CN105247041A

CN105247041A - 组入有水凝胶的层叠细胞膜片

Info

Publication number: CN105247041A
Application number: CN201480030846.8A
Authority: CN
Inventors: 山下润; 田畑泰彦; 松尾武彦
Original assignee: IHEART JAPAN CORP
Current assignee: IHEART JAPAN CORP
Priority date: 2013-05-31
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2034-05-30
Also published as: JP5862915B2; US20160121025A1; KR20160005366A; CN105247041B; EP3006559B1; EP3006559A1; EP3006559A4; WO2014192909A1; KR101870174B1; US10159766B2; JPWO2014192909A1

Abstract

本发明涉及含有活细胞的层叠细胞膜片及其制作方法。具体地，本发明提供层叠细胞膜片的方法，其包含使用水凝胶，优选地使用明胶水凝胶来层叠细胞膜片的步骤，并提供通过该方法制作的层叠细胞膜片以及包含层叠细胞膜片的医药组合物或治疗剂。

Description

组入有水凝胶的层叠细胞膜片

技术领域

本发明涉及组入有水凝胶、优选组入有明胶水凝胶，或更优选组入有明胶水凝胶粒子的层叠细胞膜片及其制作方法。

背景技术

近年来，作为对因疾病或受伤所致的细胞内组织缺损补充细胞的医疗方法，正在研究使用细胞膜片的细胞移植疗法。特别是，正在研究心肌细胞置换疗法，因为成人的心肌细胞很少增殖，从而由缺血性的心疾病等导致的心肌细胞的缺失成为不可挽回的损伤。

从而，提出了使用由心肌细胞制作的心肌细胞膜片。为了使这样的再生疗法成功，心血管细胞片段的充分定植是必不可少的。进而，正在研究作为用于上述目的的心肌细胞，使用由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)衍生的心脏细胞分段(NPL1、2和PTL1)的方法。

确认了通过移植由这些细胞制作的3层的心脏组织膜片，可抑制大鼠的心肌梗塞后的心脏功能降低。然而，该降低并非由诱导心肌细胞的直接影响导致，而是由因间接性旁分泌效应(包含利用细胞所释放的细胞因子的血管再生)而产生的左心室重构的抑制而导致(NPL3)。

因此，为了将心肌细胞膜片定植在心肌层上，则必须给与更多的心肌细胞，从而始终期望含有大量心肌细胞的更厚的膜片。然而，确认到移植没有血管的4层以上的心肌细胞膜片时，在氧和养分的供给范围外的细胞无法生存，因此定植的细胞数不会改变。从而，认为需要进一步的技术开发以制作在细胞置换疗法中有效的心肌细胞膜片。

明胶水凝胶是可生物降解的生物材料，可以用作细胞培养基质或支架，并且报告有通过在培养细胞凝集体中的含有该凝胶的粒子，可改善例如氧供给等，并从而改善细胞的状态(NPL4和PTL2)。

使用明胶水凝胶来制作移植用细胞膜片的公知的方法包含对膜片贴附明胶水凝胶以使细胞膜片容易从细胞培养基质脱离的方法(PTL3、4和5)。

引用文献目录

专利文献

PTL1:国际公开2009/118928号

PTL2:国际公开2011/059112号

PTL3:日本未经审查的专利申请公开2011-224398号

PTL4:日本未经审查的专利申请公开2013-198437号

PTL5:日本未经审查的专利申请公开2014-75979号

非专利文献

NPL1:YamashitaJ等人，Nature，408:92-6，2000

NPL2:YamashitaJK等人，FASEBJ.，19:1534-6，2005

NPL3:MasumotoH等人，StemCells，30:1196-205，2012

NPL4:HayashiK,TabataY.，ActaBiomater，7:2797-803，2011

发明内容

技术问题

本发明的目的涉及组入有水凝胶、优选组入有水凝胶粒子、或更优选组入有明胶水凝胶粒子的层叠细胞膜片，或包含该膜片的医药组合物，以及使用水凝胶、优选使用水凝胶粒子、或更优选使用明胶水凝胶粒子来层叠细胞膜片的方法。

本发明的目标是通过层叠细胞膜片来防止细胞膜片中的活细胞数减少以及随之产生的细胞功能的降低。

本发明人等发现，通过使用特定类型的水凝胶材料将细胞膜片层叠，细胞膜片中的活细胞数明显地增加，以致实现上述目标，所述水凝胶材料优选为明胶水凝胶、更优选为明胶水凝胶粒子。此外，确认到通过该方法，细胞可在5层以上的层叠膜片中生存，并且该膜片的功能得到改善。

基于如上所述的结果，本发明人等通过使用明胶水凝胶粒子成功地层叠了细胞膜片，并完成了本发明。

从而，本发明包含下述特征:

[1]一种方法，是层叠细胞膜片的方法，包含使用水凝胶来层叠细胞膜片；

[2]根据[1]所述的方法，其中，由能够使细胞生存所需要的物质扩散的材料制成所述水凝胶或所述水凝胶为能够使细胞生存所需要的物质扩散的形式；

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述水凝胶为明胶水凝胶；

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶为水凝胶粒子；

[5]根据[4]所述的方法，其中，所述水凝胶的凝胶粒子为明胶水凝胶粒子；

[6]根据[5]所述的方法，其中，所述明胶水凝胶的凝胶粒子是在明胶分子之间具有分子间交联的明胶水凝胶粒子；

[7]根据[5]或[6]所述的方法，其中，所述明胶水凝胶粒子由在干燥状态的粒子尺寸为20μm～32μm的粒子组成；

[8]根据[1]～[7]任一项所述的方法，包含：在第一细胞膜片或第一层叠细胞膜片、与第二细胞膜片或第二层叠细胞膜片之间，添加水凝胶、优选添加水凝胶粒子、或更优选添加明胶水凝胶粒子；

[9]根据[8]所述的方法，其中，所述层叠细胞膜片由2～3张细胞膜片构成；

[10]根据[8]或[9]所述的方法，其包含：以相对于细胞膜片的单位面积为500μg/cm²～2000μg/cm²的量添加水凝胶、优选添加水凝胶粒子、或更优选添加明胶水凝胶粒子；

[11]一种层叠细胞膜片，通过[1]～[10]中任一项所述的方法来进行层叠；

[12]根据[11]所述的层叠细胞膜片，其包含层叠的4张以上的细胞膜片；

[13]一种医药组合物，其包含[11]或[12]所述的层叠细胞膜片；

[14]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，所述细胞膜片为心肌细胞膜片；

[15]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，所述细胞膜片为包含心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的心脏细胞膜片；

[16]根据[14]或[15]所述的方法，其中，由多能干细胞制作所述心肌细胞；

[17]根据[15]或[16]所述的方法，其中，由多能干细胞制作所述内皮细胞；

[18]根据[15]～[17]中任一项所述的方法，其中，由多能干细胞制作所述壁细胞；

[19]根据[14]to[18]中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞为诱导多能干细胞(iPS细胞)；

