BR112018074192A2 - método para tratamento de um sujeito, método para produzir uma composição celular, composição de células, composição de vacina e kit - Google Patents

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Abstract

os inventores desenvolveram um modelo de tumor mamário 4t1 metastático em camundongos balb/c. eles mostraram que a vacinação com células-tronco embrionárias xenogênicas em combinação com ácido valpróico (vpa) gera uma maior resposta anti-tumoral contra o câncer de mama e inibe o desenvolvimento de metástases. eles estabeleceram que essas respostas são alcançadas apenas pela adição de ácido valpróico no regime terapêutico em comparação com o uso de escs ou ipscs isoladamente. assim, os inventores proveram uma nova estratégia terapêutica para tratar cânceres que expressam antígenos embrionários. assim, a presente invenção diz respeito a i) uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão de mhc, como uma preparação combinada para uso em um método para tratamento de um sujeito que sofre de um câncer, compreendendo uma etapa de administração simultaneamente, separadamente ou sequencialmente ao referido sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do mesmo.

Description

MÉTODO PARA TRATAMENTO DE UM SUJEITO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO CELULAR, COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS, COMPOSIÇÃO DE VACINA E KIT
CAMPO DA INVENÇÃO [0001] A presente invenção está no campo da oncologia e, mais especificamente, a invenção diz respeito a uma terapia combinada de vacina anticâncer.
[0002] Mais particularmente, a invenção diz respeito a métodos de produção de uma composição compreendendo células pluripotentes apresentando múltiplos neoantígenos e aqueles úteis destes na preparação de vacinas de células cancerígenas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0003] A maioria dos cânceres resulta de mutações aleatórias que surgem durante a replicação do DNA em células-tronco normais necessárias durante o desenvolvimento e a manutenção dos tecidos. As Células-Tronco Cancerígenas (CSCs) são heterogêneas e epigenéticas, aliadas ao plástico em um estado dinâmico. As células tumorais que surgem de CSCs são impulsionadas pelo acúmulo simultâneo de mutações presentes em oncogenes, genes supressores de tumor e vias de sinalização que levam a ondas clonais de evolução tumoral. No modelo de evolução clonal, os tipos de mutações variam à medida que o câncer se desenvolve, de modo que as células cancerígenas individuais se tornam cada vez mais transformadas e agressivas. Mutações adquiridas no desenvolvimento precoce do tumor são sustentadas na doença avançada.
[0004] Ao longo do tempo, essas mutações levam à expansão do tumor oligoclonal e à resistência das células cancerígenas, em associação com uma imposição e exaustão imunológica progressiva. A assinatura mutacional do câncer está altamente associada à instabilidade genômica. As mutações dão origem a novos neoantígenos não-próprios com epítopo imunogênico. No entanto, uma vez que o microambiente do tumor é geralmente imunossupressor, o sistema imunológico do hospedeiro geralmente não é capaz de destruir essas células e combater esses
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2/83 cânceres adequadamente. Os benefícios clínicos relatados pela resposta de células T com inibidores do ponto de verificação imunológico estão bem correlacionados com a taxa de mutação e o cenário de mutação dos tumores.
[0005] Células-tronco cancerígenas (CSCs) representam uma população menor de células cancerígenas auto-renováveis que contribuem para a persistência e recorrência do tumor, uma vez que frequentemente são resistentes aos tratamentos convencionais. As CSCs descobertas inicialmente em malignidades hematopoiéticas foram descritas em tumores sólidos de várias origens, incluindo mama, glioblastoma, próstata, carcinoma de células escamosas do pescoço e cabeça do cólon, bexiga ovariana, pulmão, câncer pancreático. As CSCs têm a característica de formar tumores xenográficos em camundongos e capacidade de iniciação tumoral. Além disso, são resistentes a rádio e quimio, contribuindo para a falta de resposta terapêutica em pacientes. A persistência das CSCs causa recidiva do tumor e/ou metástase após a conclusão da terapia. Várias publicações mostraram uma ligação molecular entre a patogênese do tumor e o estado das Células-Tronco Embrionárias (CTE). A CSC expressa um grande número de antígenos embrionários que são expressados também por células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSCs).
[0006] Primeiramente, os fatores de transcrição OCT4, NANOG e SOX2 são reguladores mestres e trabalham juntos como parte de uma rede altamente integrada (relacionada à rede c-myc e polycomb) para conduzir a transição de uma célula somática para uma CSC ou iPSC usando maquinaria epigenética para remodelar a cromatina através de modificação de histonas e metilação do DNA. Esses fatores estão ausentes nas células-tronco adultas normais. Expressão genética de células-tronco embrionárias e subexpressão de genes regulados por Polycomb que definem a identidade de células-tronco pluripotentes humanas (ESC/IPSC)
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3/83 estão associadas a tumores humanos pouco diferenciados com desfecho clínico desfavorável e recorrência distante após quimio-radioterapia, independentemente da origem dos cânceres (mama, pâncreas, bexiga, pulmão, próstata, meduloblastoma...). Tumores pouco diferenciados com um perfil de “severidade” estão relacionados a traços mesenquimais em células de carcinoma com marcadores “EMT” epiteliais e mesenquimais, baixos níveis de expressão de MHC-I, microambiente tumoral imunossupressor com leucócitos inflamatórios pró-tumorais, células estromais e macrófagos. As células tumorais submetidas a EMT adquirem propriedades severas e tornam-se CSC muito cedo com a capacidade de migrar em todo o organismo e de persistirem em um estágio dormente por longos períodos de tempo. As CSCs agem como um reservatório para semear e reabastecer o compartimento do tumor. Elas também se expandem por auto-renovação, disseminando-se para diferentes tecidos, gerando metástases. Essas CSCs compartilham assinaturas gênicas embrionárias pluripotentes e são resistentes a drogas anticâncer e radioterapia. Elas também escapam das defesas antitumorais imunes pelas razões indicadas acima (microambiente imuno-depressivo).
[0007] Foi relatado que tecidos fetais podem ser usados para imunizar camundongos e que isso pode induzir a rejeição de tumores transplantados, incluindo câncer de pele, fígado e trato gastrointestinal. Esta resposta foi explicada pelo fato de que essas células tumorais expressam um alto número de antígenos oncofetais.
[0008] Até o presente momento, foram realizados vários ensaios de vacinas contra câncer em humanos, com o objetivo de visar antígenos embrionários, tais como antígenos carcinoembrionários (CEA), antígenos alfa-fetoproteína ou antígenos de câncer/testes. Infelizmente, o direcionamento de apenas um antígeno mostrou não ser eficiente o suficiente para gerar fortes respostas imunológicas antitumorais para mediar a rejeição do tumor devido ao rápido aparecimento de mutantes de
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4/83 escape levando à ineficiência geral das vacinas de câncer monovalentes.
[0009] O recente interesse no potencial das células-tronco na medicina regenerativa tornou amplamente disponíveis as linhas de ESC bem definidas, assim como iPSCs que são fenotípicas e funcionalmente semelhantes às ESCs.
[0010] As aberrações epigenéticas associadas ao câncer são um traço característico das células-tronco cancerígenas que envolvem todos os componentes da maquinaria epigenética (metilação de DNA, modificações das histonas, RNAs não-codificadores, especificamente expressão de microRNA).
[0011] Vários fármacos modificadores epigenéticos com atividades inibidoras de tumores, estão atualmente em uso clínico em oncologia, incluindo agentes de hipometilação, tais como azacitidina ou decitabina e inibidores de desacetilase de histona, tais como vorinostat ou romidepsina.
[0012] Usando tais drogas, foi possível reprogramar as células cancerígenas. Além disso, a reprogramação epigenética do microambiente tumoral por drogas epigenéticas é uma abordagem de manipulação atrativa da terapia de câncer, pois há evidências claras da interação entre câncer e estroma no desenvolvimento do câncer.
[0013] Assim, continua a haver uma necessidade para novas abordagens que previnam e/ou tratem cânceres com assinatura de célulastronco. Estes cânceres expressam um conjunto de genes embrionários (ou seja, também chamados neoantígenos) em comum com ESC/IPSC, e incluem, particularmente, câncer de pâncreas, cancro da mama, câncer do ovário, câncer do cólon, câncer do rim, câncer do pulmão, carcinomas da próstata, meduloblastoma, colangiocarcinoma, câncer de fígado, leucemias e mielomas crônicas e agudas. Esta classe de câncer está mais associada a uma assinatura similar ao mesênquima, que precisa desenvolver terapias visando especificamente as CSCs para melhorar a sobrevida e melhorar a
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5/83 qualidade de vida dos pacientes com câncer. Particularmente, tais estratégias devem levar à restauração de um micro-ambiente anti-tumoral permissivo (o microambiente tumoral é geralmente imunossupressor e, portanto, deve ser refeito imunocompetente) combinado com uma resposta imune anti-CSC. Esta e outras necessidades são abordadas, no todo ou em parte, por meio do objeto atualmente divulgado.
RESUMO DA INVENÇÃO [0014] A presente invenção baseia-se na determinação, pelos inventores, de que HDACi (inibidores de desacetilase de histona) pode ser usado para estimular uma resposta imunológica em um paciente, contra um antígeno de interesse, quando uma composição imunogênica, contendo o referido antígeno de interesse, ou direcionado ao referido antígeno de interesse, é administrado ao paciente, em combinação com um HDACi, seguido opcionalmente por um tratamento adicional com um HDACi. A composição imunogênica destina-se a permitir o aparecimento de uma resposta imunológica contra (um) antígeno(s) de interesse. O uso de HDACi como adjuvante é particularmente interessante para o tratamento de cânceres, particularmente para cânceres com assinatura de células-tronco. A presente invenção é definida particularmente pelas reivindicações.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:
[0015] Os inventores mostraram que o uso de uma HDACi juntamente com uma população de células pluripotentes levou a uma sinergia e a uma resposta eficiente do sistema imunológico contra células tumorais.
[0016] De fato, os inventores hipotetizaram ainda que célulastronco pluripotentes, tais como hESCs ou hiPSCs, podem ser utilizadas como uma vacina para gerar uma resposta imunológica contra uma variedade de antígenos embrionários que são partilhados por células tumorais. Eles descobriram que a vacinação de camundongos com hESCs ou hiPSCs em combinação com um composto que é capaz de induzir MHC
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I, como ácido valpróico, foi capaz de induzir respostas imunológicas e antitumorais eficientes contra carcinoma de mama sem evidência de efeitos colaterais e doenças autoimunes. Além disso, eles descobriram que esse regime combinado estava associado a uma inibição significativa da metástase pulmonar. De maneira interessante, eles estabeleceram que essas respostas são melhoradas enormemente pela adição de HDACI, e particularmente ácido valpróico no regime terapêutico em comparação ao uso de ESCs ou iPSCs isoladamente.
HDACi para melhorar a resposta imunológica [0017] A invenção diz respeito a um método para aumentar a eficácia, em um paciente, de uma composição de vacina, compreendendo a etapa de administração de um HDACi ao doente em conjunto com a composição de vacina. Em particular, o HDACi pode ser adicionado à composição de vacina.
[0018] A eficácia aumentada pode ser entendida como aumento da imunogenicidade da composição de vacina, aumentando a resposta imunológica contra a composição de vacina, ou aumentando a resposta imunológica gerada pela composição de vacina. Isso pode ser comparado à resposta imunológica gerada na ausência de HDACi.
[0019] A composição de vacina contém um elemento imunogênico destinado a fazer com que o doente desenvolva uma resposta imunológica contra um ou mais antígeno(s) de interesse. Um antígeno de interesse é qualquer antígeno contra o qual uma resposta imunológica é desejada, e inclui qualquer peptídeo, proteína de si mesma (como antígenos de células cancerígenas) ou exógena, tal como proteína bacteriana, viral ou parasitica, outro tipo de antígeno, tal como ácidos nucleicos, açúcares, lipopolisacarídeos e semelhantes.
[0020] Assim, a invenção refere-se ao uso de uma HDACi como adjuvante, particularmente para aumentar a resposta imunológica contra uma composição de vacina, bem como para HDACi para seu uso como
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7/83 adjuvante, ou para aumentar a resposta imunológica contra uma composição de vacina. A invenção também se refere ao uso de uma HDACi para a fabricação de uma composição de vacina contendo um ou mais antígeno(s) de interesse, destinada a fazer com que o doente desenvolva uma resposta imunológica contra o(s) antígeno(s) de interesse.
[0021] O método e a uso descritos neste documento são particularmente interessantes quando a composição de vacina é uma composição de vacina contra câncer, isto é, contêm antígeno(s) de interesse que são expressados por células cancerígenas. Particularmente, o método e uso são muito adaptados para cânceres de tumores sólidos. De fato, nestes tipos de cânceres, o microambiente imunológico é particularmente imunossupressor (isto é, há uma expressão de citocinas e de sinais moleculares, e recrutamento de tais células CD4, que a potência das células imunes contra os antígenos cancerígenos é diminuída); sem estar vinculado a essa teoria, postula-se que a presença da HDACi modificará o microambiente e permitirá que as células imunológicas sejam potencializadas para combater as células cancerígenas, provavelmente pela modificação da expressão dos genes que possuem efeito imunossupressor nas células que estão presentes no, próximo ou ao redor do tumor.
[0022] O método descrito neste documento pode compreender também a etapa de administração de uma HDACi durante alguns dias após a administração da composição de vacina. Essa administração contínua de uma HDACi pode ser útil para manter a modificação do microambiente por um tempo suficientemente longo para que as células imunológicas possam assumir o tumor. Geralmente, esta administração contínua adicional do HDACi consistirá na administração diária de uma dose adequada do HDACi, durante pelo menos três dias após a administração da vacina e até um mês. No entanto, é preferencial que a administração adicional de HDACi seja realizada por pelo menos uma semana, mais preferencialmente
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8/83 por pelo menos ou cerca de duas semanas.
[0023] A composição de vacina contém um elemento imunogênico (composto) destinado a fazer com que o doente desenvolva uma resposta imunológica contra um ou mais antígeno(s) de interesse.
[0024] Este elemento imunológico pode ser um antígeno (ou antígenos múltiplos). Este antígeno pode ser, como visto acima, de qualquer forma, dependendo das células alvo (que é destinada a incluir células hospedeiras, assim como células bacterianas, agentes patogênicos parasitários ou partículas virais). O antígeno pode ser formulado com qualquer adjuvante (imunoestimulante) conhecido na técnica, tal como alúmen ou adjuvantes de Freund completos ou incompletos.
[0025] Em outra modalidade, o composto imunogênico é um extrato a partir de uma composição celular, em que as células da referida composição expressam um antígeno de interesse. O extrato celular pode ser células lisadas que foram centrifugadas para remover matéria insolúvel, tais como fragmentos de membranas, vesículas e núcleos, e consistem assim principalmente em citosol. Em outra modalidade, o extrato pode ter sido preparado usando técnicas específicas para esgotar ou enriquecer componentes específicos (por exemplo, a sonicação pode ser utilizada para quebrar grandes fragmentos de membrana em pequenas partículas que permanecem no extrato, ou centrifugação a alta velocidade para remover os menores componentes insolúveis). O extrato celular é obtido por qualquer ação química ou mecânica, tal como por pressão, destilação, evaporação e similares.
[0026] Em outra modalidade o composto imunogênico é uma composição celular, em que as células da referida composição expressam o antígeno de interesse. Nesta modalidade, é preferencial que a membrana das células seja preservada (de modo que a apresentação do antígeno seja feita através da via do MHC-I). É preferencial que as células sejam inativadas, como descrito abaixo.
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9/83 [0027] Nestas modalidades, as células podem ser células pluripotentes, como descrito abaixo, células cancerígenas, células infectadas por vírus ou células bacterianas.
[0028] Em outra modalidade, o elemento imunogênico é uma composição celular compreendendo Células Apresentadoras de Antígeno (APCs) que foram iniciadas in vitro por antígenos de interesse. Esta composição é uma vacina celular apresentadora de antígeno, feita de antígenos e células apresentadoras de antígenos (APCs). As células apresentadoras de antígenos são células que exibem antígeno complexado com os principais complexos de histocompatibilidade (MHCs) em suas superfícies. Pode-se citar células dendríticas (DC), que são preferenciais no contexto da invenção, uma vez que são capazes de apresentar antígeno tanto a células T auxiliares e citotóxicas, macrófagos, ou células B. Essas APCs podem ser células naturais ou células modificadas. Pode-se, particularmente, citar Eggermont et al. (Trends in Biotechnology, 2014, 32, 9, 456-465) que analisam os avanços no desenvolvimento de células artificiais apresentadoras de antígenos. Os métodos de desenvolvimento de vacinas anticâncer, utilizando APCs, foram propostos amplamente na técnica e são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0029] Em outra modalidade, o elemento imunogênico na verdade não contém um antígeno, mas consiste em uma composição de linfócitos de células T que foram iniciados in vitro contra o antígeno de interesse, por exemplo, por exposição a células apresentadoras de antígeno que apresentam o antígeno de interesse. Consequentemente, esta composição é capaz de desencadear uma resposta imunológica in vivo contra o antígeno de interesse. Essa estratégia pode ser chamada de “transferência adotiva de células T”, e é sabido que tais células T transferidas adotivamente persistem por longos períodos de tempo in vivo e migram prontamente entre os compartimentos linfático e vascular (Bear et al, J Biomed Biotechnol. 2011 ;2011:417403; Melief et al, J Clin Invest. 2015;
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125(9):3401-3412).
[0030] Em todas estas modalidades, uma HDACi é administrada em combinação com a composição de vacina contendo o elemento imunogênico. A referida administração pode ser simultânea, separada ou sequencial, como divulgado abaixo para a modalidade onde o elemento imunogênico é uma composição de células pluripotentes. Nota-se que todas as descrições abaixo, que são divulgadas para a composição de células pluripotentes, são igualmente aplicáveis às vacinas que compreendem qualquer elemento imunogênico como divulgado acima.
