ES2633306T3 - Genes con expresión específica de células ES - Google Patents
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Abstract
Un gen aislado que comprende un ADN del apartado (a), (b), (c) o (d) siguiente: (a) un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 33 o 17; (b) un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 33 o 17, en el que una base está sustituida; (c) un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o 18; (d) un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o 18, en la que un aminoácido está suprimido, sustituido o añadido.
Description
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DESCRIPCION
Genes con expresion espedfica de celulas ES Sector de la tecnica
La presente invencion se refiere a un gen ECAT (gen transcrito asociado a celulas ES) expresado espedficamente en celulas ES (celulas madre embrionarias) y al uso del mismo.
Tecnica anterior
Una celula madre embrionaria (ES, del ingles “embryonic stem”) es una celula aislada a partir de un embrion tem- prano de mairnfero, que continua proliferando de forma semipermanente, aunque conserva la capacidad de diferen- ciarse en cualquier celula en el cuerpo, es decir, la pluripotencia. Las celulas ES se establecieron por primera vez en raton en 1981, y aportaron una tecnica trascendental para el analisis de la funcion genica utilizando ratones con genes desactivados. Aunque el establecimiento de las celulas ES humanas ya se describio en 1998, su aplicacion en la medicina regenerativa ha sido muy esperada. Un intento es lograr una recuperacion funcional mediante el trasplante de celulas musculares cardiacas o celulas nerviosas diferenciadas procedentes de celulas ES, en pacien- tes con infarto de corazon y enfermedades neurodegenerativas.
Aunque la terapia de trasplante de celulas ya se ha empleado, como se observa tfpicamente en el injerto de medula en la leucemia, esta asociada con dos problemas, garantizar un suministro suficiente de celulas que se van a tras- plantar e inhibir una reaccion de rechazo. El uso de las celulas ES que se dividen de forma semipermanente, resuel- ve totalmente el problema de un suministro garantizado de una cantidad suficiente de celulas. Cuando se combina con la tecnologfa de clonacion de celulas somaticas, por otra parte, la reaccion de rechazo tambien se puede su- perar. Cuando se establece una celula ES a partir de un embrion clonado, preparado a partir de una celula somatica de un paciente y se utiliza para trasplante, el rechazo no puede ocurrir ya que tiene el mismo gen que el paciente. Por lo tanto, las celulas ES tienen el potencial de resolver simultaneamente los dos problemas de la terapia de trasplante de celulas.
Aunque las celulas ES tienen un potencial elevado tal y como se ha descrito anteriormente, las celulas ES humanas son diffciles de establecer y mantener, en comparacion con las celulas ES de raton. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de una tecnica de establecimiento y una tecnica de cultivo fiables. Ademas, para que se establezca una celula ES humana, se tiene que sacrificar un embrion. Cuando se combina con la tecnologfa de clonacion de celulas somaticas, conduce facilmente a la clonacion humana. Por lo tanto, para resolver este tipo de cuestiones eticas, se desea el desarrollo de una tecnica para producir directamente una celula similar a ES que tenga pluripotencia, a partir de una celula somatica, sin tener que pasar por un embrion.
Lo que desempena un papel clave en el desarrollo de estas tecnicas es un gen (gen transcrito asociado a celulas ES, en lo sucesivo, gen ECAT), que se expresa espedficamente en las celulas pluripotenciales tales como celulas ES y similares. El gen ECAT se convierte en un marcador para determinar si la celula es una celula ES. Ademas, las celulas ES se pueden seleccionar de manera eficaz a partir de un cultivo mixto de diversos tipos de celulas, mediante la combinacion de una region de control del gen ECAT que induce la expresion espedfica de celulas ES y un gen de resistencia a los farmacos (documento JP-T-9-500004; correspondiente a la patente de Estados Unidos n° 6146888). Ademas, puede ser posible favorecer la conversion de una celula somatica a una celula similar a ES mediante la induccion de la expresion de un gen ECAT.
El unico gen descrito hasta la fecha como un gen ECAT es el gen del factor de transcripcion Oct3 (tambien denomi- nado Oct4, POU5f1, en lo sucesivo, se denominara Oct-3/4). Aunque se ha descrito un gen similar con respecto a los seres humanos (en lo sucesivo, denominado gen hOct-3/4: Takeda et al., Nucleic Acids Res. 20: 4613-4620, 1992, SEQ ID NO: 39), no se ha encontrado hasta ahora ninguna resena sobre una expresion espedfica verificada en celulas ES del gen hOct-3/4. Oct-3/4 es un factor de transcripcion que se expresa espedficamente en una celula ES y una celula EG (celulas germinales embrionarias), cuya expresion desaparece junto con la diferenciacion celu- lar. Por lo tanto, se utiliza como un marcador de celulas Es, y se ha intentado el establecimiento eficaz de celulas ES mediante el intercambio de un gen por uno de resistencia a neomicina en su locus genico (documento JP-T-9- 500004; correspondiente a la Patente de Estados Unidos n° 6146888). Sin embargo, tambien se ha documentado en un informe que Oct-3/4 se expresa tambien en las celulas del trofodermo, ademas de las celulas pluripotenciales (Biol Reprod 63: 1698-1705, 2000). Por lo tanto, el uso del gen Oct-3/4 solo como indicador, produce como resultado la seleccion de celulas distintas a las celulas ES. Para evitar este riesgo, es deseable identificar varios genes ECAT y usarlos de forma combinada.
