JP2007228921A - 三次元組織の製造方法およびそれに用いる細胞外マトリックスの製造方法。 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 (A)基材上に細胞層を形成し、(B)前記基材上の細胞層を、第1物質の含有液および第2物質の含有液に交互に接触させ、前記細胞層上に、第1物質と第2物質とが交互に積層された細胞外マトリックスを形成し、(C)前記細胞外マトリックス上で細胞を培養して、細胞層を形成することによって、細胞外マトリックスを介して細胞層が積層された三次元組織を製造する。本発明において、前記第1物質と第2物質との組合せは、RGD配列を有するタンパク質またはRGD配列を有する高分子と、前記RGD配列を有するタンパク質または前記RGD配列を有する高分子と相互作用するタンパク質もしくは高分子との組合せ、または、正の電荷を有するタンパク質もしくは高分子と、負の電荷を有するタンパク質もしくは高分子との組合せである。
【選択図】 図1
Description
A. 基材上に細胞層を形成する工程、
B. 前記基材上の細胞層を、第1物質の含有液および第2物質の含有液に交互に接触させ、前記細胞層上に、第1物質と第2物質とが交互に積層された細胞外マトリックス(以下、「ECM」という)を形成する工程、および、
C. 前記ECM上で細胞を培養して、細胞層を形成する工程
を含み、
前記第1物質と第2物質との組合せが、RGD配列を有するタンパク質またはRGD配列を有する高分子と、前記RGD配列を有するタンパク質または前記RGD配列を有する高分子と相互作用するタンパク質もしくは高分子との組合せ、または、正の電荷を有するタンパク質もしくは高分子と、負の電荷を有するタンパク質もしくは高分子との組合せであることを特徴とする。
前記RGD配列とは、一般に知られている「Arg−Gly−Asp」配列である。本発明において「RGD配列を有する」とは、元来、RGD配列を有するものでもよいし、また、RGD配列が化学的に結合されたものであってもよい。また、第1物質は、生分解性であることが好ましい。
第2物質としては、前記第1物質との相互作用により、両物質が、例えば、結合、接着、吸着、電子の授受が可能な程度近接できる物質であれば特に制限されないが、前述のように、前記第1物質と相互作用するタンパク質があげられる。前記タンパク質としては、特に制限されないが、例えば、水溶性タンパク質があげられ、具体例として、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、抗体等が使用できる。また、第2物質は、生分解性であることが好ましい。
正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましく、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムc、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン等があげられる。
負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましく、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、卵白アルブミン等があげられる。
まず、基材1(図1(I))を第1物質含有液と第2物質含有液とに交互に接触させて、前記基材1上に、第1物質と第2物質とが交互に積層されたECM21を形成する(図1(II))。このように二種類以上の溶液に交互に接触させて重層する方法を、以下、交互積層(Layer-by-Layer:LBL)法ともいう。なお、基材上に形成したECMは、以下、「第1ナノECM」という。
続いて、基材1上に形成したナノECM21の表面において、細胞を培養し、細胞層31を形成する(図1(III))。このようにナノECM上で細胞を培養すると、細胞は二次元(平面方向)に増殖して単層の細胞層を形成し、細胞はナノECM表面と接着した状態となる。なお、基材上に一層目の細胞層を形成する際には、前述のナノECMの形成を行わずに、基材上に細胞層を形成してもよい。
前記基材上の細胞層を、フィブロネクチン含有液およびゼラチン含有液に交互に接触させ、前記細胞層上に、フィブロネクチン含有液とゼラチンとが交互に積層されたナノECM(以下、「第2ナノECM」ともいう)を形成する。なお、特に示さない限りは、前述と同様にナノECMを形成すればよい。
そして、さらに、前記ナノECM上で細胞を培養して、前記細胞層を形成する。これにより、ナノECMを介して2層の細胞層が積層された三次元組織が形成できる。なお、細胞の培養方法は、前述と同様である。
細胞層を3層以上積層する場合には、前記B工程と前記C工程とを繰り返すことにより、前記細胞層の上に、さらにナノECMと細胞層とを交互に積層すればよい。
(1)ゼラチン−フィブロネクチンからなるナノECM
ゼラチン含有緩衝液として、1mg/ml(0.1wt%)ゼラチンおよび0.15M NaClを含有する0.05Mトリス緩衝液(pH7.4)を使用し、フィブロネクチン含有緩衝液として、0.2mg/ml(0.02wt%)フィブロネクチンおよび0.15M NaClを含有する0.05Mトリス緩衝液(pH7.4)を使用した以外は、前記実施例1と同様にして、QCM基材上に、ゼラチンとフィブロネクチンとが交互に積層されたナノECMを形成した。ナノECMの形成において、ステップ毎に測定した振動数シフトを図10(A)の表に示す。同図において、○が、ゼラチン含有緩衝液に浸漬した後の結果であり、●が、フィブロネクチン含有緩衝液に浸漬した後の結果である(同図においてa)。なお、ナノECMの厚みは、2ステップの処理後で約10nm、8ステップの処理後で約13nmであった。
前記フィブロネクチン緩衝液に代えて、0.1wt%ラミニンおよび0.15M NaClを含有する0.05Mトリス緩衝液(pH7.4)を使用した以外は、前述と同様にしてQCM基材の浸漬を行い、QCM基材上に、ゼラチンとラミニンとが交互に積層されたナノECMを形成した。ナノECMの形成において、ステップ毎に測定した振動数シフトを図10(A)に併せて示す。同図において、□が、ゼラチン含有緩衝液に浸漬した後の結果であり、■が、ラミニン含有緩衝液に浸漬した後の結果である(同図においてb)。
前記(1)において、ゼラチン含有緩衝液およびフィブロネクチン含有緩衝液中のNaCl濃度を、所定の濃度(0M、0.15M、1.0M)に設定した以外は、同様にしてゼラチンおよびフィブロネクチンが交互に積層されたナノECMを形成した。ナノECMの形成において、ステップ毎に測定した振動数シフトを図10(B)に示す。同図において、□および■が、NaCl濃度0Mの結果(a)、△および▲が、NaCl濃度0.15Mの結果(b)、○および●が、NaCl濃度1.0Mの結果であり、白抜きのシンボル(□、△、○)が、ゼラチン含有緩衝液に浸漬した後の結果、黒塗りのシンボル(■、▲、●)が、フィブロネクチン含有緩衝液に浸漬した後の結果である。