[0031] A presente descrição enfatiza um inibidor HDAC (particularmente, ácido valpróico), juntamente com uma composição de células pluripotentes, tais como células pluripotentes que expressam neoantígenos que são encontrados também em cânceres muito agressivos, como lembrado acima. Consequentemente, qualquer que seja o elemento imunológico, é preferencial que se o antígeno de interesse é um neoantígeno que é expressado por células cancerígenas, como descrito acima e também abaixo.
[0032] Particularmente, o elemento imunológico é uma composição celular, em que a composição celular foi obtida pela expansão e inativação de células pluripotentes, como divulgado adicionalmente em detalhes abaixo.
Método de tratamento de um sujeito que sofre de um câncer com uma preparação combinada [0033] A presente invenção diz respeito a um método para tratamento de um sujeito que sofre de um câncer, compreendendo uma etapa de administração simultaneamente, separadamente ou sequencialmente ao referido sujeito, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de i) uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC, como uma preparação combinada.
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11/83 [0034] No ambiente preferencial, as células foram cultivadas de modo a apresentar neoantígenos através da via de MHC I e, particularmente, algumas células mutadas da população presente. O composto utilizado em combinação com as células pode preservar também a pluripotência das células. É consideravelmente preferencial se a administração das células é seguida pela administração de um composto que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC (preferencialmente a mesma que foi administrada inicialmente em combinação, mas potencialmente outra) para melhorar a resposta imunitária.
[0035] Como usado neste documento, os termos “tratar” ou “tratamento” referem-se a tratamento profilático ou preventivo, bem como tratamento curativo ou modificador da doença, incluindo tratamento do sujeito com alto risco de predisposição a contrair câncer, tais como síndromes de câncer familiar hereditárias ou suspeita de ter contraído um câncer, bem como pessoas que estão doentes ou foram diagnosticadas como sofrendo de um câncer ou condição médica, e inclui a supressão de recaída clínica. O tratamento pode ser administrado a um sujeito com um câncer ou que por fim pode adquirir o câncer, de modo a prevenir, curar, retardar o aparecimento de, reduzir a severidade de ou melhorar um ou mais sintomas de câncer ou câncer recorrente, ou a fim de prolongar a sobrevivência de um sujeito para além do esperado na ausência de tal tratamento. Por regime terapêutico entende-se o padrão de tratamento de uma doença, por exemplo, o padrão de dosagem utilizado durante a terapia. Um regime terapêutico pode incluir um regime de indução e um regime de manutenção. A frase regime de indução ou período de indução diz respeito a um regime terapêutico (ou a porção de um regime terapêutico) que é utilizado para o tratamento inicial de uma doença. O objetivo geral de um regime de indução é prover um alto nível de fármaco a um sujeito durante o período inicial de um regime de tratamento. Um regime
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12/83 de indução pode empregar (em parte ou no todo) um regime de carga, que pode incluir a administração de uma dose maior do fármaco do que um médico utilizaria durante um regime de manutenção, administrando um fármaco com mais frequência do que um médico administraria o fármaco durante um regime de manutenção ou ambos. A frase regime de manutenção ou período de manutenção refere-se a um regime terapêutico (ou a porção de um regime terapêutico) que é usado para a manutenção de um sujeito durante o tratamento de uma doença, por exemplo, para manter o sujeito em remissão por longos períodos de tempo (meses ou anos). Um regime de manutenção pode empregar terapia contínua (por exemplo, a administração de um fármaco em intervalos regulares (por exemplo, semanal, mensal, anual, etc.) ou terapia intermitente (por exemplo, interrupção do tratamento, tratamento intermitente, tratamento na recaída ou tratamento após a realização de um determinado critério predeterminado (por exemplo, dor, manifestação da doença, etc.).
[0036] Como utilizado neste documento, o termo administração simultânea refere-se à administração de 2 ingredientes ativos pela mesma via e ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo. O termo administração separada refere-se a uma administração de 2 ingredientes ativos ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo por diferentes rotas. O termo “administração sequencial” refere-se a uma administração de 2 ingredientes ativos em momentos diferentes, sendo a via de administração idêntica ou diferente.
[0037] Como usado nesse documento, o termo “sujeito” diz respeito a quaisquer mamíferos, tais como um roedor, um felino, um canino e um primata humano ou não-humano. Particularmente, na presente invenção, o sujeito é um humano acometido ou susceptível a ser afetado por cânceres que possuem uma expressão de antígenos pluripotentes de células-tronco semelhantes a embrionários.
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13/83 [0038] Como utilizado neste documento, o termo população refere-se a uma população de células, em que a maioria (por exemplo, pelo menos cerca de 20%, preferencialmente pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 80%, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%) do número total de células têm as características especificadas das células de interesse (por exemplo, marcadores de pluripotência para iPSC, ESC definidos pela iniciativa internacional de células-tronco incluindo pelo menos 96 marcadores (Adewumi et al, Nat Biotech 2007), e ensaio baseado na expressão gênica (PluriTest) ( FJ Muller, Nature Methods 2011).
[0039] Particularmente, o termo “uma população de células pluripotentes” refere-se a uma população de células onde as características das células é expressão dos marcadores de pluripotência para iPSC, ou ESC. Estas células são selecionadas preferencialmente a partir do grupo que consiste em: células-tronco embrionárias humanas (hESC), célulastronco humanas pluripotentes induzidas (iPS), células-tronco alogênicas, xenogênicas, autólogas ou singeneicas.
[0040] Como usado neste documento, o termo pluripotente diz respeito a células com a capacidade de dar origem à progênie que pode sofrer diferenciação, sob condições apropriadas, em todos os tipos de células derivadas das três camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme) com características das linhagens de célula específicas. O termo “pluripotente” inclui células-tronco embrionárias normais (ESCs), ou células-tronco embrionárias muito pequenas (VSELs) ou células-tronco pluripotentes induzidas manipuladas (iPSCs), reprogramadas a partir de todas as origens e origens celulares de células somáticas adultas (ASCs).
[0041] As células-tronco pluripotentes contribuem para os tecidos de um organismo pré-natal, pós-natal ou adulto. Testes padrão aceitos pela técnica são usados para estabelecer a pluripotência de uma
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14/83 população de células, como a capacidade de formar um teratoma em camundongos SCID com 8-12 semanas de idade, e várias características de células-tronco pluripotentes. Mais especificamente, as células-tronco pluripotentes humanas expressam pelo menos alguns (pelo menos três, mais geralmente pelo menos quatro ou cinco) e, opcionalmente, todos os marcadores da seguinte lista não limitativa: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, fosfatase alcalina (ALP), Sox2, E-cadherin, UTF-I, Oct4, Lin28, Rexl, Nanog, TERC, TERT.
[0042] As células-tronco pluripotentes tradicionalmente surgem do estágio de blastocisto do desenvolvimento embrionário e têm a capacidade de se desenvolver em todos os tipos de células fetais e adultas, exceto talvez para a placenta. As células-tronco pluripotentes embrionárias (ESC) podem ser isoladas geralmente a partir de um blastocisto pósfertilização com 4 a 5 dias de vida e com 50 a 150 células. Embora as ESCs sejam capazes de proliferação ex vivo indefinida, elas existem apenas transitoriamente in vivo durante a embriogênese. Várias linhagens ESC animais (incluindo humanas), tais como, por exemplo, ESCs humanos WA09 com linhagem celular aprovadas pela NIH podem ser obtidas comercialmente pelo WiCell Research Institute, Madison, Wis. As linhagens ESC humanas, tais como Cecol-14, podem ser obtidas comercialmente, por exemplo, pela Cecolfes, Bogotá, Colômbia. Evidentemente, outras linhagens de células-tronco embrionárias podem ser utilizadas, se desejado.
[0043] Como utilizado neste documento, o termo célula-tronco embrionária refere-se a células pluripotentes de humanos (isto é, hESC). Os hESC são isolados de um embrião em estágio pré-blastocisto. Em outra modalidade, as células hES são preparadas por desdiferenciação de células diferenciadas pelo menos parcialmente (por exemplo, células multipotentes) e são totipotentes na prática. Os métodos de preparação de hESC são bem conhecidos e ensinados, por exemplo, nas Patentes dos
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EUA Nos. 5.843.780, 6.200.806, 7.029.913, 5.453.357, 5.690.926, 6.642.048, 6.800.480, 5.166.065, 6.090.622, 6.562.619, 6.921.632 e 5.914.268, Pedido Publicado nos EUA No. 2005/0176707 e no Pedido Internacional NW02001085917. No contexto da invenção, as células-tronco embrionárias humanas (hESC) são geradas sem destruição de embriões, de acordo com a tecnologia descrita em Chung et al 2008.
[0044] Como utilizado neste documento, o termo célula-tronco pluripotente induzida refere-se a uma célula-tronco pluripotente derivada artificialmente a partir de uma célula não-pluripotente por meio de um procedimento de reprogramação, utilizando métodos conhecidos na técnica e divulgados inicialmente por Yamanaka (particularmente WO2012/060473, PCT/JP2006/324881, PCT/JP02/05350, US 9,499,797, US 9,637,732, US8,158,766, US 8,129,187, US 8,058,065, US 8,278,104. Em suma, as células somáticas são reprogramadas para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) por meio da expressão ectópica de fatores definidos, tais como Oct4, Sox2, Klf4 e c-My, ou Oct4, Sox2, Lin28 e Nanog. Em uma modalidade particular, as células-tronco pluripotentes induzidas são derivadas de mamíferos, particularmente (mas não limitados a) roedores, porcos, gatos, cães e primatas não-humanos e humanos.
[0045] As iPSCs foram geradas com sucesso a partir de células somáticas de várias origens (fibroblastos, células sanguíneas, queratinócitos...) e usando tecnologias variáveis (como lentivírus/retrovírus integrativos e vetores não-integrativos, tais como sendai de vírus, vetores epissômicos, mRNA sintético, Adenovirus, rAAV, proteínas recombinantes ..) com ou sem pequenos compostos químicos.
[0046] Pequenas moléculas podem ser usadas para melhorar a indução e a qualidade de iPSCs de ratos e humanos, atuando como modificadores epigenéticos (ou seja, modificando a expressão de alguns genes). Como ilustração, pode-se citar BIX01294 (BIX, um inibidor metiltransferase da histona G9a), butirato de sódio (NaB, um inibidor de
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16/83 deacetilase de histona HDAC) ou S-adenil-isocromocisteína (SAH, um agente de desmetilação do DNA), 5-azacitidina (5-AZA, um inibidor da DNA metiltransferase), o ácido valpróico (VPA, outro inibidor da histona desacetilase) também melhora a reprogramação e a qualidade das iPSCs normais.
[0047] A iPSC autêntica totalmente reprogramada expressa similarmente genes pluripotentes do que células-tronco embrionárias com capacidade de autorrenovação e representam um recurso ilimitado de células-tronco (ou semelhantes a células-tronco).
[0048] A ESC e a IPSC podem ser iterativamente amplificadas durante passagens múltiplas e ilimitadas, permitindo recursos escalonáveis de células-tronco. O potencial de pluripotencialidade é mantido ativamente em condições de cultura permissivas, preservando o alto nível de expressão de genes de pluripotência. Estes métodos são conhecidos na técnica.
[0049] Condições e métodos de cultura específicos permitem replicar um genoma estável, mas algumas mutações do exoma e modificações epigenômicas foram, no entanto, descritas (Gore A et al. Nature 2011).
[0050] Como usado neste documento, o termo célula somática refere-se a qualquer célula do corpo, exceto células germinais (esperma e óvulo).
[0051] Como usado neste documento, 0 termo “células
alogênicas” refere-se a células da mesma espécie, mas geneticamente
distintas.
[0052] Como usado neste documento, 0 termo células
singeneicas ou autólogas refere-se a células da mesma espécie e do mesmo fundo genético.
[0053] Como usado neste documento, o termo “células xenogênicas” refere-se a células de espécies diferentes e geneticamente
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17/83 distintas.
[0054] Em uma modalidade particular, as células-tronco podem ser derivadas de mamíferos, particularmente (mas não limitados a) roedores, porcos, gatos, cães e primatas, incluindo humanos.
Método para produção de uma população de células pluripotentes:
[0055] Em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um método para a produção de uma composição celular, compreendendo as etapas de
i. expandir células pluripotentes, na presença de condições para manter a capacidade pluripotente das células, na presença de um agente que induz a apresentação de MHC-I a partir de antígenos na referida população durante a etapa de expansão ii. expor as células expandidas a um agente inativador que inativará as células, iii. recuperar e condicionar as células inativadas expandidas.
[0056] Em uma modalidade específica, a integridade do envelope celular é mantida na etapa ii).
[0057] Em outra modalidade, as células são inativadas e um produto derivado de células é obtido, tal como extratos celulares.
[0058] A composição celular produzida de acordo com o método acima pode ser utilizada para tratamento de câncer, de acordo com os métodos divulgados neste documento.
Agente para apresentação de antíqeno MHC I [0059] As células pluripotentes são expandidas na presença de um agente que melhorará a apresentação de antígenos através da via do MHC I. Tal expressão melhorada pode ser verificada pela comparação do número de moléculas de MHC I na superfície das células na presença ou na ausência do agente.
[0060] Tais agentes são conhecidos na técnica e pode-se citar, particularmente inibidores de deacetilase de histona (HDACis). Os inúmeros
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18/83 produtos com esta atividade são conhecidos na técnica arte, entre estes HDACis, pode-se citar, particularmente, valproato (VPA ou ácido valpróico, número CAS 99-66-1). Outros HDACis que podem ser utilizados (porque têm o mesmo modo de ação que o VPA) são, particularmente, vorinostat, romidepsina, chidamide, panobinostat, belinostat, panobinostat, mocetinostat, abexinostat, entinostat, SB939, resminostat, givinostat ou quisinostat.
[0061] Estes agentes estão presentes no meio de cultura celular (expansão) durante a expansão das células pluripotentes.
Mantendo a plurlootencialidade das células [0062] A expansão das células é realizada em condições de modo a manter a capacidade pluripotencial das células (meio, temperatura). Estas condições de cultura são conhecidas na técnica. A manutenção da capacidade pluripotente das células assegurará que tais células expressem (e portanto, apresentem) todos os antígenos embrionários, aumentando assim a capacidade das células de apresentar tal antígeno em sua superfície através da via de MHC I.
[0063] Os antígenos mais embrionários presentes na superfície das células pluripotentes aumentam a probabilidade de que pelo menos um desses antígenos também estejam presentes na superfície das células cancerígenas, que então será reconhecido e direcionado pelo sistema imunológico que foi preparado pela composição de vacina da invenção.
[0064] Assim, a manutenção da pluripotência das células da composição de acordo com a invenção, obtida pelos métodos divulgados neste documento, leva à apresentação de uma grande variedade de antígenos embrionários e, assim, à potência onipresente da composição de vacina da invenção nos métodos de tratamento divulgados neste documento.
[0065] A expansão das células em condições tais como para manter a pluripotencialidade é conhecida na técnica. É descrito,
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19/83 particularmente, em todos os protocolos de expansão de iPSC descritos até à data (Shi Y et al, Nat Rev Drug Discovery 2017; Chen KG et al Cell Stem Cell. 2014). É preferencial quando são usadas as seguintes condições:
Uso do meio E8 ou de todos os meios de cultura ES/iPSC de nível clínico, suplementado opcionalmente com agentes VPA e/ou mutagênico (como ENU, vide abaixo).
Temperatura de 37 °C com ou sem condições de hipóxia
Mudança do meio todos os dias usando o mesmo meio com adição de VPA (de 0,1 mM a 5 mM) e/ou ENU (0,1 pg/ml a 100 pg/ml) e/ou inibidor de p53 e/ou composto que melhore a sobrevivência celular, tal como inibidor Rock Y-27632.
[0066] As células são geralmente cultivadas por 8 semanas, com uma densidade ideal de 90% mantida por passagens regulares uma vez por semana utilizando descolamento enzimático (colagenase, tripsina).
Inativação das células [0067] Na modalidade preferencial, as células pluripotentes que são utilizadas no método de tratamento descrito neste documento são inativadas. O termo inativado e as suas variantes gramaticais, são utilizados neste documento para referir uma célula (por exemplo, uma célula pluripotente) que está viva, mas que se tornou incapaz de proliferação (isto é, inativada mitoticamente). Os versados na técnica podem utilizar técnicas que são conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, exposição a agentes químicos, irradiação e/ou liofilização. As células pluripotentes podem ser inativadas de modo que, após a administração a um sujeito, as células pluripotentes são incapazes de se dividirem e, assim, não podem formar teratomas no sujeito. Entende-se que no contexto de uma pluralidade de células, nem toda célula precisa ser incapaz de proliferação. Assim, tal como usado neste documento, a frase inativado em uma extensão suficiente para prevenir a formação de teratoma no sujeito refere-se a um grau de inativação na população como
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20/83 um todo, de tal modo que após administração a um sujeito um teratoma não se forma, uma vez que as células-tronco pluripotentes irradiadas não se dividiram mais, como confirmado pela cultura in vitro. Deve-se notar que, mesmo se uma ou mais células na pluralidade de células são de fato capazes de proliferação no sujeito, postula-se que o sistema imunológico do hospedeiro destruirá aquelas células antes que um teratoma possa se formar. Tal incapacidade de proliferação e formação de teratoma pode ser confirmada por testes em camundongos que têm um sistema imunitário funcional e não funcional.
[0068] Em algumas modalidades, uma célula inativada é uma célula morta e, em algumas modalidades, a célula inativada é um lisado celular completo, exossomos derivados de células-tronco pluripotentes, neoantígenos de células-tronco enriquecidos com câncer, neoantígenos de células-tronco com câncer completamente purificados, extratos de DNA, RNA e proteínas, suspensão de células inteiras que foram liofilizadas, uma fração de um lisado celular, tal como uma fração de membrana, uma fração citoplasmática ou uma combinação sua. As células-tronco pluripotentes inativadas permanecem capazes de estimular resposta imunológica quando a vacinação de camundongos é realizada com hESCs ou hiPSCs em combinação com ácido valpróico ou outro HDACi. Essa vacinação é capaz de induzir respostas imunológicas e antitumorais eficientes contra carcinoma de mama 4TI sem evidência de efeitos colaterais e doenças autoimunes.