Incluso si se induce la expresion solo de Oct-3/4 en celulas somaticas, no se observa la conversion a celulas similares a ES. Incluso si Oct-3/4 se expresa constantemente, la diferenciacion de las celulas ES (diferenciacion en endo- dermo primitivo, ectodermo primitivo) asociada con la retirada de LIF (factor inhibidor de la leucemia) no se puede inhibir. Por el contrario, se ha publicado un informe interesante en el que al aumentar la cantidad de expresion de Oct-3/4 solo aproximadamente 1,5 veces el nivel general, se induce una diferenciacion similar a la asociada con la retirada de LIF (Experimental Medicine, 19, 330-338, 2001). Como se ha descrito anteriormente, la accion de Oct-3/4 no es simple y la induccion del mismo en celulas ES mediante la expresion de Oct-3/4 solo en celulas somaticas, es
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diffcil. Desde este aspecto, tambien, se considera necesario combinar varios genes ECAT y analizar las celulas ES.
Sin embargo, no se han encontrado genes ECAT distintos del gen Oct-3/4 y existe un gran requerimiento de que se proporcione un nuevo gen ECAT, desde los aspectos de la medicina regenerativa y la aplicacion de celulas ES al trasplante de celulas.
La secuencia de ADN genomico del oncogen humano c-Ha-ras2 se describe en la entrada de la base de datos con el numero de acceso EM_PRO: X00419. Miyoshi et al. (Nucleic Acids Research, 12, 1821-1828, 1984) describe que c-Ha-ras2 humano es un pseudogen procesado inactivado por numerosas sustituciones de bases. Capon et al (Nature, 302, 33 - 37, 1983) describen las secuencias nucleotidicas completas del oncogen del carcinoma de vejiga humana T-24 y su homologo normal. Seeburg et al (Nature, 312, 71-75, 1984) describen las propiedades biologicas de los genes c-HA-ras1 humanos mutados en el codon 12. Cohen y col. (Nature, 334, 119-124, 1988) describen una mutacion puntual en el ultimo intron responsable del aumento de la expresion y la actividad transformadora del oncogen c-Ha-ras. Cheng y col. (Cell, 95, 793-803, 1998) revelan que Grb2 de mairnferos regula multiples etapas en el desarrollo embrionario y en la transformacion maligna. Takahashi et al. (Nature, 423, 541-545, 2003) describe una funcion de Eras en la promocion de propiedades tumorales en celulas madre embrionarias de raton. Kameda et al. (Stem Cells, 23, 1535 - 1540, 2005) revela que el gen Eras humano tiene una senal de poliadenilacion prematura en el sentido ascendente que da como resultado un transcrito no codificante truncado. Cambers y col. (Oncogene, 23, 7150 - 7160, 2004) describen la auto-renovacion de teratocarcinomas y celulas madre embrionarias.
Descripcion de la invencion
La presente invencion tiene por objeto proporcionar un nuevo gen ECAT. Mas particularmente, la presente invencion tiene por objeto proporcionar un metodo de cribado de celulas ES utilizando el nuevo gen ECAT y un peptido de un producto genico codificado por el mismo, asf como una sonda para seleccionar una celula ES.
Para identificar genes ECAT candidatos, los presentes inventores utilizaron la base de datos EST (marcador de secuencia expresada) (detalle que se describira posteriormente) para el analisis informatico, e identificaron genes candidatos hasta llegar a 10 genes. De los 10 genes, 8 genes se sometieron a transferencia Northern, mediante la cual se analizo la expresion en celulas ES y 12 tipos de organos (raton). Como resultado, se encontro que la expresion de los 8 genes era espedfica de las celulas ES. Tambien se encontro que la expresion de estos genes desapa- recfa rapidamente despues de la estimulacion de las celulas ES con acido retinoico, es decir, mediante induccion de la diferenciacion. Basandose en los resultados anteriores, los presentes inventores han encontrado que estos 8 genes son genes ECAT, lo que ha dado como resultado la realizacion de la presente invencion. De los dos genes restantes, un gen se analizo por transferencia Northern y tecnicas similares, y se encontro que el gen era un gen ECAT.
Ademas, se ha identificado un gen humano homologo al gen ECAT (en lo sucesivo, hECAT) y se ha analizado la expresion en celulas ES y 13 tipos de organos (humanos).
Por consiguiente, la presente invencion proporciona lo siguiente.
(1) Un gen aislado que comprende un ADN del apartado (a), (b), (c) o (d) siguiente:
(a) un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 33 o 17;
(b) un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 33 o 17, en donde una base esta sustituida;
(c) un ADN que codifica una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 34 o 18;
(d) un ADN que codifica una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 34 o 18, en donde un aminoacido esta suprimido, sustituido o anadido.
(2) Una protema aislada de los siguientes apartados (a) o (b):
(a) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 34 o 18.
(b) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos definida en (a), en donde un aminoacido esta suprimi- do, sustituido o anadido.
(3) Un vector de expresion que contiene el gen del apartado (1) mencionado anteriormente.
(4) Una celula transformada con el vector de expresion del apartado (3) mencionado anteriormente.
(5) Un anticuerpo que se une espedficamente a una protema del apartado (a) o (b) siguiente:
(a) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 34 o 18;
(b) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos definida en (a), en donde esta suprimido, sustituido o
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anadido un aminoacido.
(6) El anticuerpo del apartado (5) mencionado anteriormente para uso en determinar si una celula es una celula ES no humana o seleccionar una celula ES no humana.
(7) Uso de un ADN del apartado (a) o (b) siguiente:
(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 5 o 17;
(b) un ADN que se hibrida con un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 5 o 17 en condiciones rigurosas;
como sonda para determinar si una celula es una celula ES no humana.
(8) Uso de un ADN que tiene no menos de 20 bases contiguas a partir de una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 17 para determinar si una celula es una celula ES no humana, en donde el ADN no tiene una secuencia repetitiva y tiene una secuencia espedfica para un gen espedficamente expresado en una celula ES no humana.
(9) Un metodo de cribado para una celula ES no humana, que comprende:
(I) analizar un estado de expresion intracelular de:
(la) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 17; o
(lb) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 18.
