CN112703011A - 用于治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的方法。许多癌症具有干性标记以去分化为未成熟的祖细胞，从而赋予肿瘤克隆从胎儿发育中重新表达基因的能力。发明人获得了每组五只小鼠，其分别接受7天和14天的2x106个辐射的hESC细胞的两次加强疫苗接种，这些细胞与3种不同的佐剂混合：500μgTLR3、50μg TLR9激动剂或50μg/mlQuil‑

疫苗佐剂。14天后，将5x1044T1个细胞注入小鼠的乳腺脂肪垫中，并以4mg/ml的剂量将丙戊酸添加到饮用水中。他们已经表明，与未接种疫苗的小鼠相反，与使用TLR9激动剂或Quil‑

Description

用于治疗癌症的方法和组合物

技术领域

本发明属于肿瘤学领域，更具体地，本发明涉及抗癌疫苗联合疗法。更特别地，本发明涉及用诱导抗原的MHC-I呈递的试剂，(ii)含有免疫原性成分的疫苗组合物和iii)佐剂治疗癌症的方法。

背景技术

癌症干细胞(CSC)代表少量群体的自我更新的癌细胞，其对肿瘤的持久性和复发有反应，因为它们可能对常规治疗耐药。这些CSC最近在各种来源的实体瘤(包括乳腺癌、结肠癌和颈癌)中得到了证实，并且代表了一种新的治疗靶标。已经显示那些CSC表达大量的胚胎抗原，其与人胚胎干细胞(hESC)或人诱导多能干细胞(hiPSC)共享表达。还已经在与肿瘤发生和/或肿瘤进展相关的分化癌细胞中发现了那些胚胎抗原中某些的表达。

在过去的十年中，癌症治疗方法已经从靶向疗法发展到免疫干预策略，在生存率以及与癌症相关的发病率和死亡率方面取得了空前的增长。但是，尽管已经证明了免疫检查点抑制剂的功效和临床益处，但仍有大量的由影响肿瘤特异性免疫应答和癌细胞自主信号的免疫调节因子引起的局部应答和原发性耐药性肿瘤(“先天性耐药性”)。对PD-1/PD-L1阻断的初始应答后，在许多癌症的发展和复发中都获得了耐药性。获得对PD1/PDL-1阻断的耐药性的潜在机制由具有获得性体细胞突变(突变体)的新抗原景观(具有耗尽的T细胞的表观遗传稳定性的进化的肿瘤免疫微环境(TIME))的进化引起。

癌症种系抗原代表在胚胎和胎儿发育过程中表达的蛋白质，这些表观遗传控制的抗原可以以多种癌症的不同比例重新表达。迄今为止已经建立了几种人癌症疫苗试验以靶向胚胎抗原，诸如癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白或癌症/睾丸抗原(NY-ESO-1)。用基因工程化为表达针对癌症种系抗原NY-ESO-1的HLA-A-0201表位的T细胞抗原受体(TCR)的自体淋巴细胞转移的过继细胞导致某些转移性黑素瘤患者的持久性肿瘤消退。不幸的是，由于逃脱突变体和新的体细胞新抗原的快速出现以及单价癌症疫苗普遍无效，仅靶向一种抗原被证明不足以产生强大的抗肿瘤免疫应答来介导肿瘤排斥。

对干细胞在再生医学中的潜力的最新兴趣使得可广泛使用定义明确的未分化ESC系以及在表型和功能上类似于ESC的未分化iPSC。

继发于来自强大的免疫抑制肿瘤微环境的内在途径和诱导因子，具有干性特征的癌症呈现出基因组可塑性以及染色质景观的深刻变化。它们去分化为未成熟祖细胞的能力赋予肿瘤克隆从胎儿发育中重新表达基因的能力，其中下调I型MHC的表达并且上调共抑制分子的表达。

因此，继续需要预防和/或治疗具有干细胞标记的癌症的新途径。针对干细胞突变新表位的疫苗接种可用于增强过继转移的T细胞或通过免疫检查点阻断激活的细胞的免疫应答。

本文公开的主题的全部或部分解决了这一需求和其他需求。

发明简述

本发明涉及用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括以下步骤：向所述受试者同时、分别或顺次施用治疗量的(i)诱导抗原的MHC-I呈递的试剂，(ii)含有免疫原性成分的疫苗组合物和iii)佐剂。本发明特别由权利要求书限定。特别地，所述诱导抗原的MHC-I呈递的试剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，并且所述佐剂是toll样受体(TLR)3激动剂。优选受试者不具有针对抗原的预先存在的免疫力。

在一个具体实施方案中，所述疫苗组合物中的免疫原性成分选自下组：

a.目标抗原，

b.人胚胎干细胞(hESCs)组合物，

c.人诱导多能干细胞(hiPSC)组合物，

d.胎儿干细胞组合物

e.来自细胞组合物的提取物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

f.细胞组合物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

g.包含已通过目标抗原体外引发的抗原呈递细胞的细胞组合物，和

h.通过暴露于呈递目标抗原的抗原呈递细胞已针对目标抗原体外引发的T细胞淋巴细胞。

特别地，所述抗原是胎儿抗原或多种胎儿抗原。

在一个实施方案中，所述疫苗组合物包含表达一种或多种也由所述受试者的癌细胞表达的目标抗原的群体的细胞。

在一个实施方案中，所述疫苗组合物包含表达新胎儿抗原的灭活的胎儿细胞群体。

特别地，所述胎儿干细胞通过包括以下步骤的方法获得：

a.使多能细胞群体向与患者的特定癌症有关的途径分化，

b.扩增由此分化的细胞，

c.任选地在扩增过程中暴露于诱变剂，以诱导所述群体的细胞中的基因诱变，

d.验证所述群体的至少70％的细胞表达胎儿标志物，

e.任选地验证所述群体的所述细胞表达所述受试者的癌细胞中存在的至少一种肿瘤相关抗原(TAA)或新抗原，

f.使所述细胞灭活，以使所述细胞丧失其分裂能力。

在一个实施方案中，所述疫苗组合物包含表达新胎儿抗原的灭活的多能细胞，诸如胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(hiPSC)的群体。该群体描述于WO2017202949中。

特别地，所述干细胞通过包括以下步骤的方法获得：

a.在用以维持所述细胞的多能能力的条件存在下，任选地在扩增步骤过程中诱导所述群体中抗原的MHC-I呈递的试剂存在下，扩增多能细胞，

b.和将所述扩增细胞暴露于将灭活细胞的灭活剂，同时保持细胞包膜的完整性。

优选所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂选自下组：丙戊酸(VPA)、伏立诺他、帕比司他、吉维司他、贝利司他、恩替诺特、莫塞替诺特、Practinostat、西达本胺、奎诺司他、阿贝司他和左乙拉西坦。

优选所述TLR3激动剂是聚(A:U)或聚(I:C)。

在一个实施方案中，对所述含有免疫原性成分和TLR3激动剂的疫苗组合物进行初次施用，并从所述初次施用进行所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的多次施用。

在一个实施方案中，所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、大肠癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、淋巴瘤、急性和慢性淋巴样和髓样白血病、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、头颈肿瘤以及所有亚型实体瘤、造血系统恶性肿瘤和RET突变的内分泌肿瘤，包括甲状腺髓样癌。

在一个实施方案中，所述癌症是激素依赖性癌症。在此实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、子宫癌和卵巢癌。

本发明涉及(i)组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，(ii)含有免疫原性成分的疫苗组合物，和iii)toll样受体(TLR)3的激动剂的联合制剂，其用于通过同时、分别或顺次施用以用于治疗受试者的癌症。

在一个实施方案中，所述疫苗组合物中的免疫原性成分选自与上述相同的组，特别是胎儿抗原或多种胎儿抗原、表达一种或多种也由所述受试者的癌细胞表达的目标抗原的群体的细胞、表达新胎儿抗原的灭活的胎儿细胞群体或表达新胎儿抗原的灭活的多能细胞，诸如胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(hiPSC)的群体。

发明详述

发明人获得了每组五只小鼠，其分别接受7天和14天的2x106辐射的hESC细胞的两次加强疫苗接种，这些细胞与3种不同的佐剂混合：500μgTLR3、50μg TLR9激动剂或50μg/ml

Saponin疫苗佐剂。14天后，将5x104 4T1细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中，并以4mg/ml的剂量将丙戊酸添加到饮用水中。他们已经表明，与未接种疫苗的小鼠相反，与使用TLR9激动剂或

Saponin疫苗佐剂相比，用hESC和TLR3激动剂联合接种的小鼠产生了最大的乳腺肿瘤体积减少(p<0.001)。

用于治疗患有癌症的受试者的方法

本发明涉及用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括以下步骤：向所述受试者同时、分别或顺次施用治疗量的作为联合制剂的(i)诱导抗原的MHC-I呈递的试剂，ii)含有免疫原性成分的疫苗组合物和iii)佐剂。

如本文所用，术语“治疗”是指预防或预防性治疗以及治愈性或疾病改变性治疗，包括治疗具有高度患癌症(例如遗传性家族癌症综合征)风险的受试者，或怀疑患有癌症的受试者以及生病或已经被诊断患有癌症或医学病症的受试者，且包括抑制临床复发。可以向患有癌症或最终可能患有癌症的受试者施用治疗，以预防、治愈、延迟癌症或复发性癌症的一种或多种症状的发作、降低癌症或复发性癌症的一种或多种症状的严重性或改善癌症或复发性癌症的一种或多种症状，或者为了使受试者的存活期延长超过在没有这种治疗的情况下预期的存活期。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的一般目标是在治疗方案的初始阶段向受试者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)采用“加载方案”，其可以包括施用比医生在维持方案期间使用的更大剂量的药物，比医生在维持治疗期间更频繁地施用药物，或两者。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在治疗疾病期间维持受试者，例如使受试者长期(数月或数年)保持缓解的治疗方案(或治疗方案的一部分)。维持方案可以采用持续治疗(例如以规律的间隔(例如每周、每月、每年等)施用药物)或间歇治疗(例如中断治疗、间歇治疗、复发治疗或实现特定的预定标准(例如疼痛、疾病表现等)时的治疗)。

如本文所用，术语“癌症”是指具有侵入或扩散到身体其他部位的潜力的异常细胞生长。癌症选自但不限于下组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、大肠癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、淋巴瘤、急性和慢性淋巴样和髓样白血病、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、头颈肿瘤以及所有亚型实体瘤、造血系统恶性肿瘤和RET突变的内分泌肿瘤，包括甲状腺髓样癌。

如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物，诸如啮齿动物、猫、犬和非人和人灵长类动物。特别地，在本发明中，受试者是患有或易患具有多能胚胎样干细胞抗原或胎儿样干细胞抗原表达的癌症的人。典型地，受试者是如上所述患有癌症或易患癌症的人。

如本文所用，术语“诱导抗原的MHC-I呈递的试剂”是指能够刺激免疫原性的化合物。该化合物被称为受试者中MHC表达和/或免疫应答的激活剂。MHC-I的诱导可通过流式细胞仪(FACS)分析测定癌细胞(诸如4T1细胞或刘易斯肺癌，LLC细胞)表面MHC-I分子的至少2倍增加来评估(FACS)。术语“MHC”是指主要的组织相容性复合物，其存在于细胞表面以识别称为抗原的外源分子。MHC结合抗原并将其呈递给免疫分子(诸如淋巴细胞T和B)。术语“免疫应答”是指免疫系统对抗原的免疫应答。通过激活免疫应答，FoxP3亚群和髓样抑制细胞(MDSC)的群体减少，并且相反地，NK群体增加。在本发明的上下文中，针对肿瘤的免疫应答包括针对存在于肿瘤细胞内或上的抗原的细胞毒性T细胞应答。在一些实施方案中，细胞毒性T细胞应答由CD8+T细胞介导。典型地，在本发明的上下文中，激活MHC表达和/或免疫应答的抗原对应于如上所述的胎儿干细胞群体中存在的分子。在这种情况下，激活MCH表达和/或免疫系统的化合物是胎儿基因或免疫原性新抗原。术语“新抗原”或“新抗原性的”是指源自至少一种突变的一类抗原，所述突变改变了基因组编码蛋白的氨基酸序列。

在本发明的上下文中，化合物选自下组：细胞因子、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂。

在一个具体实施方案中，MHC表达和/或免疫应答的激活剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。HDAC抑制剂(HDACi)是在细胞中具有广泛功能的天然或合成化合物。多种HDACi是已知的并且被设计为靶向HDAC的催化位点。根据其结构和特异性，HDACi可分为几类，包括异羟肟酸酯、环肽、脂族酸和苯甲酰胺。可以通过Blackwell等人(Life Sciences 82(2008)1050–1058)或Kozikowski等人(Journal of Medicinal Chemistry 50(13),3054–3061)公开的方法测试化合物的HDACi活性。

如本文所用，术语组蛋白“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”也称为HDACi，是指干扰组蛋白脱乙酰基酶功能的一类化合物。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)在转录调节和癌症的发病机制中发挥重要作用。通常，HDAC的抑制剂调控转录并诱导细胞生长停滞、分化和细胞凋亡。HDAC还增强用于癌症治疗的治疗剂(包括放射和化疗药物)的细胞毒性作用。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是丙戊酸(VPA)。

术语“丙戊酸”是指酸-2-丙戊酸钠(C₈H₁₆O₂)，在本领域中其具有以下CAS号和式99-66-1：

丙戊酸具有多种生物活性(Chateauvieux等、J.Biomed.Biotechnol、2010、pii:479364.doi:10.1155/2010/479364)。丙戊酸影响增强抑制活性的神经递质GABA(γ氨基丁酸盐)。提出了几种作用机制。丙戊酸尤其是GABA代谢：抑制GABA、GABA转氨基黄嘌呤(LAMP)的降解，GABA合成的衰减，并改变其流动。此外，丙戊酸阻断某些离子通道，减少由N-甲基-D-天冬氨酸介导的唤醒，并阻断包括Na+和Ca2+的离子通道的活性(电压依赖性L型CACNA1C、D、N和F型)。

在本发明的上下文中，丙戊酸用作免疫刺激剂以加强针对表达癌症人胚胎干细胞的癌症的免疫应答，多能细胞暴露于与胎儿干细胞共享的诱变剂或胎儿干细胞新抗原。

更具体地，VPA用于刺激并增强癌症干细胞隔室上MHC-1的表达，增加一些肿瘤细胞中的新抗原含量。胎儿干细胞上的更高表达允许增强与MHC-I相关的新抗原向APC/树突细胞的呈递以诱导TH1免疫应答。更高水平的趋化因子(CXCL9、CXCL10)允许增强T细胞募集到肿瘤中。

