CN109689089A - 治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

发明人已经在BALB/c小鼠中开发了转移性4T1乳腺肿瘤模型。他们已经证明，异种胚胎干细胞与丙戊酸(VPA)联合接种产生针对乳腺癌的更高的抗肿瘤反应并抑制转移发展。他们确定，与单独使用ESC或iPSC相比，这些反应仅通过在治疗方案中添加丙戊酸实现。因此，本发明人提供了治疗表达胚胎抗原的癌症的新治疗策略。因此，本发明涉及治疗患有癌症的受试者的方法，包括以下步骤：向所述受试者同时、分别或依次施用治疗量的作为组合制剂的i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达的组的化合物。

Description

治疗癌症的方法和组合物

技术领域

本发明属于肿瘤学领域，更具体地，本发明涉及一种抗癌疫苗联合疗法。

更具体地，本发明涉及产生包含多能细胞的组合物的方法，所述多能细胞呈递多种新抗原，并且其可用于制备癌细胞疫苗。

背景技术

大多数癌症是由在发育和组织维持期间所需的正常干细胞的DNA复制期间产生的随机突变引起的。癌症干细胞(CSC)在动态状态中是异质性的并且在表观遗传上是塑性的。由CSC产生的肿瘤细胞由同时积累的存在于癌基因、肿瘤抑制基因和信号传导途径上的突变驱动，导致肿瘤进化的克隆波。在“克隆-进化模型”中，突变的类型随着癌症的发展而变化，因此个体癌细胞变得越来越变化和侵略性。在早期肿瘤发展中获得的突变在晚期疾病中持续存在。

随着时间的推移，这些突变导致寡克隆肿瘤扩增，以及与进行性免疫编辑和耗尽相关的癌细胞抗性。癌症的突变特征与基因组的不稳定性高度相关。突变产生具有免疫原性表位的新型非自身新抗原。然而，由于肿瘤微环境通常是免疫抑制的，宿主免疫系统通常不能正确地破坏这些细胞并对抗这些癌症。免疫检查点抑制剂的T细胞应答报告的临床益处与肿瘤的突变率和突变谱密切相关。

癌症干细胞(CSC)代表了一小部分自我更新的癌细胞，这些细胞有助于肿瘤持续存在和复发，因为它们经常对常规治疗产生抗性。在各种来源的实体瘤中描述了最初在造血系统恶性肿瘤中发现的CSC，包括乳腺癌、成胶质细胞瘤、前列腺癌、结肠癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌。CSC的特征在于在小鼠中形成异种肿瘤和肿瘤发生能力。此外，它们具有放射性和化学抗性，导致患者缺乏治疗性反应。因此，在治疗完成后，CSC持续性地引起肿瘤复发和/或转移。一些出版物已经表明了肿瘤发病机制与胚胎干细胞(ESC)状态之间的分子联系。CSC表达大量胚胎抗原，所述胚胎抗原也由人胚胎干细胞(hESC)和人诱导的多能干细胞(hiPSC)表达。

首先，OCT4、NANOG和SOX2转录因子是主要调节因子，它们作为高度整合网络(与c-myc和多梳(polycomb)网络相关)的一部分一起工作，使用表观遗传机制通过组蛋白修饰和DNA甲基化重塑染色质，以驱动体细胞转变为CSC或iPSC。这些因子在正常成体干细胞中不存在。胚胎干细胞样基因表达和定义人多能干细胞(ESC/IPSC)身份的多梳调控基因的低表达在低分化的人肿瘤中与临床结果差和化疗后远处复发相关，无论癌症来源如何(乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、成神经管细胞瘤...)。具有“干性”特征的低分化肿瘤与具有上皮-间充质“EMT”标志物的癌细胞的间充质性状、低水平的MHC-I表达、具有促肿瘤炎性白细胞的免疫抑制性肿瘤微环境、基质细胞和巨噬细胞相关。经历EMT的肿瘤细胞获得干性性质并且成为具有在整个生物体中非常早地迁移且长时间持续处于休眠期的能力的CSC。CSC充当种子储库并补充肿瘤隔室。它们还通过自我更新扩增，传播到不同的组织，产生转移。这些CSC具有多能胚胎基因特征，并且对抗癌药物和放疗具有抗性。由于上述原因(免疫抑制性微环境)，它们也逃避了免疫抗肿瘤防御。

据报道，胎儿组织可用于使小鼠免疫，并且这可以诱导移植肿瘤的排斥，包括皮肤癌、肝癌和胃肠道癌。这种反应可以通过以下事实来解释：这些肿瘤细胞表达大量癌胚抗原。

迄今为止，已经建立了几种人类癌症疫苗试验，以靶向胚胎抗原，例如癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白或癌症/睾丸抗原。不幸的是，已经证明单独靶向一种抗原不足以产生强的抗肿瘤免疫应答以介导肿瘤排斥，因为逃逸突变体的快速出现导致单价癌症疫苗的普遍低效。

最近对干细胞在再生医学中的潜力的兴趣使得定义明确的ESC系以及在表型上和功能上与ESC相似的iPSC得以广泛应用。

癌症相关的表观遗传畸变是癌症干细胞的特征性状，涉及表观遗传机制的每个组分(DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、特别是microRNA表达)。

目前，几种具有肿瘤抑制活性的表观遗传修饰药物在肿瘤学中用于临床，包括低甲基化剂如阿扎胞苷或地西他滨，以及组蛋白脱乙酰基酶抑制剂如伏立诺他或罗米地辛。

使用这些药物，可以重新编程癌细胞。此外，表观遗传药物对肿瘤微环境的表观遗传重编程是一种癌症治疗的有吸引力的操作方法，因为有明确证据表明癌症发展中癌症-基质的相互作用。

因此，仍然需要新的方法来预防和/或治疗具有干细胞特征的癌症。这些癌症表达与ESC/IPSC共有的一组胚胎基因(即，也称为新抗原)，尤其包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、成神经管细胞瘤、胆管癌、肝癌、慢性和急性白血病和骨髓瘤。这类癌症主要与间充质样特征相关，其需要开发特异性靶向CSC的疗法以改善癌症患者的存活并提高生活质量。特别地，这样的策略应导致恢复允许的抗肿瘤微环境(肿瘤微环境通常是免疫抑制的，因此应重建为具有免疫活性)和免疫抗CSC应答。本发明的主题全部或部分地解决了这个需求和其他需求。

发明简述

本发明基于发明人确定，当向患者施用HDACi(组蛋白脱乙酰基酶抑制剂)与含有目标抗原或靶向目标抗原的免疫原性组合物的组合时，任选随后用HDACi进一步治疗，HDACi可用于针对所述目标抗原刺激患者的免疫应答。免疫原性组合物旨在允许针对目标抗原的免疫应答的发生。使用HDACi作为佐剂对于治疗癌症特别令人感兴趣，特别是对于具有干细胞特征的癌症。本发明尤其由权利要求限定。

发明详述

发明人已经表明，将HDACi与多能细胞群一起使用导致免疫系统针对肿瘤细胞的协同作用和有效应答。

实际上，发明人进一步假设，多能干细胞如hESC或hiPSC可用作疫苗以产生针对肿瘤细胞共有的各种胚胎抗原的免疫应答。他们发现，用hESC或hiPSC联合一种能够诱导MHCI的化合物(如丙戊酸)免疫接种小鼠能够诱导针对乳腺癌的有效免疫和抗肿瘤反应，而没有副作用和自身免疫疾病的迹象。此外，他们发现，这种联合方案与肺转移的显著抑制有关。令人惊讶的是，他们证实，与单独使用ESC或iPSC相比，通过在治疗方案中加入HDACI，特别是丙戊酸，可以极大改进这些反应。

用于改进免疫应答的HDACi

本发明涉及增强患者中疫苗组合物的功效的方法，包括向患者施用HDACi和所述疫苗组合物。特别地，可以在疫苗组合物中加入HDACi。

功效增强可以理解为疫苗组合物的免疫原性增强，针对疫苗组合物的免疫应答增强或由免疫组合物产生的免疫应答增强。这可以与不存在HDACi时产生的免疫应答进行比较。

疫苗组合物包括旨在使患者产生针对一个或多个目标抗原的免疫应答的免疫原性元件。目标抗原是期望免疫应答的任何抗原，包括来自自身的(例如来自癌细胞的抗原)或外源的任何肽、蛋白质，例如细菌、病毒或寄生虫蛋白，其他种类的抗原，例如核酸、糖、脂多糖等。

因此，本发明涉及HDACi作为佐剂，特别是用于增强针对疫苗组合物的免疫应答的用途，并且涉及用作佐剂，或用于增强针对疫苗组合物的免疫应答的HDACi。本发明还涉及HDACi在制备含有一种或多种目标抗原的疫苗组合物中的用途，所述疫苗组合物旨在使患者产生针对目标抗原的免疫应答。

当疫苗组合物是癌症疫苗组合物，即含有由癌细胞表达的目标抗原时，本文公开的方法和用途特别令人感兴趣。特别地，该方法和用途非常适用于实体瘤癌症。实际上，在这些类型的癌症中，免疫微环境特别是免疫抑制的(即，存在细胞因子和分子信号的表达，以及这些CD4细胞的募集，免疫细胞对癌抗原的效力降低)；不受这一理论束缚，假定HDACi的存在将改变微环境并允许免疫细胞增强以对抗癌细胞，可能是通过改变在肿瘤内、肿瘤附近或肿瘤周围的细胞中具有免疫抑制作用的基因的表达。

本文所述的方法还包括在施用疫苗组合物后几天施用HDACi的步骤。HDACi的这种连续施用可用于将微环境变化维持足够长的时间以使免疫细胞能够“接管”肿瘤。通常，HDACi的这种进一步连续施用在于在施用疫苗后至少三天，并且长达一个月，每天施用足够剂量的HDACi。然而，优选进一步施用HDACi至少一周，更优选至少或约两周。

疫苗组合物包含旨在使患者产生针对一个或多个目标抗原的免疫应答的免疫原性元件(化合物)。

所述免疫原性元件可以是抗原(或多个抗原)。如上所述，取决于靶细胞(其意欲包括宿主细胞，以及细菌细胞、寄生病原体或病毒颗粒)，该抗原可以是任何形式。它也可以与本领域已知的任何佐剂(免疫刺激剂)，例如明矾或弗氏完全或不完全佐剂一起配制。

在另一个实施方案中，免疫原性化合物是来自细胞组合物的提取物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原。细胞提取物可以是已经离心以除去不溶物例如膜片段、囊泡和细胞核的裂解细胞，因此主要由细胞溶质组成。在另一个实施方案中，提取物可以使用特定技术制备以耗尽或富集特定组分(例如，超声处理可用于将大的膜片段破碎成保留在提取物中的小颗粒，或高速离心以除去最小的不溶性组分)。通过任何化学或机械作用，例如通过压力、蒸馏、蒸发等获得细胞提取物。

在另一个实施方案中，免疫原性元件是细胞组合物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原。在该实施方案中，优选保留细胞膜(以便通过MHC-I途径呈递抗原)。如下所述，优选细胞是灭活的。

在这些实施方案中，细胞可以是多能细胞，如下所述，癌细胞、病毒感染的细胞或细菌细胞。

在另一个实施方案中，免疫原性元件是包含已经通过目标抗原在体外引发(prime)的抗原呈递细胞(APC)的细胞组合物。该组合物是抗原呈递细胞疫苗，由抗原和抗原呈递细胞(APC)制成。抗原呈递细胞是在其表面上显示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原的细胞。在本发明的上下文中，可以引用优选的树突细胞(DC)，因为它们能够将抗原呈递给辅助细胞和细胞毒性T细胞、巨噬细胞或B细胞。这些APC可以是天然细胞或工程化细胞。特别地，可以引用Eggermont等(Trends in Biotechnology,2014,32,9,456-465)，其综述了开发人工抗原呈递细胞的进展。使用APC开发抗癌疫苗的方法是本领域已经广泛提出的，并且是本领域技术人员已知的。

在另一个实施方案中，免疫原性元件实际上不含抗原，而是由在体外针对目标抗原引发(例如通过暴露于呈递目标抗原的抗原呈递细胞)的T细胞淋巴细胞的组合物组成。因此，该组合物能够在体内针对目标抗原产生免疫应答。这种策略可以称为“T细胞的过继转移”，并且已知这种过继转移的T细胞在体内持续存在很长一段时间并且容易在淋巴和血管隔室之间迁移(Bear等,J Biomed Biotechnol.2011；2011:417403；Melief等,J ClinInvest.2015；125(9):3401-3412)。

在所有这些实施方案中，HDACi与含有免疫原性元件的疫苗组合物联合施用。所述施用可以是同时、分别或依次进行，如以下免疫原性元件是多能细胞组合物的实施方案所公开。应注意，对于多能细胞组合物公开的以下所有描述同样适用于如上所述的包含任何免疫原性元件的疫苗。

本说明书强调HDAC抑制剂(特别是丙戊酸)，以及多能细胞组合物，因为这种多能细胞表达在非常侵袭性的癌症中同样存在的新抗原，如上所述。因此，无论免疫原性元件如何，优选目标抗原是由癌细胞表达的新抗原，如上文以及下文所述。

特别地，免疫原性元件是细胞组合物，其中细胞组合物通过多能细胞的扩增和灭活获得，如下面进一步详细公开。

用组合制剂治疗患有癌症的受试者的方法

本发明涉及治疗患有癌症的受试者的方法，包括向所述受试者同时、分别或依次施用治疗量的作为组合制剂的i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的化合物的步骤。