10. El metodo del mencionado apartado (9), que comprende ademas:
(II) analizar un estado de expresion intracelular de:
(lla) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 11 y / o un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 25; o
(llb) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 12 y/o una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 26.
11. El metodo del mencionado apartado (9) o (10), que comprende analizar un estado de expresion de un gen espe- dficamente expresado en una celula ES no humana, utilizando el ADN del apartado (7) o (8) antes mencionado.
12. El metodo del (11) antes mencionado, que comprende ademas analizar un estado de expresion de un gen espe- dficamente expresado en una celula ES no humana, utilizando un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 2 o 11 y/o un ADN que tiene una secuencia de bases representada en la SEQ ID NO: 25.
13. Un metodo para seleccionar una celula ES no humana que comprende usar el ADN de los mencionados aparta- dos (7) o (8).
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 muestra un analisis de la expresion de cada gen ECAT en una celula ES y en 12 tipos de organos en raton adulto mediante transferencia Northern.
La Fig. 2 muestra un analisis de la expresion de cada gen ECAT en una celula ES, en una celula madre mesenqui- matica y en 13 tipos de organos en ser humano adulto mediante transferencia Northern.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de un gen expresado espedficamente en una celula ES (en lo sucesivo, denominado tambien gen con expresion espedfica de celula ES), a saber, un gen ECAT. Es posible determinar si una celula es una celula ES no humana, por la presencia de expresion de un gen ECAT como indicador.
En esta memoria se describe una sonda para la seleccion de celulas ES no humanas para decidir sobre la celula ES como se ha descrito. A modo de ejemplo de esta sonda se puede mencionar espedficamente un polinucleotido que contiene un ADN que comprende una secuencia de bases representada en una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 - 8 (la invencion es SEQ ID NO: 5), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 9 (en lo
sucesivo, gen ECAT1), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 11 (en lo
sucesivo, gen ECAT2), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 13 (en lo
sucesivo, gen ECAT3), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 15 (en lo
sucesivo, gen ECAT4), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 17 (la invencion, en lo sucesivo, gen ECAT5), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 19 (en lo sucesivo, gen ECAT6), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 21 (en
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lo sucesivo, gen ECAT7), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 23 (en lo sucesivo, gen ECAT8) o un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 41 (en lo sucesivo, gen ECAT9). Por otra parte, la sonda para la seleccion de celulas Es puede ser cualquiera siempre que pueda alcanzar el objeto de confirmar la presencia o no de expresion de un gen ECAT, y puede ser la secuencia de bases mencionada anteriormente que se somete a una modificacion mediante sustitucion, delecion, adicion y simila- res. Espedficamente, un polinucleotido que comprende un ADN que se hibrida con un gen ECAT en condiciones estrictas y que codifica una protema expresada espedficamente en una celula ES, y un polinucleotido que comprende un ADN que tiene una secuencia de bases de un gen ECAT, en donde de una a varias bases estan deleciona- das, sustituidas o anadidas, y que es capaz de hibridarse, en condiciones rigurosas, con un ADN que codifica una protema expresada espedficamente en una celula ES, se puede utilizar preferiblemente como una sonda para la seleccion de celulas ES. Los ejemplos espedficos descritos en esta memoria incluyen un polinucleotido que contie- ne un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 27 (en lo sucesivo, gen hECAT2), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 29 (en lo sucesivo, gen hECAT3), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 31 (en lo sucesivo, gen hECAT4), un
ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 33 (la invencion, en lo sucesivo, gen
hECAT5), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 35 (en lo sucesivo, gen
hECAT7), un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 37 (en lo sucesivo, gen
hECAT8) o un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 43 (en lo sucesivo, gen hECAT9).
Ademas, un polinucleotido que contiene un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 25, es decir, un ADN que codifica Oct-3/4, o un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 39, es decir, un ADN que codifica hOct-3/4, tambien se puede utilizar como una sonda de seleccion de celulas ES. Debido a que un informe ha documentado que el gen Oct-3/4 se expresa incluso en las celulas del trofo- dermo, tal y como se ha mencionado anteriormente, es preferible el uso simultaneo de un polinucleotido que contiene preferiblemente un gen ECAT distinto del gen Oct-3/4 o del gen hOct-3/4 y similares, tal como la nueva sonda para la seleccion de celulas ES de la presente invencion. Incluso en el caso de una nueva sonda para la seleccion de celulas ES que contiene el gen ECAT mencionado anteriormente, es preferible el uso simultaneo de varios tipos de sondas para determinar con mayor precision si se trata de una celula ES.
En la presente memoria descriptiva, la expresion "condiciones rigurosas" significa las condiciones bajo las cuales un ADN que tiene aproximadamente 70% o mas, preferiblemente aproximadamente 80% o mas, particularmente prefe- rido aproximadamente 90% o mas de homologfa en una secuencia de bases, se puede hibridar, en donde el rigor se puede controlar cambiando de forma apropiada la temperatura, la concentracion de sales y similares durante la reaccion hibridacion y el lavado. Las condiciones mas preferibles son aquellas bajo las cuales se puede hibridar un ADN que tiene aproximadamente no menos de 95% de homologfa.