本发明涉及增加衍生的人胚胎干细胞、在存在HADCi(诸如VPA和/或5个氮杂胞苷)的情况下暴露于诱变剂的多能细胞和具有通过染色质重塑表达胎儿抗原的肿瘤细胞中以及趋化因子表达(CXCL9、CXCL10、CXL13)中的新抗原含量的方法。

特别地，当用于体内治疗受试者时，本发明的组合物和疫苗使得可以改变肿瘤微环境并促进T细胞募集到肿瘤中，从而获得肿瘤体积的长期持久减少。

这是由于人胚胎干细胞、暴露于诱变剂的多能细胞或胎儿干细胞疫苗和VPA共施用的协同作用，当疫苗注射后向患者进一步施用HDACi一段时间(诸如至少15天)后，其进一步改进。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是辛二酰苯胺异羟肟酸，也称为伏立诺他(N-羟基-N'-苯基辛二酰胺)，它是美国食品和药物管理局(FDA)于2006年批准的第一个组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(Marchion DC等2004；Valente等2014)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是FDA于2015年批准的帕比司他(LBH-589)，它的结构如Valente等2014所述。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是吉维斯特(ITF2357)，它已被欧盟批准为孤儿药(Leoni等2005；Valente等2014)。

在另一个实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是左乙拉西坦：尽管该化合物对HDAC没有直接作用，但是其在人体内的主要羧酸代谢物2-吡咯烷酮-正丁酸(PBA)抑制了Ki值为2.25+/-0.78mM的HDAC(Eyal S,Epilepsia.2004Jul；45(7):737-44)。因此，在本上下文中，它被认为是HDACin。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是贝利司他，也称为Beleodaq(PXD-101)，其于2014年获得FDA批准(Ja et al 2003；Valente et al 2014)。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是恩替诺特(为SNDX-275或MS-275)。该分子具有以下化学式(C₂₁H₂₀N₄O₃)，并具有如Valente et al 2014所述的结构。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₃H₂₀N₆O)的莫塞替诺特(MGCD01030)(Valente et al 2014)。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是如Diermayr et al 2012所述的具有以下化学式(C₂₀H₃₀N₄O₂)和结构的Practinostat(SB939)。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₂H₁₉FN₄O₂)的西达本胺(CS055/HBI-8000)。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₁H₂₆N₆O₂)的奎诺司他(JNJ-26481585)。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₁H₂₃N₃O₅)的阿贝司他(PCI24781)(Valente et al 2014)。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₀H₁₉FN₆O₂)的CHR-3996(Moffat D et al 2010；Banerji et al 2012)。

在一个具体实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₁₈H₂₀N₂O₃)的AR-42(Lin等人2012)。

在一个具体实施方案中，MHC表达的激活剂是DNA甲基转移酶抑制剂。

如本文所用，术语“DNA甲基转移酶抑制剂”是指能够与DNA甲基转移酶(DNMT)相互作用并抑制其活性的化合物。DNMT是催化甲基转移至DNA的酶。DNA甲基化具有多种生物学功能。所有已知的DNA甲基转移酶都使用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体。

在一个具体的实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是氮杂胞苷，也称为5-氮杂-2-脱氧胞苷，具有以下化学式(C₈H₁₂N₄O₅)和本领域的结构(Kaminskas等2004；Estey等2013)。

在一个具体的实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是地西他滨，也称为5-氮杂-2'-脱氧胞苷，具有下式(C₈H₁₂N₄O₄)(Kantarjian等，2006)。

在一个具体的实施方案中，MHC表达和/或免疫应答的激活剂是组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂或DNA甲基转移酶抑制剂。如本文所用，术语“组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂”是指能够与由参与DNA甲基化的zeste同源物1(EZH1)和2(EZH2)基因的增强子编码的组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶相互作用的化合物。EZH2通过使用辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸催化向赖氨酸27处的组蛋白H3添加甲基。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是3-脱氮亚麻素A(DZNep，C-c3Ado)。DZNep，C-c3Ado在本领域中具有以下化学式C₁₂H₁₄N₄O₃和CAS号102052-95-9。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是UNC1999和无活性的类似化合物。UNC1999在本领域中具有以下化学式C₃₃H₄₃N₇O₂和CAS号1431612-23-5。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是UNC2400和无活性的类似化合物。UNC2400在本领域中具有以下化学式C₃₅H₄₇N₇O₂和CAS号1433200-49-7。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是tazemetostat(EPZ6438，E7438)。Tazemetostat在本领域中具有以下化学式C₃₄H₄₄N₄O₄和CAS号1403254-99-8。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是三氟乙酸盐(EPZ011989)。三氟乙酸盐在本领域中具有以下化学式CF₃COONa和CAS号2923-18-4。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是EPZ005687。EPZ005687在本领域中具有以下化学式C₃₂H₃₇N₅O₃和CAS号1396772-26-1。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是GSK343。GSK343在本领域中具有以下化学式C₃₁H₃₉N₇O₂和CAS号1346704-33-3。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是GSK126。GSK126在本领域中具有以下化学式C₃₁H₃₈N₆O₂和CAS号1346574-57-9。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是GSK2816126。GSK2816126在本领域中具有以下化学式C₃₁H₃₈N₆O₂和CAS号1346574-57-9。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是ZLD1039。ZLD1039在本领域中具有以下化学式C₃₆H₄₈N₆O₃和CAS号1826865-46-6。

如本文所用，术语“疫苗组合物”是指含有免疫原性成分的疫苗组合物，所述免疫原性成分旨在使受试者产生针对一种或多种目标抗原的免疫应答。目标抗原是针对其期望免疫应答的任何抗原，包括任何肽、来自自身的蛋白质(诸如来自癌细胞的抗原)或外源的任何蛋白质(诸如细菌、病毒或寄生蛋白)、其他类型的抗原(诸如核酸、糖、脂多糖等)。

在一个具体实施方案中，疫苗组合物含有旨在使受试者产生针对一种或多种目标抗原的免疫应答的免疫原性成分(化合物)。

在另一个实施方案中，免疫原性化合物是来自细胞组合物的提取物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原。细胞提取物可以是已经离心以除去不溶物例如膜片段、囊泡和细胞核的裂解细胞，因此主要由细胞溶质组成。在另一个实施方案中，提取物可以使用特定技术制备以耗尽或富集特定组分(例如，超声处理可用于将大的膜片段破碎成保留在提取物中的小颗粒，或高速离心以除去最小的不溶性组分)。通过任何化学或机械作用，例如通过压力、蒸馏、蒸发等获得细胞提取物。

如本文所用，术语“免疫原性成分”是指刺激免疫系统的化合物。在本发明的上下文中，免疫原性成分选自但不限于下组：

a)目标抗原，

b)人胚胎干细胞(hESCs)组合物，

c)人诱导多能干细胞(hiPSC)组合物，

d)胎儿干细胞组合物，

e)来自细胞组合物的提取物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

f)细胞组合物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

g)包含已通过目标抗原体外引发的抗原呈递细胞的细胞组合物，或

h)通过暴露于呈递目标抗原的抗原呈递细胞已针对目标抗原体外引发的T细胞淋巴细胞。

获得细胞组合物的方法：

在另一个实施方案中，免疫原性成分是细胞组合物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原。

在一个具体实施方案中，细胞组合物是人胚胎干细胞(hESCs)组合物、人诱导多能干细胞(hiPSCs)组合物或胎儿干细胞组合物。

胎儿细胞群体和用途

在本文中，胎儿细胞群体对应于维持为细胞培养物的细胞群体，但还涵盖类器官，其中细胞开始形成器官，并且可以观察到细胞的3D空间组织。

要提醒的是，分化是由较不特异的细胞形成更特异的细胞的过程。这是一个连续的过程。从多能细胞(胚胎干细胞或iPS细胞)开始，这些细胞将失去多能性，并参与一种分化方式，其中它会在完全分化的专门细胞中成熟。对于某些器官，在分化过程中，多个细胞会产生类器官。

诱导和指导多能细胞的分化是本领域技术人员已知的。可以引用描述了多能细胞的发育或类器官的Wu et al(Cell.2016Jun 16；165(7):1572-1585),Fatehullah et al(Nat Cell Biol.2016 Mar；18(3):246-54)或Sasaki and Clevers(Curr Opin GenetDev.2018 Sep 24；52:117-122)。还有许多其他文章描述了所述群体，并教导了使多能细胞在各种目标组织中分化的方法和条件。

在一个实施方案中，所述免疫原性成分是已经灭活的胎儿细胞群体，所述胎儿细胞有利地处于与待治疗的癌症相同的细胞分化谱系中。

在该实施方案中，本发明涉及(i)组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，和(ii)含有灭活的胎儿细胞群体的疫苗组合物，和iii)佐剂，其中所述佐剂是toll样受体(TLR)3的激动剂的联合，其用于治疗受试者的癌症。

在另一个实施方案中，疫苗由灭活的胎儿细胞群体组成。特别地，群体的细胞表达一种或多种也由受试者的癌细胞表达的目标抗原。在一个特定实施方案中，灭活的胎儿细胞群体是类器官或衍生自类器官(即已经通过破坏类器官的3D结构获得)。

一般而言，术语“胎儿干细胞”是指胎儿细胞群体，其是在发育早期出现的瞬时祖细胞。可以通过异源、异种或同基因多能干细胞(ESC和iPSC)的分化在体外繁殖这种群体。胎儿群体细胞的特征是与多能性有关的基因丧失，其中以下基因丧失至少20％：NACC1、BLM、WDR33、DAZAP1、CDK1、CDC45、ZNF165、XRCC5、SMARCAD1、AIMP2、CKS1B、NANOG、ZFP42、U2AF1、CCNB2、DCTPP1、TGIF1、SUPT3H、AURKB、GEMIN7、SRSF1、PNP、SIGLEC12、POU5F1、PSMA3、RMND5B、GDF9、STXBP2、BAG6、GMPS、PCNA、NME1、POP7、RCHY1、SMARCC1、HNRNPK、PTMA、NPM1、SNRPA、MYBBP1A、CDT1、HSPD1、TRIM28、PHF10、GRB7、HSPE1、DAXX、FAM136A、KPNA2、FUS、PNN、RFC3、HPRT1、PA2G4、SNRPE、RBPMS、PRMT5、PIAS2、BYSL、POLD2、LSM5、TDGF1、NOP56、EPPK1、TARBP2、MRE11A、CDC7、SRSF3、TNNI3、NUDT1、DIAPH1、PPID、CDA、GADD45A、MCM6、SNURF、CDC25C、TNFRSF8、STIP1、ACTA1、POLR1D、TUBA3C、RPA1、VAMP8、UNC119、COIL、BIK、PARP1、SP1、CHEK2、NLE1、RPA2、HDAC1、KPNB1、LSM7、TMSB4Y、HMGA1、POLR1C、LSM1、EXO1、MCM5、ITGB3BP、LSM6、UNG、PSMA6、CCNE1、SMNDC1、SET、FKBP3、TK1、CTBP2、POLQ、PLSCR1、GMNN、RND1、NUP153、PHGDH、SNRPB、HSPA14、HSPH1、TCOF1、ANP32A、PELP1、MBD2、HIST1H2BC、TMPO、SPAG5、DNMT3B、LCK、ARMC6、COPS6、MCM3、PPAP2C、LSM4、NME1-NME2、EWSR1、POLG2、BCL2、NFKBIB、SALL4、PXN、EXOSC8、HSPA2、HMGB1、RUVBL1、GOT2、PPM1B、ATIC、DHCR24、APEX1、RFC2、WDYHV1、NTHL1、EXOSC7、SNRPD1、DPPA2、MRPS12、FBL、POLD1、MCM10、EXOSC3、NOP58、TPX2、PAK3、HNRNPAB、ANXA2、BUB1B、SEPHS1、WDR77、LUC7L3、VASP、MCM4、PAK1、PMAIP1、PBX1、NOLC1、PCYT1B、NCL、ORC6、GPRIN2、ORC1、RAD51、HSPA8、ANXA3、NUP50、SNRPC、HAUS1、MATK、BIRC5、MYC、GEMIN6、PSIP1、DSCC1、STRBP、SMN1、EXOSC9、TOE1、GEMIN2、TRIP13、ORC2、MSH3、MNAT1、KIT、RFC5、FOXO4、AATF、RBM14、ZNF281、NPPB、RPA3、APOE、PFDN6、COPS3、CCND1、CXADR、MCM2、ANAPC1、SUMO1、SSB、HSP90AB1、TRAIP、PHC1、LRIF1、LSM3、SNRPN、RPP40、MSH2、FBP1、PFN1、OTX2、STX3、STXBP3、GTF2H2、ELAC2、TCERG1、ERCC5、PASK、ZNF593、PSME3、WRN、ARID3B、ERBB3、POP1、KAT7、PTPN6、SYNCRIP、SIRT1、SLC19A1、ARL4A、CEBPZ、MSH6、AURKA、BAK1、MTHFD1、HSPA9、MYBL2、POP5、RFC4、CHEK1、BCCIP、SOCS1、PHB、PMF1、MPP6、NOC2L、HDAC2、CENPE、RECQL4、CASP6、GNL3、SRSF2、BRIX1、MYB、RNMTL1、DHFR、FEN1、SNRPF、MUTYH、PRNP、MT1G、PSMD11、GAR1、DDX11、FUBP1、CDK7、WRAP73、CASP9、RASL11B、CHAF1A、CCNB1、CKS2、CCNA2、PPAN、WEE1、TP53、HMMR、TDP2、RAD9A或RAD54L。特别地，胎儿干细胞的特征还在于不存在成年分化细胞的谱系特异性基因的表达。

更具体地，当通过包括以下步骤的方法获得胎儿干细胞时是优选的：

a.将多能细胞群体向与患者特定癌症有关的途径分化，

b.扩增如此分化的细胞，

c.任选在扩增期间暴露于诱变剂，以诱导所述群体的细胞中的基因诱变，

d.验证至少70％的所述群体的细胞表达胎儿标志物，

e.任选验证所述群体的细胞表达存在于所述受试者癌细胞中的至少一种肿瘤相关抗原(TAA)或新抗原，

f.灭活所述细胞，以使所述细胞丧失其分裂能力。

当进行诱变时，优选诱变剂选自下组：化学诱变剂和辐射诱变剂(X射线、UV辐射)。特别地，诱变剂选自下组：ENU、活性氧族、脱胺剂、多环芳族烃、芳族胺和叠氮化钠。

在优选实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂选自下组：丙戊酸(VPA)、伏立诺他、左乙拉西坦、帕比司他、吉维司他、贝利司他、恩替诺特、莫塞替诺特、Practinostat、西达本胺、奎诺司他和阿贝司他。丙戊酸(VPA)、伏立诺他和左乙拉西坦是特别关注的。

