JP2024514024A - ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジンおよびベネトクラクスの併用療法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＤＮＭＴ１阻害剤を含む多標的阻害剤である４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン（４’－ｔｈｉｏ－５－Ａｚａ－２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）およびアポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を媒介するＢＣＬ－２の阻害剤であるベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）の併用療法に関する。

Description

本発明は、ＤＮＭＴ１阻害剤を含む多標的阻害剤である４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン（４’－ｔｈｉｏ－５－Ａｚａ－２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）およびアポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を媒介するＢＣＬ－２の阻害剤であるベネトクラクス（Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）の併用療法に関する。

ヌクレオシド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）誘導体は、我々の体を構成する細胞の最も核心的な機能（複製／分裂による生命機能維持）を行うＤＮＡとＲＮＡの構成成分と非常に似た構造の有機化合物であって、抗癌化学療法／抗ウイルス化学療法などで中心的な役割を果たしている。

１９６０年代以降、Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ、Ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ、Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ、５－Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅを含む）、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ、Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ、Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅなどの様々なヌクレオシド系抗癌剤が商用化され（図４）、このうち、多数の抗癌剤がＷＨＯのＥｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｌｉｓｔに属する程に主要抗癌剤Ｃｌａｓｓとして分類されている。

デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ（登録商標）または５－Ａｚａ－２’－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎとも呼ばれる）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を阻害し、ＤＮＡ低メチル化を誘導するシチジンのピリミジンヌクレオチド類似体である。具体的には、デシタビンは、複製時、ＤＮＡ鎖に組み込まれることによって機能し、ＤＮＭＴ１のようなＤＮＡメチルトランスフェラーゼがＤＮＡに結合し、娘鎖にメチル化を複製する場合、ＤＮＭＴはデシタビンに不可逆的に結合されて分離することができない。したがって、デシタビンの作用は、細胞分裂に依存的である。薬が作用するには細胞が分裂する必要がある。そのため、身体の他のほとんどの細胞よりもはるかに速く分裂する細胞（例：癌細胞など）は、デシタビンの影響をより厳しく受ける。換言すると、ＤＮＡ過メチル化が発達に重要な骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む白血病のような癌の治療にデシタビンが使用される。

既存のヌクレオシド系抗癌剤は、癌細胞だけでなく、急速に分裂する正常細胞である骨髄／胃腸管、粘膜／皮膚細胞などにも作用するため、副作用として（ｉ）アザシチジン（ＶｉｄＡｚａ）の場合、Ｎａｕｓｅａ（吐き気）、Ａｎｅｍｉａ（貧血）、Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ（血小板減少症）、Ｖｏｍｉｔｉｎｇ（嘔吐）、Ｐｙｒｅｘｉａ（発熱）、Ｌｅｕｋｏｐｅｎｉａ（白血球減少症）、Ｄｉａｒｒｈｅａ（下痢）、Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｅｒｙｔｈｅｍａ（注射部位紅斑）、Ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ（便秘）、Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ（好中球減少症）、Ｅｃｃｈｙｍｏｓｉｓ（斑状出血）、Ｐｅｔｅｃｈｉａｅ（点状出血）、Ｒｉｇｏｒｓ（悪寒）、Ｗｅａｋｎｅｓｓ（倦怠感）、Ｈｙｐｏｋａｌｅｍｉａ（低カリウム血症）がみられ、および（ｉｉ）デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ）の場合、Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ（好中球減少症）、Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ（血小板減少症）、Ａｎｅｍｉａ（貧血）、Ｆａｔｉｇｕｅ（疲労）、Ｐｙｒｅｘｉａ（発熱）、Ｎａｕｓｅａ（吐き気）、Ｃｏｕｇｈ（咳）、Ｐｅｔｅｃｈｉａｅ（点状出血）、Ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ（便秘）、Ｄｉａｒｒｈｅａ（下痢）、Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ（高血糖）がみられる。このため、使用量が制限されることで、各種耐性メカニズムが発生し、治療効果が制限される問題点がある。

我々の体の遺伝子は、細胞毎に同じ塩基配列を有しているが、我々の体の細胞は、特定の組織によって互いに異なる遺伝子のみが発現され、他の遺伝子は発現されないように非常に精密に調節されている。

このような後成的調節を行う作用機序を後成遺伝学作用機序（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）といい、この機序は（１）ＤＮＡの変化、（２）ＤＮＡと物理的に結合し、クロマチン構造をなすヒストンの変化、（３）その他のクロマチン構造をなす他の成分の変化からなる。

このうち、ＤＮＡメチル化は、最も源泉的な後成遺伝学作用機序として、Ｇｅｎｅ Ｂｏｄｙ、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｅｎｈａｎｃｅｒなど様々な遺伝子の構成要素の中からＣｐＧ配列のＣの塩基をメチル化して、遺伝子の発現程度を調節する。一般に、ＣｐＧ配列は、プロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）領域に多く存在し、プロモーターにＣｐＧメチル化がかなり進行した遺伝子は発現され難い。逆にＣｐＧメチル化があまり進行していない遺伝子は活発に発現される（図１）。

我々の体において、ＤＮＡメチル化は、次の２つの段階からなることが知られている：（１）ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＤＮＭＴ）３Ａまたは３Ｂが、組織の分化および発生段階において、ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡをメチル化し、各組織別に遺伝子発現のパターンを決定する；（２）ＤＮＭＴ１が組織を構成する各細胞が既に確立したＤＮＡメチル化パターンを忠実に複製し、ＤＮＡをメチル化する。

一般的な細胞では、ＤＮＡメチル化が多く進行した領域において、ＤＮＭＴ１が他のタンパク質、特に遺伝子発現を抑制するヒストンタンパク質およびその他のＲｅｐｒｅｓｓｏｒタンパク質と結合して、遺伝子発現が起こりにくい構造を形成し、これによって遺伝子発現を抑制する。逆に、ＤＮＡメチル化があまり進んでいない場合には、遺伝子が発現し易い構造を形成し、遺伝子発現を促進させる。ＤＮＡメチル化は、このように我々の体の各細胞が決まった機能をうまく果たせられるように細胞ごとに定められた遺伝子の組み合わせをスムーズに発現させる上で重要な役割を担う。したがって、これらの機能に異常が生じると、多様な疾病の発症につながる。

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄に発生する癌であり、骨髄を構成する造血幹細胞のうち、未熟な白血病細胞（Ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｂｌａｓｔ）を産生するクローンが、正常に多様な血液細胞を産生するクローンの数を圧倒し、血液は正常に機能しない白血病芽細胞（Ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｂｌａｓｔ）でいっぱいになる。最終的には血液の機能不全により死亡に至る病気である。

我々の体の正常な造血過程は、次のような過程からなる。（１）造血幹細胞が血液細胞を生産するように刺激されると、（２）造血幹細胞が、１段階で急速に分裂して、十分な数の血液細胞を生産できる前駆細胞に分化するようになり、（３）前駆細胞が分裂して、十分な数の前駆細胞が生成された後、（４）２段階でこれ以上の分裂／増殖が停止し、それぞれが独自の機能を持ち、（５）これ以上分裂しなくなった機能細胞として成熟する過程を経ることになる（図２）。