Un gen ECAT2 se describe como un gen pH34 que muestra una disminucion de la expresion cuando una celula EC se estimula con acido retinoico (Differentiation 46: 61-67, 1991), y de acuerdo con la base de datos de RIKEN, se describe como ESG 1 (gen espedfico de una celula ES). Ademas, un gen ECAT3 es un gen que codifica una protef- na de raton que tiene una caja F, cuya expresion se describe en el testmulo y el ovario (Current Biology 9: 11801182, 1999). Se describe un gen ECAT7 como una protema DNMT3L que es similar a DNMT3 que causa la metila- cion del ADN (Genomics 65: 293-298, 2000). El gen ECAT9 se describe como un factor de crecimiento llamado GDF3, en Jones CM et al., Mol Endocrinol. 6: 1961-1968, 1992 para raton, y en Caricasole et al., Oncogene 16: 95103, 1998 para ser humano. No hay ningun informe sobre una expresion espedfica en celulas ES. Con respecto al gen ECAT4, el gen ECAT5 y el gen ECAT6, no se encuentra ningun informe en la bibliograffa publicada, pero una busqueda en una base de datos de protemas ha revelado que el gen ECAT4 tiene una caja homeo, el gen ECAT5 tiene homologfa con el oncogen H-Ras y el gen ECAT6 es similar a la queratina. Para el gen ECAT5, a pesar de que se conoce su secuencia parcial, no se ha determinado una secuencia de ADNc por sf misma, ni la secuencia de aminoacidos de una protema que este codificada por el ADN. Por consiguiente, la presente invencion proporciona un gen ECAT5, una protema ECAT5. Tambien se describe un gen que tiene una homologfa extremadamente alta con estas y una protema que muestra comportamiento similar a estas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el "gen que tiene una homologfa extremadamente alta" significa esped- ficamente un gen que hibrida con el gen ECAT5 en condiciones rigurosas, y siempre y cuando este requisito se cumpla, una o varias bases pueden ser suprimidas, sustituidas o anadidas en la secuencia base (SEQ ID N°: 17) del gen ECAT5. Espedficamente, es un gen que tiene aproximadamente 70% o mas, preferiblemente aproximadamente 80% o mas, mas preferiblemente aproximadamente 90% o mas, particularmente preferiblemente 95% o mas, homo- logfa con el gen ECAT5. La "protema que muestra comportamiento similar" significa una protema que tiene las ca- ractensticas que la protema ECAT5 muestra, es decir, que se expresa espedficamente en una celula ES. Siempre y cuando este requisito se cumpla, uno o varios aminoacidos pueden ser suprimidos, sustituidos o anadidos en la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 18) de la protema ECAT5.
Por otra parte, la sonda para seleccionar celulas ES incluye un fragmento de ADN que consiste en una secuencia parcial que comprende 20 o mas bases continuas sin una secuencia repetida, procedente de la secuencia de bases descrita en SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 (invencion), 19, 21, 23 o 41, o SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33 (invencion), 35, 37 o 43, que se construye basandose en las secuencias de varios genes ECAT y genes hECAT. El fragmento de
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ADN no esta particularmente limitado siempre que se pueda hibridar con el gen ECAT o el gen hECAT. Espedfica- mente, es un ADN que contiene una secuencia parcial continua que comprende generalmente 20 bases o mas, preferiblemente aproximadamente 100 bases o mas, y mas preferiblemente aproximadamente 200 bases o mas, de la secuencia de bases de cada SEQ ID NO, que contiene al menos una secuencia espedfica para diversos genes ECAT o genes hECAT destinadas a la deteccion, y que no consiste en una secuencia repetida aislada. Los ejemplos preferibles de la misma incluyen un fragmento de ADN representado en SEQ ID NOs: 1-8 (la invencion es SEQ ID NO: 5).
De los 9 tipos de genes ECAT de raton mencionados anteriormente, se ha encontrado que 7 tipos, gen ECAT2, gen ECAT3, gen ECAT4, gen ECAT5, gen ECAT7, gen ECAT8 y gen ECAT9, tienen los genes eCaT humanos corres- pondientes (se mencionan a continuacion: gen hECAT2, gen hECAT3, gen hECAT4, gen hECAT5, gen hECAT7, gen hECAT8 y gen hECAT9, respectivamente). Entre estos, las secuencias de bases de los genes hECAT3, hECAT5 y hECAT8 y las secuencias de aminoacidos de las protemas codificadas por las secuencias de bases no se han determinado. Por consiguiente, la presente invencion proporciona el gen y la protema de hECAT5 asf como genes que tienen una homologfa extremadamente alta con la misma y protemas que muestran comportamiento similar.
En esta memoria, los "genes que tienen una homologfa extremadamente alta" y las "protemas que muestran comportamiento similar" significan espedficamente genes que hibridan con los genes de hECAT3, hECAT5 (invencion) o hECAT8 en condiciones rigurosas. Siempre que se cumpla este requisito, se pueden suprimir una o varias bases, sustituirlas o anadirlas en las secuencias de bases de los genes hECAT3, hECAT5 (invencion) y hECAT8 (SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 37, respectivamente). Para ser exactos, es un gen que tiene aproximadamente 70% o mas, preferiblemente aproximadamente 80% o mas, mas preferiblemente aproximadamente 90% o mas, particularmente preferiblemente 95% o mas, homologfa con esos genes. Las "protemas que muestran comportamiento similar" significan protemas que tienen las caractensticas de la protema hECAT3, protema hECAT5 (invencion) o protema hECAT8. Siempre que se cumpla este requisito, pueden eliminarse uno o varios aminoacidos, susti- tuirlos o anadirlos en las secuencias de aminoacidos de la protema hECAT3, protema hECAT5 (invencion) y protef- na hECAT8 (SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 38, respectivamente).
La sonda empleada en la presente invencion se puede preparar de acuerdo con los metodos conocidos en este campo. Por ejemplo, esta sonda se puede preparar como un ADN aislado mediante la escision de EST del gen ECAT correspondiente con una enzima de restriccion, un ADN obtenido mediante amplificacion con PCR utilizando como molde, ADN genomico, ADN complementario (ADNc) preparado a partir de ARNm obtenido a partir de celulas ES, ADN sintetizado qmmicamente y un ADN construido mediante una combinacion adecuada de estos metodos.
La presente invencion proporciona un metodo de cribado para una celula ES no humana, que se caracteriza por analizar el estado de expresion de un gen expresado espedficamente en una celula ES. Tal y como se usa en el presente documento, el "gen expresado espedficamente en una celula ES" es el mismo que el gen ECAT5 o el gen hECAT5 antes mencionado.
