JPH06319546A - 発現に性差のある遺伝子を利用したマウスおよびウシ胚の性判別法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 雌雄で発現に差のある遺伝子を利用し、マウ
スあるいはウシの胚または組織の性を判別するための方
法、およびそのためのプライマーならびにプローブの提
供。 【構成】 雌雄で発現に差のある遺伝子としてマウスお
よびウシのＭｅａ遺伝子のｃＤＮＡ、ウシのＭｅａ遺伝
子のゲノムＤＮＡ、これらより指定されるＲＮＡおよび
ポリペプチド、これら核酸の１部をプライマーとして利
用しＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写酵素を利用したポリメラー
ゼ連鎖反応）により性を判別する方法、これら核酸のす
べてあるいは１部を利用しハイブリダイゼーション法に
より性を判別するためのプローブ、抗原抗体反応により
性を判別するための抗原となるポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はマウスあるいはウシの胚
又は組織の性判別の方法およびかかる方法に用いるプロ
ーブおよびプライマーに関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類、特に家畜の雌雄産み分け技術は
２つ大別される。第１の方法はＹ染色体とＸ染色体を持
つ精子とを分離し、前者と受精した卵子より雄胚を、後
者のそれから雌胚を得る方法である。フローサイトメー
ターにより分離は可能といわれるが、精子を染色しレー
ザー光をあてるので変性の可能性があり、また、多数の
精子を得るのが困難であること、機器が高価であること
などの欠点がある。

【０００３】第２の方法は胚の１部を採取し、雌雄を判
別する方法である。これには２つの方法がある。１つは
細胞遺伝学的方法で、胚の１部を培養し、染色体標本を
作製し、ＸおよびＹ染色体があれば雄胚、２本のＸ染色
体があれば雌胚とするものである。この方法の欠点は染
色体標本が必ずしも容易でなく、成功率が５０％前後と
低いことである。したがって、実用的とはいい難い。

【０００４】他の方法はPCR(polymerase chain reactio
n)を利用するもので、Ｙ染色体に特異的なＤＮＡがあれ
ば雄、なければ雌とする。この方法はＹ染色体上のＤＮ
Ａなら何でも利用できるというわけではない。Ｘ染色体
や常染色体と類似の配列を示す部分や、偽常染色体領域
と呼ばれる部分では、Ｙ染色体の特異性が検出できな
い。また、Ｙ染色体上に１個のみ存在するＤＮＡ配列は
増幅するうえで不利である。Ｙ染色体のＤＮＡのうちコ
ピー数の多い部分を利用すると有効な方法となる。現在
のところ繰り返し配列を利用したこの方法が最も簡便か
つ信頼のおける方法となっている。しかし、この目的に
かなったＹ染色体由来の特定の配列を得るのは必ずしも
容易ではない。また、小さな胚の１部を採取するっこと
も技術的に容易でない。

【発明が解決しようとする課題】そこで、上記従来技術
に鑑がみさらに優れた、新しい原理に基づくマウス又は
ウシの雌雄判別方法を開発すべく鋭意研究を行い本発明
を完成するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１に
より表される塩基配列を有するマウスｃＤＮＡ，配列番
号２により表されるアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、配列番号３により表される塩基配列を有するウシゲ
ノムＤＮＡ、配列番号４により表される塩基配列を有す
るウシｃＤＮＡ，配列番号５により表される塩基配列を
有するＲＮＡ，配列番号１、配列番号３、配列番号４又
は配列番号５で表される核酸とハイブリダイズしうる核
酸、配列番号６により表されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、配列番号７および配列番号８により表され
るプライマーＤＮＡ，又は配列番号９および配列番号１
０により表されるプライマーＤＮＡである。

【０００６】さらに、本発明は、マウスあるいはウシの
胚又は組織の１部を採取し、該組織から逆転写酵素を用
いてｃＤＮＡを作製し、請求項１、請求項３、請求項
４、請求項５又は請求項６に記載の核酸の少なくとも１
部をプライマーとして用い、性により発現の差のある遺
伝子の１部を増幅させることによりマウス又はウシの性
を判別する方法である。

【０００７】さらに、本発明は、マウスあるいはウシの
胚又は組織の１部を採取し、細胞標本を作製し、請求項
１、請求項３、請求項４、請求項５又は請求項６に記載
の核酸のすべて又は１部を標識して標識したプローブと
して用い、性により発現の差のあるｍＲＮＡにハイブリ
ザイズさせることを特徴とするマウス又はウシの性を判
別する方法である。

【０００８】さらに、本発明は、配列番号２又は配列番
号７の配列を有するポリペプチドに対する抗体を作製
し、これを標識して標識したプローブとして用い、マウ
スあるいはウシの胚又は組織の１部に作用させ、性によ
り発現に差のある遺伝子産物を検出することを特徴とす
るマウス又はウシの性を判別する方法である。以下、本
発明を詳細に説明する。

【０００９】本発明は、原理的に全く新規な方法で、雌
雄を識別する方法である。すなわち、本発明は、Ｘおよ
びＹ染色体という雌雄で遺伝的に異なるＤＮＡの差異を
利用する従来の方法でなく、遺伝的には同一で雌雄間で
発現を異にする遺伝子を利用するものである。この目的
に合致する遺伝子は、まず真の遺伝子であれ偽遺伝子で
あれ、ｍＲＮＡとして転写されなねばならない。しか
も、発現は雌雄間で、時間的あるいは空間的に差がなけ
ればならない。例えばＳｒｙ（A.H.Sinclair et al., N
ature,346, 240-244 (1990)）のようなＹ染色体上の雄
特異的遺伝子であっても、胚で発現していなければ胚で
の性判別には利用できない。

【００１０】これらを満足させる遺伝子の１例として、
Ｍｅａ（male enhanced antigen）遺伝子がある。この
遺伝子は常染色体上にあるので、雌雄共に同じ遺伝子を
同じ数だけ保持している。しかし、雄で優先的に発現さ
れ、しかも８細胞期以降の段階ですでに見られるので、
本発明の目的に合致したのである。また、１遺伝子より
転写されるmRNAの数は数十〜数万に及ぶと考えられ、こ
れより翻訳されるポリペプチドも多数である。このこと
は生体試料自体が前もって増幅処理をしているに等し
く、本発明の適用にきわめて好都合である。