[20]层叠细胞膜片，通过[14]～[19]中任一项所述的方法层叠；

[21]根据[20]所述的层叠细胞膜片，其包含层叠的4张以上的细胞膜片；

[22]一种心脏疾病用治疗剂，包含[11]、[12]、[20]和[21]中任一项所述的层叠细胞膜片。

发明的有利效果

根据本发明的方法，能够在细胞生存的状态下层叠细胞膜片。进而，生成的细胞膜片能够应用于细胞置换疗法。

附图说明

图1表示用于形成心脏细胞膜片的规程。图中，EC代表内皮细胞、VEGF代表血管内皮生长因子、cAMP代表环磷酸腺苷、MC代表壁细胞、CM代表心肌细胞、CsA代表环孢霉素A、以及M.C.代表培养基更换。

图2表示根据本发明的方法通过使用明胶水凝胶微粒子进行细胞膜片层叠的步骤。a面表示将膜片放平并静置在经明胶涂覆的培养皿上的步骤；b面表示吸出培养基并固定培养皿和膜片的步骤；c面表示对细胞膜片滴加明胶水凝胶微粒子的步骤。d面表示在37℃下孵育30分钟的步骤。e面表示明胶水凝胶处理后，层叠另一张细胞膜片的步骤。f面表示反复层叠5层后的细胞膜片。

图3表示根据本发明层叠膜片(5层)的组织标本的照片和将其量化的结果。A面表示来自下述对象群的苏木精-伊红(HE)染色图像：在未使用明胶水凝胶而层叠的对象群(对照)、向各层添加250μg的明胶水凝胶微粒子(在干燥状态的粒子尺寸为20～32μm)的群(低剂量)、以及滴加750μg的明胶水凝胶微粒子(在干燥状态的粒子尺寸20～32μm)的群(高剂量群)。图中，黑色箭头指明胶水凝胶微粒子。B面中，左侧图表表示细胞膜片的厚度的各群之间的比较，而右侧图表表示HE染色呈阳性的细胞区面积的各群之间的比较。

图4表示根据本发明层叠膜片(5层)的组织标本的照片和将其量化的结果。A面表示来自下述对象群的苏木精-伊红(HE)染色图像：在未使用明胶水凝胶的状态下层叠的对象群(对照)、滴加干燥状态的粒子尺寸为小于20μm的粒子的群、滴加干燥状态的粒子尺寸为20～32μm的粒子的群、以及滴加干燥状态的粒子尺寸为32～53μm的粒子的群。B面中，左侧图表表示各群之间细胞膜片的厚度的比较，而右侧图表表示各群之间HE染色呈阳性的细胞区面积的比较。

图5的图表表示将本发明的层叠膜片(5层)移植在通过公知方法从无胸腺裸大鼠(雄性，10～12周大)生成的心肌梗塞模型大鼠的心脏前壁时的左心室(LV)缩短率(％)的经时变化。图中，(1)示出假手术未处理群、(2)示出未使用明胶水凝胶的层叠膜片(5层)、以及(3)示出本发明的层叠膜片(5层)。

具体实施方式

1.水凝胶

这里使用的“水凝胶”是指能够含有大量水的物质，由能够容易地使细胞生存所需要的物质扩散的材料或形态如氧、水、水溶性养分以及多肽如酶类和细胞因子类，代谢物等制成，并且通常是生物相容性的。水凝胶的形状和形态，只要能够组入细胞膜片中就没有特别限制，可使用各种形状和形态，例如粒子状、颗粒状、薄膜、管状、圆盘状、网状、网眼状、多孔状、悬浮状或分散状。特别是，优选作为含有胶体粒子的水溶液凝固的结果而形成的水凝胶粒子。只要具有上述水凝胶性质，就可以使用由任何材料制成的粒子。例子包含例如由交联下述成分而得的水凝胶制成的粒子，所述成分为：水溶性、亲水性或吸水性的合成聚合物如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚乳酸和聚乙二醇酸，多聚糖，蛋白质以及核酸。多聚糖的例子包含但不限于糖胺聚糖如透明质酸和硫酸软骨素、淀粉、糖原、琼脂糖、果胶、纤维素等。蛋白质的例子包含但不限于胶原蛋白和其水解明胶、蛋白聚糖、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白(entactin)、腱生蛋白、凝血酶敏感蛋白、血管性血友病因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原等。适合本发明的粒子优选具有生物相容性且由在人体中由细胞降解的材料制成，更优选为由明胶制成的粒子。因此，本发明中，优选的水凝胶凝胶粒子为明胶水凝胶粒子。

本发明中，水凝胶或水凝胶粒子通过在上述水凝胶、优选为水凝胶粒子、更优选为明胶水凝胶粒子等的表面上涂覆细胞粘接蛋白质如胶原蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖等和其活性肽，或生物功能糖，低聚糖，多聚糖等而得，或者通过将这样的物质固定在表面上而得，可用于改善培养条件和细胞增殖。

本发明中所使用的明胶水凝胶粒子为微粒状的明胶水凝胶，其通过对明胶分子进行化学反应、热脱水工艺、辐射、紫外线辐射或电子束照射，进行交联而得。作为化学交联剂，可使用水溶性碳二亚胺如EDC、环氧丙烷、二环氧化合物(diepoxycompound)以及在羟基、羧基、氨基、硫基、咪唑基等中的两个之间形成化学键的缩合剂等。

本发明中的明胶是指改性的胶原蛋白，其中，胶原蛋白的肽链之间的盐键和氢键通过酸或碱或酶处理等而产生断裂，以致胶原蛋白不可逆地变成水溶性蛋白质。胶原蛋白可以从动物或植物收集，或可以使用重组胶原蛋白。本发明中所使用的明胶可以是酸性明胶和碱性明胶中的任一种。在此使用的“酸性明胶”意味着通过对胶原蛋白用碱进行处理来制备且等电点为2.0以上且小于7.0、优选为约4.0以上且约6.5以下、更优选为约4.5以上且约5.5以下的明胶。“碱性明胶”意味着通过对胶原蛋白用酸进行处理来制备且等电点为约7.0以上且约13.0以下，优选为约7.5以上且约10.0以下，更优选为约8.5以上且约9.5以下的明胶。例如，作为“酸性明胶”可使用来自新田明胶公司的等电点(IEP)为约5.0等的试样，而作为碱性明胶，同样地，可使用来自新田明胶公司的IEP9.0的试样等。更优选地，该明胶为等电点为约5.0的“酸性明胶”。