当从iPS衍生的胎儿造血谱系获得包含灭活的胎儿干细胞的灭活细胞组合物时，并且当扩增后所述群体中的细胞在选自下组的至少一种基因中呈现至少0.1％的突变率时，是优选的：ARHGEF10L、TRIM66、NKAIN、ITGAGGT1、PDZD、MUC4、MUC2、NECAB3、MNT、GLTSCR1、COPZ2、ZFP36、MIB2、ABCC12、IGFN1、LRRK2、RIN3、GGT1、ANK2、HDAC7、MUC20、SDCCAG3、DNAI1、BTNL9、ABTB2、MC2R、DOCK4、FSD1L、CRP、PPP1R3A、SLC22A17、PITPNM1、A2M、CTDSP2、IFNA14、KIF5C、THNSL2、GTF3C3、NRXN1、MED26、FNBP1、TMCO3、ING1、ZNF292、RBL1、CD109、FOXRED2、PLIN2、ZNF85、SESN1、CENPE、BTBD7、STOM、ZNF317、TET1、LRBA、MED4、CDC27、BCR、HPRT1、NASP、和MSH2。这些基因通常在急性白血病，特别是急性髓细胞性白血病中表达。

在一个实施方案中，灭活的胎儿细胞组合物包含在iPS衍生的肾器官中的灭活的胎儿干细胞，其中所述群体中的细胞表达至少一种选自下组的胎儿抗原：TRAPPC4、MX1、ITSN1、DNAJC7、TAF15、TMEM88、CRYM、PRTG、TYRO3 C12ORF60、FJX1、ADM、FAM45A、ASS1、CA2、ZFHX4、CLVS1、NRG1、EZH2、SLC22A23、MSH5、FBN2、GTF2H2、LIX1、HESX1、FZD5、LRP2、RHOQ、NUAK2、ILF2、ACP6、RPL5、NMNAT1、ID1、U2AF2、KLHL14、CDH2、GREB1L、ARRDC4、THBS1、BMP4、LRIG3、SOX5、SF1、LGR4、MGEA5、BCORL1、STOM、GLIS3、ANXA1、KDM4C、SDC2、TMEM130、MAGI2、GLI3、HEY2、TPBG、ID4、MYLIP、ENC1、EGR1、CDH6、NPY1R、SEL1L3、LRAT、CLDN1、CEP97、BHLHE40、ARL5A、ARL4C、ZNF385B、LYPD1、B3GNT7、INSIG2、ARHGAP29、NOTCH2和IFI16。这些基因通常在与c-Met突变相关或不相关的原发性成人肾癌中表达。

在一个实施方案中，灭活的胎儿细胞组合物包含在iPS衍生的肺类器官中的灭活的胎儿干细胞，其中所述群体中的细胞表达至少一种选自下组的胎儿抗原：AIM2、AQP4、AURKA、BMP5、CDCA7、CEP55、CYP4B1、DACH1、EMP2、EPB41L4A、GJB2、MAOA、MELK、MKI67、NEBL、NFIA、PHF19、RNF144B、和UHRF1。这些基因通常在成年肺癌中表达。

本发明还涉及疫苗组合物，其包含：

a.灭活的胎儿干细胞群体，

b.刺激免疫应答和/或MHC I表达的试剂，和

c.佐剂，其是toll样受体3激动剂，特别是聚I:C或聚A:U。

特别地，灭活的胎儿干细胞包含诱变的胎儿干细胞。它可以用于治疗受试者的癌症，尤其是在癌症具有胎儿干细胞特征的情况下。

本发明的另一部分是试剂盒，其包含如上所述的疫苗组合物和提供免疫指导的信息单。

本发明还涉及(i)灭活的胎儿干细胞群体，(ii)激活MHC表达和/或免疫应答的化合物，和iii)toll样受体3激动剂的联合制剂，其通过同时、分别或顺次施用用于治疗受试者的癌症。当癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、淋巴瘤、急性和慢性淋巴样和髓样白血病、黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、头颈肿瘤以及实体瘤和造血系统恶性肿瘤的所有亚型时，可以使用该联合制剂。

还公开了其中向需要治疗的患者施用治疗量的组合物(灭活的胎儿细胞群体和佐剂)的治疗方法，并且是本发明的一部分。

在本申请中，所有基因均以本领域技术人员已知的名称表示。根据这些名称，可以使用任何搜索引擎(包括通才搜索引擎)或在专用于维护癌症基因库的数据库(例如COSMIC数据库，(Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer，由英国Sanger研究所开发)或癌症基因组图谱(TCGA，由美国NCBI维护)找到基因和蛋白序列。这些数据库重组了编码癌细胞中表达的抗原的各种序列。

因此，胎儿细胞是指已经丧失其多能性的细胞，因为其开始参与分化途径(内胚层、中胚层、外胚层)。

可以确定细胞群是否是胎儿细胞群体，因为这些细胞应表达胎儿标志物(见下文)而不表达多能性标志物。

根据本发明，群体包含大量细胞(至少0.5x10⁶个细胞，更优选至少1x10⁶个细胞，更优选至少2x10⁶个细胞或5x10⁶个细胞或大于5x10⁶个细胞。

为了确定细胞群体是否为胎儿细胞群体，必须：

(a)确定该群体的细胞基本上不表达多能性基因(或标志物)，

(b)确定由该群体的细胞表达的胎儿基因(或标志物)的存在。

在特定实施方案中，胎儿细胞群体的细胞使得

(a)没有细胞或小于10％的细胞表达典型地在未分化的多能自我更新细胞(胚胎干细胞或诱导多能干细胞)中表达的基因。这优选通过流式细胞术，更具体地通过FACS(荧光激活细胞分选)来确定

和

(b)群体中至少70％，更优选大于75％，更优选大于80％的细胞表达祖细胞/胎儿标志物，而不论群体是否为源自三个种系层或3D类器官组织的定型分化祖细胞的形式。

当小于10％的细胞表达成年组织标志物时，这也是优选的。成年组织标志物是在成年细胞中表达的标志物(蛋白质或基因)。

上述百分比与群体中表达给定标志物的细胞百分比有关。作为说明，典型地在未分化的多能自我更新细胞中表达的主基因的低表达(<10％)表明群体中小于10％的细胞表达所关注的基因，如下文进一步解释。

要提醒的是，表达的标志物在分化过程中发生变化。因此，一些与细胞的胎儿性质有关的标志物在分化过程中早期表达(即在丧失多能性后迅速表达)，而某些标志物在分化过程中晚期表达(即在成年细胞成熟之前)。缺乏这些胎儿标志物的表达表明细胞已经丧失其胎儿特性，并可能获得了表型，表明它们已经成熟为分化的成体细胞。

为了确定(a)多能性基因不被群体的细胞表达，可以使用基因表达和/或免疫细胞化学评估。目的是表明典型地在未分化的多能自我更新细胞(胚胎干细胞和诱导多能干细胞)中表达的主基因的缺乏或较低表达。

特别地，可以：

a)使用iPS细胞的群体作为多能性标志物的阳性对照，并且

b)比较一组多能性基因在靶标群体和iPS细胞群体中的表达水平。

当多能性基因的表达水平低于iPS细胞群体中这些基因的表达水平的10％，更优选地低于5％时，或当少于10％，更优选少于5％的细胞表达基因时，认为靶标群体的细胞不表达多能性基因。可以使用任何定量方法，例如RT PCR或流式细胞仪，或免疫组织标记。优选使用细胞的FACS(荧光激活细胞分选)。用这种方法，群体的少于10％的细胞应表达这些多能性基因。

多能细胞表达多种标志物。实际上，当细胞丧失其多能性特征时，由于这些多能性标志物的表达是相关的，因此它也将丧失这些标志物的表达。因此，尽管由多能细胞表达的多个基因(多能性基因)是本领域已知的，但是不必研究大量这种基因。

更详细地，优选研究选自下组的至少一种多能性基因的表达：NANOG、POU5F1(Oct4)、SSEA4、Tra-1-81和Tra-1-60。

在一个实施方案中，可以使用一种细胞内(例如OCT4或Nanog)和一种细胞外(例如SSEA-4或Tra-1-60或Tra-1-81)的联合以改进测量的准确性。

但是，也有可能观察这些基因中的三个、四个或甚至五个基因。

利用本领域可用的抗体，通过FACS方法可以容易地确定群体中表达这些标志物的细胞的百分比。甚至有可能在多重实验中进行此分析。

当研究多个基因时，通过取具有每个标志物的细胞百分比的平均值来确定群体中被认为是多能细胞的百分比。

作为示例，如果给定群体中表达基因(1)的细胞百分比为6％，而给定群体中表达基因(2)的细胞百分比为5％，则认为该群体包含5.5％的多能细胞(5％和6％的平均值)并且给定的群体将被视为已通过上述条件(a)。

为了确定群体中的细胞表达胎儿基因并满足条件(b)，当细胞进入分化途径之一时，有必要检测由细胞表达的基因(标志物、蛋白质或抗原)。

神经胎儿细胞：

早期神经外胚层祖细胞：TP63、MASH1、Notch1、Sox1、Sox2、Musashi 2、Musashi 1、Nestin、Pax6、MUC18、BMI1、Mash1、FABP7、Nucleostemin

造血胎儿细胞：

造血中胚层祖细胞：Brachyury(T)、MIXL1、cryptic、GATA1、LMO2、ACE、SCL(Tal1)、HoxA9、Fli1

肾胎儿细胞：

肾中胚层祖细胞：WT1、HOXD11、SIX2、SALL1、WT1、PAX2、OSR1、PAX8、LHX1、GATA3、HOXB7

肝胎儿细胞：

肝内胚层祖细胞：SOX17、HNF3B、HNF6、Fox-A2、HNF1B、GATA4、AFP、LGR5

胰腺胎细胞：

胰腺内胚层祖细胞：SOX17、Fox-A2、CXCR4、GATA4、HNF1B、HNF4A、PDX1、HNF6、PROX1、Ngn3、NeuroD1、PAX6、、SYP、SOX9、NKX2-2、NKX6-1、P48、LGR5、HB9

肠胎细胞：

肠内胚层祖细胞：CDX2、TCF-2、SOX 9、NMYC、ID2、SOX2、PAX8、Nkx2.1、LGR5

肺胎细胞：

肺内胚层祖细胞：CXCR4、SOX17、FOXA2、NKX2.1、PAX9、TBX1、SOX2 SOX9、ID2、Foxj1、Scgb1a1、Foxj1

甲状腺胎细胞：

甲状腺内胚层祖细胞：CXCR4、SOX17、FOXA2、Pax8、HHEX、Nkx2-1

其他胎细胞：

成肌细胞祖细胞：Pax7、Pax3、Myf5

软骨细胞祖细胞：Osteonectin、Sox9

成骨细胞祖细胞：Runx2、ALP、Osx、骨桥蛋白、骨钙蛋白。

上述基因都是本领域已知的，并且对于每种分化途径和每种组织类器官具有特异性。这些早期或晚期祖细胞中的胎儿基因在成年完全分化的细胞中不表达。如所示，它们的序列可以在广泛使用的公共数据库中找到。

因此，这些标志物是早期个体发育的标志物，并且反映了具有这些标志物的细胞不是完全成年的成熟细胞的事实。它们仍然是胎儿发育阶段的祖细胞，这意味着它们仍然可以产生各种类型的成熟细胞。

在本发明的上下文中，为了获得胎儿细胞群体，本领域技术人员应根据已知方法在分化途径之一中诱导多能细胞(例如胚胎儿干细胞或iPS细胞)的分化。

如上所述，通过检查至少90％的细胞中如上所述的标志物的表达丧失将验证多能性的丧失。

取决于本领域技术人员选择的分化途径，可以检查细胞群中上述的特定胎儿标志物的存在。

为此，本领域技术人员将使用FACS分析来测量表达给定途径的胎儿标志物的细胞百分比，并将通过验证至少70％的细胞表达这些标志物中的至少一种来计算百分比。使用多重FACS分析还可以鉴定表达一种以上标志物的细胞数量。换言之，这表示不表达任何这些标志物的细胞百分比不超过30％。也可以通过FACS分析容易地测定。

即使没有细胞分化途径的在先知识，也可以确定细胞群是否是胎儿细胞群体。

为了检查细胞群是否为根据本发明的胎儿细胞群体，首先应观察细胞是否表达一种或多种上述多能性标志物(以及在该群体中表达所述标志物的细胞百分比)。如果少于10％的细胞表达上述标志物，则本领域技术人员可以观察细胞群对胎儿标志物的表达。

细胞的形态/组织学可以向本领域技术人员提供关于细胞谱系提交的信息，从而可以选择一些标志物用于首次检查。但是，也可以在不预先了解细胞谱系提交的情况下验证细胞的胎儿自然阶段。

为此，可以将来自群体细胞的RNA提取、反转录、任选扩增、并应用于包含上述用于胎儿标志物的探针的任何DNA芯片或阵列。尤其可以使用低密度阵列(LDA)。这不仅可以测定胎儿标志物的存在，而且还使这些标志物合格，即可以测定群体细胞的分化途径(取决于被来自细胞群的RNA“打开”的探针)。

一旦知道了分化途径，就可以使用该特定细胞谱系分化途径的特定标志物进行FACS分析以量化在群体中表达这些标志物的细胞百分比。

长期以来提示，胎儿抗原可以在肿瘤细胞中表达(Ting et al,Proc Natl AcadSci USA.1972Jul；69(7):1664–1668)。

如本文所公开的胎儿细胞的该群体用于预防性或治疗性治疗受试者中的癌症。实际上癌症的发生和发展可能是由于受试者细胞中的突变引起或促进的，所述细胞诱导去分化并使其在分化途径中消退以达到新的“胎儿样”特征，并导致其增殖。因此，此类细胞表达胎儿标志物，而在成熟且完全分化的成年细胞中不表达。此外，由于这些细胞以高速率分裂，这诱导突变，其产生突变的抗原，也称为新抗原。实际上要注意，肿瘤细胞的胎儿抗原或新抗原通常在癌症之间共享，至少在源自相同分化途径(外胚层、内胚层或中胚层)的器官的癌症之间共享。