【００１１】本発明のマウス又はウシの性を判別する方
法の概略を以下に説明する。まず、公知のBALB/cマウス
Ｍｅａ配列（Y.-F.C. Lau et al., Proc. Natl. Acad.
Sci.USA, 86, 8462-8466 (1989)）より適当な部位を選
び、PCRで増幅できるよう１対のプライマーをＤＮＡ合
成装置により合成しておく。次に、マウスの精巣よりｍ
ＲＮＡを抽出する。これを逆転写酵素によりｃＤＮＡと
する。このｃＤＮＡにプライマーを加えPCRを行うこと
により、Ｍｅａ遺伝子の特定の部位を増幅する(RT-PC
R)。あるいは、マウス精巣のｍＲＮＡより公知の方法
（J. Sambrook et al.(Eds.), Molecular Cloning, 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)）
によりｃＤＮＡライブラリーを作製し、これに上述のプ
ライマーを加え、特定部位を増幅してもよい。増幅産物
を増幅時に直接、あるいは増幅後にランダムプライマー
法、ニックトランスレーション法など公知の方法により
ラベルすれば、マウスのｃＤＮＡライブラリーやゲノム
ライブラリーからマウスＭｅａ遺伝子を単離するための
プローブとして利用できる。選んだ部分がウシＭｅａ遺
伝子と相同性が高ければ、ウシのｃＤＮＡライブラリー
あるいはゲノムライブラリーをスクリーニングするため
のプローブとして利用できる。あるいはマウスＭｅａ遺
伝子をまず得て、これをプローブとして、ウシＭｅａ遺
伝子を探してもよい。

【００１２】こうして得られたウシＭｅａ遺伝子の適当
な部分を選び、１対のPCR用プライマーを合成してお
く。一方、胚や組織の１部を取り、ｍＲＮＡを抽出し、
逆転写酵素を作用させることにより、ｃＤＮＡを作製す
る。ここにプライマーを加えてPCRを行う。もし、Ｍｅ
ａ遺伝子が性特異的に転写されｍＲＮＡとなっていれ
ば、その特定の部分が増幅されて、電気泳動により一定
の長さのバンドが検出される。こうして雌雄の判別が可
能となる。ただし、雌雄ともにＭｅａのゲノムＤＮＡが
細胞あたり１対づつ存在しているので、転写されるｍＲ
ＮＡの数が少ないと合成されるｃＤＮＡの数も少なく、
雌雄の差が得られない可能性がでる。そこで、ｃＤＮＡ
とゲノムＤＮＡとでは増幅される産物の長さが異なるよ
う、スプライシング部位を挟んで両側にプライマーが来
るよう設定するとよい。

【００１３】一方、PCR法によらずとも、Ｍｅａ遺伝子
の核酸を放射線あるいは蛍光的にラベルし、これをプロ
ーブとして胚あるいは組織の１部をインサイチューハイ
ブリダイゼーションにかけ、雌雄を識別することも可能
である。さらに、Ｍｅａ遺伝子産物に対する抗体を作製
して、胚の１部を採取することなくこの抗体を用いて性
の判別することができる。この場合は、胚への傷害が軽
減され胚の生存率が上昇するし、凍結保存も容易とな
り、かつ煩雑な胚の切断操作が不要となり、有用性は飛
躍的に増大する。

【００１４】

【発明の効果】本発明は、性差のある遺伝子発現を利用
した性判別のためのプローブあるいはプライマーの提供
した。そして、かかるプローブおよびプライマーを用い
てマウスあるいはウシの性判別を簡単に行うことができ
た。

【００１５】

【実施例】以下、実施例により、本発明について具体的
に説明する。ただし、これら実施例により本発明が限定
されるものではない。 （実施例１）マウスＭｅａ遺伝子のｃＤＮＡの単離。

【００１６】成熟雄マウス(Mus musculus domesticus,
CD-1系統)の精巣を集め、グアニジンチオシアネート法
（J.M. Chirgwin et al., Biochem., 18, 5294-5299 (1
979)）によりＲＮＡを抽出、オリゴｄＴ（Oligotex-dT3
0, Takara）をとおすことにより、ｍＲＮＡを得た。こ
の5 μgをとり市販キット（ZAP-cDNA Synthesis kit,St
ratagene社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤ
ＮＡ0.4μgをクローニング用ファージベクターλZAPII
（Stratagene社製）に連結、これをE. coli PLKF'（Str
atagene社製）に導入することにより、ｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。別途、文献（Y.F.C. Lau et al., P
roc. Natl. Acad. Sci.USA, 86, 8462-8466 (1989)）に
記載のBALB/cマウスＭｅａ遺伝子の塩基配列における特
定の部分塩基配列の２ケ所をＤＮＡ合成装置（ＡＢＩ
社、Model 391）を用いて合成した。その塩基配列は次
のとおりである。

【００１７】 5' CATCAGGGTCCTACAGAA 3' 5' CAGCTCTACATGTTCTGG 3' 大腸菌２０ｍｌを培地中で培養し、ｃＤＮＡライブラリ
ーを構成するファージを感染させ、培養上清からファー
ジＤＮＡを密度勾配遠沈法により抽出し、ＤＮＡ200 μ
gを得た。このＤＮＡ0.5-1.0 μgに前記合成プライマー
20μMを添加、PCR装置（Cetus社、Thermal Cycler）に
かけた。具体的には、反応液を混合し、４分後に94℃で
1分、60℃で1分、72℃で1分というサイクルを35回繰り
返した。得られた３０９塩基対よりなるＤＮＡをランダ
ムプライマー法により³²Ｐ-α-ｄＣＴＰでラベルし、こ
れをプローブとしてマウスｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングした。その結果、８個のクロンが得られ、そ
のうちの１個につき塩基配列を決定した。方法はサンガ
ー法を利用した自動シーケンサー（ＡＢＩ社、model 37
3A）によった。決定した塩基配列を配列表の配列番号１
に示した。この配列番号１のＤＮＡを含むプラスミドを
持つ大腸菌は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所
特許微生物寄託センターにE.c.bs-mMea1（寄託番号FERM
P-13300）として寄託している。配列番号１のCD-1マウ
スのｃＤＮＡはBALB/cマウスの塩基配列とほぼ同等であ
ったが、３ケ所で異っていた。この３塩基には下線を施
してある。このｃＤＮＡにより演繹されるポリペプチド
を配列番号２に示した。