明胶的交联度可根据所期望的含水率，即水凝胶的生物可吸收性的水平而合适地选择。明胶水凝胶的制备中，关于明胶和交联剂的优选浓度范围，明胶浓度为约1～约20w/w％，交联剂浓度为约0.01～约1w/w％。交联条件没有特别限制，但交联可以在例如在约0～约160℃进行约1～约48小时。一般而言，明胶和交联剂的浓度增加以及交联时间的增加导致水凝胶的交联度增加以及明胶水凝胶的生物可吸收性降低。或者，对明胶，可通过在高温减压下进行热脱水来进行交联。热脱水交联可以在例如约80～约160℃或优选地在约120～约140℃，在0.1托(Torr)左右的减压下进行约1～约48小时。水凝胶粒子的溶胀度根据交联程度而不同。当在层叠细胞膜片中使用水凝胶粒子时，可无需特别限制水凝胶的交联度而得到。交联程度可用例如含水率(溶胀状态的水凝胶重量/干燥状态的水凝胶重量×100)来表示。本发明中所使用的水凝胶粒子的含水率没有特别限制，但为约85～约99％。

明胶水凝胶粒子可通过公知的方法制作。例如，作为方法之一，明胶水凝胶粒子可以如下制备：将明胶溶液放入固定的搅拌电动机(例如新东科学股份有限公司供应的三一电动机(Threeonemotor)、EYELAminiD.C.搅拌器等)和特氟隆(注册商标)用的螺旋桨安装在三颈圆底烧瓶并与烧瓶一起固定的装置中；向其中添加如橄榄油那样的油并以约200～约600rpm左右的速度进行搅拌以形成W/O乳液；并且，向其中添加交联剂的水溶液以在明胶分子之间形成交联。或者冷却W/O乳液后向其中添加丙酮、乙酸乙酯等，进行搅拌，并通过离心分离法来收集未交联的明胶粒子。进一步将所收集的明胶粒子用丙酮、乙酸乙酯等清洗，然后用2-丙醇、乙醇等清洗，然后进行干燥。在该阶段，可根据目的而合适地将经干燥的明胶粒子筛分，以得到所需尺寸的粒子。明胶水凝胶粒子可通过将经干燥的明胶粒子交联来制作。另外，明胶水凝胶粒子可如下制作：向橄榄油中滴加通过在橄榄油中预乳化明胶水溶液而得到的乳液(例如使用涡旋混合器AdvantecTME-21、均化器PolytronPT10-35等)以制备微粒状的W/O乳液；向其中添加交联剂的水溶液来进行交联。通过离心分离将由此得到的明胶水凝胶粒子收集，然后用丙酮、乙酸乙酯等清洗，并进一步浸渍于2-丙醇、乙醇等以停止交联。将所得到的明胶水凝胶粒子依次用2-丙醇、含有吐温-80的蒸馏水和蒸馏水清洗，然后供细胞培养用。当明胶水凝胶粒子凝集时，例如，可添加表面活性剂等，或可采用超声波降解法(优选在冷却状态下且1分钟左右以内)。

所得到的明胶水凝胶粒子的平均粒子直径根据制作上述粒子时的明胶浓度、明胶水溶液与橄榄油的体积比、搅拌速度等而不同。一般而言，粒子直径为约500nm～约1000μm，所需尺寸的粒子可通过根据目的而合适地进行筛分来得到。在此使用的“粒子直径”可被称为“粒子尺寸”。“粒子直径”、“粒子尺寸”和“微粒直径”可互换地使用。此外，粒子尺寸为约50nm～约20μm以下的微粒状明胶水凝胶粒子可通过实施预乳化而得。此外，尺寸约50nm～约1μm的粒子可通过使明胶从水溶液状态产生相分离以使它们自聚而得。相分离通过公知技术来完成，其包含添加第二成分，改变水溶液的pH、粒子强度等。

本发明中，通过筛分而得的优选粒子尺寸为约50nm～约1000μm、约500nm～约1000μm，更优选为约1μm～约200μm，甚至更优选为约10～约50μm和20～32μm。在此，粒子尺寸优选以干燥状态的粒子尺寸来表示，因为粒子可能会在溶剂中溶胀。

另外，明胶水凝胶粒子可通过例如国际公开2011/059112号中所述的方法制作，但并非特别限制于此。

明胶水凝胶粒子以外的水凝胶粒子也可通过同样的或公知的技术来制作。进而，最合适的粒子直径范围可通过使用各种粒子直径的水凝胶粒子来制作层叠细胞膜片后，用下述实施例1中所述的方法测定活细胞区的面积和层叠细胞膜片的厚度来决定。

2.用于制作细胞膜片的细胞

制作细胞膜片的细胞为包含人在内的哺乳动物的细胞，例如体细胞、其前体细胞或其混合细胞，但不限于此。

本发明中，细胞膜片为片状的细胞凝集体，其中，细胞通过细胞间的结合而连接。细胞的种类没有特别限制，但该细胞为包含人在内的哺乳动物的细胞，例如体细胞，其前体细胞或其混合细胞。具体地，细胞的例子包含但不限于心肌细胞、内皮细胞(例如血管内皮细胞和淋巴内皮细胞)、壁细胞(例如周细胞)、肌细胞(例如骨骼肌细胞和平滑肌细胞)、上皮细胞(例如表皮细胞、真皮细胞、胃肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、食道上皮细胞、肾盂上皮细胞、输尿管上皮细胞、膀胱上皮细胞、尿道上皮细胞和前列腺导管细胞)、软骨细胞、牙周膜细胞、神经系细胞(例如神经细胞和神经胶质细胞)、毛乳头细胞、骨细胞、它们的前体细胞和它们的混合细胞。这些细胞可以是在通过任何方法单离的组织中所含有的细胞，或可以是从组织确立的细胞株。另外，细胞可以是从多能干细胞通过任何方法诱导的细胞。用于目的的该诱导方法没有特别限制，可使用本领域技术人员熟知的方法，例子包含日本未经审查的专利申请公开(PCT申请的翻译文本)2003-523766号所述的形成胚状体的方法。

进而，可以层叠由这些细胞的混合物组成的细胞膜片或层叠不同种类的细胞膜片。

以下说明用于制作心脏细胞膜片的细胞。

2.1.由诱导多能干细胞制作心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的方法

在此使用的“心肌细胞”是指至少表达心肌肌钙蛋白(cTnT)或αMHC的细胞。人cTnT的例子为NCBI编号NM_000364，小鼠cTnT的例子为NM_001130174。人αMHC的例子为NCBI编号NM_002471，小鼠αMHC的例子为NM_001164171。

在此所使用的“内皮细胞”是指表达血小板-内皮细胞粘附分子(PE-CAM)、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)和血管性血友病因子(vWF)中的一种的细胞。壁细胞是指表达平滑肌肌动蛋白(SMA)的细胞。人PE-CAM的例子为NCBI编号NM_000442，小鼠PE-CAM的例子为NM_001032378。人血管内皮钙粘蛋白的例子为NCBI编号NM_001795，小鼠血管内皮钙粘蛋白的例子为NM_009868。人vWF的例子为NCBI编号NM_000552，小鼠vWF的例子为NM_011708。人SMA的例子为NCBI编号NM_001141945，小鼠SMA的例子为NM_007392。