この過程で主な役割をするのは、マスター転写因子（Ｍａｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（Ｍａｓｔｅｒ ＴＦ））であり、１段階で造血幹細胞が刺激されると、ＣＥＢＰ／ａｌｐｈａなどの前駆細胞を生成するマスター転写因子が強く作用し、十分な数の前駆細胞が生成されるようにする。その後、十分な数の前駆細胞が生成されると、２段階に入って、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎのようなＭａｓｔｅｒ ＴＦが生成される。２段階におけるＭａｓｔｅｒ ＴＦは、１段階におけるＭａｓｔｅｒ ＴＦを分解し、それ以上の急速な分裂／増殖が起こらないようにし、決められたプロセスに従って細胞の成熟を誘導する。

ＭＤＳおよびＡＭＬでは、この転移過程を主導する２段階におけるＭａｓｔｅｒ ＴＦの遺伝子プロモーターが、色んな原因で過メチル化されることに伴い、この２段階におけるＭａｓｔｅｒ ＴＦの発現が低下している。その結果、前駆細胞は、成熟段階に進むことができず、持続的に分裂／増殖を続け、絶えず未成熟細胞を作り出すことになる。この過程がさらに進むと、いくつかの突然変異（ＦＬＴ３－ＩＴＤなど）が蓄積して、急速に進行する悪性ＡＭＬに変わって患者が死亡に至ることになる。

ＭＤＳ／ＡＭＬの相当数が、ＤＮＭＴ１が過活性化して、異常なメチル化パターンが発生し、逆にＤＮＭＴ１の阻害を通じて、後成遺伝学作用機序を正常化することにより、このような疾病を治療することができることが確認された（図３）。

Ｍａｓｔｅｒ ＴＦ遺伝子のプロモーター過メチル化の原因としては、ＤＮＭＴ系酵素の異常（過剰発現、過活性化、欠失／変異（ｄｅｌｅｔｉｏｎ／ｍｕｔａｔｉｏｎ）など）によるメチル化パターンの変化、ＩＤＨ１／２酵素の異常によってメチル化パターンの除去が困難になって発生するパターンの異常、ＴＥＴ酵素の異常によるメチル化パターンの除去が難しくなって発生するパターンの異常、高齢による後成遺伝学的変化の蓄積など多様な原因がある。いずれの場合でも、細胞が成長／分裂／生存維持過程で、メチル化パターンをそのまま維持するＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＭａｃｈｉｎｅｒｙであるＤＮＭＴ１の活性化を阻害すれば、過メチル化パターンの解消が可能であり、これによりＭＤＳ／ＡＭＬの治療効能をもたらすことが確認された。

ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）またはＡＬＬ（急性リンパ性白血病）の治療過程および方法は、疾病の分類、患者の年齢と健康状態などによって異なるが、一般的な標準治療法（ＳｏＣ、ｔａｎｄａｒｄ ｏｆ ｃａｒｅ）は、がんを切除する手術が伴う固形がんとは異なり、抗癌剤を用いて芽球（ｂｌａｓｔ）を減少させるための化学療法による誘導療法（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、完全寛解に到達後に施行する地固め療法（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、寛解状態を維持する維持療法（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｔｈｅｒａｐｙ）などで主に構成され、特に治療が緊急な重症患者の場合、骨髄移植（ＨＣＴ、ｈｅｍａｔｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）という最も効果が良い方法を実施することもできるが、強力な化学療法や放射線治療を通じて患者の異常な骨髄を完全に除去してから行うことができる治療法であるため、体調の優れない高齢患者の場合、実施可能性が非常に制限的である。

血液癌、すなわち、骨髄の病気を起こしうる遺伝子変異の可能性は、加齢（ａｇｉｎｇ）によって顕著に増加するため、年齢そのものが白血病、特にＡＭＬおよびＭＤＳの最も主要な危険因子（ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ）といえるが、身体状態が良好な比較的若年層の患者に比べて、基礎疾患などの色々な要因により身体機能が弱まった状態の高齢者患者の場合、毒性の強い既存の化学療法による標準治療法を適用しにくい場合がほとんどであり、たとえ化学療法を通じた治療を経ても、予後が良くない場合が多く、再発が頻繁で、早期死亡率が非常に高い。

ＭＤＳ／ＡＭＬ細胞（細胞株または患者由来サンプル）にＤＮＭＴ１阻害剤であるデシタビン／アザシチジン処理時、２段階におけるＭａｓｔｅｒ ＴＦであるＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎプロモーターの過メチル化が減少するとともに、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎが発現され、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎのｄｏｗｎ－ｓｔｒｅａｍ ｅｆｆｅｃｔｏｒであるｐ２７などの癌抑制遺伝子が発現され、抗癌効能を示す。

既存の商用化された２種のＤＮＭＴ１阻害剤Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ＶｉｄＡｚａ（アザシチジン）は、高齢患者群のＭＤＳ／ＡＭＬ治療のための標準治療剤として使用されているが、不十分な効能、高い毒性、投与経路（ＩＶまたは皮下注射）による使用利便性上の問題、適応症拡大によるＤＮＭＴ１阻害剤市場の拡大などいくつかの問題が指摘された。

一方、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の多くは、Ｂ細胞性起源を有するＢ－ＡＬＬであるが、一部はＴ細胞性細胞に起源を有するＴ－細胞性ＡＬＬ（以下Ｔ－ＡＬＬ）であり、Ｔ－ＡＬＬの場合、適切なｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙの開発が制限されているので、一次化学療法治療以後には治療オプションが制限されている。

成人ＡＬＬの治療は、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｅ、Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ、Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅなどに基づいた高強度化学抗癌療法が一次治療オプションである。

約３０～４０％の患者は、このような高強度化学抗癌療法にもかかわらず、再発または耐性を獲得し、このような再発／耐性患者のうち、Ｂ細胞性ＡＬＬ患者の場合、抗体治療剤、ＡＤＣ、ＣＡＲ－Ｔなどの多様な治療オプションが存在することに比べて、Ｔ－ＡＬＬ患者の場合、Ｎｅｌａｒａｂｉｎｅに治療剤が限られているので、新しい治療剤の開発に対する要求が高い。

Ｔ－ＡＬＬの場合、多様な細胞傷害性抗癌剤を組み合わせたｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙを活用する治療に多くの患者が良好な反応を示すが、標準治療の活用にもかかわらず、耐性が発生したＴ－ＡＬＬの場合は、適切な治療法がないので、新しい治療法の開発に対する要求が非常に高い。このような耐性患者の一部では、ＢＣＬ－２などの抗アポトーシス遺伝子（Ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｇｅｎｅ）の過剰発現によって耐性が発生するものと把握され、試験的にＤＮＭＴ１阻害剤（デシタビンなど）とベネトクラクスとの組み合わせによる治療が試みられており、優れた治療シナジー効果が確認されたことがある。

ただし、Ｔ細胞性ＡＬＬの治療に既存のヌクレオシド系抗癌剤が適用され、耐性患者の場合、ヌクレオシド代謝耐性が発生する可能性が高く、既存のデシタビンを超えて、代謝耐性を含む様々な耐性機序を克服できる新しいＤＮＭＴ１阻害剤の開発に対するニーズが高い状況である。