在优选的环境中，培养细胞以便通过MHC I途径呈递新抗原，特别是群体中的一些细胞存在突变。与细胞联合使用的化合物也可以保持细胞的多能性。优选在施用细胞之后，施用激活MHC表达和/或免疫应答的化合物(优选与最初联合施用的化合物相同，但可能是另一种)以增强免疫应答。

如本文所用，术语“治疗”是指预防或预防性治疗以及治愈性或疾病改变性治疗，包括治疗具有高度患癌症(例如遗传性家族癌症综合征)风险的受试者，或怀疑患有癌症的受试者以及生病或已经被诊断患有癌症或医学病症的受试者，且包括抑制临床复发。可以向患有癌症或最终可能患有癌症的受试者施用治疗，以预防、治愈、延迟癌症或复发性癌症的一种或多种症状的发作、降低癌症或复发性癌症的一种或多种症状的严重性或改善癌症或复发性癌症的一种或多种症状，或者为了延长受试者的存活期超过在没有这种治疗的情况下预期的存活期。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的一般目标是在治疗方案的初始阶段向受试者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)采用“加载方案”，其可以包括施用比医生在维持方案期间使用的更大剂量的药物，比医生在维持治疗期间更频繁地施用药物，或两者。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在治疗疾病期间维持受试者，例如使受试者长期(数月或数年)保持缓解的治疗方案(或治疗方案的一部分)。维持方案可以采用持续治疗(例如以规律的间隔(例如每周、每月、每年等)施用药物)或间歇治疗(例如中断治疗、间歇治疗、复发治疗或实现特定的预定标准(例如疼痛、疾病表现等)时的治疗)。

如本文所用，术语“同时施用”是指通过相同途径并同时或基本上同时施用2种活性成分。术语“分别施用”是指同时或基本上同时通过不同途径施用2种活性成分。术语“依次施用”是指在不同时间施用2种活性成分，施用途径相同或不同。

如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物以及非人类和人类灵长类动物。特别地，在本发明中，受试者是患有或易患有具有癌症的人，所述癌症表达多能胚胎样干细胞抗原。

如本文所用，术语“群体”是指细胞群，其中细胞总数的大多数(例如至少约20％、优选至少约50％、更优选至少约70％、甚至更优选至少约80％，甚至更优选至少约90％)具有目标细胞的特定特征(例如，由包括至少96个标志物(Adewumi等,Nat Biotech 2007)和基于基因表达的测定(PluriTest)(FJMuller，Nature Methods 2011)的国际干细胞倡议定义的iPSC、ESC的多能性标志物)。

特别地，术语“多能细胞群”是指其中细胞的特征是表达iPSC或ESC的多能性标志物的细胞群。这些细胞优选选自人胚胎干细胞(hESC)、诱导的人多能干细胞(hiPSC)、同种异体、异种或同基因/自体干细胞。

如本文所用，术语“多能性”是指细胞具有产生后代的能力，所述后代在适当条件下可以从三个胚层(内胚层，中胚层和外胚层)衍生分化为具有特定细胞谱系特征的所有细胞类型。术语“多能性”包括正常胚胎干细胞(ESC)、或非常小的胚胎样干细胞(VSEL)或从所有来源和细胞来源的成体体细胞(ASC)重编程的工程诱导的多能干细胞(iPSC)。

多能干细胞贡献了产前、出生后或成年生物的组织。使用标准的本领域公认的测试来建立细胞群的多能性，例如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，以及各种多能干细胞特征。更具体地，人多能干细胞表达来自以下非限制性列表的至少一些(至少三个、更通常至少四个或五个)和任选地所有标志物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、碱性磷酸酶(ALP)、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-1、Oct4、Lin28、Rex1、Nanog、TERC、TERT。

多能干细胞一般起源于胚胎发育的胚泡阶段，并且可能除了胎盘外，还能够发育成所有类型的胎儿和成体细胞。胚胎多能干细胞(ESC)通常可以从50-150个细胞的4-5天龄的受精后胚泡中分离。虽然ESC能够无限期离体增殖，它们在胚胎发生期间仅在体内瞬时存在。各种动物(包括人)ESC系，例如NIH批准的细胞系WAO9人ESC可以从WiCell ResearchInstitute，Madison，Wis商购获得。人ESC系，例如Cecol-14，可以从例如Cecolfes,Bogota,Colombia商购获得。当然，如果需要，可以使用其他胚胎干细胞系。

如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指人的多能细胞(即hESC)。hESC从胚泡前期的胚胎中分离。在另一个实施方案中，通过将至少部分分化的细胞(例如专能细胞)去分化来制备hES细胞，它们在实践中具有全能性。制备hESC的方法是众所周知的，并且教导于例如美国专利号5,843,780、6,200,806、7,029,913、5,453,357、5,690,926、6,642,048、6,800,480、5,166,065、6,090,622、6,562,619、6,921,632和5,914,268、美国公开申请号2005/0176707、国际申请号WO2001085917。在本发明的上下文中，根据Chung等2008中描述的技术，在不破坏胚胎的情况下产生人胚胎干细胞(hESC)。

如本文所用，术语“诱导的多能干细胞”是指使用本领域已知的并且最初由Yamanaka公开的方法(特别是WO2012/060473、PCT/JP2006/324881、PCT/JP02/05350、US 9,499,797、US 9,637,732、US 8,158,766、US 8,129,187、US 8,058,065、US 8,278,104)，通过重编程程序从非多能细胞人工衍生的多能干细胞。简言之，通过确定因子(例如Oct4、Sox2、Klf4和c-My，或Oct4、Sox2、Lin28和Nanog)的异位表达将体细胞重编程为诱导的多能干细胞(iPSC)。在一个具体的实施方案中，诱导的多能干细胞衍生自哺乳动物，特别是(但不限于)啮齿动物、猪、猫、狗和非人灵长类动物，和人。

已经从各种来源的体细胞(成纤维细胞、血细胞、角质形成细胞......)并在含或不含小化合物的情况下使用各种技术(如整合的慢病毒/逆转录病毒和非整合的载体，如仙台病毒、游离载体、合成mRNA、腺病毒、rAAV、重组蛋白质......)成功地制备了iPSC。

通过充当表观遗传修饰物(即，修饰一些基因的表达)，小分子可用于增强小鼠和人iPSC的诱导和质量。举例来说，可以引用BIX01294(BIX，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂)、丁酸钠(NaB，组蛋白脱乙酰基酶HDAC抑制剂)或S-腺苷酸同型半胱氨酸(SAH，DNA去甲基化剂)、5-氮杂胞苷(5-AZA，DNA甲基转移酶抑制剂)、丙戊酸(VPA，另一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂)也改进了正常iPSC的重编程和质量。

完全重编程的真正的iPSC表达与具有自我更新能力的胚胎干细胞相似的多能基因并且代表无限的干细胞(或干细胞样)资源。

ESC和IPSC可以在多个和无限(illimited)的传代中反复扩增，从而允许可扩大的干细胞来源。通过保持多能性基因的高水平表达，在容许培养条件下积极维持多能性潜力。这些方法在本领域中是已知的。

然而，已经描述了允许复制稳定的基因组(但具有一些外显子组突变和表观基因组修饰)的特定培养条件和方法(Gore A and al.Nature 2011)。

如本文所用，术语“体细胞”是指除生殖细胞(精子和卵子)外的任何机体细胞。

如本文所用，术语“同种异体细胞”是指来自相同物种但在遗传上不同的细胞。

如本文所用，术语“同基因或自体细胞”是指来自相同物种且具有相同遗传背景的细胞。

如本文所用，术语“异种细胞”是指来自不同物种并且遗传上不同的细胞。

在一个具体实施方案中，干细胞可以源自哺乳动物，但不限于啮齿动物、猪、猫、狗和灵长类动物，包括人。

生产多能细胞群的方法

在第一个方面，本发明涉及生产细胞组合物的方法，包括以下步骤：

i)在维持细胞多能性的这种条件下，在扩增步骤期间诱导所述群体中的MHC-I抗原呈递的试剂存在下，扩增多能细胞，

ii)将扩增的细胞暴露于将使细胞灭活的灭活剂，

iii)回收并调节扩增的灭活细胞。

在一个具体的实施方案中，在步骤ii)中保持细胞被膜的完整性。

在另一个实施方案中，将细胞灭活并获得细胞衍生产物，例如细胞提取物。

根据本发明所公开的方法，根据上述方法产生的细胞组合物可用于癌症治疗。

用于MHC I抗原呈递的试剂

在改进通过MHC I途径的抗原呈递的试剂存在下扩增多能细胞。通过比较在存在或不存在试剂的情况下细胞表面的MHC I分子数，可以检查这种改进的表达。

这些试剂是本领域已知的，尤其可以引用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)。具有这种活性的许多产品是本领域已知的，在这些HDAC中，尤其可以引用丙戊酸盐(VPA或丙戊酸，CAS号99-66-1)。可以使用的其他HDACi(因为它们与VPA具有相同的作用模式)，特别是伏立诺他(vorinostat)、罗米地辛(romidepsin)、西达本胺(chidamide)、帕比司他(panobinostat)、贝利司他(belinostat)、帕比司他、莫西诺司他(mocetinostat)、阿昔诺司他(abexinostat)、恩替诺特(entinostat)、SB939、瑞米司他(resminostat)、吉维斯特(givinostat)或奎司他斯特(quisinostat)。

在多能细胞扩增期间，这些试剂存在于细胞(扩增)培养基中。

维持细胞的多能性

在维持细胞多能性的条件下(培养基、温度)进行细胞扩增。这些培养条件是本领域已知的。维持细胞的多能性将确保这些细胞表达(从而呈递)所有胚胎抗原，从而增强细胞通过MHC I途径在其表面呈递这种抗原的能力。

多能细胞表面呈递的胚胎抗原越多，至少一种这些抗原将存在于癌细胞表面的可能性越高，所述癌细胞将会被通过本发明的疫苗组合物引发的免疫系统所识别并靶向。

因此，维持通过本文公开的方法获得的根据本发明的组合物的细胞的多能性导致各种胚胎抗原的呈递，从而导致本发明的疫苗组合物在本文公开的治疗方法中的广泛效力。

在维持多能性的条件下扩增细胞是本领域已知的。它尤其描述于目前所述的所有iPSC扩增方案中(Shi Y and al,Nat Rev Drug Discovery 2017；Chen KG and al CellStem Cell.2014)。优选使用以下条件：

-使用E8培养基或所有临床级ES/iPSC培养基，任选补充有VPA和/或突变剂(例如ENU，参见以下)，

-37℃的温度，具有或不具有低氧条件，

-用添加有VPA(0.1mM-5mM)和/或ENU(0.1μg/ml-100μg/ml)和/或p53抑制剂和/或增强细胞存活的化合物例如Y-27632Rock抑制剂的相同培养基每天更换培养基。

通常培养细胞8周，使用酶促分离(胶原酶、胰蛋白酶)每周一次通过常规传代维持90％的最佳密度。

将细胞灭活

在优选的实施方案中，用于本文公开的治疗方法的多能细胞是灭活的。术语“灭活的”及其语法变体在本文中用于指存活但已经不能增殖(即，有丝分裂灭活)的细胞(例如多能细胞)。本领域技术人员可以使用本领域已知的技术，包括但不限于暴露于化学试剂、辐射和/或冻干。多能细胞可以被灭活，使得在向受试者施用时多能细胞不能分裂，因此不能在受试者中形成畸胎瘤。应理解，在多个细胞的背景下，并非每个细胞都需要不能增殖。因此，如本文所用，短语“灭活到足以防止在受试者中形成畸胎瘤的程度”是指整个群体中的灭活程度，使得在向受试者施用后不会形成畸胎瘤，因为如体外培养所证实的，经辐射的多能性干细胞不再分裂。应注意，即使多个细胞中的一个或多个细胞实际上能够在受试者中增殖，也假定宿主的免疫系统将在畸胎瘤形成之前破坏那些细胞。通过在具有功能性和非功能性免疫系统的小鼠中进行测试，可以证实不能增殖和不能形成畸胎瘤。

在一些实施方案中，“灭活的”细胞是杀死的细胞，在一些实施方案中，灭活的细胞是完整的细胞裂解物、多能干细胞衍生的外泌体、富集的癌症干细胞新抗原、完全纯化的癌症干细胞新抗原、DNA、RNA和蛋白质提取物、冻干的全细胞悬浮液、细胞裂解物的级分(例如膜级分、细胞质级分)或其组合。当用hESC或hiPSC与丙戊酸或另一种HDACi组合进行小鼠疫苗接种时，灭活的多能干细胞仍然能够刺激免疫应答。该疫苗接种能够诱导针对4T1乳腺癌的有效免疫和抗肿瘤应答，而没有副作用和自身免疫疾病的迹象。

通常，为了将干细胞灭活，可以将它们暴露于致死剂量的辐射(例如，单个级分5至100Gy)。递送至细胞的精确辐射剂量和剂量长度并不重要，只要细胞不能存活即可。

回收并调节细胞

该方法的回收步骤包括洗涤细胞培养物的一个(或多个)步骤，并将细胞重悬于任何适当的培养基中，例如X-Vivo/Stemflex培养基或任何其他临床级细胞培养基。

调节细胞可以包括冷冻或冻干细胞以能够在使用前储存细胞组合物。

突变多能细胞并表达新抗原

应提醒，多能细胞是遗传上非常稳定的细胞。实际上，由于它们在胚胎发育过程中很早就存在并且它们必须繁殖以进行胚胎发育，这些细胞不易发生突变以便在胚胎中具有同质性是非常重要的。

