CN112603995B - 靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗的制备方法，属于生物医药技术领域，其方法是采用慢病毒包装质粒感染肿瘤细胞得到稳定表达株，然后灭活制得；本发明还公开了采用上述方法制备的疫苗的应用；本发明基于全新的制备方法，所制得的疫苗能够更稳定地表达抗原，免疫治疗响应率更高，效果更好更稳定，且得到的是广谱性的疫苗，可以治疗超过90%的上皮来源的肿瘤、部分软组织肿瘤和黑色素瘤；此外，本疫苗还可以增强肿瘤的放射敏感性，与放射治疗尤其是与消融放射治疗联合使用可以取得更优的效果，并且可以改善放疗引起的纤维化，降低放疗的毒副作用。

Description

靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗、其制备方法及其应用。
背景技术
长期以来，肿瘤研究的重点主要集中在肿瘤细胞本身。而随着研究的深入，人们发现肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)中的基质细胞不仅为肿瘤发生、发展、侵袭、转移提供“肥沃土壤”，也是协助肿瘤细胞逃避免疫监视帮凶。越来越多的研究表明，和肿瘤细胞一样，TME中的基质细胞也成为肿瘤治疗的重要靶标。
肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts；CAF或CAFs)是TME中关键成分。在不同的肿瘤中，CAFs构成TME的5-90％，在乳腺癌和胰腺癌中，肿瘤体积的80％是CAFs及其驱动的结缔组织。与正常的成纤维细胞不同，CAFs通常处于不可逆激活状态且抗凋亡，通过分泌细胞因子、趋化因子、中间代谢分子和外泌体，与肿瘤细胞、微环境中其他细胞直接或间接发生联系，参与组织形态构建、肿瘤特有微环境及肿瘤干细胞特有生长环境的维持，保护肿瘤细胞逃避免疫系统的杀伤，调节肿瘤代谢，促进肿瘤生长和转移。因此，CAFs本身及其产物可作为抗肿瘤治疗的靶点。
大量研究表明，CAFs还可通过多种方式降低肿瘤的放疗敏感性，促进放疗后肿瘤复发。放疗后TME发生一系列变化，导致肿瘤细胞放射敏感性降低，并通过多种途径(如低氧、纤维化、免疫调节等)促进放疗抗性的形成。放疗后造血干细胞进入TME，并进一步转化为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)，与肿瘤细胞相比，CSCs具有更高的放疗抗性。CAFs能够通过外泌体通过激活TGFβ信号通路，促进细胞增殖和干细胞性基因的表达，从而增强肿瘤的放疗抵抗。CAFs分泌产生的外泌体还可通过调控Wnt通路增强结肠直肠癌干细胞的耐药性，通过抑制外分泌可以逆转这种效应，表明该外泌体不仅能增强肿瘤的生长，还能诱导放化疗抵抗。
放疗损伤脉管内皮细胞，造成肿瘤组织乏氧，释放HIF-1α刺激SDF-1表达上调，进一步募集免疫抑制细胞，增加肿瘤对放疗及免疫治疗的抗性。CAFs分泌CXCL12、TGF-b1和IL-10等细胞因子促进免疫抑制细胞的募集，抑制效应性T细胞的功能。CXCL12可诱导组织乏氧，放疗后CXCL12分泌增加可诱导肿瘤细胞自噬，促进肿瘤细胞增殖及修复。CAFs分泌肝细胞生长因子诱导肿瘤细胞处于对放射治疗更敏感的增殖、浸润及转移状态。CAFs释放基质细胞衍生因子1与CXC趋化因子受体4结合诱导血管生成，促进肿瘤细胞增殖，并降低放疗效果。CAFs激活MAPK、AKT、β1-integrin-FAK等信号通路，影响放射诱导的DNA损伤，最终导致放疗抵抗。
除了细胞外信号的直接调节，CAFs增殖能力增强、具有收缩性、形成纤维，降解基质，趋化性及产生细胞因子，在放射性纤维化过程中起到了中枢作用3。此外，CAFs可促进上皮间质转化，导致上皮细胞的移动能力提升，获得高侵袭性、抗凋亡的生物学特征，细胞间粘连蛋白丢失，波形蛋白、纤连蛋白上调，基质金属蛋白酶效应增加，增强肿瘤的侵袭转移并降低肿瘤对放疗的敏感性。FAPα是特异性表达于CAFs表面的抗原分子，不仅在肿瘤侵袭转移和肿瘤微环境的免疫抑制等方面发挥重要作用，还与TGF-b1、MMP1等细胞因子协同作用促进纤维化形成，保护肿瘤细胞免于放疗的杀伤。