从外胚层途径，器官是表皮皮肤细胞、神经元、神经胶质细胞、神经嵴、色素细胞。

从中胚层途径，器官是心肌、骨骼肌细胞、肾脏(肾小管)、红细胞、平滑肌(肠内)。

从内胚层途径，可以引用肺细胞(特别是肺泡)、甲状腺细胞、胰腺细胞、肝细胞。

最后，癌细胞的微环境通常对免疫系统有利，因为它将抑制T淋巴细胞的作用。

将这些胎儿细胞群体的灭活的细胞，优选与HDACi或增加MHC-1分子表达的化合物一起施用，将可以诱导针对受试者(优选人，但是可以是另一种哺乳动物，例如狗、猫、牛或马)中群体细胞上存在的胎儿抗原的免疫应答，因此对抗肿瘤细胞，从而导致癌症消退。它对于实体瘤和血液肿瘤均有效。

实际上，癌细胞可以表达抗原(标志物)，例如本文公开和表征的胎群体细胞表达的抗原。

因此，胎儿细胞群体(胎群体)可用于引发患者的免疫系统，以使其能够充分和有效地对抗癌症。

鉴于不同的途径，胎儿细胞群体可用于治疗肺癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、血液癌、胃肠道癌、甲状腺癌、前列腺癌、脑癌(尤其是成胶质细胞瘤)、胃癌、肝癌、骨癌、卵巢癌。应当选择与待治疗癌症参与相同细胞分化谱系的胎儿细胞群体。

使用这种胎儿细胞群体使得可以递送在给定癌症中表达或在不同癌症中共同的至少10，更通常至少50，或至少100、500或甚至1000个胎抗原或新抗原。

胎细胞可含有易患家族性癌症的突变，这些突变表达由该突变去调节的胎基因(BRCA、cMET、RET、APC等)，并在谱系癌症中共享，例如，由包含c-Met突变的血细胞获得的iPS细胞可衍生为包含肾癌中存在的c-Met突变的肾脏类器官。

在制备胎细胞组合物时使用诱变剂(见下文)应在群体细胞基因中引入突变(例如错义或移码突变)，从而表达新抗原。

特别地，本发明人已经表明，获自慢性髓性白血病(CML)、经ENU突变并衍生于造血胎细胞的iPS细胞包含存在于急性髓性白血病(AML)中的抗原。

为了治疗患者，可以：

i)从此类癌症的活检中获得受试者癌症的抗原特异性特征，

ii)选择灭活的胎儿细胞群体，这些细胞群含有表达步骤i)中测定的至少一种抗原的细胞，

iii)将该群体与HDACi或增加MHC-I表达的试剂和TLR3激动剂一起向患者施用。

使用本领域中可用的工具，通过本领域已知的方法进行步骤i)。

所述特征尤其通过以下获得：

–测定在癌细胞中表达的基因(外显子组测序)，

-将基因与癌症特异性基因的数据库比较(尤其可以引用COSMIC数据库(英国Sanger研究所开发的癌症体细胞突变目录)或癌基因组图谱(TCGA，由美国NCBI维护)。这些数据库重新组合了编码癌细胞中表达的抗原的各种序列，

-选择存在于外显子组和数据库两者中的基因作为癌症的抗原特异性特征。

步骤ii)是通过进行胎儿细胞群体的外显子组并验证从胎儿细胞群体获得的外显子组中是否存在癌症的抗原特异性特征的至少一种基因来进行。

在另一实施例中，可以

i)从此类癌症的活检中获得受试者癌症的抗原特异性特征，

ii)选择灭活的胎儿细胞群体，这些细胞包含通常表达步骤i)中测定的至少一种抗原的细胞，

iii)将该群体的提取物与HDACi或增加MHC-I表达的试剂和TLR3激动剂一起向患者施用。

在该实施方案中，提取物选自总RNA、mRNA、DNA、蛋白质提取物、裂解物、冻干提取物、冻干或干燥细胞、外泌体、细胞外微泡和凋亡小体。

在另一实施例中，可以

i)从此类癌症的活检中获得受试者癌症的抗原特异性特征，

ii)选择灭活的胎儿细胞群体，这些细胞包含通常表达步骤i)中测定的至少一种抗原的细胞，

iii)在存在HDACi或增加MHC-I表达的试剂的情况下，向患者施用已经用ii)的群体或该群体的提取物体外引发的T细胞或抗原呈递细胞群体和TLR3激动剂。

在一个具体的实施方案中，通过以下获得所述群：

a.多能细胞群向与患者特定癌症有关的途径分化，其中多能细胞任选已经在诱变剂存在下扩增，

b.扩增如此分化的细胞，

c.任选地在扩增期间暴露于诱变剂，以诱导所述群体的细胞中的基因诱变，

d.验证至少70％的群体细胞表达胎儿标志物，

e.任选验证群体细胞是否表达存在于受试者癌细胞中的至少一种癌症或新抗原，

f.灭活所述细胞，以使细胞丧失其分裂能力。

使用根据本发明的胎儿细胞群体是特别令人感兴趣的。实际上，这些细胞包含易被癌细胞表达的多种胎抗原。

本发明还涉及开发和产生旨在用于治疗患者癌症的细胞群的方法。

该方法包括以下步骤：

a)可选地对癌症进行活检，

b)分析从患者的癌症活检回收的细胞以鉴定癌细胞表达的胎儿标志物和癌症标志物，

c)通过与患者特定癌症有关的途径分化多能细胞群(例如，如果患者患有肾癌，则将诱导肾脏途径的分化)，

d)任选地在分化的细胞群中引入突变：该步骤是任选的，但优选进行。其旨在增加由群体细胞表达的抗原的多样性，以改进一旦暴露于细胞免疫系统控制癌细胞的能力，即使存在其细胞突变。突变率可以通过检查细胞群体的一个或多个基因的序列来控制。可以鉴定群体中给定基因的突变序列的存在并量化，例如与群体中的基因序列进行比较。例如，给定基因的0.1％的突变率表明在该群体中针对该基因鉴定的序列的0.1％表现出突变。给定基因的突变率通过对该基因的DNA进行测序，并计算相对于天然序列((这是基本且主要存在的序列(因为主要序列为天然的“野生型”序列))而言包含突变的拷贝的百分比来计算。

e)任选验证所述群体的细胞表达存在于所述受试者的癌细胞中至少一种癌症或新抗原，

f)灭活所述细胞，以使细胞丧失其分裂能力。这是为了避免在向患者施用全部或部分细胞群后体内细胞的增殖。

一旦获得了细胞群体，就可以在HDACi或刺激MHC-I表达的化合物和TLR3激动剂的存在下，将其全部或部分施用于动物(优选哺乳动物，更优选人)。如上所述，在所有方法中，可以施用灭活的胎儿细胞群体或其提取物，或用该群或其提取物引发的T淋巴细胞或抗原呈递细胞。

在一个具体的实施方案中，步骤c)的多能细胞是已经从患者细胞发育而来的iPS细胞(诱导的多能干细胞)。当向患者施用胎细胞时，这可以降低交叉免疫的风险。实际上，非胎抗原不应被免疫系统识别，而胎抗原(存在于群体细胞和癌细胞上)则应被识别。

或者，本发明涉及用于治疗患者的方法，包括以下步骤：

a)任选地进行癌症活检，

b)分析从患者的癌症活检中回收的细胞，以鉴定癌细胞表达的胎儿和癌症标志物，

c)选择参与与患者特定癌症有关的分化途径的灭活的和任选诱变的胎儿细胞群体，

d)向患者施用细胞、HDACi或刺激或增加MHC-I表达的化合物以及TLR3激动剂。

在具体的实施方案中，胎细胞参与肺分化途径。因此，它们将表达上述用于肺的标志物。这些细胞特别适合于治疗肺癌。

在具体的实施方案中，胎细胞参与甲状腺分化途径。因此，它们将表达上述用于甲状腺的标志物。这些细胞特别适合于治疗甲状腺癌。

在具体的实施方案中，胎细胞参与肾脏分化途径。因此，它们将表达上述用于肾脏的标志物。这些细胞特别适合于治疗肾癌。

在具体的实施方案中，胎细胞参与造血分化途径。因此，它们将表达上述用于造血细胞的标志物。这些细胞特别适合于治疗血癌(白血病)。

在具体的实施方案中，胎细胞参与肠分化途径。因此，它们将表达上述用于肠的标志物。这些细胞特别适合于治疗胃肠癌。

在具体的实施方案中，胎细胞参与胰腺分化途径。因此，它们将表达上述用于胰腺的标志物。这些细胞特别适合于治疗胰腺癌。

在具体的实施方案中，胎细胞参与神经分化途径。因此，它们将表达上述用于神经元或脑的标志物。这些细胞特别适于治疗脑癌(特别是成胶质细胞瘤)。

在具体的实施方案中，胎细胞参与骨分化途径。因此，它们将表达上述用于骨的标志物。这些细胞特别适合于治疗骨癌。

该成分公开于WO2019101956中公开。

多能细胞群体

多能干细胞可以是胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)，优选是人来源的。但是，当受试者来自人以外的其他物种时，多能细胞则来自受试者的物种。

如本文所用，术语“人胚胎干细胞(hESC)”是指来自前囊胚期胚胎的分离的细胞。在另一个实施方案中，通过至少部分分化的细胞(例如，多能细胞)的去分化来制备hES细胞，并且在实践中是全能的。制备hESC的方法是众所周知的，例如在美国专利号5,843,780、6,200,806、7,029,913、5,453,357、5,690,926、6,642,048、6,800,480、5,166,065、6,090,622、6,562,619、6,921,632和5,914,268、美国公开申请号2005/0176707、国际申请号WO2001085917中有所教导。在本发明的上下文中，根据Chung等人2008中描述的技术，在不破坏胚胎的情况下产生人胚胎干细胞(hESC)。

如本文所用，术语“人诱导多能干细胞(hiPSC)”是指使用本领域已知的方法并通过Yamanaka最初公开的方法(特别是WO2012/060473、PCT/JP2006/324881、PCT/JP02/05350、US 9,499,797、US 9,637,732、US 8,158,766、US 8,129,187、US 8,058,065、US 8,278,104)，通过重编程程序从非多能细胞人工衍生的多能干细胞。简而言之，通过异位表达限定的因子(诸如Oct4、Sox2、Klf4和c-My或Oct4、Sox2、Lin28和Nanog)，将体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)。在一个具体实施方案中，诱导多能干细胞衍生自哺乳动物，特别是(但不限于)啮齿动物、猪、猫、狗、非人灵长类动物和人。

制备细胞群体

在一个具体实施方案中，保留细胞膜(从而通过MHC-I途径进行抗原呈递)。在一个具体实施方案中，如上文或下文所述，细胞是灭活的。在一个具体实施方案中，细胞是如下所述的人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)、胎儿干细胞、癌症干细胞、病毒感染的细胞或细菌细胞。在另一个实施方案中，免疫原性成分是包含已经通过目标抗原在体外引发(prime)的抗原呈递细胞(APC)的细胞组合物。该组合物是抗原呈递细胞疫苗，由抗原和抗原呈递细胞(APC)制成。抗原呈递细胞是在其表面上显示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞。在本发明的上下文中，可以引用优选的树突细胞(DC)，因为它们能够将抗原呈递给辅助细胞和细胞毒性T细胞、巨噬细胞或B细胞。这些APC可以是天然细胞或工程化细胞。特别地，可以引用Eggermont等(Trends in Biotechnology,2014,32,9,456-465)，其综述了开发人工抗原呈递细胞的进展。使用APC开发抗癌疫苗的方法是本领域已经广泛提出的，并且是本领域技术人员已知的。

在另一个实施方案中，免疫原性成分由在体外针对目标抗原引发(例如通过暴露于呈递目标抗原的抗原呈递细胞)的T细胞淋巴细胞的组合物组成。因此，该组合物能够在体内针对目标抗原产生免疫应答。这种策略可以称为“T细胞的过继转移”，并且已知这种过继转移的T细胞在体内持续存在很长一段时间并且容易在淋巴和血管隔室之间迁移(Bear等,J Biomed Biotechnol.2011；2011:417403；Melief等,J Clin Invest.2015；125(9):3401-3412)。

在一些实施方案中，将HDACi与含有免疫原性成分的疫苗组合物联合施用。所述施用可以是同时的、分别的或顺次的，如以下所公开的实施方案，其中免疫原性成分是i)人胚胎干细胞(hESC)，ii)人诱导多能干细胞(hiPSC)或iii)胎儿干细胞的群体的组合物。

如上文所述，本说明书强调了HDAC抑制剂(特别是丙戊酸)联合i)人胚胎干细胞(hESC)，ii)人诱导多能干细胞(hiPSC)或iii)胎儿干细胞的群体，因为这些细胞表达非常具有侵略性的癌症中同样存在的抗原和新抗原。因此，不管免疫原性成分如何，如上文以及下文所述，优选目标抗原是癌细胞表达的抗原或新抗原。

在一个具体实施方案中，免疫原性成分是细胞组合物，其中已经从多能干细胞和胎儿干细胞的灭活获得了i)人胚胎干细胞(hESC)，ii)人诱导多能干细胞(hiPSC)或iii)胎儿干细胞组合物的群体，如下文进一步详细公开。

在一个具体实施方案中，免疫原性成分是细胞组合物，其中细胞组合物已经通过体外分化多能干细胞(ESC和iPSC)或胎儿干细胞组合物而获得。更特别地，免疫原性成分是i)人胚胎干细胞(hESC)组合物，ii)人诱导多能干细胞(hiPSC)组合物或iii)胎儿干细胞组合物的群体。典型地，在以下专利申请中分别描述了用于产生多能细胞或胎儿干细胞群体的方法：WO2017/202949和EP17306635.8。

典型地，用于产生hESC或hiPSC的方法包括以下步骤：i)在维持细胞多能能力的条件下，在诱导步骤期间在所述群体中诱导抗原的MHC-I呈递的试剂的存在下，扩增多能细胞；ii)将扩增的细胞暴露于将使细胞灭活的灭活剂中，iii)回收并调节扩增的灭活细胞。

在一定条件下进行细胞扩增，以维持细胞的多能能力(培养基、温度)。这些培养条件是本领域已知的。维持细胞的多能能力将确保此类细胞将表达(并因此呈递)所有胚胎抗原，从而提高细胞通过MHC I途径在其表面呈递此类抗原的能力。