因此，当考虑它们的遗传内容时，存在于多能细胞群中的细胞通常是非常均质的(即，群体中超过95％的细胞呈现相同的遗传背景)。

当制备iPSC时，在多次传代期间出现一些细胞的选择性优势，这导致在晚期传代中呈现特定突变但细胞基因组的序列接近100％的iPSC克隆群。

然而，经过几次传代，iPSC与hESC一样稳定(Hussein SM和al，Nature 2011)。在长期培养后将获得具有极少遗传变化的培养诱导的(适应性)突变(Hussein SM和al，Bioessays，2012)。

然而，有利的是能够在细胞中诱导突变以增加在侵袭性癌症中发现的经处理的细胞材料上的胎儿/胚胎新抗原的可变性。以这种方式，它将增加免疫系统产生T细胞的可能性，所述T细胞针对这些突变细胞并且能够对抗癌细胞以及在肿瘤生长期间将经历后期变化的癌细胞。

这将有助于对抗由遗传变异的积累所导致的癌症，所述遗传变异来自癌症干细胞增殖期间的DNA复制错误和/或环境损害。这些变异包括引发致癌的癌症驱动突变和基因组不稳定突变。这种增加的基因组不稳定性导致克隆进化，进而导致选择耐药性增加的更具攻击性的克隆。

因此，在一个具体的实施方案中，在诱导细胞基因突变的条件下扩增所述细胞。

因此，可以将细胞暴露于诱变剂，即改变生物体的遗传物质(通常是DNA)的物理或化学试剂，从而增加突变频率超过自然背景水平。

诱变剂可以选自物理诱变剂和化学诱变剂。

在物理诱变剂中，可以引用：

-可以导致DNA断裂和其他损伤的电离辐射，如X射线、γ射线和α粒子。尤其可以引用来自钴-60和铯-137的辐射。辐射射线的水平应远低于用于细胞灭活的射线，并且可由本领域技术人员设计；

-波长在260nm以上的紫外线辐射，如果不加以纠正，可能会导致复制错误；

-或放射性衰变，如DNA中的14C。

在化学诱变剂中，可以引用：

-活性氧(ROS)，如超氧化物、羟基自由基、过氧化氢；

-脱氨基剂例如亚硝酸，其可通过将胞嘧啶转化为尿嘧啶从而引起转换突变；

-多环芳烃(PAH)，当被活化为二醇-环氧化物时可与DNA结合；

-烷化剂，例如乙基亚硝基脲(ENU，CAS号759-73-9)、芥子气或氯乙烯；

-芳香胺和酰胺，如2-乙酰氨基芴；

-来自植物的生物碱，例如来自长春花种的生物碱；

-溴和一些含有溴的化合物；

-叠氮化钠；

-博莱霉素；

-补骨脂素与紫外线辐射相结合；

-苯；

-碱基类似物，其可在复制过程中替代DNA碱基并引起转换突变；

-嵌入剂，如溴化乙锭、普罗黄素、柔红霉素；

-金属，如砷、镉、铬、镍及其可能具有致突变性的化合物。

在该实施方案中，可以获得多能干细胞群，其中细胞具有随机突变(通常细胞之间彼此不同，从而导致异质群体)，特别是在癌症相关的新抗原中。

发明人已经表明，可以设计培养条件，从而在多能干细胞中诱导DNA复制错误，而不触发DNA损伤依赖性细胞凋亡。

这特别出乎意料，因为如上所述，多能细胞天然非常稳定，因此在胚胎发生早期应引入尽可能少量的突变。由此得出，DNA修复机制在这些细胞中非常有效，从而纠正大多数缺陷和/或在不可能纠正这些缺陷的情况下诱导细胞凋亡。

在一个实施方案中，在多能容许培养基(如本领域已知)中扩增和维持起始群体的多能细胞(例如ESC或IPSC)，以在反复传代期间保持多能阶段。在这些条件下，通常会观察到少量的外显子组突变(每个外显子组5-10个突变)。

然后用诱变化合物方法在体外培养多能细胞以诱导和增加多能干细胞内的基因组不稳定性，例如上面列出的那些。作为双链断裂(DSB)的标记物，γH2AX磷酸化证实了DNA损伤。ESC或IPSC中γH2AX阳性细胞的比例和γH2AX灶的频率均增加，以及作为基因组不稳定性标志物的微核数量较高。

优选的试剂是博来霉素、ENU、烷化剂、放线菌素D、ROS调节剂、UV、H2O2、电离辐射(γ射线、X射线)，它们都能诱导和增强在培养过程中积累的多能干细胞中的突变率。

在一个优选的实施方案中，已经显示剂量<50μg/ml的N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)在长期培养(至少7至60天)期间产生新的突变并增强经处理的多能干细胞中的新抗原水平。这些突变与癌症中报道的相似。

因此，可以用长时间培养时来自选择性优势的高突变率，在多能细胞增殖期间积累多种响应于DNA损伤的突变，同时保持细胞的多能性，特别是在培养基中用HDACi培养细胞时。培养物中HDACi的存在可以保持增加的活性组蛋白(H3K4me3和H3K9ac)和响应于诱导DNA损伤的多能性表观遗传标志物，以及传代过程中的复制和增殖速率。

在本文所述的组合物和方法的另一个实施方案中，通过用促进高水平基因组不稳定性的基因对细胞进行遗传修饰，在多能细胞中诱导突变。特别地，可以使用适当的抑制剂如NER/BER/DSBR/MMR抑制剂来删除或降低参与DNA修复和复制的基因或信号传导途径的活性。诱导与DNA损伤增加相关的基因组不稳定性的这些方法可以通过使用灭活或敲低DNA修复相关基因或信号传导途径的“载体”或“遗传修饰”进行，例如DNA聚合酶δ复合物、错配修复(MMR)、碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、同源重组(HR)、DSBR或NEJH。DNA修复基因的其他实例是DNApkC、Ku70、Rad 51、Brca1或Brca2。

在其他实施方案中，修饰多能细胞以通过遗传修饰或化学p53(例如Pifithrin-mu、Nutlin-3)，或通过使用增强细胞存活的化合物如Y-27632(一种p160-Rho相关卷曲激酶(ROCK)的选择性抑制剂)来抑制细胞凋亡相关基因如p53。

在一个特定的实施方案中，多能细胞群由从体细胞(例如从患者分离的细胞)产生的诱导的多能干细胞(iPSC)组成，所述诱导的多能干细胞已经包含与以下相关的基因组改变：

i)DNA修复疾病，包括例如共济失调毛细血管扩张症、布卢姆综合征、Cockayne综合征、范可尼贫血症、Werner综合征、着色性干皮病、奈梅亨破损综合征；

ii)具有基因组不稳定性的遗传性家族癌症综合征，如林奇综合征(具有MMR基因(包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS1和PMS2)突变的遗传性非息肉性结直肠癌)、具有TP53基因或CHEK2突变的Li-Fraumeni、具有BRC1/2基因缺失或突变的遗传性乳腺癌和卵巢癌(HBOC)综合征、具有APC基因突变的家族性腺瘤性息肉病(FAP)；

iii)如在具有易位(T9；22)的CML中体细胞致癌诱导的基因组不稳定性。

在一个优选的实施方案中，突变的多能细胞群由诱导的多能干细胞制成，并由含有与疾病相关的基因组改变的体细胞产生。通常，基因组改变可以是易位(T9：22)、缺失(BRCA1/2)或突变(BRCA、RET)。

在一个具体的实施方案中，多能干细胞群由从癌细胞系或患者特异性癌细胞产生的iPSC组成。

在另一个实施方案中，通过使用“载体”对ESC或IPSC群体进行遗传修饰以过表达多种非随机癌症干细胞相关的新抗原。在具体的实施方案中，通过“基因组编辑”技术对ESC或IPSC群体进行遗传修饰以在多能干细胞中表达多种突变和癌症干细胞特异性新抗原(至少5种)。本发明提供了通过RNA引导的多重基因组编辑、修饰、表达抑制和其他基于RNA的技术引入多种新抗原来提供ESC或IPSC的组合物和方法。

本文使用的术语“基因组编辑”是指RNA介导的遗传操作，特别包括用于cas9介导的基因组编辑的向导RNA。该向导RNA(gRNA)与内切核酸酶cas9一起转染。向导RNA提供支架和与靶标互补的间隔子序列。在另一个实施方案中，遗传操作序列可以是设计用于根据本领域的标准方法通过使用Crispr-Cas 9系统进行基因沉默的siRNA或microRNA序列。制备和使用Crispr-Cas系统的组合物和方法是本领域已知的，并且特别描述于U.S.8,697,359中。

在一个具体实施方案中，用烷化剂处理多能细胞群。如本文所用，术语“烷化剂”是指将一个或多个烷基从一个分子添加到另一个分子的物质。这种处理在新抗原中产生新的突变，通过增加TIL的寡克隆扩增和Th1/Th2细胞免疫来提供优异的免疫应答。

在本发明中，烷化剂选自以下：氮芥、亚硝基脲、烷基磺酸盐、三嗪、乙烯亚胺及其组合。氮芥的非限制性实例包括盐酸氮芥(Lundbeck)、苯丁酸氮芥(GlaxoSmithKline)、环磷酰胺(Mead Johnson Co.)、苯达莫司汀(Astellas)、异环磷酰胺(BaxterInternational)、美法仑(Ligand)、美法仑氟哌嗪(Oncopeptides)及其药学上可接受的盐。亚硝基脲的非限制性实例包括链佐星(Teva)、卡莫司汀(Eisai)、洛莫司汀(Sanofi)及其药学上可接受的盐。烷基磺酸盐的非限制性实例包括白消安(Jazz Pharmaceuticals)及其药学上可接受的盐。三嗪的非限制性实例包括达卡巴嗪(Bayer)、替莫唑胺(Cancer ResearchTechnology)及其药学上可接受的盐。乙烯亚胺的非限制性实例包括噻替派(BedfordLaboratories)、六甲蜜胺(MGI Pharma)及其药学上可接受的盐。其他烷化剂包括ProLindac(Access)、Ac-225BC-8(Actinium Pharmaceuticals)、ALF-2111(AlfactInnovation)、曲磷胺(Baxter International)、MDX-1203(Bristol-Myers Squibb)、硫尿基丁腈(CellCeutix)、二溴硝基苯(Chinoin)、二溴卫矛醇(Chinoin)、尼莫司汀(DaiichiSankyo)、葡膦酰胺(Eleison Pharmaceuticals)、HuMax-TAC和PBD ADC组合(Genmab)、BP-C1(Meabco)、苏消安(Medac)、硝呋替莫(Metronomx)、甲磺英丙舒凡(Mitsubishi tanabePharma)、雷莫司汀(Mitsubishi tanabe Pharma)、ND-01(NanoCarrier)、HH-1(NordicNanovector)、22P1G细胞和异环磷酰胺组合(Nuvilex)、雌莫司汀磷酸盐(Pfizer)、泼尼莫司汀(Pfizer)、lurbinectedin(PharmaMar)、曲贝替定(PharmaMar)、altreatamine(Sanofi)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)、福莫司汀(Servier)、奈达铂(Shionogi)、庚铂(Sk Holdings)、阿哌喹酮(Spectrum Pharmaceuticals)、SG-2000(Spirogen)、TLK-58747(Telik)、拉莫司汀(Vion Pharmaceuticals)、甲基苄肼(Alkem Laboratories Ltd.)及其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，烷化剂选自盐酸氮芥(Lundbeck)、苯丁酸氮芥(GlaxoSmithKline)、环磷酰胺(Mead Johnson Co.)、链佐星(Teva)、达卡巴嗪(Bayer)、噻替派(Bedford Laboratories)、六甲蜜胺(MGI Pharma)、其药学上可接受的盐，以及它们的组合。在另一个实施方案中，烷化剂选自ProLindac(Access)、Ac-225BC-8(ActiniumPharmaceuticals)、ALF-2111(Alfact Innovation)、苯达莫司汀(Astellas)、异环磷酰胺(Baxter International)、曲磷胺(Baxter International)、MDX-1203(Bristol-MyersSquibb)、替莫唑胺(Cancer Research Technology)、硫尿基丁腈(CellCeutix)、二溴硝基苯(Chinoin)、二溴卫矛醇(Chinoin)、尼莫司汀(Daiichi Sankyo)、卡莫司汀(Eisai)、葡膦酰胺(Eleison Pharmaceuticals)、HuMax-TAC和PBD ADC组合(Genmab)、白消安(JazzPharmaceuticals)、美法仑(Ligand)、BP-C1(Meabco)、苏消安(Medac)、硝呋替莫(Metronomx)、甲磺英丙舒凡(Mitsubishi tanabe Pharma)、雷莫司汀(Mitsubishi tanabePharma)、ND-01(NanoCarrier)、HH-1(Nordic Nanovector)、22P1G细胞和异环磷酰胺组合(Nuvilex)、美法仑氟哌嗪(Oncopeptides)、雌莫司汀磷酸盐(Pfizer)、泼尼莫司汀(Pfizer)、lurbinectedin(PharmaMar)、曲贝替定(PharmaMar)、altreatamine(Sanofi)、洛莫司汀(Sanofi)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)、福莫司汀(Servier)、奈达铂(Shionogi)、庚铂(Sk Holdings)、阿哌喹酮(Spectrum Pharmaceuticals)、SG-2000(Spirogen)、TLK-58747(Telik)、拉莫司汀(Vion Pharmaceuticals)、甲基苄肼(AlkemLaboratories Ltd.)、其药学上可接受的盐，及其组合。