【００１８】（実施例２） ウシＭｅａ遺伝子のゲノムＤＮＡの単離。 ウシ（ホルスタイン）の肝臓よりフェノール法によりＤ
ＮＡを抽出、精製し、その100 μgを制限酵素MboI（タ
カラ酒造社製）6.25ユニットで部分分解後、15-20キロ
塩基対の長さの部分を公知の方法（J. Sambrook et al.
(Eds.), Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring H
arbor Laboratory Press,(1989)）によりEMBL3ファージ
ベクター（Stratagene社製）に組み込み、ゲノムＤＮＡ
ライブラリーを作製した。実施例１で得られたCD-1マウ
スのＭｅａ遺伝子ｃＤＮＡをランダムプライマー法によ
り³²Ｐ-α-ｄＣＴＰでラベルし、前記ゲノムＤＮＡライ
ブラリーからなる100万個のファージクロンをスクリー
ニングしたところ、３個のクロンを得た。その１つを制
限酵素XhoI（ニッポンジーン社製）で完全分解し、マウ
スＭｅａのｃＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ断片を
得て、これをプラスミドベクターpBluescript SK(-)に
導入、上記同様に処理して、塩基配列を決定した。この
決定した塩基配列を配列表の配列番号３に示す。この配
列番号３に示す塩基配列と配列番号４（後述）に示す塩
基配列との比較から、Ｍｅａゲノム遺伝子は転写後ｍＲ
ＮＡのスプライシングを受けることが示された。配列番
号３において、ゲノムＤＮＡのエクソンの部分に下線を
施した。

【００１９】（実施例３） ウシＭｅａ遺伝子ｃＤＮＡの単離。 黒毛和種（成牛）より精巣を得た。実施例１に述べた方
法によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。ライブラリ
ーの大きさは150万個であった。上記と同様、マウスＭ
ｅａのｃＤＮＡを放射線でラベルし、これをプローブと
し、ウシ精巣ライブラリーをスクリーニングしたとこ
ろ、６個のクロンを得た。このクロンを上記と同様に処
理して塩基配列をサンガー法により決定した。この決定
した塩基配列を配列表の配列番号４に示す。この配列の
ＤＮＡを含むプラスミドを持つ大腸菌は通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターにE.
c.bs-bMea1（寄託番号FERM P-13301）として寄託してい
る。

【００２０】配列番号４のウシＭｅａ配列とマウスのそ
れとを比較するとＤＮＡレベルで70.8%の相同性がみら
れた。翻訳される部分に限って比較すると88.8%の相同
性があった。この部分をＲＮＡで示すと配列表の配列番
号５に示す塩基配列に、ポリペプチドに翻訳すると配列
表の配列番号６に示すアミノ酸配列となる。配列番号２
から演繹されるマウスのポリペプチドとウシの配列番号
６で示されるポリペプチドとを比較すると92.5％(161/1
74)の相同性が認められた。

【００２１】（実施例４） 常染色体上のＭｅａの遺伝子の確認。 ホルスタインおよびＦ１（雌ホルスタインｘ雄黒毛和
種）の雌雄の肝臓からＤＮＡを公知の方法（J. Sambroo
k et al. (Eds.), Molecular Cloning, 2nd ed.,Cold S
pring Harbor Laboratory Press,(1989)）により採取
し、それぞれのＤＮＡ10μgを制限酵素Eco RIで切断
し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲルで電気泳動し
た。このＤＮＡ断片ををナイロン膜に移し取り、放射線
でラベルしたウシＭｅａのｃＤＮＡでサザンハイブリダ
イゼーションを行ったところ、両系統の雌雄ともに共通
のバンド(16, 5.6, 4.2, 3.0 Kb)が見られた（図１、
Ａ）。同様にC57BL/Jマウスの雌雄を用いて試験を行っ
たところ、雌雄共通のバンド(16,5.6, 4.5 Kb)が見られ
た（図１、Ｂ）。Ｍｅａ遺伝子はマウスでは第１７番常
染色体上に、ヒトでは第６染色体にあるといわれている
（Y.-F.C. Lau et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
6, 8462-8466 (1989)）。ウシのＭｅａ遺伝子も常染色
体上にあることが確認できた。

【００２２】（実施例５） 生体におけるＭｅａ遺伝子の発現臓器の確認。 ウシの雌雄から心、肺、肝、脾、胸腺、精巣、卵巣の各
臓器をとり、またマウスの精巣をとり、実施例１に示し
たとおりｍＲＮＡを抽出した。これを各３μgずつアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、前記に記載したとおりナイ
ロン膜に移し取り、放射線でラベルしたウシＭｅａ遺伝
子を用いてノーザンハイブリダイゼーションをおこなっ
た。その結果、を図２に示す。なお、図２における略号
はmTesはマウス精巣、Tesはウシ精巣、Oはウシ卵巣、K
はウシ腎臓、Hはウシ心臓、Lはウシ肺、Tはウシ胸腺、S
はウシ脾臓をそれぞれ示す。図２からＭｅａ遺伝子は主
に精巣で発現することが判った。他の組織でもごく微量
の発現がみられるが、これは非特異的なハイブリダイゼ
ーションと思われる。