[0069] Tipicamente, para inativar as células-tronco, elas podem ser expostas a doses letais de radiação (por exemplo, uma fração única de 5 a 100 Gy). A dose de radiação precisa entregue às células e o comprimento da dose não são críticos, desde que as células se tornem inviáveis.
Recuperação e condicionamento das células [0070] A etapa de recuperação do método inclui uma (ou várias)
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21/83 etapa(s) de lavagem da cultura de celular e ressuspensão das células em qualquer meio apropriado, tal como meio X-Vivo/Stemflex ou qualquer outro meio celular de grau clínico.
[0071] O condicionamento das células pode incluir congelar ou liofilizar as células, de modo a poder armazenar a composição celular antes da utilização.
Mutação das células pluripotentes e expressão de neoantícienos [0072] É lembrado que as células pluripotentes são células geneticamente muito estáveis. De fato, uma vez que estão presentes muito cedo no processo de desenvolvimento embrionário e precisam se multiplicar para o desenvolvimento embrionário, é importante que essas células não sejam muito propensas a mutações para ter homogeneidade no embrião.
[0073] Consequentemente, as células presentes em uma população de células pluripotentes são geralmente muito homogêneas quando se considera seu conteúdo genético (isto é, mais de 95% das células da população apresentam o mesmo background genético).
[0074] Ao preparar iPSCs, uma vantagem seletiva de algumas células ocorre durante várias passagens, o que leva à população de iPSCs clones que apresentam mutações específicas nas passagens tardias, mas a sequência dos genomas celulares é semelhante próxima a 100%.
[0075] No entanto, após várias passagens, a iPSC é tão estável quanto hESC (Hussein SM et al. Nature 2011). Mutações induzidas por cultura (adaptativas) serão adquiridas com pouquíssimas mudanças genéticas em culturas prolongadas (Hussein SM et al. Bioessays, 2012).
[0076] No entanto, é favorável poder induzir mutações nas células de modo a aumentar a variabilidade dos neoantígenos fetais/embrionários no material celular tratado que são encontrados nos cânceres agressivos. Desta forma, aumentará a possibilidade do sistema imunológico gerar células T contra estas células mutantes e ser capaz de
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22/83 combater as células cancerígenas, bem como as que sofreriam variações posteriores durante o crescimento do tumor.
[0077] Isso ajudaria a combater o câncer que resulta do acúmulo de alterações genéticas resultantes de erros de replicação de DNA e/ou insultos ambientais durante a proliferação de células-tronco cancerígenas. Essas alterações incluem mutações que levam ao câncer que iniciam a carcinogênese e mutações desestabilizadoras do genoma. Este aumento da instabilidade do genoma resulta na evolução clonal, levando à seleção de clones mais agressivos com maior resistência aos fármacos.
[0078] Consequentemente, em uma modalidade específica, as células são expandidas em condições que induzirão mutações nos genes das referidas células.
[0079] Assim, as células podem ser expostas a um agente mutagênico, isto é, um agente físico ou químico que altera o material genético, geralmente o DNA, de um organismo e, assim, aumenta a frequência de mutações acima do nível de base natural.
[0080] O mutagênico pode ser selecionado do grupo que consiste em mutagênicos físicos e mutagênicos químicos.
[0081] Entre os mutagênicos físicos, pode-se citar radiações ionizantes, tais como raios X, raios gama e partículas alfa que podem causar a quebra de DNA e outros danos. Pode-se citar, particularmente, as radiações do cobalto-60 e do césio-137. O nível de raios irradiantes deve ser muito inferior àquele que é utilizado para a inativação de células e que pode ser concebido pelos versados na técnica.
radiações ultravioleta com comprimento de onda superior a 260 nm, o que pode causar erros na replicação se não for corrigido, ou desintegração radioativa, como 14C no DNA.
[0082] Entre os mutagênicos químicos, pode-se citar
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Espécies reativas de oxigênio (ROS), como superóxido, radicais hidroxila, peróxido de hidrogênio.
Agentes de desaminação, como o ácido nitroso, que podem causar mutações de transição ao converter citosina em uracila.
Hidrocarboneto aromático policíclico (PAH), que pode se ligar ao DNA quando ativado em diol-epóxidos.
Agentes alquilantes como etilnitrosoureia (ENU, CAS número 759-73-
9), gás mostarda ou cloreto de vinila.
Aminas e amidas aromáticas, como o 2-acetilaminofluoreno
Alcalóide de plantas, como aqueles das espécies de Vinca
Bromo e alguns compostos que contêm bromo
Azida de sódio
Bleomicina
Psoraleno combinado com radiação ultravioleta
Benzeno
Análogos de base, que podem substituir bases de DNA durante a replicação e causar mutações de transição
Agentes intercalantes, tais como brometo de etídio, proflavina, daunorrubicina
Metais, tais como arsênico, cádmio, cromo, níquel e seus compostos, que podem ser mutagênicos [0083] Nesta modalidade, obter-se-á uma população de célulastronco pluripotentes nas quais as células têm mutações aleatórias (geralmente diferentes de célula para célula, levando assim a uma população heterogênea), particularmente em neoantígenos relacionados com câncer.
[0084] Os inventores mostraram que é possível projetar condições de cultura que tornam possível induzir erros de replicação de DNA em células-tronco pluripotentes sem desencadear a apoptose dependente do dano ao DNA.
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24/83 [0085] Isto é particularmente surpreendente uma vez que, como indicado acima, as células pluripotentes são naturalmente muito estáveis, pois deve haver um número tão baixo quanto possível de mutações introduzidas durante os estágios iniciais da embriogênese. Resulta disto que a maquinaria de reparo do DNA é muito eficiente nessas células, corrigindo assim a maioria dos defeitos e/ou induzindo apoptose caso não seja possível corrigir esses defeitos.
[0086] Em uma modalidade, as células pluripotentes (tais como ESCs ou IPSCs) de uma população inicial são expandidas e mantidas em meios de cultura permissivos pluripotentes (como conhecido na técnica) para preservar o estágio pluripotente durante as passagens iterativas. Nestas condições, geralmente se observaria uma baixa quantidade de mutações do exoma (5-10 mutações por exoma).
[0087] As células pluripotentes são então cultivadas in vitro com métodos compostos de mutagênese para induzir e aumentar a instabilidade genômica dentro das células-tronco pluripotentes, como aquelas listadas acima. Os danos ao DNA são bem confirmados pela fosforilação de yH2AX como marcador de Quebras em Fitas Duplas (DSBs). Tanto a proporção de células positivas para yH2AX quanto a frequência de focos de yH2AX aumentaram em CES ou IPSCs, assim como maior número de micronúcleos como uma marca de instabilidade genômica.
[0088] Os agentes preferenciais são Bleomicina, ENU, agentes alquilantes, Actinomicina D, agentes moduladores de ROS, UV, H202, radiações ionizantes (raios gama, raios X), que permitem a indução e o aumento das taxas de mutação em células-tronco pluripotentes que se acumulam durante a cultura.
[0089] Em uma modalidade preferencial, foi demonstrado que a N-etil-N-nitrosoureia (ENU) cria novas mutações e aumenta o nível de neoantígenos em células-tronco pluripotentes tratadas durante a cultura a longo prazo, pelo menos de 7 a 60 dias a uma dose de <50 pg/ml. Essas
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25/83 mutações são semelhantes às relatadas no câncer.
[0090] Assim, é possível acumular uma diversidade de mutações em resposta a danos no DNA durante a proliferação de células pluripotentes com uma alta taxa de mutações a partir de uma vantagem seletiva em culturas prolongadas, mantendo a pluripotência das células particularmente quando as células são cultivadas no meio com HDACi. A presença de HDACis em cultura preserva o aumento das histonas ativas (H3K4me3 e H3K9ac) e da marca epigenética de pluripotência em resposta à indução de danos no DNA e à taxa de replicação e proliferação durante as passagens.
[0091] Em outra modalidade das composições e métodos descritos neste documento, as mutações são induzidas nas células pluripotentes através de modificação genética das células com genes que promovem um nível elevado de instabilidade genética. Particularmente, pode-se eliminar ou reduzir a atividade de genes ou vias de sinalização envolvidas no reparo e replicação do DNA, usando inibidores apropriados, tais como inibidores NER/BER/DSBR/MMR. Esses métodos que induzem instabilidade genômica ligada ao aumento de danos no DNA podem ser realizados usando “vetores” ou “modificações genéticas” que inativam ou derrubam genes relacionados ao reparo ou vias de sinalização do DNA, como o complexo delta polimerase de DNA, reparo de bases mal pareadas (MMR), reparo de excisão de base (BER), reparo de excisão de nucleotídeo (NER), recombinação homóloga (HR), DSBR ou NEJH. Outros exemplos de genes de reparo de DNA são DNApkC, Ku70, Rad 51, Brcal ou Brca2.
[0092] Em outras modalidades, as células pluripotentes são modificadas de modo a reprimir genes associados a apoptose, tais como p53 por modificação ou química genética p53, tal como Pifithrin-mu, Nutlin3, ou utilizando compostos que aumentem a sobrevivência celular, tal como Y-27632, uma inibidor seletivo da quinase enrolada associada ao pl60-Rho (ROCK).
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26/83 [0093] Em uma modalidade particular, a população de células pluripotentes consiste em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que foram geradas a partir de células somáticas, tais como células isoladas de um paciente, que já continham alterações genômicas ligadas
i. às doenças de reparo de DNA incluindo, por exemplo, Ataxiatelangiectasia, síndrome de Bloom, síndrome de Cockayne, anemia de Fanconi, síndrome de Werner, Xeroderma pigmentoso, síndrome de quebra de Nijmegen;
ii. a síndromes hereditárias de câncer familiar com instabilidade genômica, tal como síndrome de Lynch (câncer colorretal hereditário sem polipose com mutações em genes MMR incluindo MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 e PMS2), Li-Fraumeni com mutação no gene TP53 ou CHEK2, câncer hereditário de ovário e mama (HBOC) ,síndrome com deleção ou mutação no gene BRCA1/2, polipose adenomatosa familiar (FAP) com mutações no gene APC;
iii. instabilidade genômica induzida por oncogênicos somáticos como na CML com uma translocação (T 9;22).
[0094] Em uma modalidade preferencial, a população de células pluripotentes mutadas é feita de células-tronco pluripotentes induzidas e geradas a partir de células somáticas contendo alterações genéticas ligadas a uma doença. Normalmente, as alterações genômicas podem ser uma translocação (T9: 22), uma deleção (BRCA1/2) ou mutações (BRCA, RET).
[0095] Em uma modalidade particular, a população de célulastronco pluripotentes consiste em iPSCs geradas a partir de linhas celulares de câncer ou células cancerígenas específicas de pacientes.
[0096] Em outra modalidade, a população de de ESCs ou IPSCs é modificada geneticamente para sobreexpressar múltiplos neoantígenos relacionados com tronco cancerígeno não-aleatório pelo uso de vetores. Em uma modalidade particular, a população de ESCs ou IPSCs é
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27/83 modificada geneticamente para expressar mutações múltiplas e neoantígenos específicos de células-tronco cancerígenas (pelo menos 5) em células-tronco pluripotentes por tecnologia de modificação genética. A presente invenção provê composições e métodos que provêm ESCs ou IPSCs por meio da introdução de múltiplos neoantígenos dos mesmos por edição, modificação, inibição da expressão e outras tecnologias baseadas em RNA de genoma multiplex guiado por RNA.
[0097] O termo “edição de genoma” usado aqui refere-se à manipulação genética mediada por RNA incluindo, particularmente, um RNA guia para edição de genoma mediada por cas9. Este guia RNA, (gRNA) é transfectado juntamente com uma endonuclease cas9. O RNA guia provê o scaffold e uma sequência espaçadora complementar ao alvo. Em outra modalidade, a sequência de manipulação genética pode ser uma sequência de siRNA ou um microRNA concebida para silenciamento genético, de acordo com métodos padrão na técnica por meio do uso de sistemas Crispr-Cas 9. As composições e métodos para fabricar e usar sistemas Crispr-Cas são conhecidos na técnica e descritos, particularmente, na US 8.697.359.
[0098] Em uma modalidade particular, a população de células pluripotentes é tratada com agentes alquilantes. Como aqui neste documento, o termo agentes alquilantes refere-se a uma substância que adiciona um ou mais grupos alquila de uma molécula a outra. Este tratamento cria novas mutações em neoantígenos, provêndo reações imunológicas superiores pelo aumento da expansão oligo-clonal de TILs e a imunidade celular de Th1/Th2.
[0099] Na presente invenção, um agente alquilante é selecionado a partir do grupo que consiste em mostardas de nitrogênio, nitrosoureias, alquilsulfonatos, triazinas, etileniminas e suas combinações. Exemplos não limitantes de mostardas de nitrogênio incluem mecloretamina (Lundbeck), clorambucil (GlaxoSmithKline), ciclofosfamida (Mead Johnson
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Co.), bendamustina (Astellas), ifosfamida (Baxter International), melfalano (Ligand), melfalano flufenamida (Oncopeptides) e sais do mesmos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitativos de nitrosoureias incluem estreptozocina (Teva), carmustina (Eisai), lomustina (Sanofi) e sais do mesmos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitativos de alquilsulfonatos incluem bussulfano (Jazz Pharmaceuticals) e sais do mesmo farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitativos de triazinas incluem dacarbazina (Bayer), temozolomida (Cancer Research Technology) e sais dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitativos de etileniminas incluem tiotepa (Bedford Laboratories), altretamina (MGI Pharma) e sais dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis. Outros agentes alquilantes incluem ProLindac (Access), Ac-225 BC-8 (Actinium Pharmaceuticals), ALF-2111 (Alfact Innovation), trofosfamida (Baxter International), MDX-1203 (Bristol-Myers Squibb), tioureidobutironitrila (CellCeutix), o mitobronitol (Chinoin), mitolactol (Chinoin), nimustina (Daiichi Sankyo), glufosfamida (Eleison Pharmaceuticals), combinações de HuMaxTAC e PBD ADC (Genmab), BP-C1 (Meabco), treossulfano (Medac), nifurtimox (Metronomx), tosilato de improsulfano (Mitsubishi tanabe Pharma), ranimustina (Mitsubishi tanabe Pharma), ND-01 (NanoCarrier), HH-1 (Nordic Nanovector), células 22P1G e combinações de ifosfamida (Nuvilex), fosfato de estramustina (Pfizer), prednimustina (Pfizer), lurbinectedina (PharmaMar), trabectedina (PharmaMar), altreatamina (Sanofi), SGN-CD33A (Seattle Genetics), fotemustina (Sender), nedaplatina (Shionogi), heptaplatina (Sk Holdings), apaziquona (Spectrum Pharmaceuticals), SG-2000 (Spirogen), TLK-58747 (Telik), laromustina (Vion Pharmaceuticals), procarbazina (Al kern Laboratories Ltd.) e sais dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis. Em outra modalidade, o agente alquilante é selecionado a partir do grupo que consiste em mecloretamina (Lundbeck), clorambucil (GlaxoSmithKline), ciclofosfamida (Mead Johnson Co.), estreptozocina (Teva), dacarbazina (Bayer), tiotepa (Bedford
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Laboratories), altretamina (MGI Pharma), sais dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis e suas combinações. Em outra modalidade, ο agente alquilante é selecionado a partir do grupo que consiste em ProLindac (Access), Ac-225 BC-8 (Actinium Pharmaceuticals), ALF-2111 (Alfact Innovation), bendamustina (Astellas), isofamida (Baxter International), trofosfamida (Baxter International), MDX-1203 (Bristol-Myers Squibb), temozolomid (Cancer Research Technology), tioureidobutironitrila (CellCeutix), o mitobronitol (Chinoin), mitolactol (Chinoin), nimustina (Daiichi Sankyo), carmustina (Eisai), glufosfamida (Eleison Pharmaceuticals), combinações de HuMax-TAC e PBD ADC (Genmab), busulfano (Jazz Pharmaceuticals), melfalano (Ligand), BP-C1 (Meabco), treossulfano (Medac), nifurtimox (Metronomx), tosilato de improsulfano (Mitsubishi tanabe Pharma), ranimustina (Mitsubishi tanabe Pharma), ND-01 (NanoCarrier), HH-1 (Nordic Nanovector), células 22P1G e combinações de ifosfamida (Nuvilex), melfalano flufenamida (Oncopeptides), fosfato de estramustina (Pfizer), prednimustina (Pfizer), lurbinectedina (PharmaMar), trabectedina (PharmaMar), altreatamina (Sanofi), lomustina (Sanofi), SGNCD33A (Seattle Genetics), fotemustina (Sender), nedaplatina (Shionogi), heptaplatina (Sk Holdings), apaziquona (Spectrum Pharmaceuticals), SG2000 (Spirogen), TLK-58747 (Telik), laromustina (Vion Pharmaceuticals), procarbazina (Al kern Laboratories Ltd.), sais dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis e combinações dos mesmos.
[00100] Em uma modalidade particular, a população de células pluripotentes é tratada com N-etil-N-nitrosoureia (ENU, CAS número 75973-9). O ENU tem a seguinte fórmula química C3H7N3O2, é um mutagênico altamente potente pela transferência do grupo etila para nucleobases em ácidos nucleicos.
[00101] Como indicado acima, o objetivo do agente mutagênico é introduzir mutações aleatórias em genes das células pluripotentes durante a expansão (introdução de mutações ocorre durante a replicação e divisão
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30/83 das células). A população de células-tronco pluripotentes adquire mutações que podem prover uma vantagem de crescimento e são selecionadas para promover a adaptação da cultura. As passagens das ESCs ou iPSCs sofrem um alto nível de pressão de seleção e, após a expansão, a população mutada clonal múltipla pode ser favoravelmente selecionada para.