En la presente invencion, una celula ES no humana se criba mediante el analisis del estado de expresion de un gen expresado espedficamente en las celulas ES o una protema expresada espedficamente en celulas ES y que esta codificada por dicho gen. Para el analisis del estado de expresion a nivel del gen, se puede utilizar la sonda mencio- nada anteriormente para la seleccion de celulas ES. Tambien es preferible utilizar simultaneamente una sonda que comprende un polinucleotido que tiene un ADN que codifica Oct-3/4, como se ha mencionado anteriormente. Tal sonda se puede marcar con una sustancia fluorescente, una enzima, un radioisotopo o similar. Para el analisis del estado de expresion a nivel de protemas, una sustancia que tiene afinidad espedfica hacia la protema mencionada anteriormente, expresada espedficamente en las celulas ES, tal como un anticuerpo, se utiliza para examinar la expresion intracelular de la protema. Mas espedficamente, se emplean metodos que utilizan una reaccion antfgeno- anticuerpo puesta en practica generalmente en el campo pertinente, tal como inmunotransferencia, inmunoprecipita- cion y similares. El anticuerpo en esta memoria no esta particularmente limitado, siempre que pueda unirse espedficamente a la protema, y puede ser cualquiera entre un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal y un fragmento funcional de los mismos. Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos se pueden marcar con una sustancia fluorescente, una enzima, un radioisotopo o similares.
Por otra parte, pueden estar disponibles comercialmente o se pueden preparar apropiadamente de acuerdo con un metodo convencional.
La presente descripcion se refiere a un vector de expresion que comprende cualquiera de los genes mencionados anteriormente espedficamente expresados en celulas ES y un gen que codifica una protema espedficamente expresada en celulas ES. Tal como se utiliza en la presente memoria, el gen espedficamente expresado en celulas ES es como se ha definido anteriormente, y el gen que codifica una protema espedficamente expresada en celulas ES es espedficamente un gen que codifica ECAT1 (SEQ ID NO: l0), un gen que codifica ECAT2 (SEQ ID NO: 12) o hECAT2 (SEQ ID NO: 28), un gen que codifica ECAT3 (SEQ ID NO: 14) o hECAT3 (SEQ ID NO: 30), un gen que codifica ECAT4 (SEQ ID No: 16) o hECAT4 (SEQ ID nO: 32), un gen que codifica eCaT5 (invencion, SEQ ID NO: 18) o hECAT5 (invencion, SEQ ID NO: 34), un gen que codifica ECAT6 (SEQ ID NO: 20), un gen que codifica ECAT7 (SEQ ID NO: 22) o hECAT7 (SEQ ID NO: 36), un gen que codifica ECAT8 (SEQ ID No: 24) o hECAT8 (SEQ
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ID NO: 38) y un gen que codifica ECAT9 (SEQ ID No: 42) o hECAT9 (SEQ ID NO: 44). El vector de expresion tiene preferiblemente una funcion de supresion de la diferenciacion por expresion del vector en la celula, particularmente celulas ES, a la luz de la naturaleza del gen contenido en el vector. En otras palabras, es un vector que expresa forzosamente un gen inhibidor de la diferenciacion (de aqu en adelante tambien denominado vector para la expresion forzosa del gen inhibidor de la diferenciacion). El vector de expresion de la presente descripcion no esta particularmente limitado, siempre y cuando sea capaz de mantener la replicabilidad o crecimiento autonomo en diversas celulas animales y expresar el gen espedficamente expresado en celulas ES, y abarca un vector de virus, un vector de plasmido y similares. Este vector de expresion puede prepararse basandose en ingeniena genetica convencional, por ejemplo, de acuerdo con libros de texto basicos tales como Molecular Cloning 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) y similares. El vector es preferiblemente un vector de virus, que se prepara incorporando un gen espedficamente expresado en celulas ES o similares en virus de ADN o virus de ARN tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, virus de vaccinia, poxvirus, poliovirus, sindbis virus o similar. Cuando sea necesario, tambien se puede introducir una region promotora deseada, una region genica resistente a farmacos o una region reguladora de expresion.
El vector de expresion de la presente descripcion se introduce en una celula de acuerdo con metodos convencio- nalmente conocidos tales como transfeccion, lipofeccion, microinyeccion, misil balfstico, electroporacion o similares.
La incorporacion o no incorporacion del vector de expresion de la presente invencion asf preparado en una celula huesped y su expresion puede confirmarse, por ejemplo, determinando la cantidad de protema (polipeptido) que el gen EcaT introducido ha expresado y producido, por ejemplo, mediante ELISA y similares.
Ademas del uso del gen ECAT como sonda para determinar si una celula es una celula ES no humana, el gen ECAT tambien se puede utilizar para la separacion selectiva de celulas ES a partir de una mezcla de celulas ES y otros tipos de celulas. Los presentes inventores han preparado un vector dirigido para intercambiar un gen de seleccion de farmacos en una region de traduccion de protemas de cada gen ECAT y, utilizando este vector, han establecido celulas ES que causaron una recombinacion homologa. Espedficamente, se aplico la tecnica descrita en el docu- mento JP-T-9-500004 (correspondiente a la Patente de Estados Unidos n° 6146888). Por ejemplo, una celula en la que se ha intercambiado un gen de resistencia a la neomicina en un gen ECAT3, gen ECAT4 o gen ECAT5, se culti- vo en presencia de G418, pero la diferenciacion celular no se observo en una celula seleccionada. Tales resultados sugieren un posible uso del gen ECAT para la separacion selectiva de las celulas ES. Para una seleccion asegurada solo de las celulas ES, es preferible llevar a cabo una recombinacion homologa usando multiples tipos de vectores que incorporan un gen EcAt.
Ejemplos
La presente invencion se explica en detalle haciendo referencia a los Ejemplos, que no se deben interpretar como limitativos.
