JP4829272B2 - Es細胞特異的発現遺伝子 - Google Patents
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Description
即ち本発明は下記の通りである。
(1)配列表配列番号1、3、4、5、6、7または8に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(2)配列表配列番号1、3、4、5、6、7または8に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(3)配列表配列番号1、3、4、5、6、7または8に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(4)配列表配列番号9、13、15、17、19、21、23または41に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(5)配列表配列番号9、13、15、17、19、21または23に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つを含むことを特徴とする上記(4)記載のES細胞選択用プローブ。
(6)配列表配列番号9、13、15、17、19、21、23または41に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(7)配列表配列番号9、13、15、17、19、21または23に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAを含むことを特徴とする上記(6)記載のES細胞選択用プローブ。
(8)配列表配列番号9、13、15、17、19、21、23または41に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(9)配列表配列番号9、13、15、17、19、21または23に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAを含むことを特徴とする上記(8)記載のES細胞選択用プローブ。
(10)マウスES細胞の選択用である、上記(1)〜(9)のいずれか一つに記載のES細胞選択用プローブ。
(12)配列表配列番号27、29、31、33、35または37に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つを含むことを特徴とする上記(11)記載のES細胞選択用プローブ。
(13)配列表配列番号27、29、31、33、35、37または43に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(14)配列表配列番号27、29、31、33、35または37に記載の塩基配列からなるDNAのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAを含むことを特徴とする上記(13)記載のES細胞選択用プローブ。
(15)配列表配列番号27、29、31、33、35、37または43に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(16)配列表配列番号27、29、31、33、35または37に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNAを含むことを特徴とする上記(15)記載のES細胞選択用プローブ。
(17)ヒトES細胞の選択用である、上記(11)〜(16)のいずれか一つに記載のES細胞選択用プローブ。
(18)以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号17に記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNA
(c)(a)の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNA
(19)以下の(a)または(b)の蛋白質。
(a)配列表配列番号18に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つES細胞特異的に発現する蛋白質
(20)以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号29に記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNA
(c)(a)の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNA
(a)配列表配列番号30に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つES細胞特異的に発現する蛋白質
(22)以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号33に記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNA
(c)(a)の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNA
(23)以下の(a)または(b)の蛋白質。
(a)配列表配列番号34に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つES細胞特異的に発現する蛋白質
(24)以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号37に記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNA
(c)(a)の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNA
(25)以下の(a)または(b)の蛋白質。
(a)配列表配列番号38に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つES細胞特異的に発現する蛋白質