随着研究的不断深入，靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗研究也越来越多，本申请的发明人在该领域也进行了大量的研究，先前已经采用阳离子脂质体把表达FAP的质粒瞬时转染肿瘤细胞，得到了一种靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗，并证明其可用于治疗黑色素瘤，肺癌和结肠癌等。这种方法制备的疫苗虽然在治疗前期能有效减缓肿瘤生长，但后期肿瘤生长加速，可能的原因是瞬时转染后肿瘤细胞表达抗原不够稳定，不利于抗肿瘤免疫的激活，并且此种制备方法得到的肿瘤疫苗也不适合批量生产和转化应用。此外，单纯使用疫苗免疫治疗效果有限，所以有必要对此进行进一步改进。
发明内容
本发明的目的之一，就在于提供一种靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗的制备方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗的制备方法，采用慢病毒包装质粒感染肿瘤细胞得到稳定表达株，然后灭活制得。
作为优选的技术方案，包括以下步骤：
(1)以FAP cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；
(2)将步骤(1)所得的PCR扩增片段通过无缝克隆连接于经EcoRI和BamHI酶切的慢病毒载体pCDH，构建携带FAP的慢病毒载体pCDH-FAP；
(3)通过EcoRI和BamHI酶切pCDH-FAP，将pCDH-FAP进行测序验证；
(4)将pCDH-FAP与慢病毒辅助质粒通过磷酸钙共同转染293T细胞，进行慢病毒包装lenti-FAP；
(5)将步骤(4)包装成功的慢病毒lenti-pCDH和lenti-FAP分别感染肿瘤细胞，得到稳定表达株；
(6)将步骤(5)所述的稳定表达株进行辐照灭活，即得。
作为进一步优选的技术方案，步骤(4)所述的慢病毒辅助质粒为psPAX2和pMD2G。
作为进一步优选的技术方案，步骤(5)所述的肿瘤细胞为LLC、4T1和CT26细胞中的至少一种。
作为进一步优选的技术方案，步骤(6)所述的辐照为100Gy的放射线。
本发明的目的之二，在于提供上述的方法所制得的靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗。
本发明的目的之三，在于提供上述的方法所制得的靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗在制备用于上皮来源的肿瘤的药物中的应用。
采用本发明的方法所制得的疫苗，除了现有技术报道的治疗黑色素瘤，肺癌和结肠癌等外，可以用于超过90％的上皮来源的肿瘤、部分软组织肿瘤和黑色素瘤间质，比如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、骨肉瘤等等。
本发明的目的之四，在于提供上述的方法所制得的靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗作为免疫激活剂在增强放射治疗敏感性中的应用。
经过大量试验证明，本发明所制得的疫苗能够显著增强放射敏感性，尤其是SABR的敏感性和效果。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明基于全新的制备方法，所制得的疫苗能够更稳定地表达抗原，效果更好更稳定，而且靶点更多，得到的是广谱性的疫苗，可以治疗超过90％的上皮来源的肿瘤、部分软组织肿瘤和黑色素瘤，效果更稳定；另外，本申请制得的疫苗可以作为免疫激活剂，增强肿瘤的放射敏感性，与放射治疗尤其是与消融放射治疗联合使用可以取得更优的效果，并且可以改善放疗引起的纤维化，降低放疗的毒副作用。