市場に出荷されたＤＮＭＴ１阻害剤活性成分であるデシタビン、アザシチジンをベースに様々な薬品（注射剤、経口剤、各用途に応じて活用）が市場に発売されている。

図４に示すような化学構造のデシタビン／アザシチジン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ／Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）の両成分は、いずれも細胞内でデシタビントリホスフェート（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の形態で活性化された後、ＤＮＡに組み込まれ（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、次いでＤＮＭＴ１酵素をトラップ（ｔｒａｐｐｉｎｇ）し、ＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｄｄｕｃｔを形成する。その後、生成されたａｄｄｕｃｔの分解によるＤＮＡ損傷修復（ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｐａｉｒ）の修復過程で発生する様々な細胞内シグナル伝達経路によって過メチル化除去および各種抗癌効能を示すメカニズムを有しているが、（１）デシタビン／アザシチジンの両成分が、いずれも我々の体に存在するシチジンデアミナーゼ（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）による代謝に脆弱で、ＰＫプロファイル（ＰＫ ｐｒｏｆｉｌｅ）が不安定な問題で効力が制限される短所があり、（２）ＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔの形成を通じてＤＮＡ損傷を与えるため、癌細胞だけでなく、骨髄／胃腸管粘膜など、我々の体の正常組織にも損傷を与える問題があり、使用量が制限されるにつれて抗癌効力に限界があり、（３）初期治療以後に生き残った癌細胞では、ＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔ形成後に除去過程の過活性化に伴い抗癌効能が抑制される問題があり、耐性発生に脆弱な様子を示すなどの問題があり、改良新薬の開発が強く要求される状況である。

デシタビン／アザシチジンの場合、我々の体に存在するシチジンデアミナーゼによる代謝に脆弱で、ＰＫプロファイルが不安定な問題により効力が制限される短所がある。

シチジンデアミナーゼによる代謝のためには、デシタビン／アザシチジン構造における５’－ＯＨ基と３’－ＯＨ基が全部露出していなければならないことに着目し、Ａｓｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｏｔｓｕｋａでは、デシタビン（ Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）の３’－ＯＨ基にｄｅｏｘｙｇｕａｎｉｄｉｎｅを連結した構造のデシタビンプログラッグ（Ｐｒｏｄｒｕｇ）、ＳＧＩ－１１０を開発した。ＳＧＩ－１１０は、実際に人体に投与時、シチジンデアミナーゼによる代謝を避け、デシタビン成分を持続放出（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅａｓｅ）して改善されたＰＫプロファイルを示すことが確認されたが、このような改善されたＰＫプロファイルが実際の薬理効能の改善につながらないという限界が確認された。

シチジンデアミナーゼによる代謝問題を解決するための方法として、シチジンデアミナーゼ阻害剤を共に服用する経口投与剤（ＡＳＴＸ－７２７）または過量のアザシチジン（Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を投与し、ＰＫプロファイルを安定化する方式の経口投与剤（ＣＣ－４８６）のような改良新薬が開発されたが、これらも同様に上記したデシタビン／アザシチジンの問題のうち（２）および（３）に対する解決策を提供することができない実情である。また、シチジンデアミナーゼ阻害剤の併用による活性成分（デシタビン）薬効低下の問題、過剰薬物投与による胃腸関係副作用などの問題を有しており、このような問題点を解決することができる新規なＤＮＭＴ１阻害剤の開発が必要な状況である。

現在、高齢ＭＤＳ／ＡＭＬ患者の治療のために、デシタビン／アザシチジンまたはこれらの治療剤とベネトクラクスの併用療法が標準として使用されているが、薬物の単独投与時、約４０％の患者でのみ制限された治療反応を得ることができ、併用投与時にも約６５％の患者でのみ治療反応を得ることができる問題、速い耐性の問題、デシタビン／アザシチジンの２つの薬物間の交差耐性の問題などがある。

また、高齢者ＭＤＳ／ＡＭＬの場合、一般的なＭＤＳ／ＡＭＬには多様な標的抗癌剤／免疫抗癌剤／細胞治療剤などが開発されているのに対し、適用可能な開発技術が限定的であり、再発性Ｔ－ＡＬＬ、白金系抗癌剤耐性卵巣がん／膀胱癌などの技術分野でも適用可能な開発技術が限定的である。

上記したＤＮＭＴ１阻害剤関連の問題点を解決するために、本発明はＤＮＭＴ１阻害を含む多標的阻害剤である４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン（４’－ｔｈｉｏ－５－Ａｚａ－２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）およびアポトーシスを媒介するＢＣＬ－２の阻害剤であるベネトクラクスの併用療法を提供する。

本発明の第１態様は、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクスの薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、前記両薬物ともに同一の剤形または相異する剤形で併用－投与される、薬学的組成物を提供する。

本発明の第２態様は、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、前記両薬物ともに被験者に同じ経路または相異する経路を介して投与されることを意図する薬学的組成物を提供する。

本発明の第３態様は、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、前記両薬物が共に被検者に非経口投与または経口投与として投与されることを意図する薬学的組成物を提供する。

本発明の第４態様は、同時にまたは順次投与される４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス薬物を含む、癌の治療または予防のための薬学的組成物を提供する。

本発明の第５態様は、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、ベネトクラクス薬物と同時に投与される薬学的組成物を提供する。

本発明の第６態様は、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、ベネトクラクス薬物と順次投与される薬学的組成物を提供する。

本発明の第７態様は、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス薬物を含むキット（ｋｉｔ）を提供する。

第１態様から第７態様において、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、８ｍｇ／日以上３２ｍｇ／日未満で投与されることができる。

第１態様から第７態様において、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ｄｏｓｅ、ＭＴＤ）の７５％用量以下、好ましくは２５％用量～７５％用量であり、より好ましくは２５％用量～５０％用量で投与されることができる。

第１態様から第７態様において、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、濃度依存的にＤＮＭＴ１タンパク質を減少するか、ＤＮＭＴ１を阻害することができる。

第１態様から第７態様において、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、ＤＮＡ損傷修復法の一つであるＢＥＲ（塩基除去修復；Ｂａｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ）を過活性化する耐性発生機序が作動しないようにする高い投与量で投与することができる。このとき、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する強い抵抗性によって耐性発生メカニズムで過活性化されたＢＥＲ（塩基除去修復）修復過程の効率または速度を下げて耐性発生メカニズムを克服することができる。

第１態様から第７態様の薬学的組成物またはキット内の薬物は、ＤＮＭＴ１阻害剤によって耐性が発生した患者群；正常細胞に比べて癌細胞に後成遺伝学的ＤＮＡメチル化パターン変化が蓄積された患者群；ＤＮＭＴ１阻害剤を投与したときに、予後不良または耐性発生の可能性に関する情報提供または診断を受けた患者群；健常人に比べてＣＥＢＰ／ａｌｐｈａ、Ｐｕ．１およびＧＡＴＡ ｆａｃｔｏｒｓからなる群から選択されるｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒ転写因子を高い水準で発現する一方、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎまたは後期発達段階の転写因子の発現は、各遺伝子の過メチル化によって低く維持される患者群；ヌクレオシド系抗癌剤の投与時、ヌクレオシド代謝耐性が発生する可能性がある患者群；白金系抗癌剤の投与対象患者群；白金系抗癌剤に対して耐性が発生する可能性があるまたは耐性が発生した患者群；および／または健常人対比癌抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）および／またはＳＬＦＮ１１に対する後成遺伝学的にサイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）された患者群に投与することができる。

このとき、予後または耐性発生の可能性に関する情報提供は、（ｉ）ＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔ形成後、除去過程が過活性化されることに伴い抗癌効能が抑制される問題を数値化したり、（ｉｉ）上記問題発生の有無／程度によって患者群を分類化したりしたものから導き出されたものであることができる。例えば、予後不良の情報提供のデータ値は、症状再発の可能性および／または早期死亡率（平均生存期間の１年未満）であることができる。