(26)配列表配列番号9、13、15、17、19、21、23または41に記載される塩基配列からなるDNA、あるいは配列表配列番号10、14、16、18、20、22、24または42に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを特徴とする、ES細胞のスクリーニング方法。
(27)配列表配列番号9、13、15、17、19、21または23に記載される塩基配列からなるDNA、あるいは配列表配列番号10、14、16、18、20、22または24に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを特徴とする、上記(26)記載のES細胞のスクリーニング方法。
(28)さらに配列表配列番号11に記載される塩基配列からなるDNA、あるいは配列表配列番号12に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを含む、上記(26)または(27)記載のES細胞のスクリーニング方法。
(29)さらに配列表配列番号25に記載される塩基配列からなるDNA、あるいは配列表配列番号26に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを含む、上記(26)〜(28)のいずれか一つに記載のES細胞のスクリーニング方法。
(30)配列表配列番号27、29、31、33、35、37または43に記載される塩基配列からなるDNA、あるいは配列表配列番号28、30、32、34、36、38または44に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを特徴とする、ES細胞のスクリーニング方法。
(32)さらに配列表配列番号39に記載される塩基配列からなるDNA、あるいは配列表配列番号40に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを含む、上記(30)または(31)記載のES細胞のスクリーニング方法。
(33)配列表配列番号9、11、13、15、17、19、21、23または41、若しくは配列表配列番号27、29、31、33、35、37または43に記載の塩基配列において繰り返し配列を含まない連続する20塩基以上の部分配列からなり、且つES細胞に特異的に発現する遺伝子に特異的な配列を有するDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
(34)上記(1)〜(17)および(33)のいずれか一つに記載のES細胞選択用プローブを用いて、ES細胞に特異的に発現する遺伝子の発現状況を解析することを含む、ES細胞のスクリーニング方法。
(35)さらに配列表配列番号2または11に記載の塩基配列からなるDNAを含むES細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記(34)記載のES細胞のスクリーニング方法。
(36)さらに配列表配列番号25に記載の塩基配列からなるDNAを含むES細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記(34)または(35)記載のES細胞のスクリーニング方法。
(37)さらに配列表配列番号27に記載の塩基配列からなるDNAを含むES細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記(34)記載のES細胞のスクリーニング方法。
(38)さらに配列表配列番号39に記載の塩基配列からなるDNAを含むES細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記(34)または(35)記載のES細胞のスクリーニング方法。
ECAT2遺伝子は、EC細胞をレチノイン酸で刺激した時に発現が減少する遺伝子pH34として報告され(Differentiation 46:61-67, 1991)、また理化学研究所のデータベースによればESG(ES cell specific gene)1として記載されている。また、ECAT3遺伝子はFボックスを有するマウス蛋白質をコードする遺伝子であり、その発現が精巣と卵巣で認められているものとして報告されている(Current Biology 9:1180-1182, 1999)。また、ECAT7遺伝子はDNAメチル化を行うDNMT3に似た蛋白質DNMT3Lとして報告されている(Genomics 65:293-298, 2000)。ECAT9遺伝子は、GDF3とよばれる増殖因子として、マウスではJones CM et al., Mol Endocrinol. 6: 1961-1968, 1992に、ヒトではCaricasole et al., Oncogene 16: 95-103, 1998に報告されている。ES細胞特異的発現の報告はない。ECAT4遺伝子、ECAT5遺伝子およびECAT6遺伝子に関しては、文献上報告はないが蛋白質データベースの検索により、ECAT4遺伝子がホメオボックスを有していること、ECAT5遺伝子が癌遺伝子H−Rasに相同性を有していること、ECAT6遺伝子がケラチンに類似していることが明らかとなった。また、ECAT5遺伝子はその部分配列が知られてはいるもののcDNA配列そのものならびに当該DNA配列がコードする蛋白質のアミノ酸配列は未だ決定されていなかった。従って、本発明はECAT5遺伝子ならびにECAT5蛋白質、およびそれらと極めて相同性の高い遺伝子ならびに同様の挙動を示す蛋白質を提供する。
実施例1 マウスECAT遺伝子の同定
(1)コンピューター解析による候補遺伝子の同定
(手順)
ECATの候補遺伝子を同定するためにESTデータベースを利用した。ESTは各種細胞や臓器由来のcDNAライブラリーから多数のcDNAクローンを無作為に抽出し、その5’または3’断端部の配列を1反応だけ解析し、公共データベースに登録したものである。ESTは各細胞、臓器で発現している遺伝子のカタログであるといえる。マウス由来のもので100万クローン以上、マウスES細胞由来のものだけでも3万クローン以上が登録されている。
ESTデータベースとしてはUnigeneを使用した。UnigeneはESTの中で同じ遺伝子に由来すると考えられるものをクラスタリングしたものであり、2001年3月5日現在、マウスESTデータベースにおいては79917セットが報告されている。各セットは少なくとも1つのESTもしくは既知遺伝子からなる。