【００２３】（実施例６） Ｍｅａ遺伝子を利用したRT-PCR検出系の確立。 既述したように、ＭｅａのＲＮＡがスプライシングされ
ることを利用して、プライマーの位置を選ぶことによ
り、ｃＤＮＡ由来のPCR産物とゲノムＤＮＡ由来のそれ
とを区別することができる。使用したプライマーは次の
とおりである。

【００２４】 5'-ACGAGCTGCGGAGAATCGGT-3' 5'-GGATCCGATCCTGGATATCAGC-3' ウシ精巣の精製したｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを一定
量（500 ng）とり、上記のプライマーを用いてPCRを行
った。その結果、図３に示したように、ｃＤＮＡ由来の
PCR産物（図３中の上図、ｃＤＮＡ）とゲノム由来のそ
れ（雄および雌の記号）とを区別することができた。な
お、図３中の下図は対照として用いたアクチン（Acti
n）遺伝子のPCR産物を示す。

【００２５】（実施例７） 胚への応用。 ウシの１０個の胚盤胞期胚よりキット（Quick Prep Mic
ro mRNA purificationkit, Pharmacia社製）を用いてｍ
ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡ合成キット（First-strand c
DNA Synthesis kit, Pharmacia）を用いて、ｍＲＮＡよ
りｃＤＮＡを合成した。すなわち、まず胚を1.5 mlのチ
ューブに移し、抽出溶液（グアニジンチオシアネートと
Ｎ−サルコシルを含む）400μlを加えてｍＲＮＡを溶出
させ、このｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）ビーズ1 mlに吸着
させ、洗浄液１（10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1 mM EDTA,
0.5 M NaCl）1 mlおよび洗浄液２（10 mM Tris-HCl (p
H7.4), 1 mM EDTA, 0.1M NaCl）1 mlで流し、溶出液（1
0 mM Tris (pH 7.4), 1mM EDTA）200μlで2回溶出し、
ｍＲＮＡを得た。その20μlに12μl のｃＤＮＡ合成液
（逆転写酵素、最終濃度として45 mM Tris-HCl (pH 8.
3), 68 mM KCl, 9mM MgCl₂, 0.08 mg/mlウシ血清アルブ
ミン、15 mM ヂチオスレイトール，1.8 mMdNTP混液、1.
2 μgのランダムプライマーとなるキット）を添加、総
量を33μlとし、37℃で１時間反応し、ｃＤＮＡを合成
した。ここに10μlのＰＣＲ反応液（最終濃度として10
mM Tris-HCl (pH 8.9)、1.5mM MgCl₂、80 mM KCl、0.1%
NaCl、0.1% Triton X-100、50μM dNTP, 0.2 μM DNA
プライマー、2 ユニットTthDNAポリメラーゼをとなるキ
ット）を加え、全反応液量を100μlとし、ＰＣＲ反応を
行った。反応終了後、10μlをとり、NuSieve3:1アガロ
ースゲルでトリスーほう酸緩衝液を用いて電気泳動を行
い、エチジウムブロミドで染色、紫外線下でＤＮＡを検
出した。結果を図４に示す。なお、図４において、＋、
-はそれぞれ反応液中の逆転写酵素（ＲＴ）の存否を示
す。上図はＭｅａ遺伝子の検出を、下図は対照として用
いたアクチン遺伝子の検出を示す。図４上図に示したよ
うに、図３のｃＤＮＡ由来のバンドと同じ長さのPCR産
物が検出された。この時用いたＲＮＡの量は全体の１０
分の１であり、一方、胚盤胞には約150個の細胞が含ま
れていることから、１５個前後の細胞があれば、検出が
可能と計算された。ここで用いた胚は雌雄の識別をして
いないので、１０個のうち半数は雄、半数は雌と考えれ
ば、その半分、すなわち数個の細胞があれば検出できる
計算になる。

【００２６】（実施例８） ウシ胚でのＭｅａ遺伝子の発生初期における発現。 実施例５で示したように、Ｍｅａは生体では主に精巣で
発現している。発生段階のいつから発現するのかを調べ
るため、ウシの２細胞期胚70個、８細胞期胚20個、桑実
胚10個、胚盤胞10個を集め、実施例７に示したようにRT
-PCRにかけた。その結果を図５の電気泳動図に示す。な
お、図５において、＋、-はそれぞれ反応液中のＲＴの
存否を示す。上図はＭｅａ遺伝子の検出を、下図は対照
としてのアクチン遺伝子の検出を示す。図５上から、２
細胞期（ａ）では発現が見られなかったが、８細胞期
（ｂ）、桑実胚（ｃ）、胚盤胞（ｄ）では発現している
ことが判った。したがって、本発明は少なくとも８細胞
期以降の胚の性判別に利用できる。

【００２７】（実施例９） Ｍｅａ遺伝子を利用したRT-PCRによるウシ胚の性判別。 発明者らはすでにウシＹ染色体特異的な繰返し配列を利
用して、PCRによる胚の性判別法を確立し（Kudo et a
l., J. Reprod. Develop., 1993, in press;Itagaki et
al., J. Reprod. Develop., 1993, in press)、特許出
願している（特願平３ー３５２０３２）。

【００２８】そこで、屠場で得たウシ卵巣より卵胞内卵
子を採取し、5%の非働化（56℃、30分）子牛血清、0.5
mMピルビン酸ナトリウム、100 unit/mlペニシリン、100
μg/mlストレプトマイシンを含む 400μlの25 mM HEPE
S緩衝TCM-199(Sigma Chemical Co.) 培地中で、5% CO₂
空気中、39℃で23-24時間成熟させた。これらを凍結融
解したウシ精子で体外受精させ、引き続き胚盤胞に発生
するまで7-8日間培養した。この胚盤胞期胚１７個をマ
イクロブレード(Biocut blade, No. 715, Feather Safe
ty Razor Co.)を装着した顕微操作装置の下で２分割し
た。一方はＹ染色体特異的プライマーを利用して、100
μlのＰＣＲ反応液中（実施例７参照）で反応させた。
用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。