[00102] Deve notar-se que, uma vez que as células pluripotentes são muito estáveis, a aplicação do mutagênico pode ter que ser realizada durante um longo período de tempo. Como ilustração, quando se utiliza ENU, pode ser aplicado durante pelo menos 7 dias, mais preferencialmente pelo menos 15 dias, mais preferencialmente pelo menos 20 dias, mais preferivelmente pelo menos 30 dias, mais preferencialmente pelo menos 40 dias, mais preferencialmente pelo menos 50 dias ou mesmo pelo menos 60 dias. Após a aplicação do mutagênico, as células são lavadas (se o mutagênico é um agente químico) e podem ser expandidas ainda mais, na presença do agente que favorece a expressão de MHC-I, particularmente uma HDACi. Este agente está presente também preferencial mente durante a aplicação do agente mutagênico.
[00103] Assim, pode ser observado e verificado que o mutagênico induzirá mutações (isto é, não-sinônimo, nonsense, frameshift, StopGain, splice variant, CNVs, SNVs) em alguns dos genes embriogênicos que são expressados pelas células pluripotentes e, portanto, aumentam a diversidade desses antígenos (novos neoantígenos no genoma inteiro). Assim, isto aumentará a possibilidade da composição de vacina com imunogenicidade aumentada, capaz de estimular uma ampla resposta imunológica contra cânceres agressivos onde existem mutações rápidas e frequentes.
[00104] Uma resposta imunológica eficiente pode, de fato, ser difícil de obter para algum câncer onde a expansão clonal de células cancerígenas ocorre com mutações nos antígenos expressados pelas
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31/83 células tumorais. A resposta imune dependería, portanto, da carga mutacional do câncer. A geração de mutações aleatórias na população celular pluripotente pelo uso do mutagênico levaria, assim, à expressão de antígenos embrionários mutados e aumentaria a diversidade dos antígenos apresentados ao sistema imunológico após a vacinação.
[00105] Consequentemente, já haveria células T preparadas contra antígenos mutantes que apareceríam nas células cancerígenas durante a divisão dessas células, o que aceleraria e melhoraria a resposta imunológica contra essas células.
Modificação de células pluripotentes [00106] Em uma modalidade particular, a população de célulastronco pluripotentes é modificada geneticamente para sobre-expressar compostos que estimulam a resposta imunológica através da utilização da integração do gene no genoma da célula pluripotente. Normalmente, na primeira etapa, a população de células-tronco é isolada e expandida. Na segunda etapa, os genes de interesse são embalados em vetores virais integrativos, como retrovirus ou lentivírus. Na terceira etapa, vetores virais integrativos contendo o gene de interesse são transferidos para a população de células-tronco.
[00107] Em uma modalidade particular, a população de célulastronco pluripotentes é modificada com os genes de proteínas que estimulam expressões de MHC e/ou resposta imunológica. Estes compostos são selecionados a partir do grupo que consiste em interferon alfa (IFN-a), um interferon gama (IFN-y), uma interleucina 2 (IL-2), uma interleucina 4 (IL-4), uma interleucina 6 (IL-6), uma interleucina 12 (IL-12), um fator de necrose tumoral (TNF) e um fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fragmentos funcionais dos mesmos e combinações dos mesmos.
[00108] Os interferons (IFNs) contemplados pela presente invenção incluem os tipos comuns de IFNs, IFN-alfa (IFN-a), IFN-beta (IFN
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P) e IFN-gama (IFN-y). Os IFNs podem atuar diretamente nas células cancerígenas, por exemplo, retardando seu crescimento, promovendo seu desenvolvimento em células com comportamento mais normal e/ou aumentando sua produção de antígenos, tornando assim as células cancerígenas mais fáceis de reconhecer e destruir o sistema imunológico. Os IFNs também podem atuar indiretamente nas células cancerígenas, por exemplo, retardando a angiogênese, estimulando o sistema imunológico e/ou estimulando as células exterminadoras naturais (NK), as células T e os macrófagos. O recombinante IFN-alfa está disponível comercialmente como Roferon (Roche Pharmaceuticals) e Intron A (Schering Corporation).
[00109] As interleucinas contempladas pela presente invenção incluem IL-2, IL-4, IL-11 e IL-12. Exemplos de interleucinas recombinantes comercialmente disponíveis incluem Proleukin® (IL-2; Chiron Corporation) e Neumega® (IL-12; Wyeth Pharmaceuticals). A Zymogenetics, Inc. (Seattle, Wash.) está testando atualmente uma forma recombinante de IL-21, que também está contemplada para uso nas combinações da presente invenção.
[00110] Os fatores estimuladores de colônias (CSLs) contemplados pela presente invenção incluem fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSL ou filgrastim), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSL ou sargramostim) e eritropoietina (epoetina alfa, darbepoietina). O tratamento com um ou mais fatores de crescimento pode ajudar a estimular a geração de novas células sanguíneas em indivíduos submetidos à quimioterapia tradicional. Por conseguinte, o tratamento com CSLs pode ser útil para diminuir os efeitos adversos associados à quimioterapia e pode permitir a utilização de doses mais elevadas de agentes quimioterapêuticos. Vários fatores estimulantes de colônias recombinantes são disponíveis comercialmente, por exemplo, Neupogen® (G-CSL; Amgen), Neulasta (pelfilgrastim; Amgen), Leucina (GM-CSL; Berlex), Procrit (eritropoetina; Ortho Biotech), Epogen
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33/83 (eritropoetina; Amgen), Arnesp (eritropoietina).
[00111] No seu sentido mais amplo, um vetor é qualquer veículo capaz de facilitar a transferência dos oligonucleotídeos para as células. Preferencialmente, o vetor transporta o ácido nucleico para células com degradação reduzida em relação à extensão da degradação que resultaria na ausência do vetor. Em geral, os vetores úteis na invenção incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos livres, sistemas de entrega não virais (eletroporação, sonoporação, agentes de transfecção catiônica, lipossomas, etc...), fagemídeos, vírus, outros veículos derivados a partir de fontes virais ou bacterianas que foram manipuladas pela inserção ou incorporação das sequências de ácido nucleico. Os vetores virais são um tipo preferencial de vetor e incluem, mas não estão limitados a, sequências de ácido nucleico dos seguintes vírus: Vírus de RNA, tais como um retrovirus (como por exemplo, vírus da leucemia murina de moloney e vetores derivados de lentivírus), vírus do sarcoma de murino de harvey, vírus do tumor mamário murino e vírus do sarcoma de rous; adenovirus, vírus adeno-associado; vírus do tipo SV40; vírus do polioma; vírus EpsteinBarr; vírus do papiloma; vírus do herpes; vírus vaccinia; vírus da pólio. Pode-se empregar prontamente outros vetores não nomeados, mas conhecidos na técnica.
[00112] Tipicamente, no contexto da invenção, os vetores virais incluem adenovirus e vírus adeno-associados (AAV), que são vírus de DNA que já foram aprovados para uso humano em terapia gênica. Na verdade, são conhecidos 12 diferentes serótipos de AAV (AAV1 a 12), cada um com diferentes tropismos teciduais (Wu, Z Mol Ther 2006; 14: 316-27). Os AAV recombinantes são derivados do dependente AAV (Choi, VW J Virol 2005; 79: 6801-07). O vírus adeno-associado tipo 1 a 12 pode ser projetado para ser deficiente na replicação e é capaz de infectar uma ampla gama de tipos de células e espécies (Wu, Z Mol Ther 2006; 14: 316-27). Adicionalmente, isso tem vantagens, tais como, estabilidade ao solvente de calor e lipídio;
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34/83 altas frequências de transdução em células de diversas linhagens, incluindo células hematopoiéticas; e falta de inibição de superinfecção, permitindo assim várias séries de transduções. Além disso, infecções por vírus adenoassociados de tipo selvagem foram seguidas em cultura de tecidos por mais de 100 passagens na ausência de pressão seletiva, implicando que a integração genômica do vírus adeno-associado é um evento relativamente estável. O vírus adeno-associado pode funcionar também de maneira extracromossômica.
[00113] Outros vetores incluem vetores plasmídicos. Os vetores de plasmídeos foram descritos extensamente no estado da arte e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al., 1989. Nos últimos anos, os vetores plasmídicos foram utilizados como vacinas de DNA para entregar genes que codificam antígenos a células in vivo. Eles são particularmente vantajosos para isso pois não têm as mesmas preocupações de segurança como muitos dos vetores virais. Estes plasmídeos, no entanto, tendo um promotor compatível com a célula hospedeira, podem expressar um peptídeo a partir de um gene codificado operacionalmente dentro do plasmídeo. Alguns plasmídeos comumente usados incluem pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 e pBlueScript. Outros plasmídeos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Além disso, os plasmídeos podem ser personalizados usando enzimas de restrição e reações de ligação para remover e adicionar fragmentos específicos de DNA. Os plasmídeos podem ser entregues por uma variedade de vias parentéricas, mucosas e tópicas. Por exemplo, o plasmídeo de DNA pode ser injetado por via intramuscular, intradérmica, subcutânea ou outras. Pode ser administrado também por pulverização ou gotas intranasais, supositório retal e oralmente. Preferencialmente, o referido plasmídeo de DNA é injetado através de uma via intraocular (intravítrea, sub-retinal, supracoroidal...). Pode ser administrado também na epiderme ou na superfície da mucosa usando uma pistola de genes. Os
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35/83 plasmídeos podem ser administrados em uma solução aquosa, secada sobre partículas de ouro ou em associação com outro sistema de entrega de DNA incluindo, mas não limitado a lipossomas, dendrímeros, cocleados e microencapsulação.
[00114] Em uma modalidade particular, a população de células tronco é modificada pela introdução do transgene, tal como o siRNA, no local de AAVS1 do cromossoma 19 por recombinação homóloga.
[00115] O termo recombinação homóloga, como usado neste documento, refere-se a um meio de alvejamento de genes para modificar artificialmente um gene específico em um cromossomo ou em um genoma. Quando um fragmento genômico possuindo uma porção homóloga àquela de uma sequência alvo no cromossoma é introduzida nas células, o termo refere-se à recombinação que ocorre com base na homologia da sequência nucleotídica entre o fragmento gênico introduzido e o local correspondente no cromossomo.
[00116] Além disso, o termo modificação genética refere-se, no local de um gene desejado no cromossomo, a inserção de um DNA exógeno, a substituição de uma porção da ou a totalidade do gene com um DNA exógeno, ou a exclusão do gene. Mais especificamente, a modificação genética refere-se à inserção (isto é, “knock-in”) de um fragmento de DNA exógeno enquanto a sequência de DNA endógeno é retida de uma maneira tal que o fragmento é expressado em conjunção com a expressão de um gene em um local específico ou é expressado constitutivamente, ou a substituição, exclusão, ou interrupção (isto é, knock-out) de uma porção ou da sequência gênica completa de modo a modificar a sequência de DNA endógeno.
[00117] Exemplos de métodos para a introdução de um cromossoma artificial nas células incluem um método de precipitação com fosfato de cálcio (Graham et al., (1978) Virology 52: 456-457, Wigler et al., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 1373-1376 e Current Protocols in
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Molecular Biology Vol.I, Wiley Inter-Science, Supplement 14, Unit 9.1.1-
9.1.9 (1990)), um método de fusão utilizando polietilenoglicol (Patente dos EUA Num. 4.684.611), um método usando transportadores lipídicos tais como lipofecção (Teifel et al., (1995) Biotechniques 19: 79-80, Albrecht et al., (1996) Ann. Hematol. 72: 73-79; Holmen et al., (1995) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31: 347-351, Remy et al., (1994) Bioconjug. Chem. 5: 647-654, Le Bolc'het al., (1995) Tetrahedron Lett. 36: 6681-6684, Loeffler et al., (1993) Meth. Enzymol, 217: 599-618 e Strauss (1996) Meth. Mol. Biol. 54: 307-327), eletroporação, e métodos para fusão com microcélulas (Patentes US Nos. 5.240.840, 4.806.476, 5.298.429 e 5.396.767, Fournier (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6349-63 53 e Lambert et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5907-59).
População de células [00118] Assim, com os métodos descritos acima, os inventores obtiveram uma população de células pluripotentes expressando novos epítopos embrionários dentro todos ou parte dos genes embrionários que desencadearão uma imunidade antitumoral mais eficiente. Mais particularmente, os inventores mostraram que a população de células pluripotentes tratadas com N-etil-N-nitrosoureia (ENU) apresenta mutações aleatórias comparadas com a população de células pluripotentes sem tratamento com ENU. Por conseguinte, esta população é também um objeto da invenção.
[00119] Assim, a invenção diz respeito a uma composição de células compreendendo células pluripotentes, em que as células na dita população apresentam uma taxa de mutação de pelo menos 0,1%, preferencialmente pelo menos 1%, mais preferencialmente pelo menos 2%, mais preferencialmente pelo menos 5%, mais preferencialmente pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 15%, mais preferencialmente pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30%, mais preferencialmente pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, pelo
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37/83 menos em três genes, mais preferencialmente pelo menos quatro genes, mais preferencialmente pelo menos cinco genes, mais preferencialmente pelo menos seis genes, mais preferencialmente pelo menos sete genes, selecionados a partir do seguinte grupo consistindo em TP53, P2RY8, CRLF2, CRTC3, BLM, ASXL1, IDH2, NTRK3, MALAT1, EXT1 ,NCOA2, IKF1, PIK3R1, EP300, AKT2, PPP2R1A, CDK12, BRCA1, ERB2, CDH1, TBX3, SMARCD1, HSP90AA1, EZH2, SUZ12, STAT5B e POUF5F1.
[00120] Esta taxa de mutação dos genes é estudada na população celular, após a exposição ao agente mutagênico, antes ou após a expansão adicional, se tal expansão adicional for realizada.
[00121] Devido ao fato de que as células pluripotentes são geneticamente muito estáveis, a presença de uma grande quantidade de mutações em pelo menos três genes listados acima demonstra a presença de uma nova população de células pluripotentes que não se preexistiam e não seriam observadas na ausência das condições mutagênicas.
[00122] A exposição das células ao agente mutagênico desencadeará a aparição de mutações aleatórias no genoma dessas células. A população resultante dessa exposição será assim heterogênea, em comparação com uma população de células pluripotentes que é essencialmente homogênea, devido à baixa taxa de mutações naturais durante a expansão e cultura a longo prazo. Neste documento, a população obtida é assim caracterizada, particularmente, em que:
As células são pluripotentes (isto é, carregam os marcadores da pluripotência)
Existem várias diferenças no genoma das células na população, conforme indicado acima, ou seja, é possível detectar uma taxa (conforme indicado acima) de genes mutados, conforme listado acima, dentro das células da população.
[00123] Por uma questão de ilustração, uma taxa de mutação de 5% do gene TP53 significa que 95% das sequências de TP53 na população
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38/83 de células são idênticas (chamadas de sequência de referência TP53), e os últimos 5% da sequência TP53 são diferentes da sequência de referência TP53.
[00124] Em uma modalidade adicional, a invenção refere-se assim a uma composição de células compreendendo células pluripotentes, em que as células na referida população apresentam um cenário mutacional na população de ESCs ou IPSCs compreendendo uma ou mais das seguintes características:
i. Pelo menos > 3 (ou mais como visto acima) mutações neoantigênicas relacionadas ao câncer podem ser introduzidas geneticamente em CES ou IPSCs por modificação genômica.
ii. Uma combinação de tipos de mutação restrita ao genoma do câncer induzida por agentes mutagênicos e enriquecida por uma vantagem seletiva em células-tronco pluripotentes embrionárias cultivadas.
[00125] O processo mutagênico está causando níveis aumentados de novas mutações genômicas e mosaicismo genético nas linhas celulares de iPS humanas de passagem tardia resultantes.
[00126] A análise das mutações nos genes é realizada preferencialmente pela análise genômica em larga escala de assinatura mutanômica induzida relacionada ao câncer, em cada população ESCs e IPSCs, por NGS (sequenciamento Exome, RNAseq ou de todo o genoma), matriz CGH, matrizes SNP. O sequenciamento total do exoma em combinação com o perfil do transcriptoma permite a descrição do mutanoma codificando a proteína expressada.
[00127] As aberrações genômicas são identificadas utilizando pelo menos 2 algoritmos para análise bioinformática, conhecida na técnica. A prevalência de mutações totais em todo o genoma após a aplicação dos agentes mutagênicos confirmará a maior mutação e/ou carga de CNV em ESCs ou IPSCs de saída.
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39/83 [00128] Os critérios qualitativos e quantitativos permitirão definir cada população de células dentro do mosaicismo genético em ESCs ou IPSCs como descrito:
Os critérios qualitativos incluem:
Identificação de novas alterações somáticas moleculares adquiridas (mutações, CNVs ou SNVs) definidas quanto à sua presença no genoma de ESCs ou IPSs após a mutagênese e sua ausência em ESCs ou IPSCs sem mutagênese em passagens de cultura semelhantes.
Classificação de cada nova mutação (isto é, não sinônimo, sem sentido, variante splice, CNVs, SNVs) e validação pela detecção de sobreposição no genoma do câncer (a partir do banco de dados, isto é, TCGA, ICGC, COSMIC) e presente em genes pluripotentes e vias embrionárias (de acordo com genes de pluripotência, por exemplo, gene Plurinet).
Critérios quantitativos, tais como:
A prevalência dessas novas mutações somáticas (com falso valor de confiança de taxa de descoberta FDR <_0,05) e novas CNVs / SNVs (com FDR <10%) no genoma completo é definida para cada ESCs ou IPSs.
A presença de mutação validada em pelo menos > 3 genes diferentes A taxa de mutação de cada uma das mutações somáticas estáveis e novas com uma frequência alélica a partir de pelo menos > 0,1%, ou outras porcentagens como visto acima, até 50% após seleção clonal e expansão ou em relação ao número de passagens (a partir de 50X de profundidade a 100X de profundidade e 80-98% da cobertura do exoma alvo).
A expressão de marcadores de Pluripotência e um ensaio baseado na expressão gênica (PluriTest) com pelo menos >90% da taxa de expressão em comparação com os ESCs ou IPSCs de entrada antes
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40/83 da mutagênese ou modificação genética.