可用于本发明中的多能干细胞为具有分化成体内全部类型细胞的多能性和增殖能力的干细胞，其包含但不限于例如胚胎干(ES)细胞、来源于通过核移植得到的克隆胚的胚胎干(ntES)细胞、精原干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、诱导多能干(iPS)细胞和来源于经培养的成纤维细胞或骨髓干细胞(多系分化持续应激细胞(Muse细胞))的多能细胞。从制作过程中可不破坏胚、卵子等而得到的观点出发，优选的多能干细胞为诱导多能干细胞(“iPS细胞”)。

iPS细胞可通过将重编程因子导入任意的体细胞中来制作。重编程因子的例子包含基因或基因产物如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、Eras、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1。这些重编程因子可以单独使用或组合使用。重编程因子的组合的例子包含下述文献中所述的组合：国际公开2007/069666号、国际公开2008/118820号、国际公开2009/007852号、国际公开2009/032194号、国际公开2009/058413号、国际公开2009/057831号、国际公开2009/075119号、国际公开2009/079007号、国际公开2009/091659号、国际公开2009/101084号、国际公开2009/101407号、国际公开2009/102983号、国际公开2009/114949号、国际公开2009/117439号、国际公开2009/126250号、国际公开2009/126251号、国际公开2009/126655号、国际公开2009/157593号、国际公开2010/009015号、国际公开2010/033906号、国际公开2010/033920号、国际公开2010/042800号、国际公开2010/050626号、国际公开2010/056831号、国际公开2010/068955号、国际公开2010/098419号、国际公开2010/102267号、国际公开2010/111409号、国际公开2010/111422号、国际公开2010/115050号、国际公开2010/124290号、国际公开2010/147395号、国际公开2010/147612号、HuangfuD等人(2008)，Nat.Biotechnol.，26:795-797，ShiY等人(2008)，CellStemCell，2:525-528；EminliS等人(2008)，StemCells，26:2467-2474；HuangfuD等人(2008)，NatBiotechnol.，26:1269-1275；ShiY等人(2008)，CellStemCell，3,568-574；ZhaoY等人(2008)，CellStemCell，3:475-479；MarsonA(2008)，CellStemCell，3,132-135；FengB等人(2009)，NatCellBiol.11:197-203；R.L.Judsonetal.(2009)，Nat.Biotech.，27:459-461；LyssiotisCA等人(2009)，ProcNatlAcadSciUSA.，106:8912-8917；KimJB等人(2009)，Nature，461:649-643；IchidaJK等人(2009)，CellStemCell，5:491-503；HengJC等人(2010)，CellStemCell，6:167-74；HanJ等人(2010)，Nature，463:1096-100；MaliP等人(2010)，StemCells，28:713-720；MaekawaM等人(2011)，Nature，474:225-9。

体细胞包含但不限于胎儿的体细胞、新生婴儿体的体细胞和成人的健康的或疾病性的体细胞，以及原代培养细胞、继代培养细胞和确立细胞中的任何细胞。具体地，体细胞的例子包含例如(1)组织干细胞(成体干细胞)如神经系干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞，(2)组织前体细胞，(3)分化细胞如淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞、成纤维细胞(皮肤细胞)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞。

将iPS细胞用作移植用的细胞材料时，从防止排斥反应的观点出发，希望使用具有与移植接受者个体相同或实质上相同的HLA基因型的体细胞。“实质上相同”是指HLA基因型足够地一致，以能够通过免疫抑制剂来抑制针对移植细胞的免疫反应。例如，具有HLA-A、HLA-B和HLA-DR这3基因座一致或包含3基因座和HLA-C的4基因座一致的HLA型的体细胞是实质上相同的。

通过下述步骤(a)和(b)，可由诱导多能干细胞(“iPS细胞”)同时制作心肌细胞、内皮细胞和壁细胞：

(a)由诱导多能干细胞制作心肌细胞的步骤；

(b)在血管内皮细胞生长因子(VEGF)的存在下，培养在步骤(a)中得到的心肌细胞的步骤。

进而，虽然在此没有提供具体说明，但代替诱导多能干细胞，由干细胞如胚胎干细胞(“ES细胞”)也可同样地制作心肌细胞、内皮细胞和壁细胞。

作为由诱导多能干细胞制作心肌细胞的方法，例如LaflammeMA(LaflammeMA&MurryCE，Nature2011，Review)的报告那样，心肌细胞可由多能干细胞制作。另外，例子包含，通过在悬浮的状态下培养诱导多能干细胞以形成细胞团(胚状体)来制造心肌细胞的方法、在抑制BMP信号传达的物质的存在下制造心肌细胞的方法(国际公开2005/033298号)、通过连续添加激活素A和BMP来制造心肌细胞的方法(国际公开2007/002136号)、在促进经典Wnt信号传达通路的活化的物质的存在下制作心肌细胞的方法(国际公开2007/126077号)，以及在环孢菌素A的存在下制造心肌细胞的方法，其包含将Flk/KDR阳性细胞从诱导多能干细胞单离(国际公开2009/118928号)，但并非特别限制于这些。

考虑到本发明中所使用的细胞膜片的安全性，该方法可以进一步包含从含有经上述步骤制作的心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的混合细胞中除去未分化细胞的步骤。

2.2.由诱导多能干细胞制作含有心肌细胞的混合细胞的方法

另一种优选的心肌细胞制作方法如下所示。

该方法包含下述步骤：

(i)在含有激活素A的培养基中培养诱导多能干细胞；以及

(ii)在步骤(i)之后，进一步在含有BMP4和bFGF的培养基中培养细胞。

<在含有激活素A的培养基中培养细胞的步骤>

该步骤中，通过公知方法制作诱导多能干细胞，进行分离，并通过如悬浮培养以及使用经涂覆处理的培养皿进行贴壁培养那样的方法来进行培养，优选为贴壁培养。

分离方法可以是力学性的，或者可以使用具有蛋白酶活性和胶原蛋白酶活性(包含例如Accutase(商标)和Accumax(商标))的分离溶液或仅具有胶原蛋白酶活性的分离溶液。优选的是，使用仅具有胶原蛋白酶活性的分离溶液来离解细胞并力学性地将它们分离成更小的集体的方法。优选地，所使用的诱导多能干细胞来自在所使用的皿中培养至80％汇合的群体。

悬浮培养是指在细胞未与培养皿粘接的状态下培养细胞，可以没有特别限制地，通过使用没有进行人工处理(例如用细胞外基质等涂覆)以提高对细胞的粘接性的皿来进行，或者使用进行人工处理(例如用聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(poly-HEMA)涂覆)以抑制粘接的皿来进行。

关于贴壁培养，细胞在经涂覆的培养皿内的任何培养基中培养。涂覆剂的例子包含基质胶(Matrigel)(BD)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或巢蛋白以及它们的组合。优选为基质胶。更优选为通过基质胶夹层法进行的贴壁培养，其中，诱导多能干细胞与用基质胶涂覆的培养皿粘接，并且向上面进一步添加基质胶，以便用基质胶涂覆整个诱导多能干细胞。