【００２９】ウシＹ染色体特異的プライマー 5'-TGGACATTGCCACAACCATT-3' 5'-GCTGAATGCACTGAGAGAGA-3' ウシ雌雄共通プライマー 5'-GCCCAAGTTGCTAAGCACTC-3' 5'-GCAGAACTAGACTTCGGAGC-3' ２分割胚の他方は、実施例７に示した方法でRT-PCR法に
より分析した。その結果、PCRでオスと判定された９個
の胚はすべてRT-PCRでも雄と判定された。しかし、PCR
で雌と判定された８個の胚のうち、５個はRT-PCRでも雌
となったが、３個はＭｅａ陽性と判定された。通常のPC
R法はほぼ１００％の精度を誇るので、矛盾した結果が
得られた胚は本来雌であろうと想定される。これらは異
常発生胚としてＭｅａ遺伝子が転写もれ(leaky)をおこ
している可能性が考えられる。

【００３０】以上のことは、雄胚は雄として判定できる
が、雄と判定された胚には若干雌胚が混入する可能性が
あることを示している。一方、雌胚と判定された胚は雌
ということができるので、特に、雌胚の同定に有効であ
る。 （実施例１０） マウスにおけるＭｅａ遺伝子を利用したＲＴ−ＰＣＲ検
出系。