第１態様から第７態様において、ＤＮＭＴ１阻害剤の投与時、ＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔ形成を通じてＤＮＡ損傷を与えるため、癌細胞だけでなく正常組織にも損傷を与える問題によって、標準治療剤であるＤＮＭＴ１阻害剤の標準投与量が制限される患者群に標的抗癌剤として４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物を、上記制限された標準投与量以上で投与することができる。

第１から第６態様の薬学的組成物は、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）またはＡＬＬ（急性リンパ性白血病）と診断された患者群、白金耐性再発性末期卵巣癌の患者群または白金耐性転移性膀胱癌の患者群、転移性膀胱癌の患者群、治療対象細部バイオマーカーであるｐ５３変異膀胱癌の患者群またはｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＬＦＮ１１膀胱癌の患者群、または３期または４期として卵巣癌と診断された患者群に投与することができる。特に、慢性骨髄細胞白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃａｌ ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ）の患者群、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｔ－ＡＬＬ）の患者群、慢性リンパ性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）の患者群、ゲノム異常がある高危険患者群、再発したｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＡＭＬ（ｓＡＭＬ）の患者群、過去の治療履歴に起因したｔ－ＡＭＬ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ＡＭＬ）の患者群、薬物耐性／不応性患者群に投与することができる。

以下、本発明を説明する。

本明細書において、薬物とは、疾病の診断、治癒、緩和、治療または予防のために用いられたり（食品または機器を除く）、身体構造または機能に影響を与えるために用いられたりするすべての物質である。例えば、身体および身体代謝に影響を及ぼすすべての化学的または生物学的物質である。薬物の化学名は、薬物の原子または分子構造を表す。

薬物がイン・ビボで効果的に作用するためには、薬物の体内濃度が一定期間以上治療効果範囲（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒａｎｇｅ）内に維持されなければならない。薬物が体内に過剰に存在すると毒性が現れ、量が少なすぎる場合には、治療効果が現れない。

薬物効能とは、対象適応症に効果を示す期待時間の間、分解されないで体内に残っていることを意味する。代謝速度が低ければ血中濃度維持時間が長くなるため、効能持続時間が長くなる。

身体を構成している基本単位である細胞は、組織の恒常性を維持するために細胞分裂と死を調節するが、このうち、能動的な死をアポトーシスまたはプログラム細胞死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）という。こうしたアポトーシスは、細胞内に本来から存在していた自殺メカニズムが細胞の内部と外部の刺激によって活性化され、計画した通りに自ら死滅する現象であり、細胞の壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）とは異なり、死んでいく細胞の内容物が細胞外に遊離されず、他の細胞に損傷は与えない。形態学的には、細胞の比重の減少と細胞膜の破壊および染色体の凝縮と共に死滅体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ）の形成と共に食細胞の作用を経る作用を意味し、生化学的には染色体ＤＮＡが大きな断片から小さな断片に分かれるＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを意味する。

一般に、アポトーシス機序は、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）と呼ばれるタンパク質分解酵素によって細胞内タンパク質が分解されると同時にシグナルが伝達される一連の過程であって、幾種類のカスパーゼがアポトーシスと関連している。カスパーゼ－８は、ＴＮＦ－αまたはＦａｓ ｌｉｇａｎｄのようなアポトーシス誘導物質によって活性化され、一連の他のカスパーゼを活性化させると同時にアポトーシスを誘発させる。一方、アポトーシスの過程で、シトクロムｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ）は、ミトコンドリア膜に存在する通路を通じて放出され、通路を構成しているＢＣＬ－２系タンパク質によって調節される。放出されたシトクロムｃは、Ａｐａｆ－１、カスパーゼ－９、ｄＡＴＰと結合し、カスパーゼ－９を活性化させ、カスパーゼ－９によってカスパーゼ－３を活性化させて、アポトーシスを誘導することが報告されている（図９）。

腫瘍の成長を決定するには２つの要素があるが、まずは細胞の増殖であり、他の面は細胞の死滅である。細胞毒性物質によって腫瘍細胞の細胞周期が停止すれば、アポトーシスによって腫瘍細胞が死ぬことになる。

図９に示すように、Ｂ細胞リンパ腫（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＢＣＬ）－２は、アポトーシスを媒介する。

癌治療法が複種類のアポトーシスを誘発するが、発がん性キナーゼ阻害剤と細胞毒性物質による治療効能には、ＢＣＬ－２によって調節されるアポトーシスパスウェイ（ｐａｔｈｗａｙ）の活性化が最も核心的である。しかし、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌのアポトーシスパスウェイの欠陥は、色々な癌が細胞毒性薬物に対して耐性を示すようにする。

ＢＣＬ－２過剰発現は、腫瘍細胞の生存を媒介する慢性リンパ性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＬＬ）細胞において実証されており、化学療法剤に対する耐性に関連している。

ベネトクラクスは、抗アポトーシスタンパク質であるＢＣＬ－２の強力で選択的な低分子阻害剤である。すなわち、ベネトクラクスは、アポトーシス誘導抗癌剤である。ベネトクラクスは、ＢＣＬ－２のＢＨ３－結合溝に直接結合し、ＢＩＭのようなＢＨ３モチーフ含有プロアポトーシスタンパク質に代えて、これによりＢＣＬ－２に結合しないＢＩＭは、ミトコンドリア外膜透過性（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ＭＯＭＰ）、カスパーゼ活性、およびアポトーシスを開始する（図９）。非臨床試験において、この薬はＢＣＬ－２が過剰発現された腫瘍細胞に対して細胞毒性を示した。

近年、ＡＭＬ治療剤の標準療法が既存のデシタビン／アザシチジンの単独投与から、これらの薬物をＢＣＬ－２の阻害剤であるベネトクラクス（商品名：Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ）と併用することに変更されている。そこで、本発明者らはデシタビン／アザシチジンの代わりに、下記化学式１のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの場合、ベネトクラクスの薬物と併用投与時の薬効を比較評価した。

その結果、驚くべきことに、ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株をｍｉｃｅにｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｍｐｌａｎｔしたｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）は、臨床的に適切な濃度（ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）で単独処理した時にも強力なｐ５３ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎを通じてＳｕｒｖｉｖｉｎ、Ｍｃｌ－１などの抗アポトーシスタンパク質の発現量を低下させて、アザシチジン／ベネトクラクスの併用投与と同等またはより優れた抗癌効能を示すだけでなく、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄとベネトクラクスの併用投与時に非常に低い薬物投与量でもアザシチジン／ベネトクラクス（Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ／Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘの併用投与に比べて強い癌の増殖抑制効力を示すなど（Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ ０．５ｍｐｋ投与群から完全な腫瘍退縮（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を誘導））の非常に強力な抗癌効能を見出した（図２８～図３３）。このことから、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄとベネトクラクスを両方ともに併用投与した時、抗アポトーシスタンパク質（ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）の作用を抑制することを推測することができる。本発明は、これに基づいて完成した。

本発明において、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ薬物と併用投与される薬物は、ＢＣＬ－２の阻害剤である限り、下記化学式２の化合物（ベネトクラクス）に限定されず、本発明の範疇に属する。

本発明は、ベネトクラクス薬物との併用治療のためのＤＮＭＴ１阻害剤であって、既存のヌクレオシド系抗癌剤の作用機序およびその耐性作用機序であるＤＮＡ損傷修復活性化機序の解析に基づいて、化学式１のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを選択したことが特徴である。