A expressão de moléculas de MHC I nas superfícies celulares (por exemplo, como determinado por FACS) foi aumentada em pelo menos 50% e geralmente até 90% em comparação com uma população celular expandida na ausência de HDACi, particularmente VPA.
[00129] A presente invenção diz respeito a uma composição de vacina que inclui uma população de células pluripotentes, como divulgado acima e um agente que estimula a resposta imunológica e/ou expressão de MHC I.
[00130] Particularmente, tais células pluripotentes são ESCs ou IPSCs, preferencialmente inativadas e, opcionalmente, mutadas, como divulgado acima.
[00131] O agente que estimula a resposta imunológica pode ser um adjuvante (imunoestimulante) como é conhecido na técnica. Este é preferencialmente um HDACi (usado em um intervalo de dose compreendido entre 0,2 mM e 4 mM). Quando tal HDACi é usado, outro adjuvante também pode ser usado.
[00132] A invenção diz respeito também a um dispositivo (tal como uma seringa) contendo tal composição de vacina, que pode ser utilizado para uma administração simultânea do composto HDACi e da composição celular.
[00133] Tal composição de vacina pode ser utilizada como uma vacina terapêutica contra um câncer de células-tronco (câncer, no qual as células expressam neoantígenos), para cura do paciente, ou como vacina profilática, para prevenir o aparecimento de tais cânceres, particularmente em pacientes susceptíveis a esses cânceres.
[00134] Os genes de predisposição são, por exemplo (ver também Lindor et al, 2008 Journal of the National Cancer Institute Monographs, No. 38, Concise Handbook of Familial Cancer Susceptibility
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Syndromes, Second Edition):
Mama I ovário: BRCA1, BRCA2, PALB2, RAD51
Sindrome de Lynch: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM
Carcinoma Celular Papilar Renal Hereditário: FH, MET
Doença de Cowden: PTEN, PIK3CA
Doença de Fanconi: FANC
Doença de Von Hippel-Lindau: VHL
Melanoma malicioso: CDKN2A, MITF, BAP1, CDK4
Neoplasia Endócrina: MEN1, RET, CDKN1B
Neurofibromatose: NF2, NF2, LZTR1, SMARCB1, SPRED1 paraganglioma feocromocitoma hereditário: SDH, TMEM127, MAX, EPAS1
Polipose adenomatosa familiar: APC, MUTYH
Retinoblastoma: RBI
Síndrome de Birt-Hogg-dubé: FLCN
Sindrome de Bloom: BLM
Síndrome de Carney: PRKAR1A
Sindrome de Gorlin: PTCH1
Síndrome de Li-Fraumeni: TP53, CHEK2
Sindrome de Nijmegen: NBN
Síndrome de Peutz-Jeghers: STK11
Polipose juvenil familiar: BMPR1A, SMAD4
Xeroderma pigmentoso: XP
Esta lista não é limitativa.
[00135] Em certa modalidade, o produto de vacina do tronco cancerígeno compreende uma mistura de lisado celular após liofilização, uma mistura de neoantígenos de tronco cancerígeno enriquecido, neoantígenos de tronco cancerígeno purificado, exossomas derivados de ESCs ou IPSCs, DNA, RNA, proteínas ou múltiplos peptídeos a partir de CES ou IPSCs manipulados. Estes são o agente imunogênico como
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42/83 divulgado acima, que são formulados na presença de HDACi.
[00136] Em outra modalidade, o produto de vacina de célulatronco cancerosas é misturado com meio GMP sobrenadante a partir de ESCs ou IPSCs irradiados por manipulação utilizados como um efetor adjuvante.
[00137] Em uma modalidade preferencial, as células nesta composição são inativadas (isto é, não podem mais se dividir).
[00138] A composição de células da invenção é susceptível de ser obtida por qualquer um dos métodos descritos acima.
[00139] Deve-se notar que as células nesta composição são de natureza heterogênea, quando o mutagênico tem sido utilizado e, portanto, diferem de uma composição celular pluripotente que foi cultivada de acordo com métodos conhecidos na técnica, e que é homogênea.
[00140] Quando foi cultivada na ausência de um mutagênico, a população de células difere de uma população de células que foi cultivada de acordo com métodos conhecidos na técnica, como a presença do agente mantendo a expressão de genes pluripotentes e aumentando a apresentação de MHC I, no meio de cultura, farão com que as células tenham mais dessas moléculas de MHC I em sua superfície.
[00141] Como usado neste documento, o termo “composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão de MHC e/ou resposta imunológica” refere-se a compostos que são capazes de estimular a imunogenicidade. Tal composto é chamado ativador da expressão de MHC e/ou de resposta imunológica. O termo “MHC” refere-se ao complexo principal de histocompatibilidade que está presente na superfície celular para reconhecer moléculas estranhas, chamadas antígenos. O MHC liga-se a antígenos e os apresenta a moléculas imunes, tais como linfócitos T e B. O termo “resposta imunológica” refere-se à resposta imunológica do sistema imunológico a um antígeno. Ao ativar a resposta imunológica, a de população de FoxP3 e células supressoras derivadas de mielóide(MDSC)
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43/83 são diminuídas e, ao contrário, a população de NK é aumentada. No contexto da invenção, a resposta imunológica contra tumores compreende uma resposta citotóxica de células T contra um antígeno presente em ou sobre uma célula do tumor. Em algumas modalidades, a resposta de células T citotóxicas é mediada por células CD8+T. Tipicamente, no contexto da invenção, o antígeno que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC corresponde às moléculas presentes na população de células pluripotentes como descrito acima. O composto que ativa a expressão de MCH e/ou sistema imunológico é um neoantígeno. O termo neoantígeno ou neo-antigênico significa uma classe de antígenos que surge de pelo menos uma mutação que altera a sequência de aminoácidos das proteínas codificadas pelo genoma.
[00142] No contexto da invenção, os compostos são selecionados a partir do grupo que consiste em: citocinas, inibidores de deacetilase de histona, inibidores de DNA metiltransferase e inibidores da enzima histona-lisina N-metiltransferase.
[00143] Em uma modalidade particular, o ativador da expressão de MHC e/ou de resposta imunológica, é um inibidor de deacetilase de histona.
[00144] Como usado neste documento, o termo histona “inibidor da histona desacetilase” também chamado de HDACi, refere-se a uma classe de compostos que interferem com a função de histona desacetilase. As histonas desacetilases (HDACs) desempenham papéis importantes na regulação transcricional e patogênese do câncer. Tipicamente, os inibidores de HDACs modulam a transcrição e induzem a captura, diferenciação e apoptose do tumor celular. Os HDACs também aumentam os efeitos citotóxicos de agentes terapêuticos utilizados no tratamento de câncer, incluindo fármacos rádio e quimioterápicos.
[00145] Em uma modalidade particular, o inibidor de deacetilase de histona é ácido valpróico (VPA).
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44/83 [00146] O termo ácido valpróico refere-se a ácido 2propilpentanóico (C8H16O2), que possui 0 seguinte número CAS e fórmula 99-66-1 na técnica:
[00147] As atividades biológicas do ácido valpróico são múltiplas (Chateauvieux et al, J. Biomed. Biotechnol, 2010, pii: 479364. doi: 10.1155 / 2010/479364). O ácido valpróico afeta 0 neurotransmissor GABA (Gamma Amino Butirato), potenciando a atividade inibidora. São sugeridos vários mecanismos de ação. O ácido valpróico é particularmente 0 metabolismo de GABA: inibe a degradação de GABA, GABA Transaminobutirato (LAMP), aumento da síntese de GABA, e modifica 0 seu turnover. Além disso, 0 ácido valpróico bloqueia certos canais iônicos, reduz a estimulação mediada pelo N-Metil-D-Aspartato e bloqueia a atividade dos canais iônicos, incluindo Na+ e Ca 2+ (CACNA1 tipo L dependente de tensão tipo C, D, N e F).
[00148] No contexto da invenção, 0 ácido valpróico é utilizado como um estimulante imunológico para aumentar a resposta imunológica contra cânceres que expressam antígenos pluripotentes partilhados com células-tronco embrionárias humanas (ESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (IPSCs).
[00149] Mais particularmente, 0 VPA é utilizado para estimular e intensificar a expressão de MHC-I no compartimento de células-tronco cancerosas, aumentando 0 teor de neoantígenos no compartimento CSC. A
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45/83 expressão mais elevada do MHC I em ESCs e IPSCs e em CSCs permite melhorar a apresentação de neoantígenos associados a células de MHC-I a APC/Dendrítica para induzir resposta imunológica de TH1. Níveis mais altos de quimiocinas (CXCL9, CXCL10 ...) permitem aumentar o recrutamento de células T para o tumor.
[00150] A presente invenção diz respeito a métodos para aumentar o teor de neoantígeno na expressão do compartimento de CSC de antígenos embrionários em CSC e células tumorais através de remodelação de cromatina, bem como expressão de quimiocinas (CXCL9, CXCL10 ...) pela expansão de células pluripotentes na presença de um HADCi, tal como VPA e/ou 5 Azacitidina.
[00151] Particularmente, quando usadas para tratar um paciente in vivo, as presentes composições e vacinas tornam possível modificar o microambiente tumoral e promover o recrutamento de células T para o tumor, de modo a obter uma redução duradoura a longo prazo volume do tumor.
[00152] Isto é devido a um efeito sinérgico da vacina de células pluripotentes preparadas com câncer e coadministração de VPA, que é adicionalmente melhorada quando a HDACi ainda é administrada ao doente, durante um período de tempo (tal como pelo menos 15 dias) após a injeção da vacina.
[00153] Os exemplos mostram que o tratamento combinado tanto pela vacina contra células-tronco cancerígenas como pela VPA provê uma resposta antitumoral superior através do aumento das TILs com imunidade celular Th1/Th2, diminuindo a subpopulação de TReg FoxP3, ativando as células NK e diminuindo a ação supressora de MDSC, enquanto inverte a supressão imunológica tumoral e diminuição do TReg (no tumor e no baço) e recrutamento de linfócitos T CD4+ e CD8+ para o tumor com uma menor proporção de T CD4 e CD8 expressando PD-1.
[00154] O VPA pode regular negativamente o nível de expressão
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46/83 de c-Myc e potencialmente induzir apoptose e autofagia de células cancerígenas e CSCs. O VPA pode aumentar a resposta imunológica adaptativa através da apresentação cruzada do autofagossomo.
[00155] Uma outra ação bem conhecida do VPA é a diminuição das citocinas inflamatórias, como IL6, IL8, interleucina TNFa (IL) -beta, IL17 nos gânglios linfáticos.
[00156] Em uma modalidade particular, o inibidor da desacetilase de histona é o ácido suberoilanilido-hidroxâmico, também denominado Vorinostat (N-Hidroxi-N'-feniloctanediamida), o primeiro inibidor de desacetilase de histona aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA em 2006 (Marchion DC et al 2004; Valente et al 2014).
[00157] Em uma modalidade particular, o inibidor da histona desacetilase é Panobinostat (LBH- 589), recebeu a aprovação da FDA em 2015 e tem a estrutura descrita em Valente et al 2014.
[00158] Em uma modalidade particular, o inibidor da desacetilase de histona é Givinostat (ITF2357) foi concedido como um medicamento órfão na União Européia (Leoni et al 2005; Valente et al 2014).
[00159] Em uma modalidade particular, o inibidor da desacetilase de histona é Belinostat, também chamado Beleodaq (PXD-101), recebeu a aprovação do FDA em 2014 (Ja et al 2003; Valente et al 2014).
[00160] Em uma modalidade particular, o inibidor de deacetilase de histona é Entinostat (como SNDX- 275 ou MS-275). Esta molécula tem a seguinte fórmula química (C21H20N43) e tem estrutura como descrito em Valente et al 2014.
[00161] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da desacetilase de histona é Mocetinostat (MGCD01030) tendo a seguinte fórmula química (C23H20N6O) (Valente et al 2014).
[00162] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da desacetilase de histona é Practinostat (SB939) que possui a seguinte fórmula química (C20H30N4O2) e a estrutura como descrita em Diermayr et al 2012.
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47/83 [00163] Em uma modalidade particular, o inibidor da desacetilase de histona é Chidamide (CS055/HB1-8000) tendo a seguinte fórmula química (C22H19FN4O2).
[00164] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da desacetilase de histona é Quisinostat (JNJ- 26481585) que possui a seguinte fórmula química (C21H26N6O2).
[00165] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da desacetilase de histona é Abexinostat (PCI24781) tendo a seguinte fórmula química (C21H23N3O5) (Valente et al 2014).
[00166] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da desacetilase de histona é Mocetinostat CHR-3996 tendo a seguinte fórmula química (C20H19FN6O2) (Moffat D et al 2010; Banerji et al 2012).
[00167] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da desacetilase de histona é AR-42 que possui a seguinte fórmula química (C18H20N2O3) (Fin et al 2012).
[00168] Em uma modalidade particular, 0 ativador de expressão de MHC é um inibidor de DNA metiltransferase.
[00169] Como usado neste documento, 0 termo inibidores de DNA metiltransferase refere-se a compostos que são capazes de interagir com DNA metiltransferase (DNMT) e inibir sua atividade. OS DNMT são as enzimas que catalisam a transferência de um grupo metil ao DNA. A metilação de DNA serve uma ampla variedade de funções biológicas. Todas as metiltransferases DNA conhecidas usam S-adenosil metionina (SAM) como doador de metila.
[00170] Em uma modalidade particular, 0 inibidor de DNA metiltransferase é a azacitidina, também conhecida como 5-aza-2desoxicitidina, tendo a seguinte fórmula química (C8H12N4O5) e estrutura na técnica (Kaminskas et al 2004; Estey et al 2013).
[00171] Em uma modalidade particular, 0 inibidor de DNA metiltransferase é a decitabina, também conhecida como 5-aza-2'
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48/83 desoxicitidina, tendo a seguinte fórmula (C8H12N4O4) (Kantarjian et al 2006).
[00172] Em uma modalidade particular, 0 ativador de expressão de MHC e/ou de resposta imunológica, é um inibidor de enzima Nmetiltransferase histona-lisina, ou inibidor de DNA metiltransferase. Como utilizado neste documento, 0 termo “inibidor da enzima N-metiltransferase histona-lisina” diz respeito a compostos que são capazes de interagir com a enzima N-metiltransferase histona-lisina codificada pelo gene Enhancer of zeste homolog 1 (EZH1) e 2 (EZH2) que participa na metilação de DNA. O EZH2 catalisa a adição de grupos metil à histona H3 na lisina 27 usando 0 cofator S-adenosil-L-metionina.
[00173] Em uma modalidade particular, 0 inibidor de enzima de N-metiltransferase histona-lisina é 3-Deazaneplanocin A (DZNEP, Cc3Ado). O DZNep e C-c3Ado tem a seguinte fórmula química C12H14N4O3 e número CAS 102052-95-9 na técnica.
[00174] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da enzima Nmetiltransferase histona-lisina é UNCI999 e um composto análogo inativo. O UNCI999 tem a seguinte fórmula química C33H43N7O2 e número CAS 1431612-23-5 na técnica.
[00175] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da enzima Nmetiltransferase histona-lisina é UNC2400 e um composto análogo inativo. O UNC2400 tem a seguinte fórmula química C35H47N7O2 e número CAS 1433200-49-7 na técnica.
[00176] Em uma modalidade particular, 0 inibidor de enzima de N-metiltransferase histona-lisina é tazemetostat (EPZ6438, E7438). O Tazemetostat tem a seguinte fórmula química C34H44N4O4 e número CAS 1403254-99-8 na técnica.
[00177] Em uma modalidade particular, 0 inibidor de enzima de N-metiltransferase histona-lisina é trifluoroacetato (EPZ011989). O Trifluoroacetato tem a seguinte fórmula química CFsCOONa e número CAS 2923-18-4 na técnica.
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49/83 [00178] Em uma modalidade particular, o inibidor da enzima Nmetiltransferase histona-lisina é EPZ005687. Ο EPZ005687 tem a seguinte fórmula química C32H37N5O3 e número CAS 1396772-26-1 na técnica.
[00179] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da enzima Nmetiltransferase histona-lisina é GSK343. O GSK343 tem a seguinte fórmula química C31H39N7O2 e número CAS 1346704-33-3 na técnica.
[00180] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da enzima Nmetiltransferase histona-lisina é GSK126. O GSK126 tem a seguinte fórmula química C31H38N6O2 e número CAS 1346574-57-9 na técnica.
[00181] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da enzima Nmetiltransferase histona-lisina é GSK2816126. O GSK2816126 tem a seguinte fórmula química C31H38N6O2 e número CAS 1346574-57-9 na técnica.
[00182] Em uma modalidade particular, 0 inibidor da enzima Nmetiltransferase histona-lisina é ZLD1039. O ZLD1039 tem a seguinte fórmula química CseHUsNeOs e número CAS 1826865-46-6 na técnica.
[00183] É prevista também a utilização tanto de um inibidor HDACi como de um inibidor de DNA metiltransferase.
[00184] De fato, foi demonstrado que 0 uso combinado de VPA e 5-azacitidina (um análogo do nucleosídeo de citidina que pode ser incorporado no DNA e RNA) leva a um efeito sinérgico na re-expressão de antígenos neo-anti-embrionários.
[00185] O HDACi é administrado em uma quantidade terapeuticamente eficiente. Para 0 VPA, pode ser de 10 a 15 mg/kg por dia, até 60 mg/kg por dia. O nível plasmático de VPA deve estar preferencialmente, em geral, no intervalo terapeuticamente aceito (50 a 100 pg/ml).
[00186] Em um aspecto adicional, 0 método de acordo com a invenção é adequado para tratar cânceres que expressam um grande número de antígenos embrionários que partilham a expressão com células
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50/83 tronco embrionárias humanas (hESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs), (por exemplo, Antígeno Embrionário-3 (SSEA3), SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, Lin28...).