【００３１】ウシの場合と全く同じシステムを利用し
て、マウスにおいても雌雄の区別をすることができる。
すなわち、マウスの雌雄より臓器を摘出し、精製したｍ
ＲＮＡを用いて実施例７に示した方法でＲＴ−ＰＣＲを
行った。その結果、図６に示すように、雄の精巣でＭｅ
ａを検出することができた。なお、図６における略号は
mTesはマウス精巣、Lはマウス肝臓、Oはマウス卵巣、K
はマウス腎臓をそれぞれ示す。Aはアクチン検出用プラ
イマー、MはウシＭｅａ検出用のプライマーを使用した
ことを示す。アクチンによるバンドはわずかにＭｅａに
よるバンドより短い。図６のmTesでＭｅａの薄いバンド
と、それより濃い、アクチンのバンドよりさらに短いバ
ンドがみられる。この短いバンドはマウスｍＲＮＡにお
けるスプライシングの差による多様性を示していると考
えられる。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ （１）配列の長さ：792 bp （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：cDNA （６）起源 （ａ）生物名：Mus musculus domesticus （ｂ）株名：CD-1 （７）配列の特徴： （８）配列： CAACGCCGAG AATCAGTGGG GCGGCCCCTG CCCGGATGGC AGCAGTAGTT CTAGGGGGAG 60 ACACCATGGG CCCTGAGCGT ATCTTCCCCA ATCAGACTGA GGACTTAGGG CCACATCAGG 120 GTCCTACAGA AGGAACTGGG GATTGGAGCA GTGAAGAACC CGAGGAAGAG CAGGAGGAAA 180 CAGGAGCAGG CCCAGCAGGC TACTCGTACC AGCCCCTCAA TCAAGACCCT GAACAAGAAG 240 AGGTGGAATT GGCACCAGTG GGTGAAGGAG AAGATGGAGC TGCTGACATC CAAGATCGGA 300 TCCAGGCCCT GGGGCTTCAT CTGCCAGACC CTCCATTGGA GAGTGAGGAT GAAGATGAGG 360 AGGGAGCCGC CGCATTGAGC AGCCACAGCT CTATCCCCAT GGACCCAGAA CATGTAGAGC 420 TGGTGAAAAG GACGATGGCT GGAGTAAGCC TGCCTGCACC AGGGGTTCCT GCCTGGGCTC 480 GGGAGATCTC GGACGCTCAG TGGGAAGATG TGGTACAGAA AGCCCTCCAA GCCCGGCAGG 540 CATCCCCTGC CTGGAAGTGA CCAGAGAGCA AGCCGCCTTA CCTCCCTACA TTCCAAGTCA 600 GGACCAGCAC AGGACTAACA ACTCTGGTCT TAACAGCCTC CTCCTTCCCA TGTCCCTTTC 660 CACACCAAGG CGACTCAGAC CTCTCAGAGA CCCACTTTAT TCAGTTCTGT ACATATGGGG 720 ACATCGGCCC AAGCCCAGCC CACCTTAGCA TGTATCACTC TGTGGAGAAT AAAGCACCCT 780 GTGTACACAG CC Poly(A) 792 配列番号：２ （１）配列の長さ：174 aa （２）配列の型：ポリペプチド （３）鎖の数：１本鎖 （４）トポロジー： （５）配列の種類： （６）起源 （ａ）生物名：Mus musculus domesticus （ｂ）株名：CD-1 （７）配列の特徴： （８）配列： Met Ala Ala Val Val Leu Gly Gly Asp Thr Met Gly Pro Glu Arg 5 10 15 Ile Phe Pro Asn Gln Thr Glu Asp Leu Gly Pro His Gln Gly Pro 20 25 30 Thr Glu Gly Thr Gly Asp Trp Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Glu 35 40 45 Gln Glu Glu Thr Gly Ala Gly Pro Ala Gly Tyr Ser Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Asn Gln Asp Pro Glu Gln Glu Glu Val Glu Leu Ala Pro Val 65 70 75 Gly Glu Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asp Ile Gln Asp Arg Ile Gln 80 85 90 Ala Leu Gly Leu His Leu Pro Asp Pro Pro Leu Glu Ser Glu Asp 95 100 105 Glu Asp Glu Glu Gly Ala Ala Ala Leu Ser Ser His Ser Ser Ile 110 115 120 Pro Met Asp Pro Glu His Val Glu Leu Val Lys Arg Thr Met Ala 125 130 135 Gly Val Ser Leu Pro Ala Pro Gly Val Pro Ala Trp Ala Arg Glu 140 145 150 Ile Ser Asp Ala Gln Trp Glu Asp Val Val Gln Lys Ala Leu Gln 155 160 165 Ala Arg Gln Ala Ser Pro Ala Trp Lys 170 174 配列番号：３ （１）配列の長さ：2597 （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：ゲノム DNA （６）起源 （ａ）生物名：Bos taurus （ｂ）株名：Holstein （７）配列の特徴：イントロンとエクソン（下線）より
なる （８）配列： GCGTTTAAAT GTTTGTGGAC TTTAGCAGGA GACCACCAGG AGCTGGTTGA GAGGCTGAAA 60 GTNGATTTAA TTTCATCCGA CCCGTGTTCT CCTGCCTCCC TGTTCTTGCA GCCCCTGCCC 120GATGGCAACA GTAGTTCTAG GGGGCGACAC CATGGGTCCT GAACGTATCT TCCCCAATCA 180GACTGAGGAA CTGGGGCCAC ATCAGGGCCC CACGGAAGGC ACTGGGGATT GGAGCAGTGA 240GGAACCAGAG GAAGAACAAG AGGAAACGGG GGCAGGACCA GCTGGCTACT CCTACCAGCC 300TCTGAACCAA GATCCTGAAC AAGAGGAGGT GGAACTGGCA CCAGTGGGGG ATGGAGAAGA 360TGTAGTTGCT GATATCCAGG ATCGGATCCA GGCCCTGGGG CTTCATTTGC CGGACCCACC 420AGTAGAAAGT GAGGACGAAG ATGAGCAGGG AGCTACAGCA TTGAACAACC ACAGCTCTAT 480TCCCATGGAC CCAG GTAAAA GAGATCATTC TTTTACTCTG GCATAATTAT GGAAGAAGGG 540 GACTGGTTAA TGCCAATAGA GGGAAGTCCC AGAGGAACAT CCTGCTCCTA AAAGAATAGT 600 TTGTAATCTA AGATTTTCCG GACTTCAGAA TCCAAGTGAG ATGCTATTCT TTTTAGACTG 660 CCAGGATGGG CAGGCTTCCT TAGGAATAAC TGGACAGATT CAGTGACCTT ACTAGTCCAG 720 AATCTCTGAG TTGATTCAAC GAATGGGGAG GGGAGCTGGT CCCATCGTTC CTACCCACTA 780 ACTGGTCTCT GCCTGTGATT TCAGAACATG TAGAGCTGGT GAAAAGGACA ATGGCTGGTA 840TAAGCCTGCC TGCACCAGGG GTTCCTGCCT GGGCTCGCGA GCTATCAGAT GCCCAGTGGG 900AAGACGTGGT ACAGAAGGCC CTCCAAGCCC GGCAGGCCGC CCCTGCCTGG AAGTGACCAC 960CCTGAGAGCT GCCCTAACTC CCTGCATTCC AGGCCAGAAC CAGCACAGGA CTGAACATAT 1020CCTGGTGTCA CATTCATCTC CATCCTCCCC AGCTCCCCTC CACATCAAGG CAAATCAGAC 1080TTCTTCTCAG AGACCCACTT TATTCAGTTC TGTACATATG GGGACATCGG CCCAAGCCCA 1140ACCCACCGTA GCATGTATCA CTCTGTGGAG AATAAAGCAC CCTATGTACA CAGCC AAAAG 1200 CTGCACTGCC TGTGCCCTCG GAACCTGGGT CTGGCCCTCC CCAGCCCCTC ACCCCTCCAA 1260 GGTACCTGAA AGGGACAAAT GAGGACCTGC CCAGCATCAA CACAAACAAG GAAATAAATA 1320 GGTGTTGGGG GAAGCCATGC TTGGAGCACT GCTCCCTGCT TCCTTCTTCT TGGCTTTGGG 1380 GACCAACAGC ACAGGAAAGC AGTCAGCCCC AGGGTGGTCC CTTCCCTGTC AGTGATTCCC 1440 AGGGTTGCTG CTCACCGGAG GGGGCATAGG GTCCGGCGTC TGTTCATCCC CTTCTTCTCG 1500 GTTCCTTTGG GCCCTCTATT CATCAGCTGT GGTCCAGAGC CTATGCTTTT CTCCTTTTGC 1560 CCTCCCACAT TGTCTTGGTC AGGCAAGGGG TAAGAGGAAA TAATGCAGCC CCATCAGCCT 1620 GCACGCCTCT GGGTCTGGGG GCCTATTTGG GCCATTGAGG GTTGGCTCCC CACCGGCTAA 1680 TTCACTCCAG GAGCCAGTGG GNCTTGACAG AACTTTGGTG AGAATCGTCT CCTGCTGCCC 1740 CCTACAGACT TGCAGGGGAG GGAAACNAGG AGNGGGCACC TGGGGNTGAG GGGGGGAGGA 1800 GCGTATTAAT TTCTGTGTGT ATTTCTCAGA GCAGCCTCAG GTAGCTGTGG GGTGAGGAGC 1860 AGGAGGGGGC CAGGCATCCC CATGTCACTC TCAGAGCGCC GAGCACCGCC GTGCCCAGCC 1920 TGTCTGTACT AGGCGCAGGG AGGCATGAAC ACCTTTGGGG GAGAAGAGGG GCCACTCTCT 1980 GGGTGCCCCT GCTTCCAGGG CCGCGTCCCC CCCTCCCCAG