抗アポトーシスタンパク質の作用を阻害するＤＮＭＴ１阻害剤は、既存のデシタビン／アザシチジンの耐性を克服する非常に有望なアプローチとなり得る。したがって、本発明は、多重薬理学的アプローチにより、主要薬物標的であるＤＮＭＴ１の強力な阻害と、既存の耐性発生機序であるエンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）による加水分解を同時に遮断し、強力な抗癌効能を示すｗｅｌｌ－ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｍｕｌｔｉ－ｔａｒｇｅｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを分子設計する過程で、ＤＮＭＴ１阻害剤として、化学式１のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを選定して、ベネトクラクス薬物との併用治療に使用しようとするものである。

化学式１のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、４－チオ－２－デオキシリボース骨格に基づくＤＮＭＴ１阻害剤であって、ｓｕｇａｒ構造の変化（４’－チオデオキシリボース構造；４’－ｔｈｉｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）とＡｚａ－ｃｙｔｏｓｉｎｅ基を同時に有している。分子モデリングの結果、チオーデオキシリボース基盤のヌクレオシド化合物がＤＮＡに挿入された後、他のＤＮＡ構成成分に大きく影響を及ぼさないことが確認された。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、細胞内でトリホスフェート（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）で活性化され、ＤＮＡ合成時に一部のｄＣ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）に代わって用いられ、ＤＮＡ合成後にＤＮＭＴ１をトラップして様々な後成遺伝学的作用機序を活性化することによって、癌アポトーシスを誘導するヌクレオシド系抗癌剤である。特に、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、癌細胞内で急速に活性化され、ＤＮＡに組み込まれ、低濃度でもＤＮＭＴ１酵素をトラップして良好に阻害することができる。

図５に示すように、ヌクレオシド系抗癌剤は、ＤＮＡ取り込み後、多様な作用機序（ＤＮＡ合成／転写阻害、ＤＮＡ損傷誘導またはＤＮＭＴ１などのＤＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ関連酵素の阻害による薬理効力発現）によって抗癌効能を発揮する。

図６に示すように、ヌクレオシド系抗癌剤は、ＤＮＡ取り込みの際に正常なＤＮＡ構成成分と合わない塩基対（Ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成し、ＤＮＡに異常な構造が発生し、これをＤＮＡ損傷修復法のうち、ＢＥＲ（塩基除去修復）が認知し、ＤＮＡ損傷修復が進行される。

ヌクレオシド系抗癌剤の投与初期には、ＤＮＡに抗癌剤が組み込まれてから十分な薬理効能が発揮され、癌細胞が効率よく死滅する様子を示すが、抗癌剤の投与が続くとＢＥＲが過活性化され、この抗癌剤が十分な効力を奏する前に除去されて、抗癌剤に対する耐性が発生することになる。

したがって、既存のヌクレオシド系抗癌剤と同等以上の効率でＤＮＡに組み込まれ、所望の薬理効能を良好に発現しながらもＢＥＲに抵抗性を有する新しいヌクレオシド系化合物が開発されれば、既存の抗癌剤に比べて強い効能を示すことが期待される点に着目し、本発明は、ベネトクラクス薬物との併用療法に使用可能なＤＮＭＴ１阻害剤として、化学式１のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを選定した。

ＢＥＲの最初の段階は、ヌクレオシド／ヌクレオチドにあるＧｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄを切断し、Ｂａｓｅのない部位を作成し、エンドヌクレアーゼを通じてＤＮＡ損傷の修復が行われる部位を作成することである。その後、様々な酵素が反対側の塩基情報を利用して、相補的な他の塩基成分が補充されることによってＤＮＡの損傷が修復される（図６）。

ＢＥＲ修復プロセスの速度および効率を決定するのは、異常な塩基対を認識した後にＣ－Ｎ結合を切断する段階と、ＡＰ－エンドヌクレアーゼによってギャップを有するヌクレオチドの位置を作る段階である。この段階のうち１つ以上の進行を困難にすれば、ＢＥＲの効率を低下して、ＢＥＲの過活性化による耐性発生を抑制することができる。

４－チオ－２－デオキシリボース骨格を有するヌクレオシド化合物が、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ鎖切断に抵抗性を有しており、その機序がＤＮＡ－損傷修復パスウェイの第一段階に相当するため、４－チオ－２－デオキシリボース骨格のＤＮＭＴ１阻害剤は、抗アポトーシスタンパク質とＤＮＡ－損傷修復パスウェイによる薬物耐性を克服することができる。したがって、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）は、４－チオ－２－デオキシリボース骨格による既存のＤＮＭＴ１阻害剤に比べて強力な抗癌効能／耐性を克服する可能性を有している（実施例１および実施例２）。

一方、ＢＥＲ作用機序は、癌細胞では、耐性発生の機序として作用するが、逆に正常組織（特に骨髄などの造血組織）では、抗癌剤による毒性を防ぐ安全装置として機能するため、ＢＥＲを阻害する抗癌剤は癌細胞のみに選択的に伝達される必要性が高まっている。

ヌクレオシド系抗癌剤は、細胞内に入った後、多様なヌクレオシドキナーゼによって活性化されて細胞内に蓄積され、適当な時間内に活性化されなかったヌクレオシド化合物は速やかに除去される。正常細胞と癌細胞における活性化速度の差を極大化することができれば、癌細胞にのみ活性型薬物を蓄積することによって優れた安全性を確保することができる。

従来の文献によると、様々なヘテロ原子で置換されたヌクレオシドの場合、互いに異なる速度で活性化されたり、代謝によって除去されたりすることができるが、このうち、チオーデオキシリボースの場合、正常細胞では比較的ゆっくりと活性化されるのに対し、格別に癌細胞では一般的なデオキシリボース基盤のヌクレオシドと同等以上の速度で活性化され、ＤＮＡ合成の際に使用され得ることが確認された。これは正常細胞に比べて癌細胞に相対的に多く蓄積する選択的薬物伝達効果を示すことができる。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、従来のデオキシリボース骨格を改良したチオーデオキシリボース骨格の活用で、従来のデシタビンなどのデオキシリボース基盤のヌクレオシドに比べて癌細胞では急速に活性化され、ＤＮＡに効率的に組み込まれるが、正常な骨髄細胞を含む正常な臓器内では、ゆっくりと活性化されることによって癌細胞の選択的な薬物送達が可能になり；シチジンデアミナーゼと呼ばれるヌクレオシド抗癌剤の主要な代謝酵素に比較的ゆっくりと影響を受けることによって代謝関連耐性を克服する可能性を確保することができるだけでなく、ＤＮＭＴ１酵素をうまくトラップできるアザシチジン官能基を通じてＤＮＡ取り込みおよびＤＮＭＴ１トラップ後、より長く持続するＤＮＡ－ＤＮＭＴ Ａｄｄｕｃｔを形成して、より強力で差別化された効果を確保しました。

図４に示すような化学構造のデシタビン／アザシチジンとは異なり、化学式１のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、チオ－ヌクレオシド構造によって主要薬標的であるＤＮＭＴ１の強力な阻害と既存の耐性発生機序であるエンドヌクレアーゼによる加水分解を同時に遮断し、強力な抗癌効能を示すだけでなく、シチジンデアミナーゼによる代謝耐性はもちろん、経口投与でも優れたＰＫプロファイルを有することを確認し、血液がんおよび固形がん（卵巣がん／膀胱がん）に適用可能であることを確認した（実施例１～実施例４）。