在一个具体的实施方案中，用N-乙基N-亚硝基脲(ENU，CAS号759-73-9)处理多能细胞群。ENU具有以下化学式C₃H₇N₃O₂，它是一种通过将乙基转移到核酸中的核碱基的高效诱变剂。

如上所述，诱变剂的目的是在扩增期间在多能细胞的基因中引入随机突变(在细胞复制和分裂期间引入突变)。多能干细胞群获得可提供生长优势的突变，并被选择用于促进培养适应。ESC或iPSC的传代经历高水平的选择压力，并且在扩增时可以有利地选择多个克隆突变群体。

应注意，由于多能细胞非常稳定，可能必须长时间施用诱变剂。作为说明，当使用ENU时，其可以施用至少7天，更优选至少15天，更优选至少20天，更优选至少30天，更优选至少40天，更优选至少50天或甚至至少60天。施用诱变剂后，洗涤细胞(如果诱变剂是化学试剂)并且可以在有利于MHC-I表达的试剂(特别是HDACi)存在下进一步扩增。优选该试剂也存在于施用诱变剂期间。

因此可以观察和检查诱变剂将在由多能细胞表达的一些胚胎发生基因中诱导突变(即非同义、无义、移码、StopGain、剪接变体、CNV、SNV)，从而增加这些抗原(全基因组中的新抗原)的多样性。因此，这将增加疫苗组合物具有增强的免疫原性的可能性，能够刺激针对存在快速和频繁突变的侵袭性癌症的广泛免疫应答。

对于随着肿瘤细胞表达的抗原的突变而发生癌细胞克隆性扩增的某些癌症，确实难以获得有效的免疫应答。因此，免疫应答将取决于癌症的突变载量。因此，通过使用诱变剂在多能细胞群中产生随机突变将导致突变的胚胎抗原的表达，并增加疫苗接种后呈递给免疫系统的抗原的多样性。

因此，已经存在针对突变抗原的引发的T细胞，所述突变抗原在癌细胞分裂期间将出现在这些细胞中，这将加速并改善针对这些细胞的免疫应答。

多能细胞的修饰

在一个具体的实施方案中，对多能干细胞群进行遗传修饰以过表达化合物，所述化合物通过在多能细胞基因组内的基因整合来刺激免疫应答。通常，在第一步中，分离并扩增干细胞群。在第二步中，将目标基因包装到整合病毒载体(例如逆转录病毒或慢病毒)中。在第三步中，将含有目标基因的整合病毒载体转移到干细胞群中。

在一个具体的实施方案中，用刺激MHC表达和/或免疫应答的蛋白质基因修饰多能细胞群。这些化合物选自干扰素α(IFN-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、其功能片段及其组合。

本发明考虑的干扰素(IFN)包括常见的IFN类型，IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN可以直接作用于癌细胞，例如，通过减缓它们的生长、促进它们发育成具有更正常行为的细胞和/或增加它们的抗原产生，从而使癌细胞更容易被免疫系统识别和破坏。IFN还可以间接作用于癌细胞，例如，通过减慢血管生成、增强免疫系统和/或刺激自然杀伤(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞。重组IFN-α可作为Roferon(Roche Pharmaceuticals)和Intron A(ScheringCorporation)商购获得。

本发明考虑的白细胞介素包括IL-2、IL-4、IL-11和IL-12。可商购获得的重组白细胞介素的实例包括(IL-2；Chiron Corporation)和(IL-12；Wyeth Pharmaceuticals)。Zymogenetics，Inc(Seattle，Wash)目前正在测试重组形式的IL-21，其也预期用于本发明的组合。

本发明考虑的集落刺激因子(CSF)包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF或非格司亭)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF或沙格司亭)和促红细胞生成素(阿法依伯汀、达比波廷)。用一种或多种生长因子处理可以帮助在经历传统化疗的受试者中刺激新血细胞的产生。因此，用CSF处理可有助于减少与化疗相关的副作用，并且可允许使用更高剂量的化疗剂。各种重组菌落刺激因子可商购获得，例如Neupogen(G-CSF；Amgen)、Neulasta(pelfilgrastim；Amgen)、Leukine(GM-CSF；Berlex)、Procrit(促红细胞生成素；OrthoBiotech)、Epogen(促红细胞生成素；Amgen)、Arnesp(促红细胞生成素)。

在其最广泛的意义上，“载体”是能够促进寡核苷酸转移至细胞的任何载体。优选地，相对于载体不存在导致的降解程度，载体将核酸转运至细胞的降解降低。通常，可用于本发明的载体包括但不限于裸质粒、非病毒递送系统(电穿孔、声孔、阳离子转染剂、脂质体等)、噬菌粒、病毒、已经通过插入或整合核酸序列进行操作的衍生自病毒或细菌来源的其他载体。病毒载体是优选的载体类型，包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：RNA病毒，例如逆转录病毒(例如莫洛尼鼠白血病病毒和衍生自慢病毒的载体)、哈维小鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和rous肉瘤病毒；腺病毒、腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒。可以容易地采用本领域已知但未命名的其他载体。

通常，在本发明的上下文中，病毒载体包括腺病毒和腺相关(AAV)病毒，它们是已经被批准用于人类基因治疗用途的DNA病毒。实际上，已知12种不同的AAV血清型(AAV1至12)，每种具有不同的组织趋向性(Wu，Z Mol Ther 2006；14：316-27)。重组AAV衍生自依赖性细小病毒AAV(Choi，VW J Virol 2005；79：6801-07)。可以将1型至12型腺相关病毒工程化为复制缺陷型并且能够感染多种细胞类型和物种(Wu，Z Mol Ther 2006；14：316-27)。它还具有例如以下优点：热和脂溶剂稳定性；不同谱系细胞(包括造血细胞)中的高转导频率；并且缺乏重复感染抑制因此允许多系列转导。此外，在没有选择压力的情况下，在超过100次传代的组织培养中已经进行了野生型腺相关病毒的感染，这意味着腺相关病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺相关病毒也可以以染色体外方式起作用。

其他载体包括质粒载体。质粒载体已在本领域中广泛描述，并为本领域技术人员所熟知。参见例如Sambrook等，1989。在过去几年中，质粒载体已被用作DNA疫苗，用于在体内将抗原编码基因递送给细胞。对此它们特别有利，因为它们不像许多病毒载体那样具有相同的安全性问题。然而，这些质粒具有与宿主细胞相容的启动子，可以从质粒内可操作编码的基因表达肽。一些常用的质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40和pBlueScript。其他质粒是本领域普通技术人员熟知的。另外，可以使用限制性酶和连接反应定制设计质粒以去除和添加特定的DNA片段。质粒可以通过各种肠胃外、粘膜和局部途径递送。例如，DNA质粒可以通过肌肉内、皮内、皮下或其他途径注射。它也可以通过鼻内喷雾剂或滴剂、直肠栓剂和口服施用。优选地，通过眼内方式(玻璃体内、视网膜下，脉络膜上...)注射所述DNA质粒。也可以使用基因枪将其施用于表皮或粘膜表面。质粒可以在水溶液中提供，干燥到金颗粒上或与另一种DNA递送系统结合，包括但不限于脂质体、树枝状大分子、耳蜗和微囊化。

在一个具体的实施方案中，通过同源重组将转基因如siRNA引入染色体19的AAVS1基因座来修饰干细胞群。

如本文所用，术语“同源重组”是指用于人工修饰染色体或基因组上的特定基因的基因靶向手段。当将与染色体上的靶序列具有部分同源的基因组片段引入细胞时，该术语是指基于引入的基因组片段与染色体上相对应的基因座之间的核苷酸序列同源性发生的重组。

此外，术语“遗传修饰”是指在染色体上所需基因的基因座插入外源DNA、用外源DNA取代部分或全部基因，或删除基因。更具体地，遗传修饰是指插入(即“敲入”)外源DNA片段的同时以使得该片段与特定基因座的基因的表达一起表达或组成型表达的方式保留内源DNA序列，或取代、缺失或破坏(即“敲除”)一部分或全部基因序列以修饰内源DNA序列。

将人工染色体引入细胞的方法的实例包括磷酸钙沉淀法(Graham等,(1978)Virology 52:456-457,Wigler等,(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76 1373-1376和Current Protocols in Molecular Biology Vol.1,Wiley Inter-Science,Supplement14,Unit 9.1.1-9.1.9(1990))、使用聚乙二醇的融合法(美国专利号4,684,611)、使用脂质载体的方法例如脂质转染(Teifel等,(1995)Biotechniques 19:79-80,Albrecht等,(1996)Ann.Hematol.72:73-79；Holmen等,(1995)In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.31:347-351,Remy等,(1994)Bioconjug.Chem.5:647-654,Le Bolc'h等,(1995)TetrahedronLett.36:6681-6684,Loeffler等,(1993)Meth.Enzymol,217:599-618和Strauss(1996)Meth.Mol.Biol.54:307-327)、电穿孔和用微细胞融合的方法(美国专利号5,240,840、4,806,476、5,298,429和5,396,767,Fournier(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:6349-6353和Lambert等,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:5907-59)。

细胞群

因此，利用如上所述的方法，本发明人获得了在部分或所有胚胎基因内表达新的胚胎表位的多能细胞群，其将引发更有效的抗肿瘤免疫。更具体地，本发明人已经表明，与未用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)处理的多能细胞群相比，用ENU处理的多能细胞群呈现随机突变。因此，该群体也是本发明的主题。

因此，本发明涉及包含多能细胞的细胞组合物，其中所述群体中的细胞在选自以下的至少3个基因，更优选至少4个基因，更优选至少5个基因，更优选至少6个基因，更优选至少7个基因中具有至少0.1％，优选至少1％，更优选至少2％，更优选至少5％，更优选至少10％，更优选至少15％，更优选至少20％，更优选至少30％，更优选至少40％，或甚至至少50％，更优选至少10％的突变率：TP53、P2RY8、CRLF2、CRTC3、BLM、ASXL1、IDH2、NTRK3、MALAT1、EXT1、NCOA2、IKF1、PIK3R1、EP300、AKT2、PPP2R1A、CDK12、BRCA1、ERB2、CDH1、TBX3、SMARCD1、HSP90AA1、EZH2、SUZ12、STAT5B和POUF5F1。

在进一步扩增之前或之后(如果进行这种进一步的扩增)，则在暴露于诱变剂之后，研究细胞群中基因的突变率。

由于多能细胞在遗传上非常稳定这一事实，在上面列出的至少三个基因中存在大量突变表明存在新的多能细胞群，其预先不存在且在没有诱变条件的情况下不会被观察到。

将细胞暴露于诱变剂将触发这些细胞基因组中随机突变的出现。因此，由于长期扩增和培养期间的天然突变率较低，与基本上同质的多能细胞群相比，由这种暴露产生的群体将是异质的。

因此，本文获得的群体的特征尤其在于：

-细胞是多能的(即，携带多能性标志物)；

-如上所述，在群体中的细胞的基因组中具有很多差异，即，可以在群体的细胞中检测如上所列出的突变基因的速率(如上所示)。

作为说明，TP53基因的突变率为5％意味着细胞群中95％的TP53序列是相同的(称为TP53参考序列)，并且最后5％的TP53序列不同于TP53参考序列。

因此，在另一个实施方案中，本发明涉及包含多能细胞的细胞组合物，其中所述群体中的细胞在包含一种或多种下列特征的ESC或IPSC群体中呈现突变谱：

i)通过基因组修饰在ESC或IPSC中遗传地引入至少>3(或更多，如上所述)癌症相关的新抗原突变；

ii)突变类型的组合限于由诱变剂诱导的癌症基因组并且在培养的胚胎多能干细胞中通过选择性优势富集。

诱变过程导致所得的晚期传代的人iPS细胞系中新基因组突变和遗传镶嵌的水平增加。

基因突变的分析优选通过NGS(外显子组、RNAseq或全基因组测序)、CGH阵列、SNP阵列对每个ESC和IPSC群体中诱导的癌症相关“突变组学(mutanome)”特征进行大规模基因组分析。全外显子组测序与转录组分析相结合使得能够描述由表达的蛋白质编码的突变组学。

通过使用本领域已知的至少2种用于生物信息学分析的算法来鉴定基因组畸变。施用诱变剂后全基因组中总突变的普遍性将证实输出ESC或IPSC中更高的突变和/或CNV载量。

定性和定量标准将允许在ESC或IPSC中的遗传嵌合体内定义每个细胞群，如下所述：

定性标准包括：

-鉴定由以下定义的获得的新的分子体细胞变异(突变、CNV或SNV)：在相似的培养传代中，在诱变后它们在ESC或IPS基因组中存在，并在没有诱变下它们在ESC或IPSC中不存在；

-每个新突变的分类(即非同义、无义、剪接变体、CNV、SNV)，并通过它们在癌症基因组中的重叠检测(来自数据库，即TCGA、ICGC、COSMIC)以及存在于多能基因和胚胎途径中(根据多能性基因，即Plurinet基因)进行验证。

定量标准包括：

-定义每个ESC或IPS的全基因组中这些新的体细胞突变(错误发现率置信度值FDR<0.05)和新CNV/SNV(FDR<10％)的普遍性；

-在至少>3个的不同基因中存在经验证的突变；

-在克隆选择和扩增后或在传代次数(从50X深度到100X，并且目标外显子组覆盖率为80-98％)后，具有等位基因频率的每个新的且稳定的体细胞突变的突变率至少从>0.1％(或如上所见的其他百分比)至高达50％；