前記(3)と同様にして、ゼラチン含有緩衝液とフィブロネクチン含有緩衝液への浸漬を合計10ステップ行い、QCM基材上にナノECMを形成した。そして、ナノECMが形成されたQCM基材を、10重量%FBSを含むEagle’s MEM培地に浸漬させ、培地におけるナノECMの安定性を確認した。安定性は、経時的にQCM基材の振動数を測定し、ナノECMの残存量(残存重量:%)を算出することによって行った。なお、残存量(%)は、培地への浸漬前の振動数(100%)に対する相対的な割合として算出した。この結果を図11に示す。同図において、■が、NaCl濃度0Mの結果、▲が、NaCl濃度0.15Mの結果、●が、NaCl濃度1.0Mの結果である。
Claims (20)
- 細胞を積層して三次元組織を製造する方法であって、
A. 基材上に細胞層を形成する工程、
B. 前記基材上の細胞層を、第1物質の含有液および第2物質の含有液に交互に接触させ、前記細胞層上に、第1物質と第2物質とが交互に積層された細胞外マトリックスを形成する工程、および、
C. 前記細胞外マトリックス上で細胞を培養して、細胞層を形成する工程、
を含み、
前記第1物質と第2物質との組合せが、RGD配列を有するタンパク質またはRGD配列を有する高分子と、前記RGD配列を有するタンパク質または前記RGD配列を有する高分子と相互作用するタンパク質もしくは高分子との組合せ、または、正の電荷を有するタンパク質もしくは高分子と、負の電荷を有するタンパク質もしくは高分子との組合せであることを特徴とする、三次元組織の製造方法。 - さらに、前記B工程と前記C工程とを繰り返す工程を含む、請求項1記載の製造方法。
- 前記B工程において、厚み1nm以上の細胞外マトリックスを形成する、請求項1または2記載の製造方法。
- 前記第1物質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲン、キチン、キトサンおよびポリリジンからなる群から選択された少なくとも一つであり、前記第2物質が、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびエラスチンからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第1物質が、フィブロネクチンまたはラミニンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記第1物質と第2物質との組合せが、フィブロネクチンとゼラチンとの組合せ、または、ラミニンとゼラチンとの組合せである、請求項5記載の製造方法。
- 前記B工程において、前記細胞層を、最初に第1物質の含有液に接触させ、前記細胞外マトリックスの最下層として第1物質層を形成する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記B工程において、前記細胞層を、最後に第1物質の含有液に接触させ、前記細胞外マトリックスの最上層として第1物質層を形成する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記A工程に先だって、前記基材を、第1物質の含有液および第2物質の含有液に交互に接触させ、前記基材上に、第1物質と前記第2物質とが交互に積層された細胞外マトリックスを形成する工程を含み、
前記A工程において、前記基材上に形成された細胞外マトリックス上に細胞層を形成する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の製造方法。 - 前記基材上に、厚み1nm以上の細胞外マトリックスを形成する、請求項9記載の製造方法。
- 前記基材を、最後に第1物質の含有液に接触させ、前記基材上の細胞外マトリックスの最上層として第1物質層を形成する、請求項9または10記載の製造方法。
- 前記細胞が、肝細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、筋細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、骨細胞および免疫細胞からなる群から選択された少なくとも一つの細胞である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第1物質の含有液および第2物質の含有液の少なくとも一方が、さらに、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモンおよび生理活性ペプチドからなる群から選択された少なくとも一つの物質を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第1物質の含有液および第2物質の含有液の少なくとも一方が、さらに、疾患の治療剤、予防剤および抑制剤からなる群から選択された少なくとも一つの物質を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の製造方法により得られる三次元組織。
- 細胞層と細胞層とを接着する細胞外マトリックスの製造方法であって、
細胞層を、第1物質の含有液および第2物質の含有液に交互に接触させ、前記細胞層上に、細胞外マトリックスとして、第1物質と前記第2物質とが交互に積層された薄膜を形成する工程を有し、
前記第1物質と第2物質との組合せが、RGD配列を有するタンパク質またはRGD配列を有する高分子と、前記RGD配列を有するタンパク質または前記RGD配列を有する高分子と相互作用するタンパク質もしくは高分子との組合せ、または、正の電荷を有するタンパク質もしくは高分子と、負の電荷を有するタンパク質もしくは高分子との組合せであることを特徴とする、細胞外マトリックスの製造方法。 - 基材上で細胞を培養し、前記基材上に前記細胞層を形成する、請求項16記載の製造方法。
- 前記薄膜の厚みが、1nm以上である、請求項16または17記載の製造方法。
- 前記第1物質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、コラーゲン、キチン、キトサンおよびポリリジンからなる群から選択された少なくとも一つであり、前記第2物質が、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸およびエラスチンからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項16〜18のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項16〜19のいずれか一項に記載の製造方法により得られる細胞外マトリックス。
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