该步骤中的培养基可通过使用培养动物细胞用的培养基作为基础培养基来制备。基础培养基的例子包含IMDM培养基、培养基199、伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)、MEM、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、Ham'sF12培养基、1640RPMI培养基、Fischer's培养基以及他们的混合培养基。优选为1640RPMI培养基。该培养基可含有血清或是无血清的。例如，可根据需要含有一种以上的血清替代物如清蛋白、转铁蛋白、Knockout血清替代品(KSR)(用于培养ES细胞的FBS的血清替代物)、N2添加剂(Invitrogen)、B27添加剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇和3'-硫代甘油(3'-thiolglycerolmay)，以及一种以上的如下物质：脂类、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。优选的生长因子包含Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、TGF-β、激活素A、Nodal、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、GDF、bFGF和VEGF。该步骤中，至少优选使用激活素A(例如(重组)人激活素A)作为生长因子。

优选的培养基的例子包含含有L-谷氨酰胺、B27添加剂和激活素A的RPMI培养基。

向培养基中添加的激活素A的浓度为例如10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、175ng/mL或200ng/mL，但不限于此。优选地，向培养基中添加的激活素A的浓度为100ng/mL。

培养温度为约30～40℃、优选为约37℃，但不限于此，并且在含CO₂空气的气氛下进行培养，此时CO₂浓度优选为约2～5％。培养时间为例如1～5天，优选为1天。

<在含有BMP和bFGF的培养基中培养细胞的步骤>

在该步骤中，当在前的步骤以悬浮培养实施时，所得到的细胞集团可以直接在经涂覆的培养皿内的任何培养基中培养。涂覆剂的例子包含基质胶(BD)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或巢蛋白以及它们的组合。优选为基质胶。或者，当在前的步骤中实施贴壁培养时，细胞可以通过更换培养基来继续培养。

该步骤中所使用的培养基可通过使用培养动物细胞用的培养基作为基础培养基来制备。基础培养基的例子包含IMDM培养基、培养基199、伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)、MEM、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、Ham'sF12培养基、1640RPMI培养基、Fischer's培养基和它们的混合培养基。优选为1640RPMI培养基。优选地，该培养基为无血清。例如可根据需要含有一种以上的血清替代物如清蛋白、转铁蛋白、亚硒酸钠、ITS-X(Invitrogen)(含有胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠)、Knockout血清替代品(KSR；用于培养ES细胞的FBS的血清替代物)、N2添加剂(Invitrogen)、B27添加剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇和3'-硫代甘油以及一种以上的如下物质：脂类、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax、非必需氨基酸、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。本发明中优选的生长因子包含Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、TGF-β、激活素A、Nodal、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、GDF、bFGF和VEGF。该步骤中，至少优选使用BMP4(例如(重组)人BMP4)和bFGF(例如(重组)人bFGF)作为生长因子。

该步骤中优选的培养基的例子包含含有L-谷氨酰胺、B27添加剂、BMP4和bFGF的RPMI培养基。

向培养基中添加的BMP4浓度为例如0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、17.5ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL或50ng/mL，但不限于此。优选地，向培养基中添加的BMP4浓度为10ng/mL。

向培养基中添加的bFGF浓度为例如0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、17.5ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL或50ng/mL，但不限于此。优选地，向培养基中添加的bFGF浓度为10ng/mL。

培养温度为约30～40℃，优选为约37℃，但不限于此，并且，在含CO₂空气的气氛下进行培养，此时CO₂浓度优选为约2～5％。培养时间为例如1～10天，优选为4天。

<VEGF存在下的培养心肌细胞的方法>

该步骤中，通过在VEGF存在下培养由上述方法得到的心肌细胞，能够以所期望的组合比制作心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的混合细胞。

例如，在之前的步骤中进行悬浮培养后得到的细胞群体中的心肌细胞，可以在涂覆培养皿内的任何培养基中培养。涂覆剂的例子包含基质胶(BD)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或巢蛋白和它们的组合。优选为基质胶。或者，该步骤中，在上述步骤中由贴壁培养得到的细胞，可以通过更换培养基来继续培养。

该步骤中所使用的培养基可通过使用培养动物细胞用的培养基作为基础培养基来制备。基础培养基的例子包含IMDM培养基、培养基199、伊格尔氏最低必需培养基(EMEM)、MEM、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、Ham'sF12培养基、1640RPMI培养基、Fischer's培养基和它们的混合培养基。优选为1640RPMI培养基。优选地，该培养基为无血清。例如可根据需要含有一种以上的血清替代物如清蛋白、转铁蛋白、亚硒酸钠、ITS-X(Invitrogen)(含有胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠)、Knockout血清替代品(KSR；用于培养ES细胞的FBS的血清替代物)、N2添加剂(Invitrogen)、B27添加剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇和3'-硫代甘油以及一种以上的如下物质：脂类、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子量化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。本发明中优选的生长因子包含Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、TGF-β、激活素A、Nodal、BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、GDF、bFGF和VEGF。该步骤中，至少优选使用VEGF作为生长因子。

例如，向培养基中添加的VEGF浓度可为10ng/mL～500ng/mL范围、25ng/mL～300ng/mL范围、40ng/mL～200ng/mL范围、50ng/mL～100ng/mL范围、60ng/mL～90ng/mL范围或65ng/mL～85ng/mL范围。优选地，向培养基中添加的VEGF浓度为50ng/mL～100ng/mL。进而，向培养基中添加的VEGF浓度可为10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL或200ng/mL，但不限于此。优选地，向培养基中添加的VEGF浓度为75ng/mL。

培养温度为约30～40℃，优选为约37℃，但不限于此，并且，培养在含CO₂空气的气氛下进行，此时CO₂浓度优选为约2～5％。培养时间为例如4～20天(例如5～15天)，优选为10天。

经FACS分析测定，相对于总细胞数，通过上述方法制作的心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的细胞组合比为：心肌细胞40～80％、内皮细胞1～20％、壁细胞1～45％以及未分化细胞0.1～10％，但不限于此。优选地，含有至少3～12％左右的内皮细胞。心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的组合比的例子包含下述组合比的混合细胞：心肌细胞62.7％、内皮细胞7.9％、壁细胞18.3％以及未分化细胞2.7％，或心肌细胞45.6±3.8％、内皮细胞9.9±1.7％和壁细胞41.8±3.3％。根据本发明的心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的细胞组合比，可基于VEGF浓度和各种其他培养条件任意地改变，并可以在细胞形成为膜片时保持合适的强度的范围内任意地改变。

<除去未分化细胞(TRA-1-60阳性细胞)的步骤>

并且，优选从在上述步骤中制作的心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的混合细胞中除去未分化细胞。

该步骤可以采用可从混合细胞中的心肌细胞、内皮细胞和壁细胞分离未分化细胞的任何方法。从心肌细胞、内皮细胞和壁细胞分离未分化细胞的方法可以是如下方法：基于未分化细胞的指标从混合细胞仅除去未分化细胞或基于心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的指标从混合细胞除去心肌细胞、内皮细胞和壁细胞。该步骤中优选使用前者方法。