[00187] Como usado neste documento, os termos “cânceres que expressam células-troncos humanas” são cânceres que são direcionados preferencialmente pelos métodos, vacinas e composições divulgadas neste documento, referem-se a células-tronco cancerígenas que expressam um grande número de antígenos embrionários que partilham a expressão com células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Normalmente, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo em carcinoma da bexiga, carcinoma da mama, carcinoma cervical, colangiocarcinoma, carcinoma colorrectal, sarcoma gástrico, glioma, carcinoma do pulmão, linfoma, linfóide agudo e crônico e leucemias mieloides, melanoma, mieloma múltiplo, osteossarcoma, carcinoma ovariano, carcinoma pancreático, carcinoma da próstata, carcinoma do estômago, carcinoma renal, um tumor de cabeça e pescoço e um tumor sólido.
[00188] Como usado neste documento, os termos administrar ou administração referem-se ao ato de injeção ou de outro modo de entrega física de uma substância tal como existe fora do corpo (por exemplo, preparação combinada) no sujeito, tal como por entrega subcutânea, mucosa, intradérmica, intravenosa, intramuscular e/ou qualquer outro método de entrega física descrito neste documento ou conhecido na técnica. Quando uma doença, ou um sintoma dela, está sendo tratada, a administração da substância normalmente ocorre após o início da doença ou seus sintomas. Quando uma doença ou sintomas da mesma estão sendo prevenidos, a administração da substância normalmente ocorre antes do surgimento da doença ou dos sintomas da mesma.
[00189] Na modalidade preferencial, a composição de vacina
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51/83 (células pluripotentes + agente que estimula a apresentação de MHC) é injetada subcutaneamente. A injeção pode ser simultânea, sequencial, separada, no mesmo ponto de injeção ou em diferentes pontos de injeção, na mesma seringa ou em seringas separadas.
[00190] Em uma modalidade preferencial, o tratamento posterior (administração do composto que estimula MHC I e/ou sistema imunológico, tal como um HDACi, particularmente VPA) é administrado por via oral.
[00191] Uma quantidade terapeuticamente eficaz destina-se a uma quantidade mínima de agente ativo que é necessária para conferir benefício terapêutico a um sujeito. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz a um sujeito é uma quantidade tal que induz, melhora ou provoca de outro modo uma melhoria nos sintomas patológicos, progressão da doença ou condições fisiológicas associadas à doença ou resistência à sucumbência de um transtorno. Será entendido que o uso diário total dos compostos da presente invenção serão decididos pelo médico assistente no âmbito da capacidade de julgamento médico. O nível de dose terapeuticamente eficaz específico para qualquer sujeito particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o transtorno a ser tratado e a gravidade do transtorno; atividade de composto específico empregado; a composição específica empregada, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do sujeito; o tempo de administração, via de administração e taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coincidentes com o composto específico empregado; e como fatores bem conhecidos nas técnicas médicas. Por exemplo, é bem conhecido dentro da habilidade da técnica iniciar doses do composto em níveis inferiores àqueles necessários para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Entretanto, a dose diária dos produtos pode variar em uma ampla faixa de 0,01 a 1.000 mg por adulto por dia. Normalmente, as composições contêm 0,01, 0,05, 0,1, 0,5,
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1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 e 500 mg do ingrediente ativo para o ajuste sintomático da dose ao assunto a ser tratado. Um medicamento normalmente contém cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg do ingrediente ativo, preferencialmente a partir de 1 mg a cerca de 100 mg do ingrediente ativo. Uma quantidade eficaz do fármaco é fornecida normalmente em um nível de dosagem de 0,0002 mg/kg a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dia, especialmente a partir de cerca de 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por dia.
[00192] Em uma modalidade particular, o método de acordo com a invenção compreende adicionalmente uma ou mais dentre terapia de radiação, terapia dirigida, imunoterapia ou quimioterapia. Tipicamente, o médico pode escolher administrar ao sujeito com i) uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC, como uma preparação combinada com terapia de radiação, terapia dirigida, imunoterapia, ou quimioterapia.
[00193] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com i) uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC, como uma preparação combinada e um agente quimioterápico.
[00194] O termo agente quimioterapêutico diz respeito a compostos químicos que são eficazes na inibição do crescimento de tumores. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclofosfamida; sulfonatos de alquila tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfaoramida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma carnptotecina (incluindo o topotecano analógico sintético); briostatina; calistatina; CC
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1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitroureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tais como os antibióticos enediina (por exemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina (11 e caliqueamicina 211, ver, por exemplo, Agnew Chem Inti. Ed. Eng. 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos enediina cromoproteicos relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caninomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidorxicubina), epirrubicina, esorubicina, idanitricicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalarnicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptomgrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina, anti-metabólitos tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU), análogos do ácido fólico como a denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como
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54/83 aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfaramida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidamina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentoestatina; fenameto; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; spirogenânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomostina; mitobromtol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (Ara-C); ciclofosfamida, tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, BristolMyers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França), clorambucil, gemcitabina, 6tioguanina; mercaptopurina, metotrexato, análogos da platina, como a cisplatina e carboplatina, vinblastina, platina, etoposido (VP-16), ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, navelbina, novantrona, teniposídeo, daunomicina, aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO), ácido retinóico, capecitabina e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima. Também incluídos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir ação hormonal em tumores tais como anti-estrogênios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, inibidores da aromatase 4(5)-imidazóis, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e anti-andrógenos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.
[00195] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com i)
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55/83 uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC, como uma preparação combinada e uma terapia direcionada ao câncer.
[00196] Terapias direcionadas para o câncer são fármacos ou outras substâncias que bloqueiam o crescimento e a disseminação do câncer ao interferir com moléculas específicas (alvos moleculares) que estão envolvidas no crescimento, progressão e disseminação do câncer. As terapias direcionadas ao câncer são chamadas algumas vezes de fármacos direcionadas molecularmente, terapias direcionadas molecularmente, medicamentos de precisão ou nomes similares. Em algumas modalidades, a terapia direcionada consiste na administrao do sujeito com um inibidor da tirosina quinase. O termo inibidor de tirosina quinase diz respeito a qualquer uma de uma variedade de agentes terapêuticos ou fármacos que atuam como inibidores seletivos ou não seletivos de tirosina quinase receptoras e/ou não receptoras. Os inibidores de tirosina quinase e compostos relacionados são bem conhecidos na técnica e descritos na publicação da patente dos EUA 2007/0254295, que é incorporada neste documento por referência à sua totalidade. Será apreciado por um versado na técnica que um composto relacionado com um inibidor de tirosina quinase irá recapitular o efeito do inibidor de tirosina quinase, por exemplo, o composto relacionado atuará em um membro diferente da via de sinalização de tirosina quinase para produzir o mesmo efeito que teria um inibidor de tirosina quinase dessa tirosina quinase. Exemplos de inibidores de tirosina quinase e compostos relacionados adequados para utilização em métodos de modalidades da presente invenção incluem, mas não estão limitados a dasatinib (BMS-354825), PP2, BEZ235, saracatinib, gefitinib (Iressa), sunitinib (Sutent; SU11248 ), erlotinib (Tarceva; OST1774), lapatinib (GW572016; GW2016), canertinibe (Cl 1033), semaxinibe (SU5416), vatalanibe (PTK787 / ZK222584), sorafenibe
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56/83 (BAY 43-9006), imatinibe (Gleevec; STI571), leflunomida (SU101), vandetanib (Zactima; ZD6474), bevacizumabe (avastin), MK-2206 (cloridrato 8-[4-aminociclobutil)fenil]-9-fenil-1,2,4-triazolo[3,4f][1,6]naftiridina-3(2H)-ona) derivados, seus análogos e suas combinações. Inibidores adicionais de tirosina quinase e compostos relacionados adequados para utilização na presente invenção são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente dos EUA 2007/0254295, Pat. Num.
5.618.829, 5.639.757, 5.728.868, 5.804.396, 6.100.254, 6.127.374,
6.229.759, 6.307.874, 6.320.138, 6.317.444, 6.329.380, 6.344.459,
6.420.382, 6.479.512, 6.498.165, 6.544.988, 6.562.818, 6.586.423,
6.586.424, 6.740.665, 6.794.393, 6.875.767, 6.927.293 e 6.958.340 ,todos as quais são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, o inibidor de tirosina-quinase é um inibidor quinase de molécula pequena que foi administrado oralmente e que tem sido objeto de pelo menos um ensaio clínico de Fase I, mais preferencialmente pelo menos um ensaio clínico de Fase II, ainda mais preferencialmente pelo menos um ensaio clínico de Fase III, e mais preferencialmente aprovado pelo FDA para pelo menos uma indicação hematológica ou oncológica. Exemplos de tais inibidores incluem, mas não estão limitados a, Gefitinib, Erlotinib, Lapatinib, Canertinib, BMS-599626 (AC-480), Neratinib, KRN-633, CEP-11981, Imatinib, Nilotinib, Dasatinib, AZM-475271, CP -724714, TAK-165, Sunitinib, Vatalanib, CP-547632, Vandetanib, Bosutinib, Lestaurinib, Tandutinib, Midostaurina, Enzastaurina, AEE-788, Pazopanib, Axitinib, Motasenib, OSI-930, Cediranib, KRN-951, Dovitinib, Seliciclib ,SNS-032, PD-0332991, MKC-I (Ro-317453; R-440), Sorafenib, ABT-869, Brivanib (BMS-582664), SU-14813, Telatinibe, SU6668, (TSU-68) ,L-21649, MLN-8054, AEW-541 e PD-0325901.
[00197] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com i) uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de
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MHC, como uma preparação combinada e um inibidor do ponto de verificação imunológico.
[00198] Como utilizado neste documento, o termo inibidor do ponto de verificação imunológico refere-se a moléculas que reduzem, inibem, interferem ou modulam total ou parcialmente com uma ou mais proteas de ponto de verificação. As proteínas do ponto de verificação regulam a ativação ou função de células T. São conhecidas numerosas proteínas de ponto de verificação, tais como CTLA-4 e seus ligantes CD80 e CD86; e PD1 com os seus ligantes PDL1 e PDL2 (Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012). Estas proteínas são responsáveis por interações co-estimulatórias ou inibitórias de respostas de células T. As proteínas do ponto de verificação imunológico regulam e mantêm a autotolerância e a duração e amplitude das respostas imunológicas fisiológicas. Inibidores do ponto de verificação imunológico incluem anticorpos ou são derivados de anticorpos. Em algumas formas de realização, o inibidor do ponto de verificação imunológico é um anticorpo selecionado do grupo que consiste em anticorpos anti-CTLA4 (por exemplo, Ipilimumab), anticorpos anti-PDL (por exemplo, Nivolumab, Pembrolizumab), anticorpos anti-PDL1, anticorpos anti-TIM3, anticorpos anti-LAG3, anticorpos anti-B7H3, anticorpos anti-B7H4, anticorpos antiBTLA e anticorpos anti-B7H6. Exemplos de anticorpos anti-CTLA-4 são descritos nas Patentes dos EUA Num.: 5,811,097; 5,811,097; 5,855,887; 6,051,227; 6,207,157; 6,682,736; 6,984,720; e 7.605.238. Um anticorpo anti-CTLA-4 é tremelimumab, (ticilimumab, CP-675,206). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é ipilimumab (também conhecido como 10D1, MDX-D010), um anticorpo IgG monoclonal totalmente humano que se liga a CTLA-4. Outra proteína do ponto de verificação imunológico é a morte celular programada 1 (PD-1). Exemplos de bloqueadores de PD-1 e PD-L1 são descritos nas Patentes dos EUA Num. 7.488.802; 7.943.743; 8,008,449; 8,168,757; 8177149 e Pedido de Patente PCT Publicado Num:
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W003042402, WG2008156712, W02010089411, W02010036959,
WO2011066342, WO2011159877, WO2011082400 e WO2011161699. Em algumas modalidades, os bloqueadores de PD-1 incluem anticorpos antiPD-L1. Em certas outras modalidades, os bloqueadores de PD-1 incluem anticorpos anti-PD-1 e proteínas de ligação semelhantes tais como nivolumab (MDX 1106, BMS 936558, ONO 4538), um anticorpo lgG4 totalmente humano que se liga e bloqueia a ativação de PD- 1 pelos seus ligantes PD-L1 e PD-L2; lambrolizumab (MK-3475 ou SCH 900475), um anticorpo lgG4 monoclonal humanizado contra PD-1; CT-011 um anticorpo humanizado que se liga a PD-1; AMP-224 é uma proteína de fusão de B7DC; uma porção Fc de anticorpo; BMS-936559 (MDX-1105-01) para o bloqueio PD-L1 (B7-H1). Outros inibidores do ponto de verificação imunológico incluem os inibidores do gene-3 (LAG-3) de ativação de linfócito, como ο IMP321, uma proteína de fusão de Ig solúvel (Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179: 4202-4211). Outros inibidores do ponto de verificação imunológico incluem inibidores B7, tais como os inibidores B7H3 e B7-H4. Particularmente, o anticorpo anti-B7-H3 MGA271 (Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834). São incluídos também inibidores TIM3 (domínio mucina 3 e domínio imunoglobina célula T) (Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86 e Sakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94). Em algumas modalidades, o tratamento imunoterapêutico consiste em uma imunoterapia adotiva, como descrita por Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley e Steven A. Rosenberg (“Adoptiveimmunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012). Na imunoterapia adotiva, os linfócitos circulantes do paciente, ou linfócitos infiltrados no tumor, são isolados in vitro, ativados por linfocinas como IL-2 e readministradas (Rosenberg et al., 1988; 1989). Os linfócitos ativados são, de um modo muito preferencial, as células do próprio paciente que foram isoladas anteriormente a partir de uma amostra de sangue e ativadas (ou
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59/83 “expandidas”) in vitro.
[00199] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com i) uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC, como uma preparação combinada e um agente radioterapêutico.
[00200] O termo agente radioterapêutico, tal como utilizado neste documento, destina-se a se referir a qualquer agente radioterapêutico conhecido por um versado na técnica como sendo eficaz para tratar ou melhorar o câncer, sem limitação. Por exemplo, o agente radioterapêutico pode ser um agente como aqueles administrados em terapia de braquiterapia ou radioisótopo. Tais métodos podem, opcionalmente, compreender adicionalmente a administração de uma ou mais terapias de câncer adicionais, tais como, mas não se limitando a, quimioterapias e/ou outra radioterapia.
Composições Farmacêuticas e de Vacinas [00201] Os compostos que ativam a expressão de MHC e/ou resposta imunológica e a população de células pluripotentes, como descrito acima, podem ser combinados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, matrizes de liberação sustentada, tais como polímeros biodegradáveis, para formar composições farmacêuticas.
[00202] Farmaceuticamente ou farmaceuticamente aceitável se refere entidades e composições moleculares que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra desagradável quando administrado a um mamífero, especialmente um ser humano, conforme apropriado. Um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a um preenchimento sólido, semissólido ou líquido não tóxico, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo. As composições farmacêuticas da presente invenção para administração oral, sublingual, subcutânea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, local ou retal, o princípio ativo, isolado ou em combinação com outro princípio ativo,
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60/83 podem ser administrados em uma forma de administração unitária, como uma mistura com suportes farmacêuticos convencionais, para animais e seres humanos. As formas de administração unitária adequadas compreendem formas de via oral tais como comprimidos, cápsulas de gel, pós, grânulos e suspensões ou soluções orais, formas de administração sublingual e bucal, aerossóis, implantes, subcutânea, transdérmica, tópica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdérmica, transdérmica, formas de administração intratecal e intranasal e formas de administração retal. Tipicamente, as composições farmacêuticas contêm os veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação capaz de ser injetada. Estas podem ser em particular soluções salinas isotônicas, estéreis (fosfato monossódico ou dissódico, sódio, cloreto de potássio, cálcio ou magnésio e afins ou misturas desses sais), ou secas, especialmente composições liofilizadas sobre adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou soro fisiológico, permitam a constituição de soluções injetáveis. As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões; formulações, incluindo o óleo de gergelim, óleo de amendoim ou propilenoglicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersões. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser flexível, na medida em que siringabilidade fácil existe. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de micro-organismos, como bactérias e fungos. Soluções compreendendo compostos da invenção, como sais de base ou farmacologicamente aceitáveis, podem ser preparadas em água devidamente misturada com um surfactante, tais como hidroxipropilcelulose. Dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições normais de armazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microorganismos. O
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61/83 polipeptídeo (ou ácido nucleico que o codifica) pode ser formulado em uma composição em uma forma neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos de aminoácidos livres da proteína) e os quais são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, clorídrico ou ácidos fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico e afins. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e afins. O transportador também pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e afins), suas misturas adequadas e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como lecitina, pela manutenção da granulometria necessária em caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de microorganismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e afins. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes de atraso da absorção, por exemplo, gelatina e monoestearato de alumínio. Soluções injetáveis estéreis são preparadas pela incorporando dos polipeptídeos ativos na quantidade exigida no solvente apropriada com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização do filtrado. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão a base e os outros ingredientes necessários daqueles acima enumerados. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de
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62/83 preparação são técnicas de vácuo-secagem e liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução esterilizada previamente filtrada dos mesmos. Sobre formulação, soluções serão administradas de forma compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade que é terapeuticamente eficaz. As formulações são administradas facilmente em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descrito acima, mas as cápsulas de liberação de drogas e o similares pode também ser empregados. Para a administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada em ,se necessário, e o líquido diluente processado primeiro isotônico com solução salina ou glicose suficiente. Essas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração por via intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Nesta conexão, meios aquosos estéreis, os quais podem ser empregados serão conhecidos aos de habilidade na técnica à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de NaCI e adicionado a 1000 ml de fluido hipodermoclise ou injetado no local da infusão proposta. Alguma variação na dosagem ocorrerá, necessariamente, dependendo da condição do sujeito a ser tratado. O responsável pela administração, em qualquer caso, determinará a dose adequada para o sujeito individual.