解析の手法としては、Digital differential display法を使用した。この方法は、指定した細胞や臓器のライブラリーにおける各セットの存在頻度、すなわち各セットに含まれるESTクローン数をそのライブラリー由来の全EST登録数で割ったものを算出し、異なる細胞や臓器間での発現頻度を調べる方法である。
Digital differential display法により次に示す5つの細胞や臓器由来のライブラリー群における遺伝子発現頻度解析を行った。各群の括弧内の数字は解析したクローン数を示している。1群から5群までは該当するライブラリーをすべて解析した。6群はデーター数が膨大であるため、全身の臓器、細胞を可及的に含むように抽出した23ライブラリーを解析した。
1群 1細胞期よりブラストシストまでの受精卵(49050クローン)
2群 ES細胞またはEmbryonic carcinoma細胞(32277クローン)
3群 受精後8.5日までの胎児(46728クローン)
4群 受精後9日以降の胎児(128882クローン)
5群 精巣(65685クローン)
6群 その他の細胞、組織(272460クローン)
Digital differential display法により受精卵とES細胞等の全能性細胞で特異的に発現することが予想されたセットについては、マウス由来のESTデータベースをBlastNにて検索し、全能性細胞由来のライブラリーでのみESTが存在するかどうかを検討した。
使用したデータベースおよび解析プログラムのURLは以下の通りである。
Unigene Mouse Sequence Collection
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Mm.Home.html
Digital differential display
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ddd.cgi?ORG=Mm
Blast search
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
(結果)
Digital differential display法による解析とBlastNによるESTデータベース検索の結果の候補として10個の遺伝子を同定した。これらの遺伝子のESTは受精卵とES細胞において高頻度に存在するが、第6群のその他の細胞や組織では認められない。胎児や精巣由来のライブラリーにESTが含まれる遺伝子も存在したが、これは分化全能性細胞である始原生殖細胞や精母細胞に由来する可能性が高いので、ECAT遺伝子の候補に含めた。一方Oct−3/4遺伝子は受精卵とES細胞で高頻度に存在するが、その他の細胞や臓器でも少数であるが含まれていた。候補のうち8遺伝子について、マウス由来のESTデータベースをBlastNにて検索した結果を表1に示す(ECAT1〜8)。
同様にして残る2つの遺伝子のうち、1つの遺伝子(ECAT9)についても解析をすすめた。結果を表1に示す。
(手順)
コンピューター解析により同定された候補遺伝子について、実際にES細胞特異的に発現しているかどうかをノザンブロットにより解析した。未分化ES細胞およびレチノイン酸で5日間分化誘導したES細胞よりライフテックオリエンタル社のTrizolを用いて全RNAを抽出した。成体マウスの各種臓器由来のRNAはサワデーテクノロジーより購入した。全RNA(5μg)をホルマリンアガロースゲルにより分離後、ナイロンメンブランにトランスファーし、UVクロスリンクにより固定した。目的遺伝子のESTが購入可能な場合は同DNAをプローブとして用いた。ESTが入手不可能な場合は、PCRにて各ECATに特異的なDNA断片を増幅し、プローブとして用いた。具体的には以下のプローブを用いてOct−3/4、ECAT1、ECAT2、ECAT3、ECAT4、ECAT5、ECAT6、ECAT7およびECAT8の発現を調べた。さらにECAT9の発現についても調べた。
Oct−3/4:プラスミドC1 in BS KS(Cell 60:461-472, 1990)をEcoRIで切り出して調製した配列表配列番号25に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT1:Mm.31054EST(#AI467128)をSalI/NotIで切り出して調製した配列表配列番号1に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT2:pH34EST(#AA473366)をSalI/NotIで切り出して調製した配列表配列番号2に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT3:FBX15EST(#AA571680)をSalI/NotIで切り出して調製した配列表配列番号3に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT4:ホメオボックスコーディング領域をゲートウェイ用にPCRで増幅しTAクローニングしたプラスミドからEcoRIで切り出して調製した配列表配列番号4に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT5:E−RasS118/RACE11でRT−PCRしたものをTAクローニングしたプラスミドからEcoRIで切り出して調製した配列表配列番号5に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT6:ケラチン−EPCR産物(48927S/48927AS)である配列表配列番号6に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT7:DNMT3LESTクローン(AA895770,pBSSK−dnmt31)からEcoRI/XhoIで切り出して調製した配列表配列番号7に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT8:Mm.77010RACE産物をTAクローニングしたプラスミドからEcoRIで切り出して調製した配列表配列番号8に記載の配列を含むDNA断片。
ECAT9:GDF3(Jones CM. et al., 上述)を参考にして調製された配列表配列番号41に記載の配列を含むDNA断片。
プローブの32P−dCTPによる標識は、アマシャムファルマシア社のメガラベリングキットを用いて行った。ハイブリダイゼーションはフナコシ社のQuickhybを用いて行った。洗浄後のシグナル解析は富士フィルム社のBAS5000を用いて行った。