附图说明
图1为PCR扩增FAP电泳图；
图中，M:2kb DNA片段；1:FAP阴性对照(无模板)；2:FAP PCR产物(2286bp)
图2为pCDH-FAP酶切验证电泳图；
图中，M:5kb DNA片段；1:pCDH-FAP未酶切；2:pCDH-FAP经EcoRI和BamHI酶切(2286bp)；
图3为pCDH-FAP质粒图谱示意图；
图4为慢病毒lenti-pCDH和lenti-mFAP分别感染LLC、4T1和CT26细胞，感染72h后，用嘌呤霉素进行筛选48h后，显微镜观察细胞存活情况；
图5为RT-qPCR检测LLC、4T1和CT26稳转细胞中FAP的相对表达；
图中，control组为未感染慢病毒的野生型细胞，lenti-pCDH组为未感染空载体慢病毒的细胞，lenti-FAP组为感染lenti-FAP的细胞；
图6为实施例2的各组联合治疗模式图；
图7为实施例2在小鼠LLC肺腺癌模型中比较不同SABR分割方式及其与表达FAP的肿瘤细胞疫苗结合时的抗肿瘤效果图；
图8为实施例3的各组联合治疗模式图联合治疗方案；
图9为实施例3各组小鼠PET/CT结果图；
图10为实施例3接种肿瘤后第25天Vaccine组、SABR组、SABR+pCDH组、SABR+Vaccine组小鼠的肿瘤体积；
图11为实施例3接种乳腺肿瘤后第28天SABR组、SABR+pCDH组、SABR+Vaccine组小鼠的肿瘤体积；
图12为实施例3小鼠乳腺肿瘤生长曲线；
图13为实施例3荷瘤小鼠接种乳腺肿瘤后生存期曲线；
图14为实施例3接种结肠肿瘤细胞后各组小鼠肿瘤生长曲线；
图15为实施例3接种结肠肿瘤细胞后第30天SABR组、SABR+pCDH组、SABR+Vaccine组小鼠的肿瘤体积；
图16为实施例3接种结肠肿瘤细胞后第40天SABR组、SABR+pCDH组、SABR+Vaccine组小鼠的肿瘤体积；
图17为实施例3接种结肠肿瘤细胞后第50天SABR组、SABR+pCDH组、SABR+Vaccine组小鼠的肿瘤体积；
图18为实施例3接种结肠肿瘤细胞后第60天SABR组、SABR+pCDH组、SABR+Vaccine组小鼠的肿瘤体积；
图19为实施例4各组小鼠肺的实体图片；
图20为实施例4各组小鼠肺部切片的HE染色结果；
图21为实施例4各组小鼠肺的平均重量；
图22为实施例4各组小鼠肺的肿瘤转移结节面积；
图23为实施例5各组小鼠肿瘤组织HE、天狼星红染色及免疫组化结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
靶向CAFS的肿瘤细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
FAP(成纤维细胞活化蛋白)的NCBI基因号为NM_007986.3，其编码区长度为2285bp；以FAP cDNA为模板进行PCR扩增：所用引物序列如下表1所示：
表1 PCR所用引物序列：
Figure BDA0002874046450000071
在PCR管内混合以下溶液：
Figure BDA0002874046450000072
阴性对照为对应不加模板；PCR反应条件：98℃，10sec，55℃，5sec，72℃，30sec，共计35个循环，然后72℃2min，16℃2min；
通过上述PCR反应，成功扩增出条带大小一致的扩增片段，如图1中条带2所示，将此PCR扩增片段通过无缝克隆连接于经EcoRI和BamHI酶切的慢病毒载体pCDH，构建携带FAP的慢病毒载体pCDH-FA，如图3所示；连接成功后，通过EcoRI和BamHI酶切pCDH-FAP，酶切条带大小与FAP基因大小一致，如图2所示，将pCDH-FAP进行测序验证，结果表明测序正确；