[00203] Mais particularmente, a população de células pluripotentes e o composto que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC são formulados em uma composição de vacina. Por conseguinte, a invenção diz respeito a uma composição de vacina compreendendo i) uma população de células pluripotentes e ii) um composto selecionado a partir de um grupo que ativa a expressão e/ou resposta imunológica de MHC.
[00204] Em uma modalidade particular, a composição de vacina
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63/83 de acordo com a invenção compreende i) células-tronco embrionárias humanas e ii) ácido valpróico.
[00205] Em uma modalidade particular, a composição de vacina de acordo com a invenção compreende i) células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) expressando neoantígenos, melhorados particularmente por agentes mutagênicos ou modificação genética e ii) ácido valpróico.
[00206] A composição também pode compreender 5 azacitidina.
[00207] Além disso, a composição de vacina da presente invenção pode ser utilizada em um sujeito que sofre de um câncer, como descrito acima.
[00208] A composição de vacina de acordo com a invenção pode ser formulada com os excipientes fisiológicos definidos acima da mesma maneira que nas composições imunogênicas. Por exemplo, os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, soluções salinas tamponadas com fosfato, água destilada, emulsões tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de soluções molhantes, soluções estéreis e semelhantes. Podem ser utilizados adjuvantes, tais como peptídeos de muramilo, tais como MDP, IL-12, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, Alúmen e/ou Montanide (R) nas vacinas.
[00209] A composição da vacina de acordo com a invenção pode ser administrada subcutânea (SC), intradérmica (ID), intramuscular (i.m.) ou injeção intravenosa (IV), a administração oral e administração intranasal ou inalação. A administração da vacina é geralmente em dose única. Alternativamente, a administração da vacina da invenção é feita por uma primeira vez (vacinação inicial), seguida de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
32, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,
51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70,
71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 recalls (administração
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64/83 subsequente), com a mesma população de células-tronco, o composto que estimula o sistema imunológico ou uma combinação dos mesmos e/ou com mais uma ou mais dentre terapia de radiação, terapia direcionada, imunoterapia ou quimioterapia adicional.
[00210] A composição da vacina é provida também em um kit. O kit compreende a composição de vacina e um folheto de informativo provendo instruções para imunização. O kit compreende também todos os materiais para a administração dos produtos.
[00211] A invenção será ilustrada adicionalmente pelos seguintes exemplos e figuras. No entanto, estes exemplos e figuras não devem ser interpretados de qualquer maneira para limitar o escopo da presente invenção.
FIGURAS:
[00212] Figura 1: Estudo de vacinação com células mESCs, hESC, miPSCs e 4T1 no modelo 4T1 do tumor de mama. Projeto do estudo: Os camundongos (n=5 por grupo) recebidos para aumentos da vacina de 7 e 14 dias com 105 células irradiadas; células-tronco embrionárias murinas (MESCs), células-tronco pluripotentes induzidas por murinos (miPSCs), células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células 4T1. Após 14 dias, foram injetadas 5x104 células 4T1 na camada adiposa mamária dos camundongos. Cinco camundongos foram injetados com 4T1-CSC (crescimento de células 4T1 com citocinas adicionais, tais como TGFbeta e TNFalfa, a fim de gerar CSC crescendo na forma de mamosferas) [00213] Figura 2: Proteção imunológica após a vacinação. A; Quantificação de linfócitos CD4 positivos para infiltração tumoral (TIL) por citometria de fluxo. B; Quantificação de células T reguladoras CD25 positivas por citometria de fluxo dentro do CD4 + TIL. C; Quantificação de células T reguladoras de PD1 por citometria de fluxo dentro das células CD8+ T em relação ao grupo de camundongos.
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65/83 [00214] Figura 3: Estudo de vacinação com hESC combinado com VPA em modelo de camundongo 4T1· Projeto de estudo: Os Camundongos (n=5 por grupo) receberam aumentos de vacina entre 7 e 14 dias com 105 células irradiadas hESCs com ou sem VPA. Após 14 dias, foram injetadas 5x104 células 4T1 na camada adiposa mamária dos camundongos. A; Volumes tumorais para cada grupo: 1/controle (PBS), 2/vacinação com hESC, 3/vacinação com hESCs combinam com VPA, 4/camundongos que recebem apenas VPA. B: peso dos tumores aos 44 dias.
[00215] Figura 4: Proteção imunológica após vacinação com hESC e VPA: A; diminuição da célula PD1 no baço dentro das populações CD4 e CD8. B, aumento das células T CD4+ e CD8+ nos tumores. C: aumento de células T CD4+ e CD8+ no baço [00216] Figura 5: Quantificação do gene repórter de luciferase pelo sistema IVIS-Spectrum nos pulmões após a dissecção para cada animal dos 4 grupos (controle, hESC, hESC+VPA, VPA).
[00217] Figura 6: Expressão do gene pluripotente por PCR em tempo real em células 4T1 e 4T1 CSC (mamosferas) tratadas com 0,5 mM de VPA durante 5 dias.
[00218] Figura 7: Expressão de Oct4 em 4T1 tratado com VPA e 5Aza por RT PCR e PCR em tempo real.
[00219] Figura 8: Detecção por seguenciacão de exoma de variantes genéticas alterando seguências proteicas de neoantígenos em IPSC tratadas ou não por ENU· Quantificação de variantes em iPSC tratadas com ENU e sem iPSCs tratados. (NS = Não Sinônimo, FS = deslocação do quadro de leitura, SG = Stop Gained).
[00220] Figura 9: representação esquemática de um processo de acordo com a invenção.
EXEMPLOS:
EXEMPLO 1:
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66/83 [00221] Foi relatado que tecidos fetais podem ser usados para imunizar camundongos que são capazes de rejeitar tumores transplantáveis incluindo câncer de pele, fígado e trato gastrointestinal. Esta resposta é explicada pelo fato de que essas células tumorais expressam um alto número de antígenos oncofetais. Até o presente momento, foram realizados vários ensaios de vacinas contra câncer em humanos, com o objetivo de visar antígenos embrionários, tais como antígenos carcinoembrionários (CEA) e antígenos alfa-fetoproteína ou antígenos de câncer/testes. Infelizmente, o direcionamento de apenas um antígeno mostrou não ser eficiente o suficiente para gerar fortes respostas imunológicas antitumorais para mediar a rejeição do tumor devido ao rápido aparecimento de mutantes de escape e à ineficiência geral das vacinas de câncer monovalentes. O recente interesse no potencial das células-tronco na medicina regenerativa tornou amplamente disponíveis as linhas de ESC indiferenciadamente bem definidas, assim como iPSCs indiferenciadas que são fenotípicas e funcionalmente semelhantes às ESCs. Em nosso estudo, salientamos que células-tronco indiferenciadas podem ser utilizadas como uma vacina polivalente para gerar uma resposta imunológica contra uma variedade de antígenos embrionários que são partilhados por células tumorais e CSC. Descobrimos, pela primeira vez, que as ESCs ou iPSCs foram capazes de induzir respostas imunológicas e clínicas contra o carcinoma de mama. De maneira interessante, descobrimos que a adição de ácido valpróico no regime terapêutico pode induzir maiores respostas imunológicas e anti-tumorais em comparação ao uso de ESCs ou iPSCs isoladamente.
Material e Métodos [00222] Desenvolvemos um modelo de tumor mamário 4T1 metastático em camundongos BALB/c. Para verificar os marcadores embrionários semelhantes ao ES em linhas celulares de câncer de mama TNBC murino 4T1 foi realizada uma meta-análise com as amostras de
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67/83 células embrionárias (célula-tronco D3 - GSE51782 anotada com a plataforma Affymetrix GPL16570) e com integração de conjuntos de dados diferentes: A linhagem celular TNBC 4T1 cultivada in vitro (GSE73296 anotada com a plataforma Affymetrix GPL6246), linhagem TNBC 4T1 xenotransplantada em modelo de camundongo (GSE69006 anotada com a plataforma Affymetrix GPL6246) e amostras de glândula mamária (GSE14202 anotadas com a plataforma GLP339) (Padovani et al. 2009). Para este modelo 4T1, foi demonstrado por análise de microarray que 4T1 transplantado em camundongos balb/c compartilham 1304 genes diferentes com ESCs murinos incluindo TRAP 1 A, TET1, TSLP, FAM169A, ETV5, MOXD1, PHLDA2, CRIP1, ADAMDEC1, NIDI, EPCAM, H2-EA-PS, GPA33, IBSP, KANK3, MEST, MMP9, SPRY4, CLDN4, PRSS22, DDAH2, SPRY2, USP11, CTNNAL1, ZFP532, GRB10, CACNG7, ST14, CTH, RCN1, PECAM 1, TMEFF1, PPP1R1A, GPR97, KIF2C, BRCA2, SLAIN1, CSRP2, DOCK6, HUNK, RAD51, ESYT3, SKP2, CCL24, SFRP1, HMGB2, ITM2A, ASPN, MSH2, SUGT1, ARHGAP8, ect. Todos esses genes foram encontrados assim comumente supra-regulados em 4T1 e mESC, em comparação à glândula mamária murina normal. Foi demonstrado também que 4T1 xenotransplantado com marcadores CSC altamente expressados, tais como CD44 em comparação às células que foram colhidas in vitro /39% versus 0,27% de CD44altaCD24baiX0) (não mostrado).
[00223] Da mesma maneira, uma análise do perfil de expressão do genoma completo foi realizada no câncer de mama triplo negativo (TNBC) a partir de pacientes. Para verificar os marcadores semelhantes ao ES embrionário em pacientes com TNBC foi realizada uma meta-análise com amostras de células embrionárias e amostras de mama humana através da fusão de dados de amostras de diferentes conjuntos de dados: conjunto de dados GSE18864 compreendendo 84 amostras de câncer de mama e anotado com a plataforma Affymetrix GPL570 (Silver et al., 2010), conjunto de dados GSE20437 compreendendo 42 amostras de mama
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68/83 humana normal e anotado com a plataforma affymetrix GPL96 (Graham et al. 2010), conjunto de dados GSE23402 compreendendo 42 amostras de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas e anotadas com a plataforma Affymetrix GPL570 (Guenther et al. 2010), conjunto de dados de linhas celulares de câncer de mama (Maire et al. 2013) e conjunto de dados GSE36953 compreendendo amostras de cultura de células de linhas celulares TNBC e anotadas com placa de Affymetrix GPL570 (Yotsumoto et al. 2013). Um ANOVA supervisionado e unidirecional analisado entre os três graus de grupos de câncer de mama identificou 4288 genes significativos que permitiram classificar a maioria dos cânceres de mama triplo negativo TNBC grau III com amostras de IPS e ES incluindo CDC20, KRT81, NCAPG, MELK, DLGAP5, AURKA ADAM8, CCNB1, RRM2, QPRT, SLAMF8, EZH2, CENPF, HN1, CENPA, SLC19A1, SLC39A4, CDK1, SEPHS1, GMDS, TUBB, SCRIB, DDX39A, YBX1, MKI67, TKT, WDR1, SKP2, ISG20, NRTN, SEC14L1 ,GAPDH, ILF2, PSMB2, DHTKD1, TPX2, CCNB2, IL27RA, NADK, H2AFX, MRPS18A, AURKA, MCM7, MCAM, NOP2, KIF23, JMJD4, YIPF3, CDH3, TALDOI, BID, C16orf59, HMMR, BIRC5, ZNF232, RANBP1 ,CDK1, SHMT2, KIF20A, EPHB4, SPAG5, PPARD, ORC6, TUBB4B, [00224] LYZ, TK1, PDXK, NAA10, BAG6, SF3B3, MARCKSL1, MCM3, PSRC1, NUSAP1, etc. Todos esses genes foram encontrados assim comumente supra-regulados em tumores TNBC e hESCs, comparados à glândula mamária humana normal.
Resultados
Resultado 1 Vacinação com células-tronco embrionárias xenogênicas gera uma resposta imunológica e antitumoral contra o câncer de mama.
[00225] Primeiro investigamos se a vacinação com ESCs murinos irradiados (mESC), células-tronco pluripotentes induzidas por murino (iPSCs de murino), células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou
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69/83 células 4T1 era eficaz contra o câncer da mama em um modelo de camundongo 4T1 singênico. Esta vacinação foi seguida expondo os camundongos com dois tipos diferentes de células 4T1: a 4T1 cultivada normalmente em DMEM a 10% de células SVF ou 4T1 que cresceram com citocinas adicionais, tais como TGFbeta e TNFalfa, para gerar CélulasTronco Cancerígenas (CSC). crescendo na forma de mamosferas. Descobrimos que, em contraste com os camundongos não vacinados, os camundongos vacinados com hESCs, mESCs, iPSCS murino e 4T1 geraram respostas imunológicas celulares consistentes contra o carcinoma 4T1, que foi correlacionado com uma redução significativa do volume do tumor de mama (p<0,05) (Figura 1). Descobrimos que os tumores cresceram progressivamente no grupo de controle PBS, enquanto, notadamente, a imunização com mESC, miPS ou hESC resultou em um retardamento do crescimento do tumor, com diferenças estatisticamente significativas no tamanho médio do tumor em cada grupo comparado ao grupo PBS (Figura 1). Observamos uma drástica inibição do crescimento tumoral quando os camundongos foram expostos ao 4T1 derivado de CSC em comparação com os camundongos expostos ao 4T1 que cresceram sob condições normais mostrando que a vacinação com mESC singeneico visa preferencialmente CSCs. Para um estudo mais aprofundado do mecanismo imunocelular mediando o efeito antitumoral, analisamos o fenótipo dos linfócitos que infiltram o tumor de diferentes grupos e quantificamos as subpopulações CD4, CD8, CD25 e PD1. O efeito antitumoral foi correlacionado com 1/ um aumento de CD4+ TIL que foi significativamente correlacionado (p=0,0039) com o tamanho do tumor (Figura 2A), 2/ uma diminuição da porcentagem de células CD25 positivas que foi inversamente correlacionada com o tamanho do tumor (Figura 2B), 3/ uma diminuição das células PD1 positivas que foi mais pronunciada em camundongos com melhor repouso ao regime de vacinação (vacinação com hECS, 4T1 ou mESC) (Figura 2C).
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Resultado 2 Vacinação com células-tronco embrionárias xenogênicas em combinação com ácido valpróico (VPA) gera uma maior resposta antitumoral contra o câncer de mama e inibe o desenvolvimento de metástases.
[00226] Para avaliar os locais metastáticos nos modelos de mama 4T1, as células 4T1 foram modificadas geneticamente para que expressassem tanto a proteína repórter luciferase e GFP (4TILuc-GFP), permitindo seu rastreamento In vivo usando geração de imagem de bioluminescência (espectro Ivis) em órgãos mais profundos (baço, pulmão, osso, fígado). O experimento foi realizado conforme descrito anteriormente, mas utilizando apenas hESCs irradiados como vacina; 5 camundongos por grupo receberam dois reforços de vacina de 7 e 14 dias com 105 células hESC irradiadas com ou sem VPA na dose de 0,40 mM em água potável. Após 14 dias, foram injetadas 5x104 células 4TILuc-GFP na camada adiposa mamária dos camundongos. Descobrimos que, em contraste com os camundongos não vacinados, os camundongos vacinados com hESCs combinado com VPA geraram uma maior resposta imunológica celulare contra o carcinoma 4T1, que foi correlacionado a uma redução significativa do volume do tumor de mama (p<0,05) (Figura 3A) e redução do peso tumoral (Figura 3B). A resposta antitumoral foi correlacionada com um decréscimo drástico da expressão de PD-1 tanto em células CD4+T como em células CD8+T nos camundongos que receberam hESC e VPA (Figura 4A). Além disso, a resposta antitumoral foi correlacionada a um aumento significativo da percentagem de células CD4+T e CD8+T dentro do tumor (Figura 4B) e dentro do baço (Figura 4C) exclusivamente para os ratinhos que receberam o tratamento combinado (hESC e VPA) em comparação com o grupo controle (PBS). Nós também pudemos investigar que todos os camundongos tiveram metástase de pulmão substancialmente reduzida do que camundongos tratados com vacina hESCs e VPA (Figura 5). Tomados em conjunto, esses resultados mostram que a vacinação com base em
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71/83 tronco embrionário xenogênico (hESC) com VPA tem a mais forte eficácia em comparação com o uso de hESC e VPA isoladamente. Estes resultados mostram que a vacinação com base em tronco embrionário xenogênico poderia ser um tratamento eficiente para reduzir a recidiva tumoral no carcinoma de mama.
EXEMPLO 2 - O ácido valpróico modula a expressão de MHC classe 1 e a expressão de genes embrionários [00227] O principal complexo de histocompatibilidade (MHC) é um conjunto de proteínas da superfície celular essenciais para o sistema imunológico adquirido reconhecer moléculas estranhas que desempenham um papel essencial no sistema imunológico adquirido. A principal função das moléculas de MHC é se ligar a antígenos novos e estranhos e exibi-los na superfície celular para reconhecimento pelas células T apropriadas: Ao interagir com as moléculas CD4 nas superfícies das células T auxiliares, a classe II do MHC medeia o estabelecimento de imunidade específica chamada imunidade adquirida ou imunidade adaptativa. Ao interagir com moléculas de CD8 nas superfícies de células T citotóxicas, o MHC classe I medeia a destruição de células hospedeiras infectadas ou malignas.
[00228] A tolerância imunológica é um meio importante pelo qual os tumores em crescimento, que têm proteínas mutantes e expressão de antígeno alterada, impedem a eliminação pelo sistema imunológico do hospedeiro. A tolerância imunológica do tumor pode ser explicada em parte pela ausência de p2-m na superfície celular e ou a ausência de MHC classe na célula tumoral. Foi demonstrado que o VPA é capaz de aumentar a expressão de MHC de classe I em células 4T1 a uma dose entre 0,2 mM e mM.
[00229] A expressão de MHC de classe I em 4T1 e mamosfera de 4T1 (CSC induzida pelo tratamento por TNFa e TGFb) aumenta de 2 a 3 vezes após 24 h a 72 h de exposição com 2 mM de VPA.