未分化细胞的指标可为，例如在未分化细胞中特异性表达的基因或蛋白质。这些基因或蛋白质在该领域中是熟知的(Cell.,2005年9月23日，122(6):947-56；StemCells，2004年,22(1):51-64；MolBiolCell，2002年4月，13(4):1274-81)，例子包含，例如Oct3/4、Nanog(以上为转录因子)、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81(以上为细胞表面抗原)，但不限于此。在该步骤中所使用的指标优选为细胞表面抗原，并且特别优选使用TRA-1-60作为指标。

作为心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的指标的细胞分别为例如心肌肌钙蛋白-T(cTnT)(心肌细胞)、VE-cadherin(内皮细胞)和PDGFRb(壁细胞)，但不限于此。

基于上述指标进行该步骤中的未分化细胞去除，使用例如流式细胞术(FACS)、磁株分选法(MACS)等。优选为MACS。

在优选的方式中，从混合细胞除去未分化细胞的步骤如下实施：用TRA-1-60抗体捕获未分化细胞，并通过免疫磁株分选法(MACS)除去所捕获的未分化细胞(TRA-1-60阳性细胞)。

实施除去未分化细胞步骤后的混合细胞，可仅由心肌细胞、内皮细胞和壁细胞组成，或除心肌细胞、内皮细胞和壁细胞之外还可以包含任选细胞(optionalcell)。任选细胞可包含未分化细胞。

3.细胞膜片的层叠

<细胞膜片>

本发明中，上述细胞的膜片可通过例如使用由温度响应性聚合物涂覆的培养器材培养细胞，使温度变化，由此取出细胞的膜片来形成，所述温度响应性聚合物通过将(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或N,N-二)烷基取代的(甲基)丙烯酸酰胺衍生物(日本未经审查的专利申请公开2010-255001号)，或乙烯基醚衍生物聚合来制作。优选的培养器材的例子包含在上部固定有聚N-异丙基丙烯酸酰胺的培养器材。该培养器材可在市场上作为UpCell从Cellseed公司购买。另外，温度响应性聚合物涂覆剂的例子包含涂覆有ChenCH等人的Biomacromolecules，7:736-43，2006中所述的甲基纤维素的培养器材，或具有聚(对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的培养器材，所述薄膜涂覆有TakamotoY等人的J.Biomater.Sci.PolymerEdn,18:1211-1222,2007中所述的包含2-乙氧基乙基乙烯基醚和2-苯氧基乙基乙烯基醚的嵌段共聚物。当制作细胞膜片时，合适地使用这些培养器材。

<心脏细胞膜片>

本发明中，含有心肌细胞的细胞膜片优选为由包含心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的混合细胞制成的“心脏细胞膜片”。方便起见，主要含有心肌细胞(例如相对于总细胞数大于80％)的细胞膜片被称为“心肌细胞膜片”以便于与上述“心脏细胞膜片”区分。由多能干细胞制作该心脏细胞膜片的方法可如下进行：如国际公开2012/133945号所述的方法那样分别制作心肌细胞、内皮细胞和壁细胞后混合它们，或如国际申请PCT/JP2013/058460号中所述的方法(上述2.)那样，将其分化诱导方法组合以同时诱导3种细胞。

在此所使用的心肌细胞是指表达心肌肌钙蛋白(cTnT)或αMHC的细胞。人cTnT的例子为NCBI编号NM_000364，以及小鼠cTnT的例子为NM_001130174。人αMHC的例子为NCBI编号NM_002471，以及小鼠αMHC的例子为NM_001164171。

在此所使用的内皮细胞是指表达PE-CAM、VE-cadherin和血管性血友病因子(vWF)中的一种的细胞。壁细胞是指表达平滑肌肌动蛋白(SMA)的细胞。人PE-CAM的例子为NCBI编号NM_000442，以及小鼠PE-CAM的例子为NM_001032378。人VE-cadherin的例子为NCBI编号NM_001795，以及小鼠VE-cadherin的例子为NM_009868。人vWF的例子为NCBI编号NM_000552，以及小鼠vWF的例子为NM_011708。人SMA的例子为NCBI编号NM_001141945，以及小鼠SMA的例子为NM_007392。

<细胞膜片的层叠>

本发明中,细胞膜片可以层叠，作为层叠细胞膜片的方法，有通过叠加上述方法中得到的细胞膜片的方法。叠加细胞膜片的方法可以通过在任何培养液中叠加细胞膜片，并去除培养液来进行。叠加过程中，将上述水凝胶(例如明胶水凝胶)、或优选将水凝胶粒子(例如明胶水凝胶粒子)分散于硫酸盐缓冲液(PBS)或培养液中，将其添加(包含例如涂布于表面的一部分或全部)在由另一张细胞膜片覆盖的细胞膜片的表面上。水凝胶或优选的水凝胶粒子可以是干燥的或是在PBS培养液中溶胀的。添加水凝胶(例如明胶水凝胶)，或优选添加水凝胶粒子(例如明胶水凝胶粒子)后，优选使它们在37℃静置10分钟，或更优选地静置30分钟左右。在此所使用的水凝胶(例如明胶水凝胶)或优选的水凝胶粒子(例如明胶水凝胶粒子)可以以任意的浓度溶解于等渗溶液来使用。在此使用的等渗溶液的例子包含生理盐溶液和PBS。相对于细胞膜片每单位面积(cm²)，添加或涂布的水凝胶(例如明胶水凝胶)或优选的水凝胶粒子(例如明胶水凝胶粒子)的量为100μg～6000μg、200μg～5000μg、300μg～4000μg、400μg～3000μg或500μg～2000μg左右，并且相对于细胞膜片每单位面积(cm²)，优选为500μg/cm²～2000μg/cm²的量。

本发明中，层叠细胞膜片通过叠加多张层叠细胞膜片来制作，或可以通过单层的细胞膜片与层叠细胞膜片叠加来制作。当叠加时，在相关的膜片之间添加上述水凝胶、优选添加水凝胶粒子、或更优选添加明胶水凝胶粒子。或者，本发明中，在第一张细胞膜片或层叠细胞膜片与第二张细胞膜片或层叠细胞膜片之间添加上述水凝胶、优选添加水凝胶粒子、或更优选添加明胶水凝胶粒子。这些层叠细胞膜片可以是2张或3张的细胞膜片。如上背景技术中所述，对未组入水凝胶的4层以上的层叠细胞膜片，由于难以向细胞供应氧、养分等，导致定植的细胞数通常不增加且产生细胞死亡。相比之下，根据本发明的层叠细胞膜片具有有利特征，即，即使在4层以上的细胞膜片中，层叠细胞膜片的细胞数和厚度也会增加。

在细胞膜片之间添加的上述水凝胶、优选为水凝胶粒子、或更优选为明胶水凝胶粒子的量为能够使水凝胶或水凝胶粒子分布于细胞膜片面的一部分(例如整个表面的10～30％或以上或者优选地40～70％或以上)或整个表面的量，例如，相对于细胞膜片每单位面积的例示量如上所述。