Ejemplo 1 Identificacion de un gen ECAT de raton
(1) Identificacion de un gen candidato mediante analisis por ordenador
(procedimiento)
La base de datos EST se utilizo para identificar los genes candidatos de ECAT. EST se obtiene mediante la extrac- cion al azar de una cantidad de clones de ADNc a partir de genotecas de ADNc obtenidas a partir de varias celulas y organos, analizando solo una reaccion de la secuencia del extremo 5' o 3' de la misma y registrando la misma en una base de datos publica. Los ESTs se puede decir que son un catalogo de genes expresados en cada celula y cada organo. Se han registrado mas de un millon de clones obtenidos a partir de raton y mas de 30000 clones obte- nidos a partir de celulas ES de raton.
Como base de datos de EST, se utilizo Unigene. Unigene se prepara agrupando clones de EST, que se consideran que se han obtenido a partir del mismo gen, y a 5 de marzo de 2001, se han descrito 79917 conjuntos para la base de datos de EST de raton, en donde cada conjunto consiste en al menos un EST o un gen conocido.
Como metodo de analisis, se utilizo el metodo de presentacion diferencial digital. Este metodo se utiliza para exami- nar la frecuencia de la presencia de cada conjunto en las genotecas de celulas y organos designados, a saber, el numero de clones EST contenidos en cada conjunto se divide por el numero de registros EST completos obtenidos a partir de la genoteca de los mismos, para examinar de este modo la frecuencia de la expresion entre diferentes celulas y entre diferentes organos.
La frecuencia de la expresion genica en las genotecas obtenidas a partir de los siguientes 5 tipos de celulas y un organo, se analizo por el metodo de presentacion diferencial digital. El numero entre parentesis para cada grupo es el numero de clones analizados. Para el Grupo 1 hasta el Grupo 5, se analizaron todas las genotecas correspon- dientes. Dado que los datos del Grupo 6 conteman cantidades enormes, se analizaron 23 genotecas extrafdas que inclrnan organos y celulas de todo el cuerpo, del mayor tipo posible de tipos.
Grupo 1, ovulos fecundados en fase de celula 1 a blastocisto (49050 clones)
Grupo 2, celulas ES o celulas de carcinoma embrionario (32277 clones)
Grupo 3, feto hasta 8,5 dfas despues de la fertilizacion (46728 clones)
Grupo 4, feto 9 dfas despues de la fertilizacion (128882 clones)
5 Grupo 5, testiculo (65685 clones)
Grupo 6, otras celulas, tejidos (272460 clones)
En cuanto al conjunto que se esperaba que se expresara espedficamente en ovulos fertilizados y celulas pluripoten- ciales, tales como celulas ES y similares, por el metodo de presentacion diferencial digital, se realizo una busqueda en la base de datos EST obtenida a partir de raton, utilizando BlastN para examinar si EST estaba presente solo en 10 las genotecas obtenidas a partir de celulas pluripotenciales.
La base de datos y el programa de analisis teman las siguientes direcciones URLs.
Coleccion de secuencias de raton Unigene
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/Mm.Home.html
Presentacion diferencial digital
15
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/ddd.cgi?ORG=Mm
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Unigene/ddd.cgi?ORG=Mm
Busqueda en Blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
(Resultados)
Como resultado del analisis por el metodo de presentacion diferencial digital y la busqueda en la base de datos EST 20 utilizando BlastN, se identificaron 10 genes. Los ESTs de estos genes estaban presentes muy frecuentemente en los ovulos fertilizados y las celulas ES, pero no se encontraron en otras celulas ni en tejidos del Grupo 6. Aunque EST estaba incluido en las genotecas obtenidas a partir de feto y de testfculo para algunos genes, ya que este muy pro- bablemente se habfa obtenido a partir de una celula germinal primordial o de una celula madre de esperma, que es una celula pluripotencial, se incluyeron entre los candidatos para gen ECAT. Aunque el gen Oct-3/4 estaba presente 25 con una frecuencia muy elevada en los ovulos fertilizados y las celulas ES, tambien se encontraba en otras celulas y organos, aunque en menor cantidad. Entre los candidatos, en la base de datos de EST obtenida a partir de raton se buscaron 8 genes utilizando BlastN, cuyos resultados se muestran en la Tabla 1 (ECAT1-8).
De los dos genes restantes, se analizo un gen (ECAT9) de la misma manera. Los resultados se muestran en la Ta- bla 1.
30 Tabla 1
- ECATs
- EST
- Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6
- ovulos ES(EC) -E8.5 E9- testfculo otros
- Oct3/4
- 10 13 4 1 0 2
- 1
- 7 24 0 0 0 0
- 2
- 32 18 0 0 0 0
- 3
- 37 13 0 0 0 0
- 4
- 2 14 1 1 3 0
- 5
- 0 11 0 0 0 0
- 6
- 0 7 0 0 0 0
- 7
- 4 9 0 0 1 2
- 8
- 0 7 0 0 2 0
- 9
- 4 11 0 0 0 2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Analisis de transferencia Northern (procedimiento)
Los genes candidatos identificados por analisis informatico se analizaron en busca de expresion real espedfica de celulas ES mediante transferencia Northern. Con el empleo de Trizol (fabricado por Lifetech Oriental Co. Ltd.), el ARN total fue extrafdo a partir de celulas ES indiferenciadas y celulas ES diferenciadas inducidas con acido retinoico durante 5 dfas. Los ARNs obtenidos a partir de diversos organos de ratones adultos fueron adquiridos en Sawady Tecnologfa Co., Ltd. El ARN total (5 |jg) se separo en gel de agarosa con formalina, se transfirio a una membrana de nailon y se fijo por reticulacion con UV. Cuando el EST de un gen objeto estaba comercialmente disponible, ese ADN se uso como sonda. Cuando el EST no estaba disponible, un fragmento de ADN espedfico para cada ECAT se amplifico por PCR y se utilizo como sonda. En concreto, empleando las siguientes sondas, se examino la expresion de Oct-3/4, ECAT1, ECAT2, ECAT3, ECAT4, ECAT5, ECAT6, ECAT7 y ECAT8. Ademas, tambien se examino la expresion de ECAT9.