呈递在多能细胞表面的胚胎抗原越多，这些抗原中的至少一种也将呈递于癌细胞表面的可能性就越高，然后其将被已经由本发明的疫苗组合物引发的免疫系统识别和靶向。

因此，通过本文公开的方法获得的根据本发明的组合物的细胞的多能性的维持导致多种胚胎抗原的呈递，并且因此导致在本文公开的治疗方法中本发明的疫苗组合物的普遍效力。

在诸如维持多能性的条件下扩增细胞是本领域已知的。特别地，在迄今为止描述的所有iPSC扩增方案中都对此进行了描述(Shi Y and al,Nat Rev Drug Discovery2017；Chen KG and al Cell Stem Cell.2014)。优选使用以下条件：

人胚干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体是诱变细胞。

使用E8培养基或所有临床级ESC/iPSC培养基，并任选地补充VPA和/或诱变剂(诸如ENU，请参见下文)。

温度为37℃(缺氧或不缺氧条件下)

-使用添加VPA(从0.1mM-5mM)和/或ENU(0.1μg/ml-100μg/ml)和/或p53抑制剂和/或增强细胞存活的化合物(诸如Y-27632Rock抑制剂)的相同培养基每天更换培养基。

通常将细胞培养8周，使用酶解法(胶原酶、胰蛋白酶)通过每周一次的常规传代来维持90％的最佳密度。

在一个具体实施方案中，使本文公开的治疗方法中使用的多能细胞和胎儿干细胞是灭活的。术语“灭活的”及其语法变体在本文中用于指存活但已经不能增殖(即有丝分裂灭活)的细胞(例如，多能细胞或胎儿干细胞)。本领域技术人员可以使用本领域已知的技术，包括但不限于暴露于化学试剂、辐射和/或冻干。多能细胞和胎儿干细胞可以被灭活，使得在向受试者施用时多能细胞不能分裂，因此不能在受试者中形成畸胎瘤。应当理解，在多个细胞的情况下，并非每个细胞都需要不能增殖。因此，如本文所用，短语“灭活至足以防止受试者中畸胎瘤形成的程度”是指整个群体中的灭活度，使得在向受试者施用后不会形成畸胎瘤，因为如体外培养证实，经照射的多能干细胞或胎儿干细胞不再分裂。应当注意，即使实际上多个细胞中的一个或多个细胞能够在受试者中增殖，也可以假定宿主的免疫系统会在畸胎瘤形成之前破坏那些细胞。这种不能增殖和畸胎瘤形成的能力可以通过在具有功能性和非功能性免疫系统的小鼠中进行测试来证实。

在一些实施方案中，“灭活”细胞是被杀死的细胞，并且在一些实施方案中，灭活细胞是全细胞裂解物、多能干细胞或胎儿干细胞衍生的外泌体、富集的癌症干细胞新抗原、完全纯化的癌症干细胞新抗原、DNA RNA和蛋白质提取物、冻干的全细胞悬液、细胞裂解液级分(诸如膜部分、细胞质部分)或其组合。

当用hESC或hiPSC联合丙戊酸或其他HDACi进行小鼠疫苗接种时，灭活的多能干细胞或胎儿干细胞仍然能够刺激免疫应答。这种疫苗接种能够诱导针对4T1乳腺癌的有效免疫和抗肿瘤应答，而没有副作用和自身免疫性疾病的迹象。

典型地，为了使干细胞灭活，可以将它们暴露于致死剂量的辐射中(例如单次5-100Gy)。只要使细胞不存活，递送到细胞的精确辐射剂量和剂量长度并不重要。

该方法的恢复步骤包括一个(或多个)步骤的洗涤细胞培养物并将细胞重悬在任何合适的培养基中，诸如X-Vivo/Stemflex培养基或任何其他临床等级的细胞培养基。

细胞的调节可包括冷冻或冻干细胞，以便能够在使用前储存细胞组合物。

需要提醒的是多能细胞或胎儿干细胞是遗传上非常稳定的细胞。实际上，由于它们在胚胎发育过程中很早就存在并且它们必须繁殖以进行胚胎发育，因此重要的是这些细胞不太容易发生突变以便在胚胎中具有同质性。因此，考虑到它们的遗传含量时，多能细胞或胎儿干细胞群体中存在的细胞通常是非常同质的(即，该群体中大于95％的细胞具有相同的遗传背景)。

在制备iPSC或胎儿干细胞时，在多次传代期间出现一些细胞的选择性优势，这导致在晚期传代中呈现特定突变但细胞基因组的序列接近100％的iPSC克隆群。

然而，经过几次传代，iPSC与hESC一样稳定(Hussein SM和al，Nature 2011)。在长期培养后将获得具有极少遗传变化的培养诱导的(适应性)突变(Hussein SM and al,Bioessays,2012)。

但是，有利的是能够诱导细胞中的突变，以增加在侵袭性癌症中发现的经处理的细胞材料上的胎儿/胚胎新抗原的变异性。以此方式，将增加免疫系统产生针对这些突变细胞的T细胞并能够对抗癌细胞以及那些在肿瘤生长期间将经历随后变异的癌细胞的可能性。

这将有助于对抗由遗传变异的积累所导致的癌症，所述遗传变异来自癌症干细胞增殖期间的DNA复制错误和/或环境损害。这些变异包括引发致癌的癌症驱动突变和基因组不稳定突变。这种增加的基因组不稳定性导致克隆进化，进而导致选择耐药性增加的更具攻击性的克隆。

因此，在特定实施方案中，在将诱导所述细胞的基因突变的条件下扩增细胞。

因此，可以将细胞暴露于诱变剂，即改变生物体的遗传物质(通常是DNA)的物理或化学试剂，从而增加突变频率超过自然背景水平。

诱变剂可以选自物理诱变剂和化学诱变剂。

在物理诱变剂中，可以引用：

-可以导致DNA断裂和其他损伤的电离辐射，如X射线、γ射线和α粒子。尤其可以引用来自钴-60和铯-137的辐射。辐射射线的水平应远低于用于细胞灭活的射线，并且可由本领域技术人员设计；

-波长在260nm以上的紫外线辐射，如果不加以纠正，可能会导致复制错误；

-或放射性衰变，如DNA中的14C。

在化学诱变剂中，可以引用：

-活性氧族(ROS)，如超氧化物、羟基自由基、过氧化氢；

-脱氨基剂例如亚硝酸，其可通过将胞嘧啶转化为尿嘧啶从而引起转换突变；

-多环芳烃(PAH)，当被活化为二醇-环氧化物时可与DNA结合；

-烷化剂，例如乙基亚硝基脲(ENU，CAS号759-73-9)、芥子气或氯乙烯；

-芳香胺和酰胺，如2-乙酰氨基芴；

-来自植物的生物碱，例如来自长春花种的生物碱；

-溴和一些含有溴的化合物；

-叠氮化钠；

-博莱霉素；

-补骨脂素与紫外线辐射相结合；

-苯；

-碱基类似物，其可在复制过程中替代DNA碱基并引起转换突变；

-嵌入剂，如溴化乙锭、普罗黄素、柔红霉素；

-金属，如砷、镉、铬、镍及其可能具有致突变性的化合物。

发明人已经表明，可以设计培养条件，使得可以在多能干细胞或胎儿干细胞中诱导DNA复制错误而不触发DNA损伤依赖性细胞凋亡。

这特别出乎意料，因为如上所述，多能细胞或胎儿干细胞天然非常稳定，因此在胚胎发生早期应引入尽可能少量的突变。由此得出，DNA修复机制在这些细胞中非常有效，从而纠正大多数缺陷和/或在不可能纠正这些缺陷的情况下诱导细胞凋亡。

在一个实施方案中，将起始群体的多能细胞(诸如ESC或IPSC)在允许多能的培养基介质(如本领域中已知的)中扩增并维持，以在迭代传代期间保留多能阶段。在这些情况下，通常会观察到少量的外显子组突变(每个外显子组5-10个突变)。

然后用诱变化合物方法在体外培养多能细胞或胎儿细胞以诱导和增加多能干细胞或胎儿细胞(诸如上述细胞)内的基因组不稳定性，例如上面列出的那些。作为双链断裂(DSB)的标记物，γH2AX磷酸化证实了DNA损伤。ESC或IPSC中γH2AX阳性细胞的比例和γH2AX灶的频率均增加，以及作为基因组不稳定性标志物的微核数量较高。

在一个具体实施方案中，试剂是博来霉素、ENU、烷基化剂、放线菌素D、ROS调节剂、UV、H2O2、电离辐射(γ射线、X射线)，它们都允许诱导和增强在培养过程中积累的多能干细胞或胎儿细胞的突变率。

在一个具体实施方案中，已证明N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)在剂量<50μg/ml下长期培养至少7-60天期间会在经处理的多能干细胞或胎儿干细胞中产生新的突变并增强新抗原的水平。这些突变与癌症中报道的那些相似。

在一个具体实施方案中，本发明的方法，其中诱变剂选自下组：化学诱变剂和辐射诱变剂(X射线、UV辐射)，其中诱变剂选自下组：ENU、反应性氧类、脱氨剂、多环芳烃、芳族胺和叠氮化钠。在该实施方案中，将获得多能干细胞或胎儿干细胞的群体，其中所述细胞具有随机突变(通常因细胞而异，从而导致异质群体)，特别是在癌症相关的新抗原中。

因此，有可能以长期培养时来自选择性优势的高突变率，在多能细胞或胎儿细胞增殖过程中积累多种突变，以响应DNA损伤，同时保持细胞的多能性，特别是当在培养基中用HDACi培养细胞时。培养物中HDACi的存在可保持增加的活性组蛋白(H3K4me3和H3K9ac)和多能性的表观遗传标志，以响应诱导DNA损伤以及传代过程中的复制和增殖速率。

在本文所述的组合物和方法的另一个实施方案中，通过用能促进高水平基因组不稳定的基因对细胞进行基因修饰，在多能或胎儿干细胞中诱导突变。特别地，可以使用适当的抑制剂如NER/BER/DSBR/MMR抑制剂来删除或降低参与DNA修复和复制的基因或信号传导途径的活性。诱导与DNA损伤增加相关的基因组不稳定性的这些方法可以通过使用灭活或敲低DNA修复相关基因或信号传导途径的“载体”或“遗传修饰”进行，例如DNA聚合酶δ复合物、错配修复(MMR)、碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、同源重组(HR)、DSBR或NEJH。DNA修复基因的其他实例是DNApkC、Ku70、Rad 51、Brca1或Brca2。

在其他实施方案中，修饰多能干细胞或胎儿干细胞以通过遗传修饰或化学p53(例如Pifithrin-mu、Nutlin-3、巢蛋白)，或通过使用增强细胞存活的化合物如Y-27632(一种p160-Rho相关卷曲激酶(ROCK)的选择性抑制剂)来抑制细胞凋亡相关基因如p53。

在一个具体实施方案中，多能细胞群体由从体细胞(例如从已经包含与以下相关的基因组改变的患者分离的细胞)产生的诱导多能干细胞(iPSC)组成：

i)DNA修复疾病，包括例如共济失调毛细血管扩张症、布卢姆综合征、Cockayne综合征、范可尼贫血症、Werner综合征、着色性干皮病、奈梅亨破损综合征；

ii)具有基因组不稳定性的遗传性家族癌症综合征，如林奇综合征(具有MMR基因(包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS1和PMS2)突变的遗传性非息肉性结直肠癌)、具有TP53基因或CHEK2突变的Li-Fraumeni、具有BRC1/2基因缺失或突变的遗传性乳腺癌和卵巢癌(HBOC)综合征、具有APC基因突变的家族性腺瘤性息肉病(FAP)；

iii)诱导基因组不稳定性的体细胞，如在CML中易位(T 9；22)。

在一个具体实施方案中，突变的多能细胞群体由诱导多能干细胞组成，并由含有与疾病相关的基因组改变的体细胞产生。典型地，基因组改变可以是易位(T9:22)、缺失(BRCA1/2)或突变(BRCA，RET)。

在一个具体实施方案中，多能干细胞群体由从癌细胞系或患者特异性癌细胞产生的iPSC组成。

在另一个实施方案中，通过使用“载体”对ESC、IPSC或胎儿干细胞群体进行基因修饰以过表达多种非随机的癌症干相关新抗原。在具体实施方案中，通过“基因组编辑”技术对ESC、IPSC或胎儿干细胞群体进行基因修饰以在多能干细胞或胎儿干细胞中表达多种突变和癌症干细胞特异性新抗原(至少5种)。本发明提供了组合物和方法，该组合物和方法通过RNA指导的多重基因组编辑、修饰、表达抑制和其他基于RNA的技术，通过引入其多种新抗原来提供ESC、IPSC或胎儿干细胞。

本文使用的术语“基因组编辑”是指RNA介导的遗传操作，特别包括用于cas9介导的基因组编辑的向导RNA。该向导RNA(gRNA)与内切核酸酶cas9一起转染。向导RNA提供支架和与靶标互补的间隔子序列。在另一个实施方案中，遗传操作序列可以是设计用于根据本领域的标准方法通过使用Crispr-Cas 9系统进行基因沉默的siRNA或microRNA序列。制备和使用Crispr-Cas系统的组合物和方法是本领域已知的，并且特别描述于U.S.8,697,359中。

在一个具体实施方案中，用烷基化剂处理多能细胞胎儿干细胞的群体。如本文所用，术语“烷化剂”是指将一个或多个烷基从一个分子添加到另一个分子的物质。这种处理在新抗原中产生新的突变，通过增加TIL的寡克隆扩增和Th1/Th2细胞免疫来提供优异的免疫应答。