-与诱变或遗传修饰之前的输入ESC或IPSC相比，多能性标志物和基于基因表达的测定(PluriTest)的表达具有至少>90％的表达率；

-与不存在HDACi(特别是VPA)的情况下扩增的细胞群相比，MHC I分子在细胞表面的表达(例如通过FACS测定)增加至少50％，并且通常高达90％。

本发明涉及一种疫苗组合物，其包括如上公开的多能细胞群和刺激免疫应答和/或MHC I表达的试剂。

具体地，如上所述，这种多能细胞是ESC或IPSC，优选灭活的，且任选是突变的。

刺激免疫应答的试剂可以是本领域已知的佐剂(免疫刺激剂)。优选是HDACi(以0.2mM-4mM的剂量使用)。当使用HDACi时，也可以使用另一种佐剂。

本发明还涉及包含这种疫苗组合物的装置(例如注射器)，其可用于同时施用HDACi化合物和细胞组合物。

这种疫苗组合物可以用作针对干细胞癌症(癌症，其细胞表达新抗原)的治疗性疫苗以治愈患者，或用作预防性疫苗以预防这种癌症发生，尤其是在易患这些癌症的患者中。

易感基因例如是(也参见Lindor等,2008Journal of the National CancerInstitute Monographs,No.38,Concise Handbook of Familial Cancer SusceptibilitySyndromes,Second Edition)：

乳腺/卵巢：BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD51；

林奇综合征：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM；

遗传性乳头状肾细胞癌：FH、MET；

考登病：PTEN、PIK3CA；

范可尼病：FANC；

Von Hippel-Lindau病：VHL；

恶性黑色素瘤：CDKN2A、MITF、BAP1、CDK4；

内分泌肿瘤：MEN1、RET、CDKN1B；

神经纤维瘤病：NF1、NF2、LZTR1、SMARCB1、SPRED1；

遗传性嗜铬细胞瘤副神经节细胞瘤：SDH、TMEM127、MAX、EPAS1；

家族性腺瘤性息肉病：APC、MUTYH；

视网膜母细胞瘤：RB1；

Birt-hogg-dubé综合征：FLCN；

布卢姆综合征：BLM；

Carney综合征：PRKAR1A；

Gorlin综合征：PTCH1；

Li-Fraumeni综合征：TP53、CHEK2；

奈梅亨综合征：NBN；

Peutz-Jeghers综合征：STK11；

家族性幼年性息肉病：BMPR1A、SMAD4；

着色性干皮病:XP。

该列表是非限制性的。

在某些实施方案中，癌症干细胞疫苗产品包含冻干后的细胞裂解物的混合物、富集的多癌干细胞新抗原的混合物、纯化的癌干细胞新抗原、源自ESC或IPSC的外泌体、来自工程化ESC或IPSC的DNA、RNA蛋白或多肽。这些是如上公开的免疫原性试剂，其在HDACi存在下配制。

在另一个实施方案中，将癌症干细胞疫苗产品与用作佐剂效应物的来自辐照的工程化ESC或IPSC的上清液GMP培养基混合。

在一个优选的实施方案中，该组合物中的细胞是灭活的(即不能再分裂)。

本发明的细胞组合物易于通过上述任何方法获得。

应注意，当使用诱变剂时，该组合物中的细胞本质上是异质的，因此不同于根据本领域已知的方法培养的并且是均质的多能细胞组合物。

当在没有诱变剂的情况下培养时，细胞群不同于根据本领域已知的方法培养的细胞群，因为培养基中存在的维持多能基因表达并增加MHC I呈递的试剂将导致细胞在其表面上具有更多的这些MHC I分子。

如本文所用，术语“选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物”是指能够刺激免疫原性的化合物。这种化合物被称为MHC表达和/或免疫应答的激活剂。术语“MHC”是指主要组织相容性复合物，其存在于细胞表面以识别称为抗原的外源分子。MHC与抗原结合并将其呈递给免疫分子，例如T和B淋巴细胞。术语“免疫应答”是指免疫系统对抗原的免疫应答。通过激活免疫应答，FoxP3亚群和髓源性抑制性细胞(MDSC)的群体减少，相反，NK群体增加。在本发明的上下文中，针对肿瘤的免疫应答包括针对存在于肿瘤细胞中或细胞上的抗原的细胞毒性T细胞应答。在一些实施方案中，细胞毒性T细胞应答由CD8+ T细胞介导。通常，在本发明的上下文中，激活MHC表达和/或免疫应答的抗原对应于如上所述的多能细胞群上存在的分子。激活MCH表达和/或免疫系统的化合物是新抗原。术语“新抗原”或“新抗原性的”是指由至少一种突变产生的一类抗原，所述突变改变基因组编码的蛋白质的氨基酸序列。

在本发明的上下文中，化合物选自：细胞因子、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂。

在一个具体实施方案中，MHC表达和/或免疫应答的激活剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。

如本文所用，术语组蛋白“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”也称为HDACi，是指干扰组蛋白脱乙酰基酶功能的一类化合物。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)在转录调节和癌症的发病机制中发挥重要作用。通常，HDAC的抑制剂调控转录并诱导细胞生长停滞、分化和细胞凋亡。HDAC还增强用于癌症治疗的治疗剂(包括放射和化疗药物)的细胞毒性作用。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是丙戊酸(VPA)。

术语“丙戊酸”是指酸-2-丙戊酸钠(C₈H₁₆O₂)，在本领域中其具有以下CAS号和式99-66-1：

丙戊酸具有多种生物活性(Chateauvieux等,J.Biomed.Biotechnol,2010,pii:479364.doi:10.1155/2010/479364)。丙戊酸影响增强抑制活性的神经递质GABA(γ氨基丁酸盐)。提出了几种作用机制。丙戊酸尤其是GABA代谢：抑制GABA、GABA转氨基黄嘌呤(LAMP)的降解，GABA合成的衰减，并改变其流动。此外，丙戊酸阻断某些离子通道，减少由N-甲基-D-天冬氨酸介导的唤醒，并阻断包括Na+和Ca 2+的离子通道的活性(电压依赖性L型CACNA1C、D、N和F型)。

在本发明的上下文中，丙戊酸用作免疫刺激剂以增强针对癌症的免疫应答，所述癌症表达与人胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(IPSC)共有的多能抗原。

更具体地，VPA用于刺激并增强癌症干细胞隔室上MHC-1的表达，增加CSC隔室中的新抗原含量。在ESC和IPSC以及CSC中MHC I的更高表达允许增强与MHC-I相关的新抗原向APC/树突细胞的呈递以诱导TH1免疫应答。更高水平的趋化因子(CXCL9、CXCL10......)允许增强T细胞募集到肿瘤中。

本发明涉及在HADCi如VPA和/或5氮杂胞苷存在下，通过染色质重塑，以及通过扩增多能细胞的趋化因子表达(CXCL9，CXCL10...)来增加CSC和肿瘤细胞中CSC隔室表达的胚胎抗原中的新抗原含量的方法。

特别地，当用于体内治疗患者时，本发明的组合物和疫苗使得可以改变肿瘤微环境并促进T细胞募集到肿瘤中，从而获得肿瘤体积的长期持久减少。

这是由于癌症引发的多能细胞疫苗和VPA共施用的协同效应，当在疫苗注射后的一段时间(例如至少15天)进一步向患者施用HDACi时，其进一步改善。

实施例表明，癌症干细胞疫苗和VPA的联合治疗通过增加具有Th1/Th2细胞免疫的TIL、减少FoxP3TReg亚群、激活NK细胞和降低MDSC的抑制作用提供了优异的抗肿瘤反应，同时逆转了肿瘤免疫抑制、降低(肿瘤和脾脏中的)TReg，并将T CD4+和CD8+淋巴细胞募集到肿瘤中，而表达PD-1的T CD4和CD比例较低。

VPA可下调c-Myc表达水平并可能诱导癌细胞和CSC的细胞凋亡和自噬。VPA可通过自噬体交叉呈递增强适应性免疫应答。

VPA的另一种公知作用是减少炎症细胞因子，例如淋巴结中的IL6、IL8、TNFα、白细胞介素(IL)-1β、IL-17。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是辛二酰苯胺异羟肟酸，也称为伏立诺他(N-羟基-N'-苯基辛二酰胺)，它是美国食品和药物管理局(FDA)于2006年批准的第一个组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(Marchion DC等2004；Valente等2014)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是FDA于2015年批准的帕比司他(LBH-589)，它的结构如Valente等2014所述。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是吉维斯特(ITF2357)，它已被欧盟批准为孤儿药(Leoni等2005；Valente等2014)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是FDA于2014年批准的贝利司他，也称为Beleodaq(PXD-101)(Ja等2003；Valente等2014)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是恩替诺特(作为SNDX-275或MS-275)。该分子具有以下化学式(C₂₁H₂₀N₄O₃)，其结构如Valente等2014所述。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是莫西诺司他(MGCD01030)，具有以下化学式(C₂₃H₂₀N₆O)(Valente等2014)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是Practinostat(SB939)，具有以下化学式(C₂₀H₃₀N₄O₂)，结构如Diermayr等2012所述。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₂H₁₉FN₄O₂)的西达本胺(CS055/HBI-8000)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₁H₂₆N₆O₂)的奎司他斯特(JNJ-26481585)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₁H₂₃N₃O₅)的阿昔诺司他(PCI24781)(Valente等，2014)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₂₀H₁₉FN₆O₂)的CHR-3996(Moffat D等2010；Banerji等2012)。

在一个具体的实施方案中，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是具有以下化学式(C₁₈H₂₀N₂O₃)的AR-42(Lin等，2012)。

在一个具体实施方案中，MHC表达的激活剂是DNA甲基转移酶抑制剂。

如本文所用，术语“DNA甲基转移酶抑制剂”是指能够与DNA甲基转移酶(DNMT)相互作用并抑制其活性的化合物。DNMT是催化甲基转移至DNA的酶。DNA甲基化具有多种生物学功能。所有已知的DNA甲基转移酶都使用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体。

在一个具体的实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是氮杂胞苷，也称为5-氮杂-2-脱氧胞苷，具有以下化学式(C₈H₁₂N₄O₅)和本领域的结构(Kaminskas等2004；Estey等2013)。

在一个具体的实施方案中，DNA甲基转移酶抑制剂是地西他滨，也称为5-氮杂-2'-脱氧胞苷，具有下式(C₈H₁₂N₄O₄)(Kantarjian等，2006)。

在一个具体的实施方案中，MHC表达和/或免疫应答的激活剂是组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂或DNA甲基转移酶抑制剂。如本文所用，术语“组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂”是指能够与由参与DNA甲基化的zeste同源物1(EZH1)和2(EZH2)增强子基因编码的组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶相互作用的化合物。EZH2通过使用辅因子S-腺苷-L-甲硫氨酸催化向赖氨酸27处的组蛋白H3添加甲基。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是3-脱氮亚麻素A(DZNep，C-c3Ado)。DZNep，C-c3Ado在本领域中具有以下化学式C₁₂H₁₄N₄O₃和CAS号102052-95-9。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是UNC1999和无活性的类似化合物。UNC1999在本领域中具有以下化学式C₃₃H₄₃N₇O₂和CAS号1431612-23-5。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是UNC2400和无活性的类似化合物。UNC2400在本领域中具有以下化学式C₃₅H₄₇N₇O₂和CAS号1433200-49-7。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是tazemetostat(EPZ6438，E7438)。Tazemetostat在本领域中具有以下化学式C₃₄H₄₄N₄O₄和CAS号1403254-99-8。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是三氟乙酸盐(EPZ011989)。三氟乙酸盐在本领域中具有以下化学式CF₃COONa和CAS号2923-18-4。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是EPZ005687。EPZ005687在本领域中具有以下化学式C₃₂H₃₇N₅O₃和CAS号1396772-26-1。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是GSK343。GSK343在本领域中具有以下化学式C₃₁H₃₉N₇O₂和CAS号1346704-33-3。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是GSK126。GSK126在本领域中具有以下化学式C₃₁H₃₈N₆O₂和CAS号1346574-57-9。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是GSK2816126。GSK2816126在本领域中具有以下化学式C₃₁H₃₈N₆O₂和CAS号1346574-57-9。

在一个具体的实施方案中，组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶抑制剂是ZLD1039。ZLD1039在本领域中具有以下化学式C₃₆H₄₈N₆O₃和CAS号1826865-46-6。

还设想使用HDACi和DNA甲基转移酶抑制剂两者。

实际上，已经表明，VPA和5-氮杂胞苷(核苷胞嘧啶的类似物，其可以整合入DNA和RNA)的组合使用导致新的抗胚胎抗原的再表达的协同作用。

HDACi以治疗有效量施用。对于VPA，其可以是10-15mg/kg/天，至多60mg/kg/天。VPA的血浆水平应优选在通常可接受的治疗范围内(50-100μg/mL)。

在进一步的方面，根据本发明的方法适于治疗表达大量胚胎抗原的癌症，所述胚胎抗原与人胚胎干细胞(hESC)或人诱导的多能干细胞(hiPSC)具有共同的表达。(例如胚胎抗原-3(SSEA3)、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、Lin28......)。

如本文所用，术语“表达人干细胞的癌症”是优选通过本文公开的方法、疫苗和组合物靶向的癌症，是指表达大量与人胚胎干细胞(hESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)具有共同表达的胚胎抗原的癌症干细胞。通常，癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、淋巴瘤、急性和慢性淋巴样和髓样白血病、黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、头颈肿瘤和实体瘤。

如本文所用，术语“施用”是指将机体外存在的物质(例如，组合制剂)注射或通过物理递送至受试者的行为，例如通过粘膜、皮内、静脉内、皮下、肌肉内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当正在治疗疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作之后施用物质。当预防疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作之前施用物质。

在优选的实施方案中，皮下注射疫苗组合物(多能细胞+刺激MHC呈递的试剂)。注射可以同时、一次、分别，在同一注射点或不同注射点，在同一注射器中，或在单独的注射器中进行......