Oct-3/4: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 25, que se hada prepara- do mediante la escision del plasmido C1 en BS KS (Cell 60: 461-472, 1990) con EcoRI.
ECAT1: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 1, que se hada preparado mediante la escision de Mm.31054EST (n° AI467128) con SalI/NotI.
ECAT2: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 2, que se hada preparado mediante la escision de pH34EST (n° AA473366) con SalI/NotI.
ECAT3: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 3, que se hada preparado mediante la escision de FBX15EST (n° AA571680) con SalI/NotI.
ECAT4: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 4, que se hada preparado mediante la escision del fragmento con EcoRI procedente de un plasmido obtenido mediante la amplificacion de una region codificadora de una caja homeo para “Gateway” mediante PCR y clonacion TA de la misma.
ECAT5: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 5, que se hada preparado mediante la escision del fragmento con EcoRI procedente de un plasmido obtenido por RT-PCR de E- RasS118/RACE11 y clonacion TA.
ECAT6: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 6, que es un producto de la PCR de queratina E (48927S/48927AS).
ECAT7: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 7, que se hada preparado mediante la escision del clon dNmT3LEST (AA895770, pBSSK-dnmt31) con EcoRI/XhoI.
ECAT8: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 8, que se hada preparado mediante la escision del producto Mm. 77010RACE de un plasmido clonado por TA con EcoRI.
ECAT9: un fragmento de ADN que contema una secuencia representada en SEQ ID NO: 41, que se hada preparado haciendo referencia a GDF3 (Jones CM. et al., mencionado anteriormente).
Las sondas se marcaron con 32P-dCTP usando un kit de megamarcacion fabricado por Amersham Pharmacia. La hibridacion se realizo empleando QuickHyb de Funakoshi Co., Ltd. Las senales despues del lavado se analizaron empleando BAS5000 de Fuji Photo Film Co., Ltd.
(Resultados)
De los 10 genes identificados mediante la busqueda por ordenador, 9 genes se han sometido hasta la fecha a transferencia Northern, y se ha analizado la expresion en celulas ES y en 12 tipos de organos. En concreto, la expresion de cada gen ECAT en celulas ES y en 12 tipos de organos de raton adulto, se analizo en cada uno mediante transferencia Northern, cuyos resultados se muestran en la Fig. 1.
Se encontro que cada expresion relacionada con los 9 genes era espedfica de celulas ES. Si bien se observo cierta expresion en el testfculo, se considero que se hada obtenido a partir de celulas madre de esperma. Tambien se encontro que la expresion de estos genes desapareda rapidamente cuando las celulas ES se indudan por estimula- cion con acido retinoico. Basandose en estos resultados, los 9 genes se consideraron que eran genes ECAT.
(3) Analisis de un gen ECAT
Cuando un gen ECAT era un gen desconocido, el ADNc de longitud completa se identificaba de acuerdo con el metodo RACE (“Rapid Amplification of cDNA Ends”) utilizando el sistema 5' RACE, version 2 de Lifetech Oriental Co.
Ltd. En la base de datos RIKEN de ADNc de raton de longitud completa se realizo una busqueda en la URL (
http://genome.gsc.riken.go.jp/).
http://genome.gsc.riken.go.jp/).
Ejemplo 2 Analisis de la informacion conocida del gen ECAT obtenido
(1) Busqueda con Blast
5 Se realizo una busqueda de una secuencia EST de 8 genes que se habfan confirmado que eran genes ECAT como resultado de una transferencia utilizando Blast. Como resultado, ya se habfan descrito las secuencias de 3 genes en unos artmulos. El gen ECAT2 se describio como el gen pH34 gen que muestra una disminucion en la expresion cuando las celulas EC se estimulan con acido retinoico. El gen ECAT4 se describio como una protema de raton que tema caja F, cuya expresion se observa solo en testmulo y ovario. El gen ECAT7 se describio como una protema 10 DNMT3L similar a DNMT3 que realiza la metilacion del ADN. La identificacion del ADNc de longitud completa se intento con el metodo RACE y la region de traduccion se identifico para el gen ECAT4, el gen ECAT5 y el gen ECAT6. Se realizo una busqueda de la secuencia de aminoacidos deducible usando BlastP y se encontro que el gen ECAT4 tiene una caja homeo, el gen ECAT5 tiene homologfa con el gen del cancer H-Ras y el gen ECAT6 es similar a la queratina. Ademas, el gen ECAT9, que se habfa confirmado recientemente que era un gen ECAT, se encontro 15 que era un factor de crecimiento llamado GDF3.
(2) Busqueda a traves de la base de datos RIKEN de ADNc de raton
Se realizo una busqueda en la base de datos de ADNc de longitud completa de raton, publicada en febrero de 2001 por RIKEN. Como resultado, se encontro que el ADNc de longitud completa de 8 genes, excepto del gen ECAT5, habfa sido publicado. El gen ECAT5 no estaba incluido en la base de datos. Ademas, el gen ECAT2 se describe 20 como un gen 1 espedfico de celulas ES (ESG) en la base de datos RIKEN, pero no habfa informacion disponible en cuanto a la expresion de los otros 8 genes en celulas ES.
Ejemplo 3 Identificacion del gen ECAT humano
(1) Busqueda con Blast en la base de datos de ADN genomico humano y la base de datos de protema humana
Como resultado de una busqueda con Blast, se encontro que los genes ECAT2-5, 7, 8 eran ortologos y teman una 25 secuencia de aminoacidos identica en no menos del 50%. Para el gen ECAT9, tambien, existe el gen hECAT9 como hGDF3 (Caricasole et al., mencionado anteriormente). Por lo que respecta al gen ECAT1 y al gen ECAT6, no se pudo identificar una ortologfa humana.