また、癌またはウイルス感染の化学療法に使用されるデオキシシチジン系化合物は、活性化するために細胞酵素によるリン酸化が必要である。このとき、デオキシシチジンキナーゼ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ｄＣＫ）によるデオキシシチジン系化合物のリン酸化は、化合物の活性化において、速度－制限段階であると考えられ、二リン酸塩（ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）または三リン酸塩（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）へのさらなるリン酸化が起こる。Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、チオ－ヌクレオシド構造によって正常細胞において、ｄＣＫ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）による活性化速度が著しく低下することによって、癌細胞に選択的に薬物の活性成分が伝達され、優れた安全性プロファイル（ｓａｆｅｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ）の確保が可能であり、広い治療窓（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）の範囲を確保しているため、耐性発生機序が作動しないようにする高い投与量で投与も可能である。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ化合物は、正常細胞に比べて癌細胞において、急速に三リン酸化（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）することによって活性化されることができる。Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ化合物は、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ化合物の三リン酸化物であるＡｚａ－Ｔ－ｄＣＴＰのＤＮＡ挿入により、塩基除去修復および／またはミスマッチ修復（ｍｉｓｔａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ）を起こし、ＤＮＡ複製を遅延させることによって、複製ストレス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ）が誘発され、ＤＮＡ損傷応答（ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が勢いを増すことができる。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ化合物は、ｄＮＴＰ ｄｅ ｎｏｖｏ合成に重要な リボヌクレオチドレダクターゼ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）であるＲＲＭ１タンパク質の発現を抑制させ、細胞内ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ量の減少を通じてＤＮＡ複製ストレスを誘発して、強いＤＮＡ損傷応答 を発生させることができる。

デシタビン／アザシチジンとは異なり、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、チオ－ヌクレオシド構造によって主要薬物標的ＤＮＭＴ１の強力な阻害と共に、既存の耐性発生メカニズムであるＤＮＡ損傷修復に関与する核酸中間分解酵素（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を同時に遮断して強力な抗癌効能を示すことができる（図６）。

デシタビン／アザシチジンの場合、我々の体に存在するシチジンデアミナーゼによる代謝に脆弱で、ＰＫプロファイルが不安定な問題により効力が制限される短所がある。驚くべきことに、デシタビン／アザシチジンに比べてＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ薬およびＡｚａ－Ｔ－ｄＣＴＰ薬を経口投与した時、シチジンデアミナーゼによって分解される速度が遅く、癌細胞内でシチジンデアミナーゼによる代謝耐性の克服はもちろん、経口投与でも優れるＰＫプロファイルを有することを見出した（実施例３）。

また、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、チオ－ヌクレオシド構造によって正常細胞において、ｄＣＫ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）による活性化速度が著しく低下することによって、癌細胞に選択的に薬物の活性成分が伝達され、優れた安全性プロファイルの確保が可能になる。そのため、広い治療窓（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）範囲を確保しているので、耐性発生機序が作動しないようにする高い投与量での投与が可能である。

さらに、薬物動態学的特性評価により、（１）Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの抗癌治療効果がＡＵＣ依存性というよりは、Ｃｍａｘ依存性であること；および（２）短期間の間、より多くの量のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ薬物への曝露が効率的な抗癌治療であることを見出した。

細胞レベルでＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、デシタビン／アザシチジンに比べて著しく改善された薬物効力マーカー（ＰＤマーカー）の変化を誘導し、これによりデシタビン／アザシチジンよりも強力な癌アポトーシス誘導効果を有している（実施例１）。

また、このような改善されたＰＤマーカーの変化により、デシタビンに耐性を示す細胞株においても、優れた癌アポトーシス誘導効力を維持することができる。このような細胞レベルでの効力は、動物モデルにおける優れた効力へとつながるが、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、デシタビン／アザシチジンが全く治療効果を示さない多様な動物モデルにおいて優れた抗癌効能を示した。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、経口投与可能なＰＫプロファイルを示し、ＧＬＰ－前臨床毒性試験において、従来のデシタビン／アザシチジンに比べて優れた安全性が確認された。

特に、臨床試験で３２ｍｇ／ｄａｙ用量投与時、高い病勢コントロール率（ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒａｔｅ）が確認され、動物試験において同様の薬物露出度を示す投与用量群において、当該疾患群（ＡＭＬ、Ｔ－ＡＬＬ、各種固形がん）動物モデルを試験した結果、いずれも既存の競争薬物に比べて優れた効能を示すことが確認された。

特に、米国国立がん研究所が行ったＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの固形がんの対象臨床１ａ相試験において、既存のデシタビン投与量の約２倍用量までＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを投与しても大きな副作用は観察されず、経口投与時の優れたＰＫプロファイルと循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ）での強力なＰＤマーカーの確認など、人体での効能と安全性も確保した。非常に低い投与用量でも癌患者の疾患の進行を遅らせる効能が観察され、既存の薬物に対して優れた効力を示した。

したがって、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、標準治療薬である既存のＤＮＭＴ１阻害剤に比べて強力な効力、改善された安全性プロファイル、使用の利便性、および治療薬の耐性を克服する可能性を備えたＤＮＭＴ１阻害剤であることができる。

一方、ベネトクラクスは、２５０ｍｇ／ｄａｙまで投与可能であり、ベネトクラクスと併用時、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの投与用量は、３２ｍｇ／ｄａｙ未満、例えば、８ｍｇ／ｄａｙ以上３２ｍｇ／ｄａｙ未満、好ましくは８～２４ｍｇ／ｄａｙであることができる。２４ｍｇは、１．５ｍｐｋに該当する。

ベネトクラクス薬物との併用時、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ薬物は、最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ｄｏｓｅ、ＭＴＤ）の２５％用量～７５％用量で投与することができる。

前臨床試験後、ヒトを対象に初めて実施し、毒性および副作用の反応を観察する第１相臨床試験での主たる目標は、副作用が発生せず、被験者に耐えられる限度内で最大用量である最大耐量を決定することである。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、動物モデルにおいて、約０．５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）投与群において、強い抗癌効力を示し、その用量での薬物暴露量は、人体に投与した時、８ｍｇ／ｄａｙ以下（第１相臨床におけるＭＴＤの２５％用量）レベルで広い治療窓を確保することができる。

現在のＡＭＬ治療標準療法であるアザシチジンとＢＣＬ－２の阻害剤であるベネトクラクス（商品名：ベネクレクスタ）と併用する療法の効力とＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの効力を比較したとき、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ ２．０ｍｐｋ単独投与群（第１相臨床におけるＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄのＭＴＤ用量３２ｍｇに相当）がアザシチジン／ベネトクラクス投与群と同等水準の効力を示し、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ ０．５または１．０ｍｐｋとベネトクラクス併用投与群（第１相臨床におけるＭＴＤ用量３２ｍｇの２５～５０％）は、標準療法（アザシチジン／ベネトクラクスの併用）投与群に比べて顕著に強い効力を示すことが確認された（図２８～図３３）。

既存の同一機序薬物であるデシタビン／アザシチジンの場合、ベネトクラクスとの併用投与には、ＭＴＤから用量５０％を減量する必要があり、ＭＴＤの２５％に用量を減量したところ、優れた安全性が示されたが、効力が弱い問題が明らかになった。Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの場合、ＭＴＤの用量を２５％に減量し、ベネトクラクスと併用投与したとき、アザシチジン／ベネトクラクス投与群に比べて顕著に優れた効力を示すため、既存の薬物の結果と比較したとき、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄが人体に対して従来の標準療法に比べて優れた安全性／効力を示す可能性が非常に高い（実施例５）。