在本发明中，烷化剂选自以下：氮芥、亚硝基脲、烷基磺酸盐、三嗪、乙烯亚胺及其组合。氮芥的非限制性实例包括盐酸氮芥(Lundbeck)、苯丁酸氮芥(GlaxoSmithKline)、环磷酰胺(Mead Johnson Co.)、苯达莫司汀(Astellas)、异环磷酰胺(BaxterInternational)、美法仑(Ligand)、美法仑氟哌嗪(Oncopeptides)及其药学上可接受的盐。亚硝基脲的非限制性实例包括链佐星(Teva)、卡莫司汀(Eisai)、洛莫司汀(Sanofi)及其药学上可接受的盐。烷基磺酸盐的非限制性实例包括白消安(Jazz Pharmaceuticals)及其药学上可接受的盐。三嗪的非限制性实例包括达卡巴嗪(Bayer)、替莫唑胺(Cancer ResearchTechnology)及其药学上可接受的盐。乙烯亚胺的非限制性实例包括噻替派(BedfordLaboratories)、六甲蜜胺(MGI Pharma)及其药学上可接受的盐。其他烷化剂包括ProLindac(Access)、Ac-225 BC-8(Actinium Pharmaceuticals)、ALF-2111(AlfactInnovation)、曲磷胺(Baxter International)、MDX-1203(Bristol-Myers Squibb)、硫尿基丁腈(CellCeutix)、二溴硝基苯(Chinoin)、二溴卫矛醇(Chinoin)、尼莫司汀(DaiichiSankyo)、葡膦酰胺(Eleison Pharmaceuticals)、HuMax-TAC和PBD ADC组合(Genmab)、BP-C1(Meabco)、苏消安(Medac)、硝呋替莫(Metronomx)、甲磺英丙舒凡(Mitsubishi tanabePharma)、雷莫司汀(Mitsubishi tanabe Pharma)、ND-01(NanoCarrier)、HH-1(NordicNanovector)、22P1G细胞和异环磷酰胺组合(Nuvilex)、雌莫司汀磷酸盐(Pfizer)、泼尼莫司汀(Pfizer)、lurbinectedin(PharmaMar)、曲贝替定(PharmaMar)、altreatamine(Sanofi)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)、福莫司汀(Servier)、奈达铂(Shionogi)、庚铂(Sk Holdings)、阿哌喹酮(Spectrum Pharmaceuticals)、SG-2000(Spirogen)、TLK-58747(Telik)、拉莫司汀(Vion Pharmaceuticals)、甲基苄肼(Alkem Laboratories Ltd.)及其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，烷化剂选自盐酸氮芥(Lundbeck)、苯丁酸氮芥(GlaxoSmithKline)、环磷酰胺(Mead Johnson Co.)、链佐星(Teva)、达卡巴嗪(Bayer)、噻替派(Bedford Laboratories)、六甲蜜胺(MGI Pharma)、其药学上可接受的盐，以及它们的组合。在另一个实施方案中，烷化剂选自ProLindac(Access)、Ac-225 BC-8(ActiniumPharmaceuticals)、ALF-2111(Alfact Innovation)、苯达莫司汀(Astellas)、异环磷酰胺(Baxter International)、曲磷胺(Baxter International)、MDX-1203(Bristol-MyersSquibb)、替莫唑胺(Cancer Research Technology)、硫尿基丁腈(CellCeutix)、二溴硝基苯(Chinoin)、二溴卫矛醇(Chinoin)、尼莫司汀(Daiichi Sankyo)、卡莫司汀(Eisai)、葡膦酰胺(Eleison Pharmaceuticals)、HuMax-TAC和PBD ADC组合(Genmab)、白消安(JazzPharmaceuticals)、美法仑(Ligand)、BP-C1(Meabco)、苏消安(Medac)、硝呋替莫(Metronomx)、甲磺英丙舒凡(Mitsubishi tanabe Pharma)、雷莫司汀(Mitsubishi tanabePharma)、ND-01(NanoCarrier)、HH-1(Nordic Nanovector)、22P1 G细胞和异环磷酰胺组合(Nuvilex)、美法仑氟哌嗪(Oncopeptides)、雌莫司汀磷酸盐(Pfizer)、泼尼莫司汀(Pfizer)、lurbinectedin(PharmaMar)、曲贝替定(PharmaMar)、altreatamine(Sanofi)、洛莫司汀(Sanofi)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)、福莫司汀(Servier)、奈达铂(Shionogi)、庚铂(Sk Holdings)、阿哌喹酮(Spectrum Pharmaceuticals)、SG-2000(Spirogen)、TLK-58747(Telik)、拉莫司汀(Vion Pharmaceuticals)、甲基苄肼(AlkemLaboratories Ltd.)、其药学上可接受的盐，及其组合。

在特定的实施方案中，用N-乙基N-亚硝基脲(ENU，CAS号759-73-9)处理多能细胞或胎儿干细胞群体。ENU具有以下化学式C₃H₇N₃O₂，它是一种通过将乙基转移到核酸中的核碱基的高效诱变剂。

如上所述，诱变剂的目的是在扩增过程中在多能细胞或胎儿细胞的基因中引入随机突变(在细胞的复制和分裂过程中引入突变)。多能干细胞或胎儿干细胞的群体获得了可以提供生长优势的突变，并被选择用于促进培养适应性。ESC、IPSC或胎儿干细胞的传代经历高水平的选择压力，并且在扩增时，可以有利地选择多个克隆突变的群体。

要注意的是，由于多能细胞非常稳定，因此可能必须长时间进行诱变剂的施用。作为说明，当使用ENU时，其可以施用至少7天，更优选至少15天，更优选至少20天，更优选至少30天，更优选至少40天，更优选至少50天或甚至至少60天。施用诱变剂后，洗涤细胞(如果诱变剂是化学试剂)，并可以在有利于MHC-I表达的试剂(特别是HDACi)存在下被进一步扩增。该试剂优选也存在于诱变剂的施用过程中。

因此，可以观察和检查诱变剂将在多能细胞表达的某些胚胎发生基因中诱导突变(即非同义、无义、移码、StopGain、剪接变体、CNV、SNV)，从而增加这些抗原的多样性(整个基因组中的新的新抗原)。因此，这将增加疫苗组合物具有增强的免疫原性的可能性，能够刺激针对存在快速和频繁突变的侵袭性癌症的广泛免疫应答。

对于癌细胞的克隆扩增伴随肿瘤细胞表达的抗原突变而发生的某些癌症，可能确实难以获得有效的免疫应答。因此，免疫应答将取决于癌症的突变负荷。因此，通过使用诱变剂在多能细胞群体或胎儿干细胞中产生随机突变将导致突变的胚胎抗原的表达，并增加接种疫苗后呈递给免疫系统的抗原的多样性。

因此，已经存在针对突变抗原的引发的T细胞，所述突变抗原在癌细胞分裂期间将出现在这些细胞中，这将加速并改善针对这些细胞的免疫应答。

在一个具体的实施方案中，对多能干细胞或胎儿干细胞群体进行遗传修饰以过表达化合物，所述化合物通过在多能细胞基因组或胎儿干细胞基因组内的基因整合来刺激免疫应答。通常，在第一步中，分离并扩增多能干细胞或胎儿干细胞群体。在第二步中，将目标基因包装到整合病毒载体(例如逆转录病毒或慢病毒)中。在第三步中，将含有目标基因的整合病毒载体转移到多能干细胞群中并分化为胎儿干细胞。

在一个具体的实施方案中，用刺激MHC表达和/或免疫应答的蛋白质基因修饰多能细胞或胎儿干细胞群体。这些化合物选自干扰素α(IFN-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、其功能片段及其组合。

本发明考虑的干扰素(IFN)包括常见的IFN类型，IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN可以直接作用于癌细胞，例如，通过减缓它们的生长、促进它们发育成具有更正常行为的细胞和/或增加它们的抗原产生，从而使癌细胞更容易被免疫系统识别和破坏。IFN还可以间接作用于癌细胞，例如，通过减慢血管生成、增强免疫系统和/或刺激自然杀伤(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞。重组IFN-α可作为Roferon(Roche Pharmaceuticals)和Intron A(ScheringCorporation)商购获得。

本发明考虑的白细胞介素包括IL-2、IL-4、IL-11和IL-12。可商购获得的重组白细胞介素的实例包括

(IL-2；Chiron Corporation)和

(IL-12；Wyeth Pharmaceuticals)。Zymogenetics，Inc(Seattle，Wash)目前正在测试重组形式的IL-21，其也预期用于本发明的组合。

本发明考虑的集落刺激因子(CSF)包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF或非格司亭)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或沙格司亭)和促红细胞生成素(阿法依伯汀、达比波廷)。用一种或多种生长因子处理可以帮助在经历传统化疗的受试者中刺激新血细胞的产生。因此，用CSF处理可有助于减少与化疗相关的副作用，并且可允许使用更高剂量的化疗剂。各种重组菌落刺激因子可商购获得，例如Neupogen(G-CSF；Amgen)、Neulasta(pelfilgrastim；Amgen)、Leukine(GM-CSF；Berlex)、Procrit(促红细胞生成素；OrthoBiotech)、Epogen(促红细胞生成素；Amgen)、Arnesp(促红细胞生成素)。

如本文所用，术语“佐剂”是指能够增强针对免疫原性抗原的免疫应答并且能够增加抗原呈递细胞的募集的任何化合物。这种佐剂能够激活APC并增强抗原呈递、诱导炎性细胞因子的表达和促炎环境、引发天然T细胞以驱动获得的免疫力、调节适应性免疫应答、通过在抗原呈递过程中表现出免疫刺激作用来充当免疫增强剂和通过诱导APC上共刺激分子的表达、改进下游T辅助细胞因子谱的质量以及抗原特异性T辅助细胞群体的分化，从而从B细胞产生针对这些抗原的特异性抗体。典型地，佐剂选自但不限于下组：i)toll样受体(TLR)的激动剂：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4(例如GLA、MPLA)、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8(egVTX-2337)、TLR9(egIC-31；IM-2125、SD-101、ODN2395、ODN 1826)、TLR10 TLR11、C型凝集素样受体；视黄酸可诱导的基因样受体、核苷酸结合低聚域样受体、含有核苷酸结合域和富含亮氨酸的重复序列(LRR)的蛋白质(NLR)、RIG-I样受体(RLR)；ii)GM-CSF、IL2、IFNα-2a、IFNα-2b；iii)铝盐、氢氧化铝(alum)、IFA，

QS21(例如QS21STIMULON)、QS21皂苷、QS21异麦角蛋白、MPL+Alum

脂质体、海藻糖-6,6'、地贝酸盐(TDB)、完全弗氏佐剂(CFA)、脂多糖(LPS)、Pam3CysSerLys4(Pam3CSK4)。在一个具体实施方案中，佐剂是TLR3激动剂。如本文所用，术语“TLR3”是指Toll样受体3。TLR3激动剂是本领域技术人员众所周知的。它是指能够激活TLR3多肽以诱导全部或部分受体介导的应答的亲和剂(即与靶分子结合的分子)。例如，TLR3激动剂直接或间接诱导TLR3二聚/寡聚并触发TLR3介导的信号传导。如本文所用的TLR3激动剂可以但不是必须结合TLR3多肽，并且可以与或可以不与TLR3多肽直接相互作用。它们包括双链核糖核酸(dsRNA)，诸如：用于聚腺苷酸-聚尿苷酸的Poly(A:U)、、用于聚肌苷-聚胞苷酸的Poly(I:C)、聚(ICLC)

PolyI：PolyC12U

或RGIC dsRNA，诸如RGIC 100.1

例如，该TLR3激动剂描述于专利US8409813(特别是在第九至第二十二栏)、专利EP2281043、专利申请WO2015/091578以及专利申请WO2008/109083中。特别地，RGIC100.1描述于WO2015/091578的实施例1和2中。

在一个具体实施方案中，TLR3激动剂是聚(A:U)。

如本文所用，术语“施用”是指将机体外存在的物质(例如，组合制剂)注射或通过物理递送至受试者的行为，例如通过粘膜、皮内、静脉内、皮下、肌肉内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当正在治疗疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作之后施用物质。当预防疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作之前施用物质。如本文所用，术语“同时施用”是指通过相同途径并同时或基本上同时施用2种活性成分。术语“分别施用”是指同时或基本上同时通过不同途径施用2种活性成分。术语“顺次施用”是指在不同时间施用2种活性成分，施用途径相同或不同。

在具体实施方案中，将疫苗组合物(多能干细胞或胎儿干细胞+刺激MHC呈递的试剂+佐剂)皮下注射。注射可以在同一注射器或在分开的注射器中在相同的注射点或在不同的注射点同时、顺次、分别进行。

在特定的实施方案中，通过口服途径施用随访治疗(施用刺激MHC I和/或免疫系统的化合物，例如HDACi，特别是VPA)。

“治疗有效量”是指用于赋予受试者治疗益处所必需的活性剂的最小量。例如，对受试者的“治疗有效量”是这样的量，其诱导、缓解或引起与病症相关的病理症状、疾病进展或生理状况的改善或对疾病的抵抗。应当理解，本发明化合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合或巧合使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，本领域技术人员已知以低于实现所需治疗效果所需的水平开始化合物的剂量并逐渐增加剂量直至达到所需效果。然而，产品的每日剂量可在0.01-1,000mg/成人/天的宽范围内变化。通常，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg活性成分，用于对待治疗的受试者的剂量进行症状调整。药物通常含有约0.01mg至约500mg活性成分，优选1mg至约100mg活性成分。通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重，特别是每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供有效量的药物。

疫苗组合物包括旨在使受试者产生针对一个或多个目标抗原的免疫应答的免疫原性成分。目标抗原是期望免疫应答的任何抗原，包括来自自身的(例如来自癌细胞的抗原)或外源的任何肽、蛋白质，例如细菌、病毒或寄生虫蛋白，其他种类的抗原，例如核酸、糖、脂多糖等。

本文所述的方法还包括在施用疫苗组合物后几天施用HDACi的步骤。HDACi的这种连续施用可用于将微环境变化维持足够长的时间以使免疫细胞能够“接管”肿瘤。通常，HDACi的这种进一步连续施用在于在施用疫苗后至少三天，并且长达一个月，每天施用足够剂量的HDACi。然而，优选进一步施用HDACi至少一周，更优选至少或约两周。

根据本发明的方法，其中所述治疗是预防性治疗。

药物和疫苗组合物

如上所述的多能干细胞或胎儿干细胞的群体可以用于疫苗组合物中。因此，另一方面，本发明涉及疫苗组合物，其包含i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)诱导抗原的MHC-1呈递的试剂(例如HDACi)和iii)佐剂。

特别地，使人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的这种群体灭活，并且任选地将其突变以抑制其增殖能力并任选地获得细胞提取物。

在一个具体实施方案中，根据本发明的疫苗组合物，其中人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体是诱变的细胞。

在一个具体实施方案中，所述刺激免疫应答的试剂是HDACi(以0.2mM-4mM的剂量使用)。在另一个实施方案中，本发明上下文中的佐剂是TLR3激动剂。

在一个具体实施方案中，HDACi是VPA。

在一个具体实施方案中，TLR3激动剂是Poly(A:U)。

本发明还涉及含有该疫苗组合物的装置(诸如注射器)，其可用于同时施用HDACi化合物、佐剂和细胞组合物。

在一个具体实施方案中，本发明的疫苗组合物用于治疗患有癌症的受试者。

这种疫苗组合物可以用作针对癌细胞(表达免疫原性新抗原、驱动子或乘客突变的癌细胞；祖细胞作为表观遗传去分化的细胞，表达胎儿和胚胎基因的肿瘤引发细胞)的治疗性疫苗以治愈患者，或用作预防性疫苗以预防这种癌症发生，尤其是在易患这些癌症的患者中。例如，易感基因是(还可参见Lindor et al,2008Journal of the NationalCancer Institute Monographs,No.38,Concise Handbook of Familial CancerSusceptibility Syndromes,Second Edition)：