(結果)
コンピューター検索にて同定された10遺伝子のうち、これまでに9遺伝子に関してノザンブロットを行い、ES細胞および12種類の臓器における発現を解析した。即ちES細胞と成体マウスの12種類の臓器における各ECAT遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した結果を図1に示す。
9遺伝子に関する全ての発現がES細胞に特異的であることがわかった。精巣でも若干の発現が認められるものもあるが、精母細胞に由来すると考えられた。またこれらの遺伝子の発現はES細胞をレチノイン酸で刺激誘導するとすみやかに消失することがわかった。これらの結果から9遺伝子はECAT遺伝子であると考えられた。
ECAT遺伝子が未知遺伝子である場合全長cDNAの同定はライフテックオリエンタル社の5’RACEシステム、バージョン2を使ったRACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法を用いて行った。理研マウス完全長cDNAデータベースの検索はURL(http://genome.gsc.riken.go.jp/)において行った。
(1)Blast検索
ノザンブロットの結果ECAT遺伝子であることが確認された8遺伝子のEST配列をBlastで検索した結果、3遺伝子に関しては既に配列が論文として報告されていた。ECAT2遺伝子はEC細胞をレチノイン酸で刺激した時に発現が減少する遺伝子pH34として報告されていた。ECAT4遺伝子はFボックスを有するマウス蛋白質で、発現が精巣と卵巣でのみ認められるものとして報告されていた。ECAT7遺伝子はDNAメチル化を行うDNMT3に似た蛋白質DNMT3Lとして報告されていた。RACE法によりcDNA全長の同定を試みた結果、ECAT4遺伝子、ECAT5遺伝子、ECAT6遺伝子について翻訳領域を同定した。予想されるアミノ酸配列をBlastPで検索した結果、ECAT4遺伝子はホメオボックスを有していること、ECAT5遺伝子は癌遺伝子H−Rasに相同性を有していること、ECAT6遺伝子はケラチンに類似していることがわかった。また、あらたにECAT遺伝子であることが確認されたECAT9遺伝子はGDF3とよばれる増殖因子であることがわかった。
(2)理研マウスcDNAデータベースの検索
2001年2月に理研より公開されたマウス全長cDNAデータベースを検索した結果、ECAT5遺伝子を除く8遺伝子はcDNAの全長が公開されていた。ECAT5遺伝子はデータベースに含まれていなかった。またECAT2遺伝子は理研のデータベースにおいてES cell specific gene (ESG)1として記載されているが、他の8遺伝子に関してはES細胞での発現に関する情報は無かった。
(1)ヒトゲノムDNAおよびヒト蛋白質データベースのBlast検索
Blast検索した結果、ECAT2〜5、7、8遺伝子においてはアミノ酸配列が50%以上一致するオルソログが存在することがわかった。また、ECAT9遺伝子についてもhGDF3(Caricasole et al., 上述)としてhECAT9遺伝子が存在する。ECAT1遺伝子とECAT6遺伝子に関してはヒトのオルソログは同定できなかった。
BlastP検索の結果、hECAT3遺伝子、hECAT5遺伝子、hECAT8遺伝子の3遺伝子についてはhypothetical proteinを含め塩基配列およびアミノ酸配列ともに公開されていなかった。
霊長類におけるECAT遺伝子のES細胞特異的な発現を確認した。
ヒト成人の13種類の臓器に由来する各全RNA(サワデーテクノロジーあるいはフナコシより購入)、ヒト間葉系幹細胞(タカラより購入)由来の全RNA、およびサルES細胞(未分化ならびにレチノイン酸により分化誘導されたもの、京都大学再生医学研究所の中辻教授提供)由来の全RNAをノザンブロット法により解析した。hECAT2,4,7,8,9およびhOct3/4に相当するESTクローンの全長cDNAをプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは上記実施例1のマウスECATの解析と同様の手法で行ったが、ヒトプローブでサルRNAを検出できるよう、反応や洗浄温度は低く(50℃)設定した。その結果、すべての遺伝子について未分化ES細胞において強いシグナルを認めた(図2)。ES細胞の分化にともない、シグナルは著しく減弱した。その他の臓器(細胞)においてスメア状の薄いシグナルが認められたが、これは反応および洗浄温度を下げたことにより生じた非特異的なものであると考えられる。以上の結果から、ECAT遺伝子はマウスだけではなく霊長類のES細胞においても選択的に発現しており、そのマーカー遺伝子として利用できることが確認された。
本出願は、日本で出願された特願2001−165927を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (6)
- 配列表配列番号5に記載の塩基配列からなるDNAを含むことを特徴とするES細胞選択用プローブ。
- 配列表配列番号17に記載の塩基配列からなるDNAを含むことを特徴とする、ES細胞選択用プローブ。
- 以下の(a)〜(c)のいずれかのDNAからなる遺伝子。
(a)配列表配列番号17に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列表配列番号18に記載のアミノ酸配列をコードするDNA
(c)(b)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つES細胞特異的に発現する蛋白質をコードするDNA - 以下の(a)又は(b)の蛋白質。
(a)配列表配列番号18に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)(a)のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つES細胞特異的に発現する蛋白質 - 請求項3記載の遺伝子を含む発現ベクター。
- 請求項5記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
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