在一个优选的实施方案中，通过口服途径施用随访治疗(施用刺激MHC I和/或免疫系统的化合物，例如HDACi，特别是VPA)。

“治疗有效量”是指用于赋予受试者治疗益处所必需的活性剂的最小量。例如，对受试者的“治疗有效量”是这样的量，其诱导、缓解或引起与病症相关的病理症状、疾病进展或生理状况的改善或对疾病的抵抗。应当理解，本发明化合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合或巧合使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，本领域技术人员已知以低于实现所需治疗效果所需的水平开始化合物的剂量并逐渐增加剂量直至达到所需效果。然而，产品的每日剂量可在0.01-1,000mg/成人/天的宽范围内变化。通常，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg活性成分，用于对待治疗的受试者的剂量进行症状调整。药物通常含有约0.01mg至约500mg活性成分，优选1mg至约100mg活性成分。通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重，特别是每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供有效量的药物。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的方法还包括放疗、靶向疗法、免疫疗法或化疗中的一种或多种。通常，医生可以选择向受试者施用作为组合制剂的i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物，以及放疗、靶向疗法、免疫疗法或化疗。

在一些实施方案中，向受试者施用作为组合制剂的i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和化疗剂。

术语“化疗剂”是指有效抑制肿瘤生长的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲密胺；多聚乙酰(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(具体是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、甲二氯二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素、尤其是卡奇霉素11和卡奇霉素211，参见例如Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、争光霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧基-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、奎那霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如迪诺特宁、氨甲蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；类美登素，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙酰肼；甲基苄肼；雷佐生；根霉素)；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、粘液霉素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；卡培他滨；和以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬(keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素剂，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施方案中，向受试者施用作为组合制剂的i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和靶向癌症疗法。

靶向癌症疗法是通过干扰参与癌症生长、进展和扩散的特定分子(“分子靶标”)来阻断癌症生长和扩散的药物或其他物质。靶向癌症疗法有时被称为“分子靶向药物”、“分子靶向疗法”、“精准药物”或类似名称。在一些实施方案中，靶向疗法在于向受试者施用酪氨酸激酶抑制剂。术语“酪氨酸激酶抑制剂”是指充当受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择性或非选择性抑制剂的多种治疗剂或药物中的任何一种。酪氨酸激酶抑制剂及其相关化合物是本领域熟知的，并描述于通过引用整体并入本文的美国专利公开2007/0254295中。本领域技术人员将理解，与酪氨酸激酶抑制剂相关的化合物将再现酪氨酸激酶抑制剂的作用，例如，相关化合物将作用于酪氨酸激酶信号传导途径的不同成员以产生与那个酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制剂相同的效果。适用于本发明实施方案的方法的酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物的实例包括但不限于：达沙替尼(BMS-354825)、PP2、BEZ235、沙拉替尼、吉非替尼(Iressa)、舒尼替尼(Sutent；SU11248)、厄洛替尼(Tarceva；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、坎尼替尼(CI 1033)、塞马西尼(SU5416)、瓦塔拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、伊马替尼(Gleevec；STI571)、来氟米特(SU101)、凡德他尼(Zactima；ZD6474)、贝伐单抗(avastin)、MK-2206(8-[4-氨基环丁基)苯基]-9-苯基-1,2,4-三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮盐酸盐)衍生物、其类似物，及其组合。适用于本发明的另外的酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物描述于，例如，美国专利公开2007/0254295、美国专利号5,618,829、5,639,757、5,728,868、5,804,396、6,100,254、6,127,374、6,245,759、6,306,874、6,313,138、6,316,444、6,329,380、6,344,459、6,420,382、6,479,512、6,498,165、6,544,988、6,562,818、6,586,423、6,586,424、6,740,665、6,794,393、6,875,767、6,927,293和6,958,340，所有这些都通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是已经口服施用的小分子激酶抑制剂，并且已经是至少一个I期临床试验的对象，更优选至少一个II期临床试验，甚至更优选至少一个III期临床试验，最优选由FDA批准用于至少一种血液学或肿瘤学适应症。此类抑制剂的实例包括但不限于吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、BMS-599626(AC-480)、来那替尼、KRN-633、CEP-11981、伊马替尼、尼罗替尼、达沙替尼、AZM-475271、CP-724714、TAK-165、舒尼替尼、瓦他拉尼、CP-547632、凡德他尼、博舒替尼、来他替尼、坦度替尼、米哚妥林、恩扎妥林(Enzastaurin)、AEE-788、帕唑帕尼、阿西替尼、莫塔塞尼、OSI-930、西地尼布、KRN-951、多韦替尼、Seliciclib、SNS-032、PD-0332991、MKC-1(Ro-317453；R-440)、索拉非尼、ABT-869、布立尼布(BMS-582664)、SU-14813、替拉替尼、SU-6668、(TSU-68)、L-21649、MLN-8054、AEW-541和PD-0325901。

在一些实施方案中，向受试者施用作为组合制剂的i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和免疫检查点抑制剂。

如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调节T细胞活化或功能。已知许多检查点蛋白质，例如CTLA-4及其配体CD80和CD86；和PD1及其配体PDL1和PDL2(Pardoll，Nature ReviewsCancer 12：252-264,2012)。这些蛋白负责T细胞反应的共刺激性或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调节并维持自身耐受性以及生理免疫反应的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或衍生自抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是选自以下的抗体：抗CTLA4抗体(例如伊匹单抗)、抗PD1抗体(例如尼沃单抗、派姆单抗)、抗PDL1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗BTLA抗体和抗B7H6抗体。抗CTLA-4抗体的实例描述于美国专利号5,811,097、5811097、5855887、6051227、6207157、6,682,736、6,984,720和7,605,238。一种抗CTLA-4抗体是曲美莫单抗(替昔单抗，CP-675,206)。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为10D1，MDX-D010)，其是结合CTLA-4的完全人单克隆IgG抗体。另一种免疫检查点蛋白是程序性细胞死亡1(PD-1)。PD-1和PD-L1阻断剂的实例描述于美国专利号7,488,802、7943743、8008449、8168757、8,217,149和PCT公开专利申请号：WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699。在一些实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-L1抗体。在某些其他实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-1抗体和类似的结合蛋白，例如尼沃单抗(MDX1106、BMS 936558、ONO 4538)，其是结合并通过其配体PD-L1和PD-L2阻断PD-1活化的完全人IgG4抗体；兰布利单抗(MK-3475或SCH 900475)，抗PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，结合PD-1的人源化抗体；AMP-224是B7-DC的融合蛋白；抗体Fc部分；用于PD-L1(B7-H1)阻断的BMS-936559(MDX-1105-01)。其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)抑制剂，例如IMP321，一种可溶性Ig融合蛋白(Brignone等，2007,J.Immunol.179:4202-4211)。其他免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，例如B7-H3和B7-H4抑制剂。特别地，抗B7-H3抗体MGA271(Loo等，2012,Clin.Cancer Res.July 15(18)3834)。还包括TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade等,2010,J.Exp.Med.207:2175-86和Sakuishi等,2010,J.Exp.Med.207:2187-94)。在一些实施方案中，免疫治疗由过继免疫疗法组成，如Nicholas P.Restifo，Mark E.Dudley和Steven A.Rosenberg所述(“Adoptiveimmunotherapy for cancer:harnessing the T cell response,Nature ReviewsImmunology,Volume 12,April 2012)。在过继免疫疗法中，在体外分离患者的循环淋巴细胞或肿瘤浸润的淋巴细胞，由淋巴因子如IL-2活化并重新施用(Rosenberg等，1988；1989)。活化的淋巴细胞最优选是早期从血液样品中分离并在体外活化(或“扩增”)的患者自己的细胞。

在一些实施方案中，向受试者施用作为组合制剂的i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物和放疗剂。

如本文所用，术语“放疗剂”意指不受限的本领域技术人员已知的有效治疗或缓解癌症的任何放疗剂。例如，放疗剂可以是诸如在近距离放射治疗或放射性核素治疗中施用的那些试剂。此类方法可任选地进一步包括施用一种或多种另外的癌症疗法，例如但不限于化疗和/或另一种放疗。

药物和疫苗组合物

如上所述的激活MHC表达和/或免疫应答的化合物和多能细胞群可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质(例如可生物降解的聚合物)组合以形成药物组合物。

“药学上”或“药学上可接受的”是指当适当地施用于哺乳动物，尤其是人时，不产生有害的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。本发明的药物组合物用于口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、局部或直肠施用，活性成分(单独或与另一种活性成分组合)可以以单位施用形式，作为与传统的药学支持物的混合物向动物和人施用。合适的单位施用形式包括口服途径形式，例如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒和口服悬浮液或溶液、舌下和口腔施用形式、气溶胶、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌肉内、静脉内、真皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。通常，药物组合物含有对于被注射的制剂而言药学上可接受的载体。这些可以特别是等渗的无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，其在添加在无菌水或生理盐水(取决于情况)时，允许构成可注射溶液。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须以易于注射的程度流动。它必须在制备和储存条件下稳定，并且必须预防微生物如细菌和真菌的污染作用。可以在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备包含本发明化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。可以将多肽(或编码其的核酸)配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，通过使用涂层如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。通过以下制备无菌可注射溶液：将所需量的活性多肽加入含有如上列举的几种其它成分(根据需要)的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过以下制备分散体：将各种灭菌的活性成分加入无菌载体，所述无菌载体含有基础分散体介质和所需的来自如上列举的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型给药，例如上述可注射溶液的类型，但也可使用药物释放胶囊等。例如，对于水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释液等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌含水介质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并将其加入到1000ml的皮下输注液中或在所提出的输注部位注射。取决于所治疗的受试者的状况，剂量必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体受试者的适当剂量。

更具体地，将多能细胞群和激活MHC表达和/或免疫应答的化合物配制为疫苗组合物。因此，本发明涉及疫苗组合物，其包含i)多能细胞群和ii)选自激活MHC表达和/或免疫应答的组的化合物。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的疫苗组合物包含i)人胚胎干细胞和ii)丙戊酸。

在一个具体的实施方案中，根据本发明的疫苗组合物包含i)表达新抗原，尤其是通过诱变剂或遗传修饰增强的新抗原的诱导的多能干细胞(iPSC)和ii)丙戊酸。

组合物还可以包含5氮杂胞苷。

此外，如上所述，本发明的疫苗组合物可用于患有癌症的受试者。

可以以与免疫原性组合物相同的方式，与上文所示的生理学赋形剂配制根据本发明的疫苗组合物。例如，药学上可接受的载体包括但不限于磷酸盐缓冲的盐水溶液、蒸馏水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的润湿剂无菌溶液等。诸如胞壁酰肽如MDP、IL-12、磷酸铝、氢氧化铝、明矾和/或Montanide(R)的佐剂可用于疫苗中。

根据本发明的疫苗组合物可以皮下(s.c)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)或静脉内(i.v.)注射施用、口服施用和鼻内施用或吸入。施用的疫苗通常是单剂量。或者，本发明的疫苗的施用是第一次(初次接种)，然后用相同的干细胞群、刺激免疫系统的化合物或其组合和/或进一步的放疗、靶向疗法、免疫疗法或化疗中的一种或多种进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100次加强(recall)(后续施用)。

疫苗组合物也以试剂盒提供。该试剂盒包含疫苗组合物和提供免疫说明书的信息传单。该试剂盒还包括用于施用产品的所有材料。

通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1：在乳腺肿瘤4T1模型上用mESC、hESC、miPSC和4T1细胞进行的疫苗接种研究。研究设计：用10⁵个经辐射的细胞使小鼠(每组n＝5)接受疫苗加强7天和14天：鼠胚胎干细胞(mESC)、鼠诱导的多能干细胞(miPSC)、人胚胎干细胞(hESC)或4T1细胞。14天后，将5×10⁴个4T1细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中。5只小鼠注射4T1-CSC(4T1细胞与其他细胞因子一起生长，如TGFβ和TNFα，以产生以乳腺球形式生长的CSC)。

图2：疫苗接种后的免疫保护。对于小鼠组，A：通过流式细胞术定量CD4阳性肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)。B：通过流式细胞术定量在CD4+ TIL中的CD25阳性调节T细胞。C：通过流式细胞术定量在CD8+ T细胞中的PD1调节T细胞。

图3：在4T1小鼠模型上用hESC和VPA组合进行的疫苗接种研究。研究设计：用含有或不含VPA的10⁵个经辐射的细胞hESC使小鼠(每组n＝5)接受疫苗加强7天和14天。14天后，将5×10⁴个4T1细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中。A：各组的肿瘤体积：1/对照(PBS)、2/用hESC接种、3/用hESC和VPA的组合接种、4/仅接受VPA的小鼠。B：第44天的肿瘤重量。

图4：hESC接种和VPA之后的免疫保护。A：脾脏中CD4和CD8群体内PD1细胞减少。B：肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞增加。C：脾脏中CD4+和CD8+ T细胞增加。

图5：将4组(对照、hESC、hESC+VPA、VPA)的每只动物进行解剖后，通过IVIS-Spectrum系统对肺部荧光素酶报告基因的定量。

图6：用0.5mM VPA处理4T1细胞和4T1CSC(乳腺球)5天后，通过实时PCR测量的多能基因的表达。

图7：通过RT PCR和实时PCR测量的用VPA和5Aza处理的4T1中的Oct4表达。

图8：通过外显子组测序检测用或不用ENU处理的iPSC中改变新抗原蛋白序列的遗传变体。ENU处理的iPSC和未处理的iPSC中的变体的定量。(NS＝非同义；FS＝移码；SG＝获得停止)。