[00230] Particularmente, foi demonstrado que o VPA é capaz de
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72/83 aumentar a expressão de HLA ABC MHC classe I em IPSCs (63% versus 92%) e a expressão de marcadores pluripotentes como SSEA4 e Tral-60 (55% versus 72%) na dose de 0,5 mM.
[00231] Esses marcadores foram diminuídos após exposição a ENU (60 dias de tratamento) e foram restaurados quando as células foram tratadas com 0,5 mM de VPA (28% a 92% de iPSCs-ENU e HLAc positivos para HLA ABC respectivamente) e (48% a 69% de iPSCs-ENU e IPSCs positivos para SSEA4/Tra-1-60, respectivamente).
[00232] Os inibidores de HDAC como VPA podem alterar seletivamente a transcrição gênica, em parte, pelo remodelamento da cromatina e por mudanças na estrutura das proteínas no fator de transcrição. Foi estudado se o VPA pode modular a expressão do gene pluripotente em células de tumor de mama. Para este propósito, tratamos 4T1 e mamosferas 4T1 (CSC induzidas pelo tratamento com TNFa e TGFb) com 1 mM a 2 mM de VPA. Em todos os casos, o VPA aumentou em 2 a 3 vezes a expressão de três fatores transcricionais importantes que são altamente expressados em ESC ou iPSC, como Oct 4, Sox2 e Nanog (Figura 6). É importante ressaltar que um efeito sinérgico importante da expressão desses fatores transcricionais foi demonstrado quando as células tumorais foram tratadas com a combinação de VPA e 5-azacitidina (5aza) quando usadas em doses que inibem a metiltransferase de DNA, causando hipometilação do DNA. Particularmente, um aumento de 7 vezes do transcrito de oct-4 foi mostrado quando células 4T1 foram tratadas com VPA e 5aza (Figura 7 A e B).
EXEMPLO 3 - Indução de danos ao DNA e erros de reparo de DNA por instabilidade genômica em IPSCs expostas a fármacos mutaqênicos como N-etil-N-nitrosourea (ENU) [00233] A Etil-N-Nitrosureia (ENU) é um agente alquilante mutagênico que cria transversões de base, mas também mutações de ponto único e quebras de DNA de cadeia dupla (DSB).
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73/83 [00234] Foi possível confirmar que a ENU permite danos no DNA na iPSC.
[00235] Foi avaliada a quantidade de gama-H2AX fosforilada atraída para os locais de DSB presentes nas células foi avaliada. Neste experimento, as iPSC foram separadas de culturas estromais pela utilização de colagenase e tratadas in vitro com ENU nas concentrações indicadas (50/ml) e vezes, seguidas por análises de Western blot utilizando um anticorpo anti-fosfo-gama H2AX. Um aumento dos níveis de gamaH2AX visto como pontos de tempo iniciais como 2 minutos-10 minutos foi mostrado, seguido pelo retorno aos níveis basais.
[00236] Um protocolo foi desenhado, para induzir a instabilidade genômica em iPSC por um tratamento sequencial de IPSC com ENU, a fim de acumular erros de reparo de DNA durante a proliferação extensa. As células foram tratadas durante 60 dias com alterações diárias do meio com adição de ENU a uma concentração de 10 pg/ml. O VPA foi adicionado durante a cultura.
[00237] No dia +61, as iPSCs avaliaram a consequência genômica do procedimento de mutagênese em iPSC por Cariótipo e sequenciamento de RNA, matrizes de CGH, sequenciamento de exoma, WGS. As alterações genômicas acumuladas em iPSCs cultivadas são comparadas a iPSC não tratadas com ENU.
[00238] Após a exposição ao ENU, as iPSC mutadas foram mantidas e expandidas em cultura com VPA. Arranjos de CGH e sequenciamento de exoma são realizados sequencialmente em diferentes passagens para confirmar a genocópia da prevalência de mutação somática em ENU-iPSC durante sua expansão. O fenótipo de iPSCs é realizado através da avaliação de pluripotência Pluritest e expressão de Oct4, Sox2, Nanog, Tra-1 60, SSEA4. Descobrimos que a taxa de replicação e a duplicação da população são semelhantes à iPSC sem a exposição de ENU.
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74/83 [00239] As iPSC foram tratadas com 10 pg/ml de ENU e realizaram um sequenciamento de exoma para a detecção de neoantigenos mutados. 48 alterações em iPSC tratados com ENU foram encontradas em comparação com 8 alterações em iPSCs sem ENU (Figura 8). Esses locais foram fundidos com o programa cBioPortal (http://www.cbioportal.org) permitindo o acesso a conjuntos de dados genômicos do câncer a partir de amostras de tumores humanos de diferentes estudos de câncer. Usando o programa cBioPortal, foi demonstrado que mais de 10 a 75% dessas alterações foram desreguladas também em carcinoma (pâncreas, pulmão, próstata...). Para todo o sequenciamento de exoma, estimamos a profundidade de cobertura de 30 a 400 leituras para todas as mutações que podem ser detectadas em iPSC tratadas com ENU.
EXEMPLO 4 - Haploinsuficiência para BRCA1 leva a alteração do reparo do DNA e instabilidade qenômica com o acúmulo de CNVs em iPSC durante a cultura.
[00240] A alteração de BRCA1/2 é envolvida na síndrome hereditária da mama e do câncer de ovário (HBOC). O BReast CAncerl (BRCA1) é um gene supressor de tumor e desempenha um papel crucial na manutenção da estabilidade genômica, controlando o reparo de DNA em recombinação homóloga, reparo de ruptura de fita dupla, fase S e G2/M, pontos de verificação da haste e regulação centrossomal.
[00241] Um fibroblasto contendo uma deleção do exon 17 em BRCA1 foi reprogramado com vírus Sendai contendo Oct3/4, Sox2, Klf4 e cMyc (Kit de Reprogramação CytoTune®-iPS Sendai, Life technologies). As células foram cultivadas em meio de células-tronco pluripotentes humanas (meio hPSC) com base em DMEM/F12 suplementado com 20% de Substituto de Soro Knock Out, 1 mM de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 100 μΜ de 2-mercaptoetanol (Life technologies) e
12,5 ng/ml de FGF básico (Miltenyi Biotech). No dia 26, colônias totalmente reprogramadas foram escolhidas manualmente com base em sua
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75/83 morfologia e marcadores de pluripotência por análise FACS, Q RT-PCR de Nanog, Oct4 Sox2, formação de teratoma em camundongos NOD-SCID e Pluritest. O cariótipo foi normal.
[00242] Os níveis e a atividade da Resposta de Dano ao DNA (DDR) em normal (WT) e BRCA1 +/- iPSCs foram comparados. Os focos gamma H2AX foram determinados por imunofluorescência em iPSC em proliferação após exposição à irradiação ou ENU. A IPSC BRCA1 +/- exibiu níveis significativamente mais elevados de substratos de ATM/ATR fosforilados, bem como recrutamento de H2AX gama para DNA em comparação com WT-iPSC normal, indicando que a proliferação de IPSC BRCA1 +/- sofre maior dano de DNA em comparação com WT-IPSC.
[00243] Uma vez que o iPSC BRCA1 +/- apresentou níveis aumentados de DDR nas passagens iniciais, examinou-se se isso poderia estar associado ao acúmulo de alterações genômicas durante passagens iterativas e proliferação.
[00244] A matriz de CGH em células-tronco pluripotentes em proliferação foi analisada após a passagem prolongada de iPSC em meio suplementado com HDACi (VPA). Para este propósito, foram realizados experimentos de CGHarray Agilent em DNA de amostras de IPSCs com a plataforma aCGH de Roche-Nimbelgen. A extração de sinal e os intervalos genômicos foram identificados com os softwares citogenômico Agilent e Nexus Roche-Nimbelgen no HG18 do genoma humano. Os locais de gene foram convertidos em coordenadas HG19 com os arquivos de anotação Roche-Nimbelgen (Genes_July_2010_hgl9, website Roche-Nimbelgen). O polimorfismo de variação do número de cópias europeu (CNV) foi eliminado dos experimentos com o banco de dados scandb (Gamazon et al. 2010). Os coeficientes de CGV CNV da matriz foram traçados como mapa de calor com a versão MEV 4.9.0 software independente (vermelho: ganho, verde: perda e preto: zero) (Saeed et al. 2003). Os locais de gene encontrados afetados na célula de origem foram subtraídos dos locais de gente afetados
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76/83 na respectiva amostra de IPSCs. O CNV filtrado resultante específico de cada iPSCs foram fundidos no banco de dados de censo COSMIC (Futreal et al. 2004). A Circosplot Genômico em HG19 foi realizado com genes de câncer afetados em cada [00245] IPSCs após filtração. Este sorteio genômico foi realizado com OmicCircos R-package em ambiente R versão 3.0.2 (Hu et al. 2014).
[00246] Foi demonstrado que a cultura de iPSC BRCA1+/- (>100 dias) leva nas passagens tardias a um acúmulo de anormalidades genômicas concomitantes ao aumento da instabilidade genômica sem a exposição a ENU. O cariótipo na última passagem é normal. Os experimentos de aCGH da Agilent foram realizados em extrato de DNA a partir de células iPSC e de suas respectivas células de origem. O mapeamento genômico dos intervalos afetados durante essas induções de pluripotência mostrou que o BRCA1+/- IPSC foi afetado por um número importante de locais gênicos afetados em comparação ao WT um. Após a filtração do polimorfismo europeu CNV em iPSC WT, apenas 58 locais gênicos foram encontrados afetados (polimorfismo representa 1,69% do total de locais afetados), similarmente nos locais gênicos BRCA1-/+ iPSC 5273 ainda foram afetados após a filtração do polimorfismo. A maioria dos locais gênicos afetados em BRCA1+/-ÍPSC diz respeito ao ganho de DNA.
[00247] Entre esses locais gênicos afetados pela instabilidade genômica, alguns deles são conhecidos como gene de veículo de câncer no banco de dados COSMIC. IPSCs WT mostraram apenas um local gênico de câncer afetado em aCGH (CDK4). O BRCA1-/+IPSC é afetado por alterações relativas a 131 locais gênicos de câncer e entre eles 11 genes são conhecidos por serem afetados no câncer de mama: MSH2, SMARCD1, TBX3, CDH1, TP53, ERBB2, CDK12, BRCA1, PPP2R1A, AKT2, EP300. Essas alterações foram encontradas particularmente superrepresentadas nos pequenos cromossomos 19 e 17: o cromossomo 17, que é o cromossomo dos locais gênicos de BRCA1.
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77/83 [00248] Em conjunto, a maioria dos iPSC BRCA1+/- exibiram uma maior quantidade de indels (deleção ou amplificação) comparados em WT-IPSC. Uma taxa de 8% de CNVs em 5273 genes foi identificada e validada. A análise bioinformática revelou a expressão de 131 genes identificados na base de dados cósmica como envolvidos no desenvolvimento do câncer, essencialmente em leucemias, tumores epiteliais e em células tumorais mesenquimais. Alguns genes alterados são observados similarmente em cânceres de mama e ovário.
[00249] Taxa de replicação, gene de pluripotência (Pluritest, marcadores de superfície celular) e MHC I são mantidos e estáveis durante todo o tempo de cultura na presença de VPA.
[00250] Em conclusão, a deleção ou inativação de genes relacionados ao reparo de DNA, como o BRCA-1, permitem induzir instabilidade genômica, levando a gerar múltiplas CNV, indels e mutações associadas ao MHC I.
EXEMPLO 5 - N-etil-N-nitrosoureia (ENU) aumenta a carga de neoantígenos mutados em CML-iPSCs [00251] Caracterização de iPSC gerada a partir de células sanguíneas leucêmicas de um paciente com leucemia mielóide crônica (CML) positiva para Filadélfia. As iPSC foram geradas pelo uso de transferência de genes de pluripotência Oct4, c-Myc, Klf4 e Sox2 mediado pelo vírus Sendai. As células com morfologia pluripotente de iPSC foram amplificadas e caracterizadas utilizando marcadores de pluripotência de superfície celular (Tra-1-60 e SSEA4) bem como pela sua capacidade de gerar teratoma após injeção intramuscular em camundongos NSG. Estes iPSC abrigavam características do cromossomo Philadelphia de CML. OS CML iPSc foram expostos a ENU durante 60 dias. Colônias de blastos derivados de células de CML-IPS tratados por ENU foram comparados com IPSC não tratados com ENU.
[00252] O DNA de CML iPSC foi analisado pela matriz CGH,
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78/83 várias aberrações genômicas foram observadas em colônias de blastos derivados de iPSC tratadas com ENU com detecção de perda de heterogeneidade entre as aberrações genômicas selecionadas pela pressão de ENU em CLC IPSC (CB32 incluem variações no número de cópias CNVs que compreendiam 332 locais gênicos). Após a filtração na base de dados do polimorfismo genômico caucasiano europeu, 255 locais gênicos ainda estavam presentes nessas aberrações genômicas. A maioria das anormalidades genômicas incluiu perda de DNA genômico (71%) com perda de heterozigosidade (23%). Combinando estas aberrações genômicas com banco de dados de fatores de transcrição, os banco de dados de genes de câncer e pluripotência permitiram observar que esses importantes atores desregulados são afetados principalmente nos cromossomos 7, 8, 15, Y e X. Um Circosplot também permitiu determinar que a maioria destes anormalidades implicadas em fatores de transcrição, tais como MESP implicado na migração de células mesodérmicas e IKZF1. Alguns genes de pluripotência foram afetados, bem como alguns genes de câncer, como IDH2, NCOA2, IKZF1, BLM, que já foram descritos como envolvidos em leucemias Phi-positivas, sugerindo a relevância das anormalidades geradas pela mutagênese induzida por ENU.
[00253] Esta análise mostra que várias alterações gênicas, como ganhos e perdas e várias das anormalidades identificadas, foram identificadas como genes do câncer identificados na base de dados Cosmic.
[00254] A comparação das anormalidades identificadas na ENUIPSC permitiu reproduzir as anormalidades agressivas da fase de leucemia aguda já identificadas em pacientes com CML na fase aguda da leucemia, sugerindo que a CML iPSC tratada com ENU é uma ferramenta única para reproduzir in vitro essas anormalidades genômicas neste câncer específico.
[00255] Ao longo deste pedido, várias referências descrevem o estado da técnica ao qual pertence esta invenção. As divulgações dessas
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79/83 referências são por este meio incorporadas como referência na presente divulgação.
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Claims (19)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uso de uma combinação de (i) um inibidor de deacetilase de histona (HDACi) e (ii) uma composição de vacina caracterizado pelo fato de que contém uma população de células pluripotentes que foram inativadas para a preparação de um medicamento para administração simultânea, separada ou sequencial, para tratamento terapêutico ou profilático de câncer em um sujeito.
  2. 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um humano.
  3. 3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, um HDACi para administração em um período de tempo após a administração da composição de vacina.
  4. 4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a população de células pluripotentes foi obtida por meio de:
    i. expandir células pluripotentes, na presença de condições para manter a capacidade pluripotente das células, na presença de um agente que induz a apresentação de MHC-I a partir de antígenos na referida população durante a etapa de expansão ii. expor as células expandidas a um agente inativador que inativará as células, enquanto mantém a integridade do envelope celular iii. recuperar e condicionar as células inativadas expandidas.
  5. 5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as células da população expressam um antígeno de interesse também expressado pelas células cancerígenas do paciente, e particularmente um neo-antígeno.
  6. 6. Método para produção de população de célula pluripotente que foi inativada, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
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    i. expandir células pluripotentes, na presença de condições para manter a capacidade pluripotente das células, na presença de um agente que induz a apresentação de MHC-I a partir de antígenos na referida população durante a etapa de expansão ii. expor as células expandidas a um agente inativador que inativará as células, enquanto mantém a integridade do envelope celular iii. recuperar e condicionar as células inativadas expandidas.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a população de células pluripotentes é selecionada a partir do grupo que consiste em: células-tronco embrionárias humanas, célulastronco pluripotentes induzidas (iPS), células-tronco alogênicas, xenogênicas, autólogas e singeneicas.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que as células pluripotentes são expostas a um agente mutagênico durante a expansão, de modo a induzir a mutagênese de genes em células da referida população.
  9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente que induz a apresentação de MHC-I a partir de antígenos e melhora o gene pluripotente é um inibidor de deacetilase de histona (HDACi).
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o inibidor de deacetilase de histona é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido Valpróico (VPA), Vorinostat, Panobinostat, Givinostat, Belinostat, Entinostat, Mocetinostat, Pracinostat, Chidamide, Quisinostat e Abexinostat.
  11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 10, caracterizado pelo fato de que um inibidor de DNA metiltransferase, particularmente 5-azacitidina, está presente na etapa a).
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  12. 12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 11, caracterizado pelo fato de que as células são inativadas por exposição a uma dose letal de radiação.
  13. 13. Composição de vacina de câncer, caracterizada pelo fato de que compreende:
    a. uma população de células pluripotentes inativadas e
    b. um inibidor de deacetilase de histona.
  14. 14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que as células pluripotentes contêm células pluripotentes mutagenizadas.
  15. 15. Preparação combinada de i) uma população de células pluripotentes inativadas e ii) um composto que ativa a expressão e/ou resposta imunológica a MHC para preparação de um medicamento para administração simultânea, separada ou sequencial, para tratamento de um sujeito sofrendo de um câncer.
  16. 16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a população de células pluripotentes é selecionada a partir do grupo que consiste em: células-tronco embrionárias humanas, célulastronco pluripotentes induzidas (iPS), células-tronco alogênicas, xenogênicas, autólogas ou singeneicas.
  17. 17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a
    16, caracterizado pelo fato de que as células pluripotentes são modificadas geneticamente para sobre-expressar compostos que estimulam a expressão e/ou resposta imunológica de MHC.
  18. 18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 15 a
    17, caracterizado pelo fato de que as células pluripotentes foram tratadas com um agente mutagênico.
  19. 19. Uso, de qualquer uma das reivindicações de 15 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, a
    Petição 870190006739, de 22/01/2019, pág. 17/18 administração de um inibidor do ponto de verificação imunológico ao paciente.
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