然后将pCDH-FAP与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G通过磷酸钙共同转染293T细胞，进行慢病毒包装lenti-FAP；pCDH空载作为对照包装的慢病毒标记为lenti-pCDH；将包装成功的慢病毒lenti-pCDH和lenti-FAP分别感染LLC、4T1和CT26细胞，感染72h后，用嘌呤霉素进行筛选。嘌呤霉素筛选48h后，发现未感染慢病毒的对照细胞全部死亡，而感染慢病毒lenti-pCDH和lenti-FAP的细胞大部分存活，如图4所示，初步表明慢病毒包装和感染成功。
为验证LLC、4T1和CT26稳转株细胞中FAP的表达，利用TRIZOL提取LLC、4T1和CT26细胞的总RNA，通过RT-qPCR检测FAP的表达。将感染lenti-pCDH的细胞中FAP表达量设为1，处理组FAP表达量为与对照相比的相对表达倍数。经RT-qPCR检测，结果如图5所示：与感染空载体lenti-pCDH的肿瘤细胞相比，感染lenti-FAP的3株肿瘤细胞高表达FAP mRNA，利用放射线固定灭活稳转株细胞(100Gy)进一步增强其免疫原性用于体内实验。
实施例2：
发明人的前期研究发现表达人FAPα的肿瘤细胞疫苗可抑制肿瘤生长，并改善肿瘤间质纤维化，但单纯使用该疫苗疗效有限。研究表明，SABR结合肿瘤特异性疫苗会产生原位疫苗效应，进一步提高机体抗肿瘤免疫应答，其治疗效果受放疗方案以及联合治疗时序等因素的影响。
本实施例建立了小鼠LLC肺癌模型，比较不同的SABR方案(单次剂量16.4Gy×1次或单次剂量8Gy×3次)以及不同的治疗时序的抗肿瘤效果，并观察荷瘤小鼠对治疗的耐受情况。
实验动物分组：接种肿瘤后第6天，将48只小鼠随机分为8组，每组6只，具体如图6所示，
具体方法为：选用6～8周龄雌性C57/bl小鼠，于第0天在右侧大腿处皮下接种4×105/100μl LLC细胞。使用LQ模型计算BED，选择BED＝43.2Gy的2种SABR剂量分割方式(即8Gy×3次以及16.4Gy×1次)，采用小型动物辐照器进行放疗。联合治疗方案包括方案A(第10天行SABR放疗，第一次放疗结束后2天开始疫苗免疫，免疫治疗每周一次，连续治疗三周，按1×106细胞/100ml体系多点皮下给药)和方案B(先免疫治疗，第一次免疫治疗结束后3天开始SABR放疗)。接种肿瘤后第30天测量肿瘤大小。
如图7所示，在接种肿瘤后untreated组小鼠肿瘤生长迅速，第30天该组小鼠均已死亡。而SABR16.4Gy组、SABR3x8Gy组、Vaccine组小鼠肿瘤体积分别达到2662±180.8mm3、1557±350mm3，2301±323.3mm3。同时，Vaccine→SABR16.4Gy组，Vaccine→SABR3x8Gy组，SABR16.4Gy→Vaccine组和SABR3x8Gy→Vaccine组肿瘤体积分别为1253±135.7mm3，614.8±203.3mm3，1789±156.4mm3，1282±153.8mm3。与Vaccine组、SABR16.4Gy组相比，SABR3x8Gy组、Vaccine→SABR16.4Gy、SABR16.4Gy→Vaccine组SABR8Gyx3f→Vaccine组、Vaccine→SABR8Gyx3f组肿瘤生长受到抑制，其中Vaccine→SABR8Gyx3f组肿瘤体积最小。在整个实验过程中，小鼠未出现立毛，食欲下降，行为异常等现象，体重未出现明显减轻，表明所有小鼠可耐受上述联合治疗方案。由此可知，两种SABR剂量分割方式相比，8Gy×3次的SABR优于16.4Gy×1次；联合治疗时序方面，第一次免疫治疗3天后进行SABR的治疗效果优于SABR后再行疫苗免疫治疗。
实施例3：
本实施例建立小鼠4T1乳腺癌和CT26结肠癌皮下肿瘤模型，进一步明确了表达人FAP的肿瘤细胞疫苗结合SABR的治疗效果优于单纯放疗或疫苗免疫治疗。
选用6～8周龄雌性Balb/c小鼠，于第0天在右侧大腿处皮下接种4×105/100ml4T1乳腺癌或CT26结肠癌细胞。第8天30只小鼠随机分为5组，每组6只,具体为：
Untreated组：对照组