图9：根据本发明的方法的示意图。

具体实施方式

实施例1

据报道，胎儿组织可用于使小鼠免疫，并且能够排斥可移植肿瘤，包括皮肤癌、肝癌和胃肠道癌。这种反应可以通过以下事实来解释：这些肿瘤细胞表达大量癌胚抗原。迄今为止，已经建立了几种人类癌症疫苗试验以靶向胚胎抗原，例如癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白或癌症/睾丸抗原。不幸的是，已经证明单独靶向一种抗原不足以产生强的抗肿瘤免疫应答以介导肿瘤排斥，因为逃逸突变体快速出现且单价癌症疫苗普遍低效。最近对干细胞在再生医学中的潜力的兴趣使得定义明确的未分化ESC系以及在表型上和功能上与ESC相似的iPSC得以广泛应用。在我们的研究中，我们假设未分化干细胞可以用作多价疫苗，以产生针对肿瘤细胞和CSC共有的各种胚胎抗原的免疫应答。我们首次发现，ESC或iPSC能够诱导针对乳腺癌的免疫和临床反应。令人惊讶的是，我们发现，与单独使用ESC或iPSC相比，在治疗方案中添加丙戊酸可以诱导更高的免疫和抗肿瘤反应。

材料和方法

我们在BALB/c小鼠中开发了转移性4T1乳腺肿瘤模型。为了验证在4T1鼠TNBC乳腺癌细胞系中的胚胎ES样标志物，用胚胎细胞样品(D3干细胞-GSE51782，用Affymetrix平台GPL16570注释)进行荟萃分析，并整合不同的数据集：体外培养的TNBC细胞系4T1(GSE73296，用Affymetrix平台GPL6246注释)、在小鼠模型中异种移植的TNBC细胞系4T1(GSE69006，用Affymetrix平台GPL6246注释)和乳腺样品(GSE14202，用平台GLP339注释)(Padovani等2009)。对于该4T1模型，通过微阵列分析显示，在balb/c小鼠中移植的4T1与鼠ESC共享1304个不同的基因，包括TRAP1A、TET1、TSLP、FAM169A、ETV5、MOXD1、PHLDA2、CRIP1、ADAMDEC1、NID1、EPCAM、H2-EA-PS、GPA33、IBSP、KANK3、MEST、MMP9、SPRY4、CLDN4、PRSS22、DDAH2、SPRY2、USP11、CTNNAL1、ZFP532、GRB10、CACNG7、ST14、CTH、RCN1、PECAM1、TMEFF1、PPP1R1A、GPR97、KIF2C、BRCA2、SLAIN1、CSRP2、DOCK6、HUNK、RAD51、ESYT3、SKP2、CCL24、SFRP1、HMGB2、ITM2A、ASPN、MSH2、SUGT1、ARHGAP8等。因此，与正常鼠乳腺相比，发现所有这些基因在4T1和mESC中普遍被上调。还显示与体外收获的细胞相比，异种移植的4T1高表达CSC标记物如CD44(39％vs CD44^高CD24^低的0.27％)(未显示)。

以相同的方式，对来自患者的三阴性乳腺癌(TNBC)进行全基因组表达谱分析。为了验证TNBC患者中的胚胎ES样标志物，通过合并来自不同数据集的样品数据进行了胚胎细胞样品和人乳腺样品的荟萃分析：数据集GSE18864包含84个乳腺癌样品，并用Affymetrix平台GPL570注释(Silver等2010)，数据集GSE20437包含42个人正常乳腺样品，并用affymetrix平台GPL96注释(Graham等2010)，数据集GSE23402包含42个人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞样品，并用Affymetrix平台GPL570注释(Guenther等，2010)，乳腺癌细胞系的数据集(Maire等，2013)和数据集GSE36953包含TNBC细胞系的细胞培养物样品，并用Affymetrix平台GPL570注释(Yotsumoto等，2013)。在3个等级的乳腺癌组之间分析的监督单向ANOVA鉴定了4288个重要基因，其允许用IPS和ES样品将大多数三阴性乳腺癌TNBC III级分类，包括CDC20、KRT81、NCAPG、MELK、DLGAP5、AURKA、ADAM8、CCNB1、RRM2、QPRT、SLAMF8、EZH2、CENPF，HN1、CENPA、SLC19A1、SLC39A4、CDK1、SEPHS1、GMDS、TUBB、SCRIB、DDX39A、YBX1、MKI67、TKT、WDR1、SKP2、ISG20、NRTN、SEC14L1、GAPDH、ILF2、PSMB2、DHTKD1、TPX2、CCNB2、IL27RA、NADK、H2AFX、MRPS18A、AURKA、MCM7、MCAM、NOP2、KIF23、JMJD4、YIPF3、CDH3、TALDO1、BID、C16orf59、HMMR、BIRC5、ZNF232、RANBP1、CDK1、SHMT2、KIF20A、EPHB4、SPAG5、PPARD、ORC6、TUBB4B、LYZ、TK1、PDXK、NAA10、BAG6、SF3B3、MARCKSL1、MCM3、PSRC1、NUSAP1等。因此，与正常人乳腺相比，发现所有这些基因在TNBC肿瘤和hESC中普遍被上调。

结果

结果1用异种胚胎干细胞进行的接种产生针对乳腺癌的免疫应答和抗肿瘤反应

我们首先研究了在同基因4T1小鼠模型中接种经辐射的鼠ESC(mESC)、鼠诱导的多能干细胞(鼠iPSC)、人胚胎干细胞(hESC)或4T1细胞是否能有效对抗乳腺癌。接种疫苗后，用两种不同类型的4T1细胞挑战小鼠：在DMEM 10％的SVF中正常培养的4T1，或与其他细胞因子如TGFβ和TNFα一起生长，以产生以乳腺球形式生长的癌症干细胞(CSC)的4T1细胞。我们发现，与未接种疫苗的小鼠相比，接种hESC、mESC、鼠iPSC和4T1的小鼠产生了一致的针对4T1癌的细胞免疫应答，这与乳腺肿瘤体积的显著减少相关(p<0.05)(图1)。我们发现，肿瘤在PBS对照组中逐渐生长，而引人注目地，用mESC、miPS或hESC免疫导致肿瘤生长延迟，与PBS组相比，各组平均肿瘤大小存在统计学上显著的差异(图1)。我们观察到，与用正常条件下生长的4T1挑战的小鼠相比，当用CSC衍生的-4T1挑战小鼠时，肿瘤生长被急剧抑制，表明用同基因mESC接种疫苗优先靶向CSC。为了进一步研究介导抗肿瘤作用的细胞免疫机制，我们分析了来自不同组的肿瘤浸润淋巴细胞的表型，并量化了CD4、CD8、CD25和PD1亚群。抗肿瘤作用与以下相关：1/与肿瘤大小显著(p＝0.0039)相关CD4+ TIL增加(图2A)，2/与肿瘤大小负相关的CD25阳性细胞百分比下降(图2B)，3/在对疫苗方案(接种hECS、4T1或mESC)有更好反应的小鼠中更明显的PD1阳性细胞减少(图2C)。

结果2用异种胚胎干细胞和丙戊酸(VPA)进行的疫苗接种产生更高的针对乳腺癌的抗肿瘤反应并且抑制转移发生

为了评估4T1乳腺模型中的转移位点，对4T1细胞进行基因修饰，以便它们表达GFP和荧光素酶报告蛋白(4T1Luc-GFP)，使得能够在更深的器官(脾脏、肺、骨、肝脏)中用生物发光成像(Ivis光谱)对其进行体内追踪。如前所述进行实验，但仅使用经辐射的hESC作为疫苗；用饮用水中含有或不含0.40mM剂量VPA的10⁵个经辐射的hESC细胞使每组5只小鼠接受两次疫苗加强7天和14天。14天后，将5×10⁴个4T1Luc-GFP细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中。我们发现，与未接种疫苗的小鼠相比，接种hESC联合VPA的小鼠产生了更高的针对4T1癌的细胞免疫应答，这与乳腺肿瘤体积的显著减少(p<0.05)(图3A)和肿瘤重量减少相关(图3B)。在接受hESC和VPA的小鼠中，抗肿瘤反应与CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中PD-1表达的急剧下降相关(图4A)。此外，与对照组(PBS)相比，仅对于接受联合处理(hESC和VPA)的小鼠，抗肿瘤反应与肿瘤内(图4B)和脾脏内(图4C)CD4+ T和CD8+ T细胞百分比的显著增加相关。我们还发现，对于用hESC疫苗和VPA处理的小鼠，所有小鼠的肺转移显著减少(图5)。总之，这些结果表明，与单独使用hESC和VPA相比，基于异种胚胎干细胞疫苗接种(hESC)和VPA一起具有最强的功效。这些结果表明，基于异种胚胎干细胞的疫苗接种可能是减少乳腺癌肿瘤复发的有效治疗。

实施例2：丙戊酸调控MHC I类的表达和胚胎基因的表达

主要组织相容性复合物(MHC)是一组细胞表面蛋白，其对于获得性免疫系统识别对获得性免疫系统至关重要的外来分子必不可少。MHC分子的主要功能是结合新的和外来的抗原并将其展示在细胞表面以供适当的T细胞识别：通过与辅助T细胞表面上的CD4分子相互作用，MHC II类介导特异性免疫(称为获得性免疫或适应性免疫)的建立。通过与细胞毒性T细胞表面上的CD8分子相互作用，MHC I类介导受感染或恶性宿主细胞的破坏。

免疫耐受性是一种重要的手段，通过该手段，具有突变蛋白和改变的抗原表达的生长肿瘤阻止宿主免疫系统的消除。肿瘤免疫耐受性可部分通过细胞表面上β2-m的缺失和/或肿瘤细胞上MHC I类的缺失来解释。已经表明，剂量为0.2mM至2mM的VPA能够增加4T1细胞上MHC I类的表达。

暴露于2mM VPA后24小时至72小时，4T1和4T1乳腺球(通过TGFβ和TNFα处理诱导的CSC)上MHC I类的表达增加了2-3倍。

特别地，表明剂量为0.5mM的VPA能够增加iPSC上HLA ABCMHC I类的表达(63％vs92％)和多能标志物例如SSEA4和Tra1-60的表达(55％vs 72％)。

那些标志物在ENU暴露后降低(处理60天)，并在用0.5mM VPA处理细胞后恢复(分别为28％-92％的HLA ABC阳性iPSC-ENU和iPSC)以及(分别为48％-96％的SSEA4/Tra-1-60阳性iPSC-ENU和iPSC)。

HDAC抑制剂例如VPA可以选择性地改变基因转录，部分是通过染色质重塑和转录因子中蛋白质结构的变化。研究了VPA是否可以调控乳腺肿瘤细胞中多能基因的表达。为此，我们用1mM-2mM的VPA处理4T1和4T1乳腺球(通过TNFα和TGFβ处理诱导的CSC)。在所有情况下，VPA将在ESC或iPSC中高表达的三种不同的重要转录因子如Oct4、Sox2和Nanog的表达增加了2至3倍(图6)。重要的是，当以抑制DNA甲基转移酶的剂量使用VPA和5-氮杂胞苷(5aza)的组合处理肿瘤细胞时，显示这些转录因子表达的重要协同作用，导致DNA的低甲基化。特别是当用VPA和5aza处理4T1细胞时，显示oct-4转录物增加7倍(图7A和B)。

实施例3：在暴露于诱变剂例如N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)的iPSC中通过基因组不稳定性诱导DNA损伤和DNA修复错误

乙基-N-亚硝基脲(ENU)是诱变的烷化剂，其产生碱基颠倒，但也产生单个点突变和双链DNA断裂(DSB)。

可以证实ENU允许iPSC中的DNA损伤。

评估了吸引到细胞中存在的DSB位点的磷酸化γ-H2AX的量。在该实验中，通过使用胶原酶将iPSC与基质培养物分离，并在体外用指定浓度(50μg/ml)和时间的ENU处理，然后使用抗磷酸-γH2AX抗体进行Western印迹分析。显示在早至2分钟-10分钟的时间点，γ-H2AX水平增加，然后恢复到基础水平。

设计了一种方案，通过用ENU连续处理IPSC来诱导iPSC中的基因组不稳定性，以便在广泛增殖期间累积DNA修复错误。处理细胞60天，每天更换培养基，每天添加浓度为10μg/ml的ENU。在培养期间添加VPA。

在第+61天，通过核型分析和RNA测序、CGH阵列、外显子组测序、WGS评估在iPSC中诱变过程的基因组结果。将培养的iPSC中累积的基因组变异与未用ENU处理的iPSC进行比较。

在ENU暴露后，维持突变的iPSC并在含有VPA的培养中扩增。在不同传代中依次进行CGH阵列和外显子组测序以确认ENU-iPSC在其扩增期间体细胞突变发病率的基因拷贝。通过评估多能性Pluritest和Oct4、Sox2、Nanog、Tra-1 60、SSEA4的表达来进行iPSC的表型。我们发现复制率和群体倍增与没有ENU暴露的iPSC类似。