Como resultado de una busqueda con BlastP, no hubo ninguna publicacion de secuencias de bases o de secuencias de aminoacidos que incluyera una protema hipotetica para 3 genes, hECAT3, hECAT5 y hECAT8.
30 Ejemplo 4 Confirmacion de la expresion del gen homologo humano
La expresion espedfica en celulas ES del gen ECAT se confirmo en primates.
ARNs totales respectivos obtenidos a partir de 13 tipos de organos de ser humano adulto (adquiridos de Sawady Technology Co., Ltd. o Funakoshi Co., Ltd.), ARN total obtenido a partir de celulas madre mesenquimaticas huma- nas (adquirido en Takara) y ARN total obtenido a partir de celulas ES de simio (indiferenciadas y diferenciadas indu- 35 cidas con acido retinoico, proporcionadas por el profesor Nakatsuji del Institute For Frontier Medical Sciences) se analizaron por el metodo de transferencia Northern. El ADNc de longitud completa del clon EST correspondiente a hECAT2, 4, 7, 8, 9 y hOct3/4 se utilizo como una sonda. Aunque la hibridacion se realizo de la misma manera que en el analisis de ECAT de raton en el Ejemplo 1 mencionado anteriormente, la temperatura de reaccion y de lavado se fijo mas baja (50°C), de modo que el ARN de simio se pudo detectar usando la sonda humana. Como resultado, 40 cada gen mostraba una fuerte senal en celulas ES no diferenciadas (Fig. 2). Junto con la diferenciacion de las celulas ES, la senal se atenuaba drasticamente. Si bien se observo una senal delgada emborronada en otros organos (celulas), esta se considera que no es espedfica debido a la baja temperatura de la reaccion y del lavado. Partiendo de los resultados anteriores, se ha confirmado que los genes ECAT se expresan selectivamente en celulas ES no solo de raton sino de primates, como genes marcadores de las mismas.
45 Aplicabilidad Industrial
Se han podido proporcionar recientemente 9 tipos de genes ECAT expresados espedficamente en celulas ES de raton. Ademas, se han podido proporcionar genes ECAT humanos que se corresponden a 7 tipos de estos 9 tipos. Ademas, se han podido obtener marcadores celulares selectivos de celulas ES mediante la combinacion de estos genes ECAT o fragmentos de los mismos. Ademas, la presente invencion es mas eficaz en un metodo para selec- 50 cionar celulas ES, basado en una combinacion con un gen de resistencia a farmacos, en un intento de convertir celulas somaticas en celulas de tipo ES y similares, que el uso aislado del gen Oct-3/4 o un fragmento del mismo, y se considera que es util en la aplicacion real de una terapia regenerativa y similares.
Claims (13)
- 5101520253035401. Un gen aislado que comprende un ADN del apartado (a), (b), (c) o (d) siguiente:(a) un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 33 o 17;(b) un ADN que comprende una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 33 o 17, en el que una base esta sustituida;(c) un ADN que codifica una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 34 o 18;(d) un ADN que codifica una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 34 o 18, en la que un aminoacido esta suprimido, sustituido o anadido.
- 2. Una protema aislada de los siguientes apartados (a) o (b):(a) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 34 o 18;(b) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos definida en (a), en la que un aminoacido esta suprimido, sustituido o anadido.
- 3. Un vector de expresion que contiene el gen de la reivindicacion 1.
- 4. Una celula transformada con el vector de expresion de la reivindicacion 3.
- 5. Un anticuerpo que se une espedficamente a una protema de los siguientes apartados (a) o (b):(a) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 34 o 18;(b) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos definida en (a), en la que un aminoacido esta suprimido, sustituido o anadido.
- 6. El anticuerpo de la reivindicacion 5 para uso en la determinacion de si una celula es una celula ES no humana o en la seleccion una celula ES no humana.
- 7. Uso de un ADN de los siguientes apartados (a) o (b):(a) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 5 o 17;(b) un ADN que se hibrida con un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 5 o 17 en condiciones rigurosas;como sonda para determinar 'in vitro' si una celula es una celula ES no humana.
- 8. Uso de un ADN que tiene no menos de 20 bases contiguas a partir de una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 17 para determinar 'in vitro' si una celula es una celula ES no humana, en la que el ADN no tiene una secuencia repetitiva y tiene una secuencia espedfica para un gen espedficamente expresado en una celula ES no humana.
- 9. Un metodo in vitro de seleccion para una celula ES no humana, que comprende:(I) analizar un estado de expresion intracelular de:(la) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 17; o(lb) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en la SEQ ID NO: 18.
- 10. El metodo de la reivindicacion 9, que comprende ademas:(II) analizar un estado de expresion intracelular de:(lla) un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 11 y/o un ADN que tiene una secuencia de bases representada en SEQ ID NO: 25; o(llb) una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 12 y/o una protema que tiene una secuencia de aminoacidos representada en SEQ ID NO: 26.
- 11. El metodo de la reivindicacion 9 o 10, que comprende analizar un estado de expresion de un gen espedficamente expresado en una celula ES no humana, utilizando el ADN de la reivindicacion 7 u 8.
- 12. El metodo de la reivindicacion 11, que comprende ademas analizar un estado de expresion de un gen espedfi-camente expresado en una celula ES no humana, utilizando un ADN que tiene una secuencia de bases representa- da en SEQ ID NO: 2 o 11 y/o un ADN que tiene una secuencia de bases representada en la SEQ ID NO: 25.
- 13. Un metodo in vitro para seleccionar una celula ES no humana que comprende usar el ADN de la reivindicacion 7 u 8.
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