ES2544854T3 - Genes con expresión específica de células ES - Google Patents

Abstract

Uso de una sonda que comprende un ADN del tipo (a) o (b) siguiente: (a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 4 o 15; (b) un ADN que se hibrida con el ADN de (a) en condiciones rigurosas, y que codifica una proteína expre- sada específicamente en una célula ES, para determinar si una célula que no se ha obtenido a partir de un embrión humano es una célula ES.

Description

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el número de clones analizados. Para el Grupo 1 hasta el Grupo 5, se analizaron todas las genotecas correspondientes. Dado que los datos del Grupo 6 contenían cantidades enormes, se analizaron 23 genotecas extraídas que incluían órganos y células de todo el cuerpo, del mayor tipo posible de tipos.

Grupo 1, óvulos fecundados en fase de célula 1 a blastocisto (49050 clones) Grupo 2, células ES o células de carcinoma embrionario (32277 clones) Grupo 3, feto hasta 8,5 días después de la fertilización (46728 clones) Grupo 4, feto 9 días después de la fertilización (128882 clones) Grupo 5, testículo (65685 clones) Grupo 6, otras células, tejidos (272460 clones) En cuanto al conjunto que se esperaba que se expresara específicamente en óvulos fertilizados y células pluripoten

ciales, tales como células ES y similares, por el método de presentación diferencial digital, se realizó una búsqueda en la base de datos EST obtenida a partir de ratón, utilizando BlastN para examinar si EST estaba presente solo en las genotecas obtenidas a partir de células pluripotenciales.

La base de datos y el programa de análisis tenían las siguientes direcciones URLs. Colección de secuencias de ratón Unigene http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/Mm.Home.html Presentación diferencial digital http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/ddd.cgi?ORG=Mm Búsqueda en Blast

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ (Resultados) Como resultado del análisis por el método de presentación diferencial digital y la búsqueda en la base de datos EST

utilizando BlastN, se identificaron 10 genes. Los ESTs de estos genes estaban presentes muy frecuentemente en los óvulos fertilizados y las células ES, pero no se encontraron en otras células ni en tejidos del Grupo 6. Aunque EST estaba incluido en las genotecas obtenidas a partir de feto y de testículo para algunos genes, ya que éste muy probablemente se había obtenido a partir de una célula germinal primordial o de una célula madre de esperma, que es una célula pluripotencial, se incluyeron entre los candidatos para gen ECAT. Aunque el gen Oct-3/4 estaba presente con una frecuencia muy elevada en los óvulos fertilizados y las células ES, también se encontraba en otras células y órganos, aunque en menor cantidad. Entre los candidatos, en la base de datos de EST obtenida a partir de ratón se buscaron 8 genes utilizando BlastN, cuyos resultados se muestran en la Tabla 1 (ECAT1-8).

De los dos genes restantes, se analizó un gen (ECAT9) de la misma manera. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Tabla 1

ECATs

EST

Grupo 1 óvulos

Grupo 2 ES (EC) Grupo 3 -E8.5 Grupo 4 E9- Grupo 5 testículo Grupo 6 otros

Oct3/4

10 13 4 1 0 2

1

7 24 0 0 0 0

2

32 18 0 0 0 0

3

37 13 0 0 0 0

4

2 14 1 1 3 0

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0 11 0 0 0 0

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0 7 0 0 0 0

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4 9 0 0 1 2

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0 7 0 0 2 0

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Análisis de transferencia Northern

(procedimiento)

Los genes candidatos identificados por análisis informático se analizaron en busca de expresión real específica de células ES mediante transferencia Northern. Con el empleo de Trizol (fabricado por Lifetech Oriental Co. Ltd.), el ARN total fue extraído a partir de células ES indiferenciadas y células ES diferenciadas inducidas con ácido retinoico durante 5 días. Los ARNs obtenidos a partir de diversos órganos de ratones adultos fueron adquiridos en Sawady Tecnología Co., Ltd. El ARN total (5 µg) se separó en gel de agarosa con formalina, se transfirió a una membrana de nailon y se fijó por reticulación con UV. Cuando el EST de un gen objeto estaba comercialmente disponible, ese ADN se usó como sonda. Cuando el EST no estaba disponible, un fragmento de ADN específico para cada ECAT se amplificó por PCR y se utilizó como sonda. En concreto, empleando las siguientes sondas, se examinó la expresión de Oct-3/4, ECAT1, ECAT2, ECAT3, ECAT4, ECAT5, ECAT6, ECAT7 y ECAT8. Además, también se examinó la expresión de ECAT9.

Oct-3/4: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 25, que se había preparado mediante la escisión del plásmido C1 en BS KS (Cell 60: 461-472, 1990) con EcoRI.

ECAT1: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 1, que se había preparado mediante la escisión de Mm.31054EST (nº AI467128) con SalI/NotI.

ECAT2: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 2, que se había preparado mediante la escisión de pH34EST (nº AA473366) con SalI/NotI.

ECAT3: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 3, que se había preparado mediante la escisión de FBX15EST (nº AA571680) con SalI/NotI.

ECAT4: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 4, que se había preparado mediante la escisión del fragmento con EcoRI procedente de un plásmido obtenido mediante la amplificación de una región codificadora de una caja homeo para “Gateway” mediante PCR y clonación TA de la misma.

ECAT5: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 5, que se había preparado mediante la escisión del fragmento con EcoRI procedente de un plásmido obtenido por RT-PCR de ERasS118/RACE11 y clonación TA.

ECAT6: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 6, que es un producto de la PCR de queratina E (48927S/48927AS).

ECAT7: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 7, que se había preparado mediante la escisión del clon DNMT3LEST (AA895770, pBSSK-dnmt31) con EcoRI/XhoI.

ECAT8: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 8, que se había preparado mediante la escisión del producto Mm. 77010RACE de un plásmido clonado por TA con EcoRI.

ECAT9: un fragmento de ADN que contenía una secuencia representada en SEQ ID NO: 41, que se había preparado haciendo referencia a GDF3 (Jones CM. et al., mencionado anteriormente).

Las sondas se marcaron con 32P-dCTP usando un kit de megamarcación fabricado por Amersham Pharmacia. La hibridación se realizó empleando QuickHyb de Funakoshi Co., Ltd. Las señales después del lavado se analizaron empleando BAS5000 de Fuji Photo Film Co., Ltd.

(Resultados)

De los 10 genes identificados mediante la búsqueda por ordenador, 9 genes se han sometido hasta la fecha a transferencia Northern, y se ha analizado la expresión en células ES y en 12 tipos de órganos. En concreto, la expresión de cada gen ECAT en células ES y en 12 tipos de órganos de ratón adulto, se analizó en cada uno mediante transferencia Northern, cuyos resultados se muestran en la Fig. 1.

Se encontró que cada expresión relacionada con los 9 genes era específica de células ES. Si bien se observó cierta expresión en el testículo, se consideró que se había obtenido a partir de células madre de esperma. También se encontró que la expresión de estos genes desaparecía rápidamente cuando las células ES se inducían por estimulación con ácido retinoico. Basándose en estos resultados, los 9 genes se consideraron que eran genes ECAT.

(3) Análisis de un gen ECAT

Cuando un gen ECAT era un gen desconocido, el ADNc de longitud completa se identificaba de acuerdo con el método RACE (“Rapid Amplification of cDNA Ends”) utilizando el sistema 5' RACE, versión 2 de Lifetech Oriental Co. Ltd. En la base de datos RIKEN de ADNc de ratón de longitud completa se realizó una búsqueda en la URL (http://genome.gsc.riken.go.jp/).

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Claims (1)

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