层叠细胞膜片中的膜片数可根据目的和用途而合适地变更，例子包含4张以上、5张以上、6张以上、7张以上、8张以上、9张以上、10张以上、15张以上或20张以上。对心肌细胞膜片或心脏细胞膜片，层叠后的膜片厚度优选为500μm以上、600μm以上、700μm以上、800μm以上、900μm以上、1mm以上左右。

4.包含层叠细胞膜片的医药组合物

本发明中，由上述方法得到的层叠细胞膜片可以通过直接贴附于因疾病或失调而损伤的部分来用于治疗。因此，本发明提供包含层叠细胞膜片的医药组合物。层叠细胞膜片可根据患有疾病的动物种、用于治疗疾病的部分的尺寸、疾病的疗法等而使用任意的细胞数或任意的尺寸或膜片数。

要治疗的疾病根据细胞类型而合适地选择，例子包含角膜上皮疾病用的治疗剂，其使用角膜上皮细胞膜片或口腔黏膜上皮细胞膜片；心力衰竭、慢性心力衰竭、严重心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、急性心肌、慢性心肌梗塞、心肌病、缺血性心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张性肥厚型心肌病、扩张性心肌病用的治疗剂，其使用心肌细胞膜片或心脏细胞膜片；食道上皮重建用的治疗剂，其抑制炎症反应并防止食道狭窄，使用食道上皮细胞膜片或口腔黏膜上皮细胞膜片；牙周组织的再生用治疗剂，其使用牙根膜细胞膜片或牙髓干细胞膜片；以及退行性关节炎用的治疗剂，其使用包含软骨细胞的软骨膜片。

虽然本发明通过参考下述实施例来更具体地描述，但本发明的范围并非有意地限于这些实施例。从而，虽然在下述实施例中描述了层叠心脏细胞膜片作为特定的例子，但需要注意的是，这仅是一例，并且根据本发明，同样可以制作其他类型的细胞的层叠细胞膜片，且能够使细胞良好地定植于活体。

实施例

实施例1

层叠心脏细胞膜片的生成

<小鼠ES细胞株>

所使用的是设计成在YamashitaJK，FASEBJ.19:1534-6，2005中所记载的aMHC启动子的控制下表达EGFP的小鼠ES细胞株(EMG7)，以及通过在ZambrowiczBP，ProcNatlAcadSciUSA，94:3789-3794，1997中所记载的方法改性，以使得恒定性地表达TFP的ES细胞株(TFP-ROSA)。

<Flk+细胞>

Flk+细胞通过前文中报告的方法(YamashitaJ等人，Nature，408:92-6，2000或YamashitaJK等人，FASEBJ.19:1534-6,2005)制作。简单地说，用分化培养基(添加有10％的胎牛血清和5～10⁵mol/L的2-巯基乙醇的αMEM)，将EMG7或TFP-ROSA在明胶涂覆皿上培养4天，然后通过FACS来纯化Flk阳性细胞。

<内皮细胞和壁细胞的混合物>

通过使用前文中报告的方法(YamashitaJ等人，Nature，408:92-6，2000或Yurugi-KobayashiT等人，ArteriosclerThrombVascBiol.26:1977-84，2006)，由通过上述方法得到的来源于TFP-ROSA的Flk+细胞制作内皮细胞和壁细胞的混合物。简单地说，混合物通过使用添加有50ng/ml的VEGF和0.5mmol/L的8-bromo-cAMP分化培养基，将细胞在明胶涂覆皿上培养3天而得到。

<心肌细胞>

通过使用前文中报告的方法(国际公开2009/118928号或YanP等人，BiochemBiophysResCommun.379:115-20，2009)，由通过上述方法得到的来源于EMG7的Flk+细胞制作心肌细胞。简单地说，心肌细胞通过在用丝裂霉素C处理的OP9细胞上，用添加有1～3μg/mL的环孢菌素-A的分化培养基将Flk+细胞培养4天，然后单离GFP阳性片段来得到。

<心脏细胞膜片>

使用上述Flk+细胞、内皮细胞和壁细胞的混合物、心肌细胞，通过图1所述的在MasumotoH等人的StemCells，301196-205，2012的中所记载的方法制作心脏细胞膜片。简单地说，将来源于TFP-ROSA的2.5×10⁴～4.0×10⁴的Flk+细胞置于(plate)12孔热敏培养皿(UpCell，Cellseed公司)上，在培养的第4天，将上述内皮细胞和壁细胞的混合物的细胞5.0～10⁵个和上述心肌细胞5.0～10⁵个置于同一个培养皿上。将这些细胞在37℃下，在添加有VEGF的分化培养基中培养。添加心肌细胞的4天后(在培养的第7天)，从培养皿以膜片的形态取出细胞，通过使温度回到室温，得到心脏细胞膜片。培养基的更换在混合两种细胞的两天后进行。

<明胶水凝胶粒子>

将600ml的橄榄油(和光纯药工业株式会社)添加至1L的三颈烧瓶，并在水浴中一边用螺旋桨搅拌一边在40℃加热1小时。然后，将20ml的10wt％明胶水溶液(来源于牛骨，等电点:5.0，重均分子量:1.0×10⁵，由新田明胶公司提供)加热至40℃，添加至烧瓶中，并以转动速度400rpm搅拌10分钟，以形成W/O乳液。将该乳液冷却至0℃，并以转动速度400rpm搅拌1小时，以由明胶水溶液制成凝胶。接着，通过添加200ml的冷却丙酮并以转动速度200rpm搅拌15分钟，将明胶脱水。然后，将烧瓶中的溶液收集到50ml的Falcon离心管中，以转动速度5000rpm在4℃进行5分钟的离心分离。除去上清液后，用冷却丙酮清洗沉淀物，并用均化器(以转动速度10000rpm)搅拌1分钟。接着，对所生成的悬浮物在4℃以转动速度5000rpm进行5分钟的离心分离。再次除去上清液，清洗沉淀物，对悬浮物进行离心分离，然后将这些操作反复进行3次。一边用冷却丙酮清洗，一边用筛(开度为20、32和53μm)将明胶粒子筛分，根据粒子直径分别收集，进行真空干燥以得到干燥粒子。然后，通过在140℃、减压下在真空炉中将明胶粒子热脱水48小时，使未交联明胶粒子化学交联，从而得到明胶水凝胶粒子。使用的粒子直径为小于20μm、20～32μm和32～53μm。