本発明において、化学式１の化合物および化学式２の化合物は、それぞれ独立して固体または液体の形態で存在することができる。固体状態では、結晶質または非晶質の形態で、またはそれらの混合物として存在することができる。結晶質または非－結晶質化合物の場合、製薬上許容される溶媒和物が形成され得る。結晶質溶媒和物において、溶媒分子は、結晶化中に結晶格子に混入される。溶媒和物は、非－水性溶媒、例えば、非制限的にエタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、酢酸、エタノールアミンまたは酢酸エチルなどを含むか、またはこれらは結晶格子に混入された溶媒として水を含むことができる。水が結晶格子に混入された溶媒である溶媒和物は、通常「水和物」と呼ばれる。水和物には、化学量論的な水和物のみならず、可変量の水を含有する組成物が含まれる。本発明には、このようなあらゆる溶媒和物が含まれる。

結晶質形態で存在するその多様な溶媒和物を含む本発明の特定化合物は、多形性（すなわち、異なる結晶構造により生じる能力）を示すことができる。これらの異なる結晶質形態は、通常「多形体」として公知されている。本発明は、このような多形体が全て含まれる。多形体は、同じ化学組成を有するが、パッキング、幾何学的配置、および結晶質固体状態のその他の叙述的特性において異なる。したがって、多形体は、異なる物理的特性、いわば、形状、密度、硬度、変形性、安定性、および溶解特性を有することができる。多形体は、典型的には異なる融点、ＩＲスペクトル、およびＸ線粉末回折パターンを示し、これは同定に使用することができる。例えば、化合物の製造に使用される反応条件または試薬を変化または調整することによって、異なる多形体を製造することができる。例えば、温度、圧力、または溶媒中における変化は、多形体を生成することができる。さらに、一種の多形体は、特定の条件下で別の多形体に自発的に変換することができる。

本明細書において、４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン（Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）薬物は、上記化学式１の化合物だけでなく、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、そのプロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）を含む。

「薬学的に許容される塩」は、製薬上許容される有機または無機塩を指す。例示的な塩は、スルフェート、シトレート、アセテート、オキサレート、クロライド、ブロマイド、ヨーダイド、ニトレート、ビスルファート、ホスフェート、アジッドホスフェート、イソニコチネート、ラクテート、サリチレート、アシッドシトレート、タルトレート、オレエート、タンネート、パントテネート、ビタルトレート、アスコルベート、スクシネート、マレエート、ゲンチシネート、フマレート、グルコネート、グルクロネート、サッカレート、ホルメート、ベンゾエート、グルタメート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ｐ－トルエンスルホネート、およびパモエート（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート）塩を含むが、これらに制限されない。薬学的に許容される塩は、他の分子、例えば、アセテートイオン、スクシネートイオン、または他の対イオンを含むことができる。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であってもよい。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造内に１個超過の荷電原子を有することができる。多重荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合には、多重対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、１個以上の荷電原子および／または１個以上の対イオンを有することができる。

「プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）」とは、当該技術分野で利用されている意味を有する。例えば、生理活性物質（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）または治療的活性有機化合物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を化学的に修飾し、イン・ビボで酵素的またはその他の条件下で親化合物（ｐａｒｅｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を遊離または放出するように設計された化合物を意味する。プロドラッグは、投与後にイン・ビボで目的とする化合物に変化される。有用な薬物であるにもかかわらず、副作用、安定性、溶解性、吸収性、作用時間などで適していない性質を有することに化学的修飾を加えて臨床使用可能にする。

「溶媒和物」は、非共有分子間の力によって結合された化学量論的または非化学量論的量の溶媒をさらに含む化学式１の化合物またはその塩を意味する。溶媒が水である場合、溶媒和物は水和物である。

本明細書において、「癌」は、典型的には、非調節細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す。癌の例としては、血液－媒介性腫瘍（例えば、多発性骨髄腫、リンパ腫および白血病）および固形腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。血液がんの非限定的な例としては、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病などがあり、固形がんの非限定的な例として、胃癌、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、乳がん、黒色腫、および膵臓がんなどがある。

本明細書において、「患者」、「被検者」および「対象体」とは、哺乳動物のような動物を指す。特定の実施形態では、患者はヒトである。他の実施形態では、患者は、犬、猫、家畜（例えば、馬、豚またはロバ）、チンパンジーまたはサルなどのような、非ヒト動物である。

本明細書において、抗癌剤による抗癌効果または治療効果は、患者が特定のがんに罹患している間に発生する、癌の重症度を減少させる、腫瘍の大きさを減少させる、または癌の進行を遅延または鈍化させる作用を指す。

例えば、抗癌剤による抗癌効果は、イン・ビトロ（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ）および／またはイン・ビボ（ｉｎ－ｖｉｖｏ）上で癌細胞に抗癌剤を処理した後、癌細胞の細胞生存能力（Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）（細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）程度または細胞数の変化）であることができる。例えば、細胞株（細胞株）や非臨床動物モデル（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）を通じて薬物の反応（ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）検査を通じて間接的に確認することができる。また、癌患者からも抗癌剤による抗癌効果が直接確認されており、これに関連するデータを導き出し、データベースとして用いることができる。また、抗癌剤の投薬ガイドラインの設計時、動物モデルのＰＫパラメータおよび／または毒性プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）を並行して考慮することができる。

抗癌剤による抗癌効果は、イン・ビトロデータである当該抗癌剤の％最大効果（Ｍａｘｉｍｕｍ ｅｆｆｅｃｔ）、例えば、ＩＣ_５０、ＩＣ_６０、ＩＣ_７０、ＩＣ_８０、およびＩＣ_９０から類推することもでき、薬物の最高血中濃度（Ｃｍａｘ）および／または血中薬物濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）のようなイン・ビボデータを通じて非臨床動物モデルおよび臨床癌患者からも確認することができる。

抗癌剤の反応性は、抗癌効果の側面において、臨床的感度を意味する。

抗癌剤を用いた治療に関連して言及するとき、「感度」および「敏感な」は、治療される腫瘍または疾患の進行を緩和または減少させることにおいて、化合物の効果の程度を指す相対的な用語である。

「効果的な患者の抗癌効果／反応」は、例えば、任意の適切な手段、いわゆる遺伝子発現、細胞計数、解析結果などによって測定されるような、患者の応答において、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、またはそれ以上の抑制であってもよい。

本明細書における投与用量は、薬効が期待される用量である。本発明における薬効は、抗癌効果であることができる。抗癌剤の反応性（抗癌効果）は反応程度であって、当該抗癌剤の％最大効果（Ｍａｘｉｍｕｍ ｅｆｆｅｃｔ）、例えば、ＩＣ_５０、ＩＣ_６０、ＩＣ_７０、ＩＣ_８０、およびＩＣ_９０、正常細胞に対する毒性を発揮する値（ＬＣ_５０）であってもよい。

例えば、経口剤形は、当技術分野で公知された多様な剤形技術を使用して製剤化されることができる。例えば、口腔粘膜に付着するのに使用される生体崩壊性（加水分解性）ポリマー担体を含むことができる。予定の期間にわたって徐々に侵食されるように作製され、ここで薬物送達は本質的に全体的に提供される。