SABR组：第10天开始消融放疗8Gy×3次
Vaccine组：第7、14、21天皮下注射表达人FAP的肿瘤细胞疫苗免疫治疗
SABR+pCDH组：第10天开始消融放疗8Gy×3次，第7、14、21天用灭活的pCDH空载体感染的肿瘤细胞免疫
SABR+Vaccine组：第10天开始消融放疗8Gy×3次，第7、14、21天疫苗免疫；
联合治疗方案如图8所示，
如图9-13所示，在接种小鼠4T1乳腺癌细胞后，Untreated组小鼠肿瘤生长迅速，Vaccine组、SABR组及SABR+pCDH组小鼠的肿瘤生长有所减缓，而SABR+Vaccine组小鼠肿瘤生长明显受到抑制，其肿瘤体积明显小于各对照组(*P<0.05)，而荷瘤小鼠生存期明显延长，其差异具有统计学差异(P<0.05)。
但是，在小鼠结肠癌模型上，Untreated组小鼠肿瘤生长迅速。Vaccine组有所减缓，而SABR组、Vaccine+SABR组及pCDH+SABR组小鼠肿瘤生长均明显受到抑制(图14)。接种结肠癌细胞后第30天，Untreated组小鼠全部死亡，Vaccine组小鼠死亡4只，而SABR组、pCDH+SABR组及SABR+Vaccine组小鼠肿瘤体积分别为156.8±38.81mm3，53.56±8.304mm3，35.57±6.35mm3，pCDH+SABR组及SABR+Vaccine组小鼠肿瘤体积均明显小于SABR组，二者肿瘤体积无明显差异(图15)。
接种肿瘤后第40天，SABR组小鼠肿瘤有所增大，达到446.4±48.64mm3，SABR+pCDH组及SABR+Vaccine组小鼠肿瘤体积仍较小，分别为71.27±22.14mm3、35.76±10.02mm3，均明显小于SABR组，但二者肿瘤体积无明显差异(图16)。接5种肿瘤后第50天，SABR组小鼠肿瘤明显增大，SABR+pCDH组小鼠肿瘤体积有所反弹，达到117.5±40.08mm3，而SABR+Vaccine组小鼠肿瘤体积仍较小，二者具有统计学差异(p＝0.0447)(图17)。接种肿瘤后第60天，SABR+pCDH组小鼠肿瘤体积明显长大，达到417.7±109mm3，而SABR+Vaccine组小鼠肿瘤体积为57.94±20.32mm3，二者具有统计学差异(p＝0.0088)(图18)。结果表明，表达人FAPα的肿瘤细胞疫苗作为免疫激活剂增强放疗敏感性，尤其是增强消融放疗的作用从而进一步抑制肿瘤生长。
实施例4
按上述实施例2联合治疗方案治疗荷瘤小鼠，图19为各组小鼠肺的实体图片，图20为各组小鼠肺部切片的HE染色结果，Untreated组小鼠濒死时处死所有小鼠，充分暴露双侧肺脏，分离肺并称重，观察转移情况,仔细计数肺转移结节数目、大小、分布，并估算出肺部的肿瘤转移结节面积(0＝0％,1＝<20％,2＝20–50％,3＝50-70％，4＞＝75％)。结果如图21和22所示，SABR+Vaccine组小鼠的肺转移明显少于其他组。Untreated组、Vaccine组、SABR组、SABR+pCDH组及SABR+Vaccine组肺湿重分别为0.85±0.02g、0.62±0.6g、0.57±0.13g、0.39±0.04g、0.23±0.02g，Vaccine+SABR组肺湿重明显小于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。比较5组小鼠肺转移结节面积，Untreated组6只小鼠肺转移结节面积均占全肺面积的75％以上，SABR+Vaccine组6只小鼠中有1只小于50％，有3只小于20％，有2只未发生肺转移，另外三组的转移面积介于上述两组之间。结果表明，表达人FAPα的肿瘤细胞疫苗作为免疫激活剂增强放疗敏感性，尤其是增强消融放疗的作用从而进一步抑制乳腺癌肺转移。
实施例5