<心脏细胞膜片的层叠>

使用上述方法，但其中对所有细胞使用一半量的细胞。将在24孔板中制作的心脏细胞膜片平放并静置于经明胶涂覆的培养皿上。然后，吸出培养基以固定培养皿和膜片。心脏膜片的直径为约6mm。将干燥状态下的粒子直径为20～32μm的明胶水凝胶粒子以0.1mg/μl的浓度分散于PBS溶液中，滴加2.5μl(约885μg/cm²，低剂量)或7.5μl(约2654μg/cm²，高剂量)于该膜片上，并在37℃保温30分钟。接着，用分化培养基添加另一张心脏细胞膜片，层叠在用明胶水凝胶粒子处理的心脏细胞膜片上。然后除去培养基。将同样的操作反复进行，以使5张心脏细胞膜片层叠(图2)。层叠时，将第二、三、四、五层放在分别与第一、二、三、四层稍微偏移的位置。最后，使用移液器，以使分化培养基沿培养皿底面流淌的方式添加培养基，使层叠后的心脏细胞膜片从培养皿脱离。

所得到的层叠心脏细胞膜片与对照群比较，发现了明胶水凝胶粒子群中的膜片比其他群中的膜片自行搏动(self-beating)更长。作为比较中的对照，使用未添加明胶水凝胶粒子而层叠的心脏细胞膜片。

为了验证带有染色的所得到的层叠心肌细胞膜片，用4％PFA固定膜片后，经脱水、脱脂、脱醇，然后使石蜡渗透，然后包埋在石蜡中。将包埋在石蜡中的试样切成6μm的分段，用苏木精-伊红(HE)染色(图3A)。结果是，关于层叠膜片的厚度和活细胞区面积，低剂量群明显大于对照组群和高剂量群(图2B)(厚度，ctrl(对照群):250.9±17.7，n＝7，低剂量群:597.1±24.0，n＝10，高剂量群:449.2±25.6μm，n＝5，p<0.0001；HE染色阳性细胞区面积，ctrl(对照群):0.03511±0.009244，n＝5，低剂量群:0.4746±0.04162，n＝3，高剂量群:0.1211±0.007000mm²，n＝4，p＝0.0090)。

也能够在使用12孔板制作的心脏细胞膜片(直径为约1cm)上，同样地通过使干燥状态下的粒子直径为20～32μm的明胶水凝胶粒子以0.1mg/μl的浓度溶解于PBS溶液，滴加5μl(约637g/cm²)或15μl(约1911μg/cm²)来得到5层的层叠心脏细胞膜片。

此外，确认到通过同样的过程可以得到15层的层叠心脏细胞膜片(厚度为约1mm)。

<明胶水凝胶粒子的粒子直径的效果验证>

在上述心脏细胞膜片的层叠中，使用干燥状态下的粒子直径为小于20μm、20～32μm和32～53μm的明胶水凝胶粒子来层叠心脏细胞膜片。在ctrl(对照群)、小于20μm、20～32μm和32～53μm的4个群中，层叠膜片的厚度和活细胞区面积最大的是20～32μm的群(图4A和B)(厚度，ctrl:204.7±9.5，n＝5，小于20μm的群:389.1±7.6，n＝3，20～32μm的群:597.1±24.0μm，n＝10，32～53μm的群:333.5±5.7μm，n＝3，p<0.0001；HE染色阳性细胞区面积，ctrl:0.03446±0.005362，n＝3，小于20μm的群:0.2051±0.004676，n＝3，20～32μm的群:0.4746±0.04162μm，n＝3，32～53μm的群:0.1487±0.003894μm，n＝3，p<0.0001)。

实施例2

对心肌梗塞模型大鼠的层叠心脏细胞膜片移植试验

通过Masumoto等人(MasumotoH等人，StemCell30:1196-1205(2012))的方法，将在实施例1中制作的层叠心脏细胞膜片(5层)移植到心肌梗塞模型大鼠的心脏前壁表面上，所述大鼠通过公知技术(MasumotoH等人，同上，StemCell30:1196-1205(2012)，NishinaT等人，Circulation104:1241-1245(2001)，SakakibaraY.等人，Circulation104:106:1193-1197(2002))，从无胸腺裸大鼠(雄性，10～12周龄)制备。在结扎(基础线)之前、在心肌梗塞的六天(preTX)、1周、2周、4周、8周和12周后测量超声心动图。测量左心室的舒张期直径(LVDd)和收缩期直径(LVDs)，并且测量形成梗塞的壁和未形成梗塞的壁的左心室舒张期壁厚(LVWTd)和收缩期壁厚(LVWTs)，从下述方程式算出左心室(LV)缩短率(FS(％))的经时变化：

FS(％)＝(LVDd-LVDs)/LVDd

结果示于图5中。由该图可知，层叠有使用明胶水凝胶粒子的心脏细胞膜片的群改善了心脏功能，其与未处理群以及未使用明胶水凝胶粒子而层叠的心脏细胞膜片群相比，具有统计学上的显著差异。

产业上的可利用性

根据本发明的层叠细胞膜片的制作中，可以在细胞生存的状态下层叠细胞膜片。因此，所生成的细胞膜片可应用于细胞置换疗法。

在此所提及的全部出版物、专利和专利申请，其全部内容通过引用而包含于此。

Claims

1.一种方法，是用于层叠细胞膜片的方法，包含使用水凝胶来层叠细胞膜片。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，由能够使细胞生存所需要的物质扩散的材料制成所述水凝胶或所述水凝胶为能够使细胞生存所需要的物质扩散的形式。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述水凝胶为明胶水凝胶。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶为水凝胶粒子。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述水凝胶凝胶粒子为明胶水凝胶粒子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，明胶水凝胶凝胶粒子为明胶分子之间具有分子间交联的明胶水凝胶粒子。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述明胶水凝胶粒子由干燥状态的粒子尺寸为20μm～32μm的粒子构成。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，包含在第一细胞膜片或第一层叠细胞膜片与第二细胞膜片或第二层叠细胞膜片之间添加所述水凝胶，优选添加所述水凝胶粒子，或更优选添加明胶水凝胶粒子。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，由2～3张的细胞膜片构成所述层叠细胞膜片。

10.根据权利要求8或9所述的方法，包含以相对于细胞膜片的单位面积为500μg/cm²～2000μg/cm²的量添加所述水凝胶，优选添加所述水凝胶粒子，或更优选添加明胶水凝胶粒子。

11.一种层叠细胞膜片，通过权利要求1～10中任一项所述的方法制成。

12.根据权利要求11所述的层叠细胞膜片，包含层叠的4张以上的细胞膜片。

13.一种医药组合物，包含权利要求11或12所述的层叠细胞膜片。

14.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述细胞膜片为心肌细胞膜片。

15.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述细胞膜片为包含心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的心脏细胞膜片。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，由多能干细胞制作所述心肌细胞。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，由多能干细胞制作所述内皮细胞。

18.根据权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，由多能干细胞制作所述壁细胞。

19.根据权利要求14～18中任一项所述的方法，其中，多能干细胞为诱导多能干细胞即iPS细胞。

20.一种层叠细胞膜片，通过权利要求14～19中任一项所述的方法制成。

21.根据权利要求20所述的层叠细胞膜片，包含层叠的4张以上的细胞膜片。

22.一种心脏疾病用治疗剂，包含权利要求11、12、20和21中任一项所述的层叠细胞膜片。