乳腺/卵巢：BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD51；

林奇综合征：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM；

遗传性乳头状肾细胞癌：FH、MET；

考登病：PTEN、PIK3CA；

范可尼病：FANC；

Von Hippel-Lindau病：VHL；

恶性黑素瘤：CDKN2A、MITF、BAP1、CDK4；

内分泌肿瘤：MEN1、RET、CDKN1B；

神经纤维瘤病：NF1、NF2、LZTR1、SMARCB1、SPRED1；

遗传性嗜铬细胞瘤副神经节细胞瘤：SDH、TMEM127、MAX、EPAS1；

家族性腺瘤性息肉病：APC、MUTYH；

视网膜母细胞瘤：RB1；

Birt-hogg-dubé综合征：FLCN；

布卢姆综合征：BLM；

Carney综合征：PRKAR1A；

Gorlin综合征：PTCH1；

Li-Fraumeni综合征：TP53、CHEK2；

奈梅亨综合征：NBN；

Peutz-Jeghers综合征：STK11；

家族性幼年性息肉病：BMPR1A、SMAD4；

着色性干皮病:XP。

该列表是非限制性的。

在某些实施方案中，癌症干细胞疫苗产品包含来自人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的冻干后的细胞裂解物的混合物、富集的多癌干新抗原、纯化的癌干新抗原、衍生自胎儿干细胞的外泌体、DNA、RNA、蛋白质或多种多肽的混合物。这些是如上所述的免疫原性试剂，其在HDACi存在下配制。

在另一个实施方案中，将癌症干细胞疫苗产品与用作佐剂效应子的来自人胚胎干细胞(hESCs)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的工程化辐射群体的上清液GMP培养基混合。

在一个具体实施方案中，使该组合物中的人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞胎儿细胞的衍生群体灭活(即不能再增殖)。

本发明的人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的衍生群体的组合物易于通过上述任何方法获得。

应当指出，该组合物中人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的衍生群体是遗传异质的，当使用诱变剂时携带特定的体细胞突变，并因此与根据本领域已知的方法生产的并且在遗传上更同质的人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞胎儿细胞组合物的衍生群体不同。

在特定的实施方案中，同时使用HDACi和DNA甲基转移酶抑制剂两者。实际上，已经表明，VPA和5-氮杂胞苷(核苷胞嘧啶的类似物，其可以整合入DNA和RNA)的组合使用导致新的抗胚胎抗原的再表达的协同作用。

HDACi以治疗有效量施用。对于VPA，其可以是10-15mg/kg/天，至多60mg/kg/天。VPA的血浆水平应优选在通常可接受的治疗范围内(50-100μg/mL)。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的方法还包括放疗、靶向疗法、免疫疗法或化疗中的一种或多种。通常，医生可以选择向受试者施用作为组合制剂的i)胎儿干细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物，以及放疗、靶向疗法、免疫疗法或化疗。

在一些实施方案中，向受试者施用作为联合制剂的i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和iii)佐剂，以及化疗剂。

术语“化疗剂”是指有效抑制肿瘤生长的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲密胺；多聚乙酰(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(具体是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、甲二氯二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素、尤其是卡奇霉素11和卡奇霉素211，参见例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、争光霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧基-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、奎那霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如迪诺特宁、氨甲蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；类美登素，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙酰肼；甲基苄肼；

雷佐生；根霉素)；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、粘液霉素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(

Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(

Rhone-Poulenc Rorer、Antony、France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；和以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬(keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素剂，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方案中，向受试者施用作为联合制剂的i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和iii)佐剂，以及靶向癌症疗法。

靶向癌症疗法是通过干扰参与癌症生长、进展和扩散的特定分子(“分子靶标”)来阻断癌症生长和扩散的药物或其他物质。靶向癌症疗法有时被称为“分子靶向药物”、“分子靶向疗法”、“精准药物”或类似名称。在一些实施方案中，靶向疗法在于向受试者施用酪氨酸激酶抑制剂。术语“酪氨酸激酶抑制剂”是指充当受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择性或非选择性抑制剂的多种治疗剂或药物中的任何一种。酪氨酸激酶抑制剂及其相关化合物是本领域熟知的，并描述于通过引用整体并入本文的美国专利公开2007/0254295中。本领域技术人员将理解，与酪氨酸激酶抑制剂相关的化合物将再现酪氨酸激酶抑制剂的作用，例如，相关化合物将作用于酪氨酸激酶信号传导途径的不同成员以产生与那个酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂相同的效果。适用于本发明实施方案的方法的酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物的实例包括但不限于：达沙替尼(BMS-354825)、PP2、BEZ235、沙拉替尼、吉非替尼(Iressa)、舒尼替尼(Sutent；SU11248)、厄洛替尼(Tarceva；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、坎尼替尼(CI 1033)、塞马西尼(SU5416)、瓦塔拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、伊马替尼(Gleevec；STI571)、来氟米特(SU101)、凡德他尼(Zactima；ZD6474)、贝伐单抗(avastin)、MK-2206(8-[4-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-1,2,4-三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮盐酸盐)衍生物、其类似物，及其组合。适用于本发明的另外的酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物描述于，例如，美国专利公开2007/0254295、美国专利号5,618,829、5,639,757、5,728,868、5,804,396、6,100,254、6,127,374、6,245,759、6,306,874、6,313,138、6,316,444、6,329,380、6,344,459、6,420,382、6,479,512、6,498,165、6,544,988、6,562,818、6,586,423、6,586,424、6,740,665、6,794,393、6,875,767、6,927,293和6,958,340，所有这些都通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是已经口服施用的小分子激酶抑制剂，并且已经是至少一个I期临床试验的对象，更优选至少一个II期临床试验，甚至更优选至少一个III期临床试验，最优选由FDA批准用于至少一种血液学或肿瘤学适应症。此类抑制剂的实例包括但不限于吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、BMS-599626(AC-480)、来那替尼、KRN-633、CEP-11981、伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、AZM-475271、CP-724714、TAK-165、舒尼替尼、瓦他拉尼、CP-547632、凡德他尼、博舒替尼、来他替尼、坦度替尼、米哚妥林、恩扎妥林(Enzastaurin)、AEE-788、帕唑帕尼、阿西替尼、莫塔塞尼、OSI-930、西地尼布、KRN-951、多韦替尼、Seliciclib、SNS-032、PD-0332991、MKC-1(Ro-317453；R-440)、索拉非尼、ABT-869、布立尼布(BMS-582664)、SU-14813、替拉替尼、SU-6668、(TSU-68)、L-21649、MLN-8054、AEW-541和PD-0325901。

在一些实施方案中，向受试者施用作为联合试剂的i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和iii)佐剂(特别是TLR3激动剂)，以及免疫检查点抑制剂。

如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调节T细胞活化或功能。已知许多检查点蛋白质，例如CTLA-4及其配体CD80和CD86；和PD1及其配体PDL1和PDL2(Pardoll，Nature ReviewsCancer 12：252-264,2012)。这些蛋白负责T细胞反应的共刺激性或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调节并维持自身耐受性以及生理免疫反应的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或衍生自抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自以下的抗体：抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗)、抗PD1抗体(例如尼沃单抗、派姆单抗)、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗BTLA抗体和抗B7H6抗体。抗CTLA-4抗体的实例描述于美国专利号5,811,097、5811097、5855887、6051227、6207157、6,682,736、6,984,720和7,605,238。一种抗CTLA-4抗体是曲美莫单抗(替昔单抗，CP-675,206)。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1，MDX-D010)，其是结合CTLA-4的完全人单克隆IgG抗体。另一种免疫检查点蛋白是程序性细胞死亡1(PD-1)。PD-1和PD-L1阻断剂的实例描述于美国专利号7,488,802、7943743、8008449、8168757、8,217,149和PCT公开专利申请号：WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699。在一些实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-L1抗体。在某些其他实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-1抗体和类似的结合蛋白，例如尼沃单抗(MDX1106、BMS 936558、ONO 4538)，其是结合并通过其配体PD-L1和PD-L2阻断PD-1活化的完全人IgG4抗体；兰布利单抗(MK-3475或SCH 900475)，抗PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，结合PD-1的人源化抗体；AMP-224是B7-DC的融合蛋白；抗体Fc部分；用于PD-L1(B7-H1)阻断的BMS-936559(MDX-1105-01)。其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂，例如IMP321，一种可溶性Ig融合蛋白(Brignone等，2007，J.Immunol.179:4202-4211)。其他免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，例如B7-H3和B7-H4抑制剂。特别地，抗B7-H3抗体MGA271(Loo等，2012，Clin.Cancer Res.July 15(18)3834)。还包括TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade等、2010、J.Exp.Med.207:2175-86和Sakuishi等、2010、J.Exp.Med.207:2187-94)。在一些实施方案中，免疫疗法性治疗由过继免疫疗法组成，如Nicholas P.Restifo，Mark E.Dudley和Steven A.Rosenberg所述(“Adoptive immunotherapy for cancer:harnessing the T cell response，NatureReviews Immunology，Volume 12，April 2012)。在过继免疫疗法中，在体外分离患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润的淋巴细胞，由淋巴因子如IL-2活化并重新施用(Rosenberg等，1988；1989)。活化的淋巴细胞最优选是早期从血液样品中分离并在体外活化(或“扩增”)的患者自己的细胞。该实施方案是特别优选的，因为HDACi可以增加癌细胞表面上PDL1的表达。

在一些实施方案中，向受试者施用作为联合制剂的i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和iii)佐剂(特别是TLR3激动剂)，以及放疗剂。

如本文所用，术语“放疗剂”意指不受限的本领域技术人员已知的有效治疗或缓解癌症的任何放疗剂。例如，放疗剂可以是诸如在近距离放射治疗或放射性核素治疗中施用的那些试剂。此类方法可任选地进一步包括施用一种或多种另外的癌症疗法，例如但不限于化疗和/或另一种放疗。

在另一个实施方案中，如上所述，激活MHC表达和/或免疫应答的化合物；佐剂和人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体可以与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释放基质(诸如可生物降解的聚合物)联合，以形成药物组合物。

本发明进一步包括：i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体；ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物，和iii)佐剂。

本发明的药物组合物用于治疗。

本发明的药物组合物用于治疗癌症。

本发明的药物组合物，其中选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物是HDACi。

本发明的药物组合物，其中佐剂是TLR3激动剂。

在一个具体实施方案中，根据本发明的疫苗组合物包含：i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)VPA和iii)Poly(A:U)。

在一个具体实施方案中，根据本发明的药物组合物包含：i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)VPA和iii)Poly(A:U)。

“药学上”或“药学上可接受的”是指当适当地施用于哺乳动物，尤其是人时，不产生有害的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。本发明的药物组合物用于口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、局部或直肠施用，活性成分(单独或与另一种活性成分组合)可以以单位施用形式，作为与传统的药学支持物的混合物向动物和人施用。合适的单位施用形式包括口服途径形式，例如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒和口服悬浮液或溶液、舌下和口腔施用形式、气溶胶、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌肉内、静脉内、真皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。通常，药物组合物含有对于被注射的制剂而言药学上可接受的载体。这些可以特别是等渗的无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，其在添加在无菌水或生理盐水(取决于情况)时，允许构成可注射溶液。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须以易于注射的程度流动。它必须在制备和储存条件下稳定，并且必须预防微生物如细菌和真菌的污染作用。可以在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备包含本发明化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。可以将多肽(或编码其的核酸)配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，通过使用涂层如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。通过以下制备无菌可注射溶液：将所需量的活性多肽加入含有如上列举的几种其它成分(根据需要)的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过以下制备分散体：将各种灭菌的活性成分加入无菌载体，所述无菌载体含有基础分散体介质和所需的来自如上列举的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型给药，例如上述可注射溶液的类型，但也可使用药物释放胶囊等。例如，对于水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释液等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌含水介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并将其加入到1000ml的皮下输注液中或在所提出的输注部位注射。取决于所治疗的受试者的状况，剂量必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体受试者的适当剂量。

更特别地，将人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体以及激活MHC表达和/或免疫应答的化合物配制成疫苗组合物。因此，本发明涉及疫苗组合物，其包含：i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和iii)佐剂。

在一个具体实施方案中，根据本发明的疫苗组合物包含：i)人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体；ii)丙戊酸和iii)TLR3激动剂。

在一个具体实施方案中，根据本发明的疫苗组合物包含：i)表达新抗原，特别是被诱变剂或基因修饰增强的人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)或胎儿干细胞的群体，ii)丙戊酸和iii)Poly(A:U)。

组合物还可以包含5氮杂胞苷。

此外，如上所述，本发明的疫苗组合物可用于患有癌症的受试者。

可以以与免疫原性组合物相同的方式，与上文所示的生理学赋形剂一起配制根据本发明的疫苗组合物。例如，药学上可接受的载体包括但不限于磷酸盐缓冲的盐水溶液、蒸馏水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的润湿剂无菌溶液等。诸如胞壁酰肽如MDP、IL-12、磷酸铝、氢氧化铝、明矾和/或Montanide(R)的佐剂可用于疫苗中。

根据本发明的疫苗组合物可以皮下(s.c)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)或静脉内(i.v.)注射施用、口服施用和鼻内施用或吸入。施用的疫苗通常是单剂量。或者，本发明的疫苗的施用是第一次(初次接种)，然后用相同的干细胞群、刺激免疫系统的化合物或其组合和/或进一步的放疗、靶向疗法、免疫疗法或化疗中的一种或多种进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100次加强(recall)(后续施用)。

疫苗组合物也以试剂盒提供。该试剂盒包含根据本发明的疫苗组合物和提供免疫说明书的信息传单。该试剂盒还包括用于施用产品的所有材料。

总之，发明人证明了TLR-3激动剂可用于增强疫苗的抗癌活性，所述疫苗包含与HDAC抑制剂(也可能与检查点抑制剂)一起施用的抗原性组合物。

抗原性组合物包含灭活的细胞(多能细胞或胎儿细胞，其优选在诱变后已经被灭活)。使用这些类型的细胞，可以产生普遍存在的疫苗(使用多能细胞时)或更特异性的疫苗(使用参与待治疗的癌症分化途径的胎儿细胞时)，表达存在于癌细胞表面的新胎儿抗原。HDAC抑制剂(及其增加MHC-1表达的能力)以及TLR-3激动剂的存在增强了细胞毒性T细胞应答。也可以通过使用检查点抑制剂来改进这种应答，该检查点抑制剂可以进一步增加应答，特别是作为HDAC抑制剂可以增加PDL-1(程序性死亡配体1或CD274)的表达，从而限制免疫应答。但是，如实施例中所示，尽管具有HDACi的这种作用，本文公开的联合即使在没有检查点抑制剂的情况下也能够控制癌症的增殖。