経口用製剤における薬物送達は、経口薬物投与に遭遇する弱点、例えば、遅い吸収、胃腸管内に存在する流体による活性剤の分解および／または肝臓における初回通過不活性化を回避する。生体崩壊性（加水分解性）ポリマー担体に対して、事実上任意のそのような担体が所望の薬物放出プロファイルが損なわれない限り使用されることができ、担体は口腔服用量単位で存在する任意の他の成分と両立可能である。一般に、ポリマー担体は、口腔粘膜の湿性表面に付着する親水性（水溶性および水膨潤性）ポリマーを含む。本明細書において、有用なポリマー担体の例には、アクリル酸ポリマー（例えば、カルボマー）である。一部の実施形態において、経口用製剤に組み込むことができる他の成分の非限定的な例としては、崩壊剤、希釈剤、結合剤、潤滑剤、風味剤、着色剤、保存剤などがある。一部の実施形態では、口腔または舌下投与に対して、従来の方法で剤形化された錠剤、ロゼンジ、またはゲルの形態であってもよい。

一部の実施形態では、上記患者の状態が改善された場合に医師の裁量によって化合物の投与は提供され続け；代案として投与されるべき薬物の用量は、一時的に減少するか、または一時的にある時間の長さ（すなわち「休薬」）の間に中断され得る。休薬の長さは２日～１年の間で変化することができ、単なる例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含む。いくつかの実施形態では、休薬中の用量減少は１０％～１００％であり、一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を含む。

患者の病態が改善されると、維持用量は必要に応じて投与される。その後、服用量または投与頻度、またはその両方は、改善された疾患、障害または病態が維持されるレベルまで、症状の関数として減少されることができる。しかしながら、患者は症状が任意に再発した時、長期間にわたって断続的な治療を必要とする。

そのような量に対応する所与の製剤の量は、治療を必要とする対象体の因子、例えば、特定の化合物、疾患の重症度、同一性（例えば、体重）に応じて変化するが、それにもかかわらず、例えば、投与すべき製剤、投与経路、および治療すべき対象を取り囲む特定の状況によって当技術分野で公知の方式で日常的に決定することができる。しかしながら、一般に、成人の治療に用いられる用量は、典型的に０．０２～５０００ｍｇ／１日、または約１～１５００ｍｇ／１日の範囲であろう。

本明細書における一回投与用量は、単回用量でまたは同時に、例えば、２、３、４或いはそれを超過するサブ用量として投与される分割用量で提供されることができる。

いくつかの実施形態において、経口用剤形は、正確な服用量の単回投与に適した単位服用形態である。単位服用形態において、剤形は、適切な量の１種以上の化合物を含有する単位用量に分割される。いくつかの実施形態において、単位服用量は、別々の量の剤形を含有する包装の形態である。非限定的な例には、包装された錠剤またはカプセル、および粉末バイアルまたはアンプルである。水性懸濁組成物は、単回－用量の非－再密閉可能な容器内に包装することができる。代案として、多回－用量の再密閉可能な容器を使用することができ、この場合に組成物中に保存剤を含むことが典型的である。

いくつかの実施形態では、非経口注射用剤形は、付加された保存剤と共に、アンプルを非限定的に含む単位服用形態、または多重－用量容器で提供される。

典型的には、薬学的に許容される非経口ビヒクルと共に単位投与注射可能な形態で、非経口投与、すなわちボーラス、静脈内、および腫瘍内注射のために調製される。製薬上許容される希釈剤、担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．）とともに凍結乾燥製剤または水溶液の形態で任意に混合される。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ヌクレオシド系抗癌剤のデオキシリボース構造をチオーデオキシリボース構造に変更したチオ－ヌクレオシド化合物であって、このような変化を通じて以下のような特徴を備え、既存のヌクレオシド系抗癌剤の限界を克服し、Ｕｎｍｅｔ Ｎｅｅｄｓを満たすことができる。
（１）チオ－ヌクレオシド構造によりより長期間持続されるＤＮＭＴ１ ｔｒａｐｐｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘを形成することにより、デシタビン（商品名：Ｄａｃｏｇｅｎ）、アザシチジン（商品名：ＶｉｄＡｚａ）に比べて差別化された強力な抗癌効能および耐性ＡＭＬ患者において、耐性を克服する可能性を確保；
（２）チオ－ヌクレオシド構造により正常細胞において、ｄＣＫ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）による活性化速度が著しく低下することによって、癌細胞に選択的に薬物の活性成分が伝達されて、優れた安全性プロファイルを確保；
（３）既存のデシタビン／アザシチジンに比べて、経口投与時、シチジンデアミナーゼによって分解される速度が遅いため、癌細胞内での代謝による耐性を克服する可能性、および経口投与の可能性を確保；および
（４）ヒトへの投与を通じて安全性および経口投与ＰＫプロファイルを確保。

また、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、チオ－ヌクレオシド骨格に起因する強力な効能と差別化された安全性プロファイルであって、既存のＤＮＭＴ１阻害剤に比べて拡張された適応症（既存のＤＮＭＴ１阻害剤（ＭＤＳ／ＡＭＬ中心）ｖｓ．Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（様々な血液がんおよび固形がんにまで拡大））、既存のＤＮＭＴ１阻害剤が薬物効能を示さない様々な状況での優れた効能（第１相臨床における固形癌患者に対する強力な効能など）、優れた安全性（非臨床および第１相臨床の結果）などの効能および安全性の側面で画然たる競争上の優位を示している。

したがって、本発明によるＤＮＭＴ１阻害剤を含む多標的阻害剤である４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン（４’－ｔｈｉｏ－５－Ａｚａ－２’ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ，Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）およびアポトーシスを媒介するＢＣＬ－２の阻害剤であるベネトクラクスの併用療法は、投与用法、用量、または対象患者群の側面で多様に適用可能である。

後成遺伝学作用機序を示した模式図である。 我々の体の正常な造血過程を示す模式図である。急速な細胞分裂を通じて細胞数を確保する段階１および細胞分裂を停止し、細胞の成熟が進行する段階２では、各段階を主導するＭａｓｔｅｒ ＴＦ（特に、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎ）の役割が非常に重要である。 ＤＮＭＴ阻害剤処理時に過メチル化ＭＤＳ／ＡＭＬ血液癌細胞の正常なＤＮＡメチル化が誘導され、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎ遺伝子の再発現を通じて正常な細胞への分化が誘導され、抗癌効果を発揮することを示す模式図である。 デシタビンとアザシチジンの化学構造である。 ヌクレオシド系抗癌剤の作用機序である。 ＢＥＲ作用機序によるヌクレオシド系抗癌剤ＤＮＡ損傷修復プロセスである。 Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄのＤＮＡ損傷応答を通じてアポトーシスおよび細胞周期ａｒｒｅｓｔ（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を媒介する作用機序である。 Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの作用機序である。 アポトーシスを媒介するＢ細胞リンパ腫（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＢＣＬ）－２およびその阻害剤であるベネトクラクスの作用機序である。 ＭＶ４－１１（ＡＭＬ細胞株）細胞にＮＴＸ－３０１（ＳＲＩ－９６３９）およびデシタビンを濃度別に処理時、ＤＮＭＴ１を阻害することが確認された結果である。 ＫＧ－１ａ（ＡＭＬ細胞株）細胞にＮＴＸ－３０１（Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）およびＴ－ｄＣｙｄ処理時、ＤＮＭＴ１阻害が確認された結果である。 ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＬＬ細胞株）細胞にＮＴＸ－３０１およびＴ－ｄＣｙｄ処理時、ＤