, 또는 포물형 모양을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.