通过以下附图和实施例将进一步说明本发明。但是，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：hESC与丙戊酸(VPA)、Poly(A:U)、ODN 2395或

佐剂联合在4T1小鼠模型上的疫苗接种研究。用hESC与丙戊酸(VPA)、Poly(A:U)、ODN 2395或

佐剂联合对4T1小鼠模型进行的疫苗接种研究。在肿瘤激发的当天用含有3种不同佐剂的疫苗对Blab/c小鼠进行了两次加强免疫。使用允许测量纵向(a，mm)和横向(b，mm)直径的卡尺，评估肿瘤生长直到26天，以跟踪肿瘤大小。使用计算公式1/6Π(a+b/2)3mm3计算肿瘤体积并作图。

图2：丙戊酸处理增加乳腺癌细胞中MHC I的表达。在4T1贴壁细胞和4T1衍生的乳腺球上以2mM进行VPA处理期间，MHC I表达的变化。

图3：HDACi上调肺癌细胞系中的MHC1。VPA、左乙拉西坦、伏立诺他和恩替诺特对LLC1免疫原性的影响。通过测量相对荧光强度(RFI)的流式细胞仪分析定量MHCI和MHCII表达。LLC1用丙戊酸(A)、恩替诺特(B)、左乙拉西坦(C)和伏立诺他(D)以对应于IC50的剂量处理48小时。

具体实施方案

实施例1

实验按以下步骤进行：用与3种不同的佐剂(500μgTLR3、50μg TLR9激动剂或50μg/ml

皂苷疫苗佐剂)混合的2x10⁶个辐射的hESC细胞，使每组五只小鼠接受7天和14天两次加强疫苗接种。14天后，将5x10⁴个4T1细胞注入小鼠的乳腺脂肪垫中，并以4mg/ml的剂量将丙戊酸添加到饮用水中。五只未接受治疗的小鼠用作对照。

疫苗产品中使用的佐剂：测试了三种不同的佐剂：

1/基于TLR3的佐剂：Poly(A:U)(ref#tlrl-pau,InvivoGen)聚腺苷酸-聚尿苷酸(poly(A:U))是一种合成的双链RNA分子，其可通过TLR3特异性地发出信号。已知Poly(A:U)会诱导树突状细胞和T淋巴细胞活化，以促进抗原特异性Th1免疫应答并加强抗体产生。已开发poly(A:U)的有效佐剂活性并被批准用于治疗表达TLR3的乳腺癌(Conforti R.etal.,2010.Opposing effects of toll-like receptor(TLR3)signaling in tumors canbe therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3ligands.Cancer Res.70(2):490-500)。

2/基于TLR9的佐剂：ODN 2395VacciGrade^TMCpG ODN，C型(ref#vac-2395-1.InvivoGen)ODN 2395是C型CpG ODN，其由主要存在于细菌DNA中的含有未甲基化CpG基序的合成寡聚脱氧核苷酸(ODN)组成(CpG ODN)。CpG ODN被鼠TLR9识别，其仅在人B细胞和树突状细胞上表达，从而诱导Th1为主的免疫应答。特异性激活小鼠TLR9的ODN 2395是来自树突状细胞的强IFN-α诱导剂和强大的B细胞激活剂。

皂苷疫苗佐剂(ref#vac-quil InvivoGen)。

佐剂是一种皂苷佐剂，其含有来自南美树Quillaja saponaria Molina的水可提取级分的皂苷。皂苷诱导对T依赖性和T依赖性抗原的强烈佐剂应答，并诱导强烈的细胞毒性CD8+淋巴细胞应答。与胆固醇和磷脂联合形成免疫刺激复合物时，

佐剂可以激活细胞介导和抗体介导的针对多种肿瘤抗原的免疫应答。

结果

我们发现，与未接种疫苗的小鼠相反，与使用TLR9激动剂或

皂素疫苗佐剂相比，用hESC联合TLR3激动剂疫苗接种的小鼠产生的乳腺肿瘤体积减少最大(p<0.001)(图1)。

表1示出了肿瘤生长的减少率，其中平均肿瘤大小有统计学差异。

表1：与仅接受PBS的对照组相比，在第26天时肿瘤减少的百分比和统计学测试(Student test)。

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属的技术水平。这些参考文献的公开内容通过引用结合到本公开中。

实施例2：化合物增加MHC I的能力

可以评估化合物增加肿瘤细胞上的MHC I的能力(因此适合在本方法的上下文中)。

丙戊酸增加乳腺癌细胞上的MHC I

4T1细胞是三阴性乳腺癌细胞系，其与增加剂量(0.2和2mM)的丙戊酸(VPA)一起孵育。处理4天后，通过流式细胞术分析定量MHC I表面标志物。VPA具有以剂量依赖性方式增加MHC I水平的特性，这突出表明VPA可以通过改进T细胞肿瘤识别来增强抗肿瘤免疫应答。此外，通过流式细胞仪分析测得的相对荧光强度(RFI)显示，当用2mM VPA处理时，在4T1和衍生自乳腺球的4T1细胞中，MHC I表达分别增加了2.1倍和2.7倍(图2)。这些结果表明，VPA处理可在基线和“干细胞样”情况下有效增强MHC I表达。

此外，当用2mM VPA处理4T1细胞时，我们还观察到PDL1表达增加了2.1倍，而VDL处理后PDL2表达仅微弱上调(图2)。

HDAC抑制剂增加肺肿瘤细胞中MHC1的表达

使用表达特别具有攻击性的转移表型的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(刘易斯肺癌，LLC)。使用流式细胞术分析评估了四种HDAC抑制剂分子：恩替诺特、左乙拉西坦、伏立诺他

和丙戊酸(VPA)

的主要组织相容性复合物(MHC)I和II型的表达。

首先使用MTT细胞增殖测定确定每个HDACi的半数最大抑制浓度(IC50)。用增加剂量的HDCAi处理LLC1，并通过测量细胞掺入MMT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓)底物后的吸光度来评估增殖。伏立诺他、恩替诺特和左乙拉西坦的IC50(水平)为2-4μM，并且丙戊酸约为2mM。

对于所有测试的HDACi，用对应于IC50的剂量的4种HDACi处理的LLC1显示出改变了MHC I型表达。与未随剂量调节的MHC 2型表达相反，与未经处理的细胞相比，伏立诺他、左乙拉西坦、恩替诺特和VPA具有将MHC 1在细胞膜上的表达显著增加2倍的性能(图3)。VPA被证明比未经处理的LLC1细胞过表达MHC1 10倍(图3A)。

还应注意，一些HDACi增加了细胞表面的PDL-1(数据未显示)。

实施例3：用丙戊酸(VPA)处理的4T1细胞诱导免疫应答的上调

为了确定VPA对4T1细胞的影响，对用0.5mM VPA处理10天的细胞进行转录组分析，并将其与未经VPA处理的细胞进行比较。这些分析允许鉴定与TNF-α信号传导以及IFN-α和IFN-γ的应答有关的基因组。此外，使用SAM算法允许区分经VPA处理的样品与对照样品之间的44个免疫相关基因，并通过主成分分析进行了验证(p值＝3.3x10^-4)。在这44个与免疫相关的基因中，发现CD74、CCL2和TNFRSF9过度表达，其倍数变化大于2。已知这三种分子有助于T细胞的克隆扩增、存活和发育，并调节CD28共刺激以促进Th1细胞响应。因此，该HDACi改进了针对癌细胞的免疫应答。

Claims (28)

1.用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括以下步骤：向所述受试者同时、分别或顺次施用治疗量的(i)诱导抗原的MHC-I呈递的试剂，其中该试剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，(ii)含有免疫原性成分的疫苗组合物和iii)佐剂，其中所述佐剂是toll样受体(TLR)3的激动剂。

2.权利要求1所述的方法，其中所述疫苗组合物中的免疫原性成分选自下组：

a.目标抗原，

b.人胚胎干细胞(hESCs)组合物，

c.人诱导多能干细胞(hiPSC)组合物，

d.胎儿干细胞组合物

e.来自细胞组合物的提取物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

f.细胞组合物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

g.包含已通过目标抗原体外引发的抗原呈递细胞的细胞组合物，或

h.通过暴露于呈递目标抗原的抗原呈递细胞已针对目标抗原体外引发的T细胞淋巴细胞。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述抗原是胎儿抗原或多种胎儿抗原。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述疫苗组合物包含表达一种或多种也由所述受试者的癌细胞表达的目标抗原的群体的细胞。

5.权利要求4所述的方法，其中所述疫苗组合物包含表达新胎儿抗原的灭活的胎儿细胞群体。

6.权利要求4所述的方法，其中所述疫苗组合物包含表达新胎儿抗原的灭活的多能细胞，诸如胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(hiPSC)的群体。

7.权利要求5所述的方法，其中所述胎儿干细胞通过包括以下步骤的方法获得：

a.将多能细胞群体向与患者特定癌症有关的途径分化，

b.扩增如此分化的细胞，

c.任选在扩增期间暴露于诱变剂，以诱导所述群体的细胞中的基因突变，

d.验证至少70％的所述群体的细胞表达胎儿标志物，

e.任选验证所述群体的细胞表达存在于所述受试者癌细胞中的至少一种肿瘤相关抗原(TAA)或新抗原，

f.灭活所述细胞，以使所述细胞丧失其分裂能力。

8.权利要求6所述的方法，其中所述干细胞通过包括以下步骤的方法获得：

a.在用以维持所述细胞的多能能力的条件存在下，任选地在扩增步骤过程中诱导所述群体中抗原的MHC-I呈递的试剂存在下，扩增多能细胞，

b.和将所述扩增细胞暴露于将灭活细胞的灭活剂，同时保持细胞包膜的完整性。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂选自下组：丙戊酸(VPA)、伏立诺他、帕比司他、吉维司他、贝利司他、左乙拉西坦、恩替诺特、莫塞替诺特、Practinostat、西达本胺、奎诺司他和阿贝司他。

10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述TLR3激动剂是Poly(A:U)或poly(I:C)。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中对所述含有免疫原性成分和TLR3激动剂的疫苗组合物进行初次施用，并从所述初次施用进行所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的多次施用。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、淋巴瘤、急性和慢性淋巴样和髓样白血病、黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、头颈肿瘤以及实体瘤和造血系统恶性肿瘤的所有亚型、造血系统恶性肿瘤和RET突变的内分泌肿瘤，包括甲状腺髓样癌。

13.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述癌症是激素依赖性癌症。

14.权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、子宫癌和卵巢癌。

15.(i)组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)，(ii)含有免疫原性成分的疫苗组合物，和iii)toll样受体(TLR)3的激动剂的联合制剂，其用于通过同时、分别或顺次施用以用于治疗受试者的癌症。

16.用于根据权利要求15所述的用途的联合制剂，其中所述疫苗组合物中的所述免疫原性成分选自下组：

a.目标抗原，

b.人胚胎干细胞(hESCs)组合物，

c.人诱导多能干细胞(hiPSC)组合物，

d.胎儿干细胞组合物

e.来自细胞组合物的提取物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

f.细胞组合物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原，

g.包含已通过目标抗原体外引发的抗原呈递细胞的细胞组合物，或

h.通过暴露于呈递目标抗原的抗原呈递细胞已针对目标抗原体外引发的T细胞淋巴细胞。

17.用于根据权利要求15或16所述的用途的联合制剂，其中所述抗原是胎儿抗原或多种胎儿抗原。

18.用于根据权利要求15-17中任一项所述的用途的联合制剂，其中所述疫苗组合物包含表达一种或多种也由所述受试者的癌细胞表达的目标抗原的群体的细胞。

19.用于根据权利要求18所述的用途的联合制剂，其中所述疫苗组合物包含表达新胎儿抗原的灭活的胎儿细胞群体。

20.用于根据权利要求18所述的用途的联合制剂，其中所述疫苗组合物包含表达新胎儿抗原的灭活的多能细胞，诸如胚胎干细胞(hESC)或诱导多能干细胞(hiPSC)的群体。

21.用于根据权利要求19所述的用途的联合制剂，其中所述胎儿干细胞通过包括以下步骤的方法获得：

a.将多能细胞群体向与患者特定癌症有关的途径分化，

b.扩增如此分化的细胞，

c.任选在扩增期间暴露于诱变剂，以诱导所述群体的细胞中的基因突变，

d.验证至少70％的所述群体的细胞表达胎儿标志物，

e.任选验证所述群体的细胞表达存在于所述受试者癌细胞中的至少一种肿瘤相关抗原(TAA)或新抗原，

f.灭活所述细胞，以使所述细胞丧失其分裂能力。

22.用于根据权利要求20所述的用途的联合制剂，其中所述干细胞通过包括以下步骤的方法获得：

a.在用以维持所述细胞的多能能力的条件存在下，任选地在扩增步骤过程中诱导所述群体中抗原的MHC-I呈递的试剂存在下，扩增多能细胞，

b.和将所述扩增细胞暴露于将灭活细胞的灭活剂，同时保持细胞包膜的完整性。

23.用于根据权利要求15-22中任一项所述的用途的联合制剂，其中所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂选自下组：丙戊酸(VPA)、伏立诺他、左乙拉西坦、帕比司他、吉维司他、贝利司他、恩替诺特、莫塞替诺特、Practinostat、西达本胺、奎诺司他和阿贝司他。

24.用于根据权利要求15-23中任一项所述的用途的联合制剂，其中所述TLR3激动剂是Poly(A:U)或poly(I:C)。

25.用于根据权利要求15-24中任一项所述的用途的联合制剂，其中对所述含有免疫原性成分和TLR3激动剂的疫苗组合物进行初次施用，并从所述初次施用进行所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的多次施用。

26.用于根据权利要求15-25中任一项所述的用途的联合制剂，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、淋巴瘤、急性和慢性淋巴样和髓样白血病、黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、头颈肿瘤以及实体瘤和造血系统恶性肿瘤的所有亚型、造血系统恶性肿瘤和RET突变的内分泌肿瘤，包括甲状腺髓样癌。

27.用于根据权利要求15-25中任一项所述的用途的联合制剂，其中所述癌症是激素依赖性癌症。

28.用于根据权利要求27所述的用途的联合制剂，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、子宫癌和卵巢癌。

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