用10μg/ml的ENU处理iPSC，并进行外显子组测序以检测突变的新抗原。与没有ENU的iPSC中发现的8个变异相比，在ENU处理的iPSC中发现了48个变异(图8)。将这些基因座与cBioPortal程序(http://www.cbioportal.org)合并，允许从来自不同癌症研究的人肿瘤样品获取癌症基因组数据集。使用cBioPortal程序显示，发现超过10％至75％的这些变异也在癌(胰腺、肺、前列腺......)中失调。对于所有外显子组测序，我们估计在ENU处理的iPSC中可检测到的所有突变的覆盖深度为30至400个读长。

实施例4：BRCA1的单倍体不足导致培养期间iPSC中的DNA修复变异和基因组不稳定性，以及CNV积累。

BRCA1/2的变异涉及遗传性乳腺癌和卵巢癌(HBOC)综合征。BReast CAncer1(BRCA1)是一个肿瘤抑制基因，通过控制同源重组、双链断裂修复、S期和G2/M、纺锤体检查点和中心体调控中的DNA修复，在维持基因组稳定性中发挥关键作用。

用含有Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc的仙台病毒(-iPS仙台重编程试剂盒，Life technologies)重新编程携带BRCA1中外显子17缺失的成纤维细胞。在基于DMEM/F12的人多能干细胞培养基(hPSC培养基)中培养细胞，所述DMEM/F12补充有20％敲除血清替代物、1mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、100μM 2-巯基乙醇(Lifetechnologies)和12.5ng/ml碱性FGF(Miltenyi Biotech)。在第26天，基于它们的形态和通过FACS分析的多能标志物、Nanog、Oct4、Sox2的Q RT-PCR、NOD-SCID小鼠中的畸胎瘤形成和Pluritest，手动挑选完全重编程的克隆。核型是正常的。

比较正常(WT)和BRCA1+/-iPSC中DNA损伤应答(DDR)的水平和活性。在照射或ENU暴露后，通过增殖的iPSC中的免疫荧光测定γ-H2AX灶。与正常WT-iPSC相比，IPSC BRCA1+/-表现出显著更高水平的磷酸化ATM/ATR底物以及募集至DNA的γ-H2AX，表明与WT-IPSC相比，增殖的IPSC BRCA1+/-遭受增加的DNA损伤。

由于iPSC BRCA1+/-在早期传代中显示出增加的DDR水平，因此检查了这是否与反复传代和增殖期间基因组变异的累积相关。

在补充有HDACi(VPA)的培养基中将iPSC延长传代后，分析增殖多能干细胞中的CGH阵列。为此，使用Roche-Nimbelgen aCGH平台对来自IPSC样品的DNA进行AgilentCGHarray实验。用Agilent细胞基因组学和Nexus Roche-Nimbelgen软件鉴定人类基因组HG18上的信号提取和基因组间隔。使用Roche-Nimbelgen注释文件(Genes_July_2010_hg19，Roche-Nimbelgen网站)在HG19坐标上转换基因座。用scandb数据库从实验中消除欧洲拷贝数变异(CNV)多态性(Gamazon等人，2010)。使用MEV版本4.9.0独立软件(红色：增益，绿色：损失和黑色：零)将阵列CGH CNV比率绘制为热图(Saeed等人2003)。从各个IPSC样品中受影响的基因座中减去在细胞来源中发现受影响的基因座。将得到的每个iPSC特异性的过滤CNV与COSMIC人口普查数据库合并(Futreal等人，2004)。用过滤后在每个IPSC中发现的受影响的癌基因进行HG19上的基因组Circosplot。使用R环境版本3.0.2中的OmicCircosR-包进行基因组绘制(Hu等人2014)。

结果表明，没有ENU暴露的情况下，晚期传代的iPSC BRCA1+/-(>100天)的培养导致基因组异常的积累，并伴随着的基因组不稳定性增加。晚期传代的核型是正常的。对来自iPSC细胞和来自它们各自的细胞来源的DNA提取物进行Agilent aCGH实验。在这些多能性诱导期间受影响的间隔的基因组作图显示，与WT1相比，BRCA1+/-IPSC受到大量受影响基因座的影响。在WT iPSC上进行CNV欧洲多态性过滤后，仅发现58个基因座仍然受影响(多态性占受影响的总基因座的1.69％)，类似地，在BRCA1-/+iPSC上，多态性过滤后仍然发现5273个基因座受到影响。在BRCA1+/-iPSC中受影响的大多数基因座涉及DNA的获得。

在受基因组不稳定性影响的这些基因座中，其中一些已知为人口普查COSMIC数据库中的驱动癌基因。WT iPSC显示，在aCGH中仅一个癌基因座受影响(CDK4)。BRCA1-/+IPSC受131个癌基因座的变异所影响，其中已知11个基因在乳腺癌中受到影响：MSH2、SMARCD1、TBX3、CDH1、TP53、ERBB2、CDK12、BRCA1、PPP2R1A、AKT2、EP300。发现这些变异在小染色体19和17上特别过度呈现：染色体17是BRCA1基因座的染色体。

总之，与WT-IPSC相比，大多数iPSC BRCA1+/-表现出更高量的indel(缺失或扩增)。鉴定并验证了5273个基因上的CNV率为8％。生物信息学分析揭示了，在cosmic数据库中鉴定的131个基因的表达参与癌症发展，主要在白血病、上皮肿瘤和间充质肿瘤细胞中。在乳腺癌和卵巢癌中类似地观察到一些改变的基因。

在VPA存在下，复制率、多能性基因(Pluritest，细胞表面标志物)和MHC I在整个培养期间保持稳定。

总之，DNA修复相关基因如BRCA-1的缺失或灭活允许诱导基因组不稳定性，导致产生多个与MHC I相关的CNV、indel和突变。

实施例5：N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)增加CML-iPSC中突变新抗原的载量

表征由患有费城阳性慢性粒细胞白血病(CML)的患者的白血病血细胞产生的iPSC。通过使用仙台病毒介导的多能性基因Oct4、c-Myc、Klf4和Sox2的转移产生iPSC。扩增具有多能iPSC形态的细胞，并使用细胞表面多能性标记物(Tra-1-60和SSEA4)以及它们在肌内注射入NSG小鼠后产生畸胎瘤的能力对其进行表征。这些iPSC具有CML的费城染色体特征。将CML iPSc暴露于ENU60天。将来自ENU处理的CML-IPS的细胞衍生物原始集落(blastcolony)与未用ENU处理的IPSC进行比较。

通过CGH阵列分析CML iPSC的DNA。在源自ENU处理的iPSC的原始集落中观察到几个基因组畸变，其中检测到通过CML IPSC上的ENU压力选择的基因组畸变中的异质性丧失(CB32，这些包括含有332个基因座的拷贝数变异CNV)。在欧洲高加索基因组多态性数据库上过滤后，255个基因座仍然存在于这些基因组畸变中。大多数基因组异常包括基因组DNA丢失(71％)，杂合性缺失(23％)。将这些基因组畸变与转录因子数据库、癌症基因数据库和多能性基因数据库进行匹配，可以观察到这些重要的失调因子主要在染色体7、8、15、Y和X上受影响。Circosplot也允许确定，其中大多数异常涉及转录因子，例如涉及中胚层细胞迁移的MESP和IKZF1。一些多能性基因以及已经被描述为参与Ph1阳性白血病的一些癌症基因如IDH2、NCOA2、IKZF1、BLM受到影响，这表明ENU诱导的诱变产生的异常的相关性。

这个分析显示，发现几种基因变异如获得和损失以及鉴定的几种异常是在Cosmic数据库中鉴定的癌症基因。

ENU-iPSC中鉴定的异常的比较允许再现在急性白血病阶段的CML患者中已经鉴定的侵袭性急性白血病期异常，表明ENU处理的CML iPSC是在体外再现该特定癌症中的这些基因组异常的独特工具。

在整个申请中，各种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术。这些参考文献的公开内容通过引用结合到本公开中。

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Claims (41)

1.一种治疗受试者的方法，包括向所述受试者同时、分别或依次施用治疗有效量的(i)组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)和(ii)含有免疫原性元件的疫苗组合物。

2.权利要求1所述的方法，进一步包括在施用所述疫苗组合物后一段时间施用HDACi的步骤。

3.权利要求1或2任一项所述的方法，其中所述疫苗组合物中的免疫原性元件选自：

a.目标抗原；

b.来自细胞组合物的提取物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原；

c.细胞组合物，其中所述组合物的细胞表达目标抗原；

d.包含已经通过目标抗原体外引发的抗原呈递细胞的细胞组合物；

e.已经通过暴露于呈递目标抗原的抗原呈递细胞针对目标抗原体外引发的T细胞淋巴细胞。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述目标抗原是癌细胞表达的抗原，尤其是癌细胞表达的新抗原。

5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述治疗是治疗性治疗。

6.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述治疗是预防性治疗。

7.一种生产细胞组合物的方法，包括以下步骤：

i)在维持细胞多能性的这种条件下，在扩增步骤期间诱导所述群体中的MHC-I抗原呈递的试剂存在下，扩增多能细胞，

ii)将扩增的细胞暴露于将使细胞灭活的灭活剂，同时保持细胞被膜的完整性，

iii)回收并调节扩增的灭活细胞。

8.权利要求7所述的方法，其中所述多能细胞群选自：人胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS)、同种异体、异种、自体或同基因干细胞。

9.权利要求7或8所述的方法，其中所述多能细胞在扩增期间暴露于诱变剂以在所述群体的细胞中诱导基因突变。

10.权利要求9所述的方法，其中所述诱变剂选自化学诱变剂和辐射诱变剂(X射线、UV辐射)。

11.权利要求7-10任一项所述的方法，其中所述诱变剂选自ENU、活性氧、脱氨剂、多环芳烃、芳香胺和叠氮化钠。

12.权利要求9所述的方法，其中所述诱变剂是烷化剂，尤其是ENU，并且其中所述多能细胞暴露于诱变剂持续进行至少15天，更优选至少30天，更优选至少45天，更优选至少60天。

13.权利要求7-12任一项所述的方法，其中所述诱导MHC-I抗原呈递的试剂是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDACi)。

14.权利要求13所述的方法，其中所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂选自丙戊酸(VPA)、伏立诺他、帕比司他、吉维斯特、贝利司他、恩替诺特、莫西诺司他、Practinostat、西达本胺、奎司他斯特和阿昔诺司他。

15.权利要求7-14任一项所述的方法，其中所述组合物包含DNA甲基转移酶抑制剂，尤其是5-氮杂胞苷。

16.权利要求7-15任一项所述的方法，其中所述细胞通过暴露于致死剂量的辐射灭活。

17.权利要求7-16任一项所述的方法，其中所述回收包括洗涤并将细胞重悬于合适缓冲剂的步骤。

18.权利要求7-17任一项所述的方法，其中所述调节包括冷冻或冻干细胞的步骤。

19.包含多能细胞的细胞组合物，其中在扩增后，所述群体中的细胞在选自以下的至少三个基因中呈现至少0.1％的突变率：TP53、P2RY8、CRLF2、CRTC3、BLM、ASXL1、IDH2、NTRK3、MALAT1、EXT1、NCOA2、IKF1、PIK3R1、EP300、AKT2、PPP2R1A、CDK12、BRCA1、ERB2、CDH1、TBX3、SMARCD1、HSP90AA1、EZH2、SUZ12、STAT5B和POUF5F1。

20.一种疫苗组合物，包含：

a.多能细胞群，和

b.组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。

21.权利要求20所述的疫苗组合物，其中所述多能细胞包含突变的多能细胞。

22.权利要求20或21所述的疫苗组合物用于治疗患有癌症的受试者的用途。

23.权利要求22所述的疫苗组合物的用途，其中所述癌症具有干细胞特征(表达胚胎抗原)。

24.一种试剂盒，包含权利要求20-23任一项所述的疫苗组合物和提供免疫说明书的信息传单。

25.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括向所述受试者同时、分别或依次施用治疗有效量的作为组合制剂的(i)多能细胞群和(ii)激活MHC表达和/或免疫应答的化合物。

26.权利要求25所述的方法，其中所述多能细胞群选自：人胚胎干细胞、诱导的多能干细胞(iPS)、同种异体、异种、自体或同基因干细胞。

27.权利要求25或26所述的方法，其中所述癌症选自表达胚胎抗原的癌症。

28.权利要求25-27任一项所述的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结肠直肠癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、肺癌、淋巴瘤、急性和慢性淋巴样和髓样白血病、黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、头颈肿瘤和实体瘤。

29.权利要求25-28任一项所述的方法，其中所述多能细胞被遗传修饰以过表达刺激MHC表达和/或免疫应答的化合物。

30.权利要求29所述的方法，其中所述刺激MHC表达和/或免疫应答的化合物选自粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)及其组合。

31.权利要求25-30任一项所述的方法，其中所述多能细胞已经用诱变剂处理。

32.权利要求24-31任一项所述的方法，进一步包括向患者施用免疫检查点抑制剂。

33.权利要求25-31任一项所述的方法，进一步包括向患者施用化疗。

34.权利要求25-31任一项所述的方法，进一步包括向患者施用放疗。

35.权利要求25-31任一项所述的方法，进一步包括向患者施用化疗和放疗两者。

36.权利要求25-35任一项所述的方法，其中所述多能细胞的施用通过皮下注射进行。

37.权利要求25-36任一项所述的方法，还包括在施用多能细胞群后一段时间施用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的步骤。

38.权利要求37所述的方法，其中所述一段时间为3天至3周。

39.权利要求25-38任一项所述的方法，其中激活MHC表达和/或免疫应答的化合物是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。

40.权利要求25-39任一项所述的方法，其中所述MHC表达的激活剂是丙戊酸。

41.权利要求25-38任一项所述的方法，其中所述MHC表达的激活剂是DNA甲基转移酶抑制剂。