如图23所示，其中第一行为各组小鼠肿瘤组织HE染色结果，可以看出，与对照组相比，SABR+Vaccine组肿瘤浸润性淋巴细胞数目明显增多，表达FAPa的肿瘤细胞疫苗结合SABR能有效清除肿瘤微环境中CAFs，减少肿瘤新生血管的数量，第二到无行为各组小鼠肿瘤组织免疫组化及天狼星红染色结果，可以看出，与Untreated组、Vaccine组、SABR组、SABR+pCDH组相比，SABR+Vaccine组肿瘤内FAPα、胶原纤维、CD34、LYVE-1的表达量明显下调；
与对照组相比SABR+Vaccine组小鼠肿瘤间质内CAFSs的产物FAPα、αSMA、I型胶原表达下调，肿瘤新生血管的数量减少，表达FAPα的肿瘤细胞疫苗结合SABR能有效清除肿瘤微环境中CAFS，下调与之功能相关的生长因子和细胞因子的表达，有效抑制肿瘤生长转移及间质纤维化。
序列表
<110> 四川省肿瘤医院
<120> 靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗、其制备方法及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gattctagag ctagcgaatt cgccaccatg aagacatggc tgaaaactg 49
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atccttcgcg gccgcggatc ctcagtctga taaagaaaag cat 43
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agattctaga gctagcgaat tcgccaccat ggtgagcaag ggcg 44
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atccttcgcg gccgcggatc cttacttgta cagctcgtcc atg 43

Claims (7)

1.一种靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征在于：采用慢病毒包装质粒感染肿瘤细胞得到稳定表达株，然后灭活制得，具体包括以下步骤：
（1）以FAP cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；
（2）将步骤（1）所得的PCR扩增片段通过无缝克隆连接于经EcoRI和BamHI酶切的慢病毒载体pCDH，构建携带FAP的慢病毒载体pCDH-FAP；
（3）通过EcoRI和BamHI酶切pCDH-FAP，将pCDH-FAP进行测序验证；
（4）将pCDH-FAP与慢病毒辅助质粒通过磷酸钙共同转染293T细胞，进行慢病毒包装lenti-FAP；
（5）将步骤（4）包装成功的慢病毒lenti-pCDH和lenti-FAP分别感染肿瘤细胞，得到稳
定表达株；
（6）将步骤（5）所述的稳定表达株进行辐照灭活，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的慢病毒辅助质粒为psPAX2和pMD2G。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述的肿瘤细胞为LLC、4T1和CT26细胞中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）所述的辐照为100Gy的放射线。
5.权利要求1-4任意一项的制备方法所制得的靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗。
6.权利要求1-4任意一项的制备方法所制得的靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗在制备用于上皮来源的肿瘤的药物中的应用。
7.权利要求1-4任意一项的制备方法所制得的靶向CAFs的肿瘤细胞疫苗在制备用于增强放射敏感性的药物中的应用。
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