AGCAGAGAGG CCCTGCCTTG 2040 CCCCAAGTCA ACCAGTGGGG AGCAGAGGGT GGAGGAGGGC TGGGGCAGTG TCCCAGGGCC 2100 GAGTGGGCCG TTGCCCTGCT GTGGGAGGTG AGGAGGTCAG AGGGCCTCCT GGCTGGCAGT 2160 TAGGAACTCT TCCGCCCGCT TAGTCGCCTC CAGCGCCTTG ATGGTGTACA CGTCCTGGGG 2220 CAGCTCGGAC TTCCGCCGGA GCAGGACTTT CTCCTTCTTG ATGTCCTTCA GCATCTGTGT 2280 GTGCGTGTGC AAAGGGTGGG GGAATACGAC CGAGTACCCC GAGTAACCCC ACCGTCTTCC 2340 TCCCCTTAGT CCCCGGCTCT GCGGCTCCAG CCTCCTCTCC CTCCCAGGGC CGGCTTGTCT 2400 TTGTGCTCCC CGCTCCTACC TGCACGGCCT CTGTCTCCAC CGTCCTCTTC AGAAGCTGGA 2460 TGTCCTCTGC CGTGGGGGTC TCGGTCTCCA TCGAGTACAC GGGAGGCAGA GGGGGAGGCG 2520 CTCGGAACAT GGGATACTGG GAGGAAAGGA GGCAGACAAG TGGCCACCCG GGTGGTGTGT 2580 GGCCCTGTCC GCTTCCC 2597 配列番号：４ （１）配列の長さ：871 bp （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：cDNA （６）起源 （ａ）生物名：Bos taurus （ｂ）株名：Japanese black （７）配列の特徴： （８）配列： GGCACGAGCT GCGGAGAATC GGTGGGGAGG TTGGGGAACG CCGCAACTCG GGCCATTTGA 60 AGGGAGCCCC AGGGGCCCGA AGAGCGTTTG TCAGGCGCCC CTGCCCGATG GCAACAGTAG 120 TTCTAGGGGG CGACACCATG GGTCCTGAAC GTATCTTCCC CAATCAGACT GAGGAACTGG 180 GGCCACATCA GGGCCCCACG GAAGGCACTG GGGATTGGAG CAGTGAGGAA CCAGAGGAAG 240 AACAAGAGGA AACGGGGGCA GGACCAGCTG GCTACTCCTA CCAGCCTCTG AACCAAGATC 300 CTGAACAAGA GGAGGTGGAA CTGGCACCAG TGGGGGATGG AGAAGATGTA GTTGCTGATA 360 TCCAGGATCG GATCCAGGCC CTGGGGCTTC ATTTGCCGGA CCCACCAGTA GAAAGTGAGG 420 ACGAAGATGA GCAGGGAGCT ACAGCATTGA ACAACCACAG CTCTATTCCC ATGGACCCAG 480 AACATGTAGA GCTGGTGAAA AGGACAATGG CTGGTATAAG CCTGCCTGCA CCAGGGGTTC 540 CTGCCTGGGC TCGCGAGCTA TCAGATGCCC AGTGGGAAGA CGTGGTACAG AAGGCCCTCC 600 AAGCCCGGCA GGCCGCCCCT GCCTGGAAGT GACCACCCTG AGAGCTGCCC TAACTCCCTG 660 CATTCCAGGC CAGAACCAGC ACAGGACTGA ACATATCCTG GTGTCACATT CATCTCCATC 720 CTCCCCAGCT CCCCTCCACA TCAAGGCAAA TCAGACTTCT TCTCAGAGAC CCACTTTATT 780 CAGTTCTGTA CATATGGGGA CATCGGCCCA AGCCCAACCC ACCGTAGCAT GTATCACTCT 840 GTGGAGAATA AAGCACCCTA TGTACACAGC C Poly(A) 871 配列番号：５ （１）配列の長さ：871 b （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：１本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：mRNA （６）起源 （ａ）生物名：Bos taurus （ｂ）株名：Japanese black （７）配列の特徴：配列番号４をRNAに変換したもの （８）配列： GGCACGAGCU GCGGAGAAUC GGUGGGGAGG UUGGGGAACG CCGCAACUCG GGCCAUUUGA 60 AGGGAGCCCC AGGGGCCCGA AGAGCGUUUG UCAGGCGCCC CUGCCCGAUG GCAACAGUAG 120 UUCUAGGGGG CGACACCAUG GGUCCUGAAC GUAUCUUCCC CAAUCAGACU GAGGAACUGG 180 GGCCACAUCA GGGCCCCACG GAAGGCACUG GGGAUUGGAG CAGUGAGGAA CCAGAGGAAG 240 AACAAGAGGA AACGGGGGCA GGACCAGCUG GCUACUCCUA CCAGCCUCUG AACCAAGAUC 300 CUGAACAAGA GGAGGUGGAA CUGGCACCAG UGGGGGAUGG AGAAGAUGUA GUUGCUGAUA 360 UCCAGGAUCG GAUCCAGGCC CUGGGGCUUC AUUUGCCGGA CCCACCAGUA GAAAGUGAGG 420 ACGAAGAUGA GCAGGGAGCU ACAGCAUUGA ACAACCACAG CUCUAUUCCC AUGGACCCAG 480 AACAUGUAGA GCUGGUGAAA AGGACAAUGG CUGGUAUAAG CCUGCCUGCA CCAGGGGUUC 540 CUGCCUGGGC UCGCGAGCUA UCAGAUGCCC AGUGGGAAGA CGUGGUACAG AAGGCCCUCC 600 AAGCCCGGCA GGCCGCCCCU GCCUGGAAGU GACCACCCUG AGAGCUGCCC UAACUCCCUG 660 CAUUCCAGGC CAGAACCAGC ACAGGACUGA ACAUAUCCUG GUGUCACAUU CAUCUCCAUC 720 CUCCCCAGCU CCCCUCCACA UCAAGGCAAA UCAGACUUCU UCUCAGAGAC CCACUUUAUU 780 CAGUUCUGUA CAUAUGGGGA CAUCGGCCCA AGCCCAACCC ACCGUAGCAU GUAUCACUCU 840 GUGGAGAAUA AAGCACCCUA UGUACACAGC C Poly(A) 871 配列番号：６ （１）配列の長さ：174 aa （２）配列の型：ポリペプチド （３）鎖の数：１本鎖 （４）トポロジー： （５）配列の種類： （６）起源 （ａ）生物名：Bos taurus （ｂ）株名：Japanese black （７）配列の特徴：配列番号４から翻訳したもの （８）配列： Met Ala Thr Val Val Leu Gly Gly Asp Thr Met Gly Pro Glu Arg 5 10 15 Ile Phe Pro Asn Gln Thr Glu Glu Leu Gly Pro His Gln Gly Pro 20 25 30 Thr Glu Gly Thr Gly Asp Trp Ser Ser Glu Glu Pro Glu Glu Glu 35 40 45 Gln Glu Glu Thr Gly Ala Gly Pro Ala Gly Tyr Ser Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Asn Gln Asp Pro Glu Gln Glu Glu Val Glu Leu Ala Pro Val 65 70 75 Gly Asp Gly Glu Asp Val Val Ala Asp Ile Gln Asp Arg Ile Gln 80 85 90 Ala Leu Gly Leu His Leu Pro Asp Pro Pro Val Glu Ser Glu Asp 95 100 105 Glu Asp Glu Gln Gly Ala Thr Ala Leu Asn Asn His Ser Ser Ile 110 115 120 Pro Met Asp Pro Glu His Val Glu Leu Val Lys Arg Thr Met Ala 125 130 135 Gly Ile Ser Leu Pro Ala Pro Gly Val Pro Ala Trp Ala Arg Glu 140 145 150 Leu Ser Asp Ala Gln Trp Glu Asp Val Val Gln Lys Ala Leu Gln 155 160 165 Ala Arg Gln Ala Ala Pro Ala Trp Lys 170 174 配列番号：７ （１）配列の長さ：18 （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：１本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成DNA （６）起源 （ａ）生物名：Mus musculus domesticus （ｂ）株名：CD-1 （７）配列の特徴：配列番号１のNo. 114-131 （８）配列：5' CATCAGGGTCCTACAGAA 3' 配列番号：８ （１）配列の長さ：18 （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：１本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成DNA （６）起源 （ａ）生物名：Mus musculus domesticus （ｂ）株名：CD-1 （７）配列の特徴：配列番号１のNo.405-422 （８）配列：5' CAGCTCTACATGTTCTGG 3' 配列番号：９ （１）配列の長さ：20 （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：１本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成DNA （６）起源 （ａ）生物名：Bos taurus （ｂ）株名：Japanese black （７）配列の特徴：配列番号４のNo.4-23 （８）配列：5' ACGAGCTGCGGAGAATCGGT 3' 配列番号：１０ （１）配列の長さ：22 （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：１本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：合成DNA （６）起源 （ａ）生物名：Bos taurus （ｂ）株名：Japanese black （７）配列の特徴：配列番号４のNo.354-375 （８）配列：5' GGATCCGATCCTGGATATCAGC 3'

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシＭｅａのｃＤＮＡをプローブとして用いた
サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動図
である。ＡではウシＤＮＡ、ＢではマウスＤＮＡを用い
た。

【図２】ウシＭｅａのｃＤＮＡをプローブとして用いた
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動
図である。

【図３】RT-PCRに用いるプライマーをイントロンを挟む
よう設定することによりゲノムＤＮＡ由来の産物（上
図、雄および雌の記号）とｃＤＮＡ由来のそれ（上図、
cDNA）とが区別できることを示す電気泳動図である。下
図（Actin）は共通の対照である。

【図４】RT-PCRを用いて胚の性判別を行った電気泳動図
である。

【図５】ウシ胚でのＭｅａ遺伝子の発生初期ににおける
発現を示す電気泳動図である。

【図６】ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスの精巣でＭｅａが
特異的に発現していることを示す電気泳動図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年１１月１８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシＭｅａのｃＤＮＡをプローブとして用いた
サザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動の
写真である。ＡではウシＤＮＡ、ＢではマウスＤＮＡを
用いた。

【図２】ウシＭｅａのｃＤＮＡをプローブとして用いた
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動
の写真である。

【図３】RT-PCRに用いるプライマーをイントロンを挟む
よう設定することによりゲノムＤＮＡ由来の産物（上
図、雄および雌の記号）とｃＤＮＡ由来のそれ（上図、
ｃＤＮＡ）とが区別できることを示す電気泳動の写真で
ある。下図（Actin）は共通の対照である。

【図４】RT-PCRを用いて胚の性判別を行った電気泳動の
写真である。

【図５】ウシ胚でのＭｅａ遺伝子の発生初期における発
現を示す電気泳動の写真である。

【図６】RT-PCR法によりマウスの精巣でＭｅａが特異的
に発現していることを示す電気泳動の写真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｎ 7055−2Ｊ (72)発明者 佐藤 静治 茨城県北相馬郡守谷町久保ケ丘１丁目２番 伊藤ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者 須藤 鎮世 茨城県北相馬郡守谷町久保ケ丘１丁目２番 伊藤ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者 中村 豊郎 茨城県北相馬郡守谷町久保ケ丘１丁目２番 伊藤ハム株式会社中央研究所内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１により表される塩基配列を有
   するマウスｃＤＮＡおよびその相補鎖。
2. 【請求項２】 配列番号２により表されるアミノ酸配列
   を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号３により表される塩基配列を有
   するウシゲノムＤＮＡおよびその相補鎖。
4. 【請求項４】 配列番号４により表される塩基配列を有
   するウシｃＤＮＡおよびその相補鎖。
5. 【請求項５】 配列番号５により表される塩基配列を有
   するＲＮＡおよびその相補鎖。
6. 【請求項６】 配列番号１、配列番号３、配列番号４、
   および配列番号５で表される核酸とハイブリダイズしう
   る核酸。
7. 【請求項７】 配列番号６により表されるアミノ酸配列
   を有するポリペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号７および配列番号８により表さ
   れるプライマーＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列番号９および配列番号１０により表
   されるプライマーＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 マウスあるいはウシの胚または組織の
    １部を採取し、該組織から逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ
    を作製し、請求項１、請求項３、請求項４、請求項５お
    よび請求項６の核酸の少なくとも１部をプライマーとし
    て用い、性により発現に差のある遺伝子の１部を増幅さ
    せることによりマウス又はウシの性を判別する方法。
11. 【請求項１１】 マウスあるいはウシの胚又は組織の１
    部を採取し、細胞標本を作製し、請求項１、請求項３、
    請求項４、請求項５および請求項６に記載される核酸の
    全て又は１部を標識して標識したプローブとして用い、
    性により発現に差のあるｍＲＮＡにハイブリダイズさせ
    ることを特徴とするマウス又はウシの性を判別する方
    法。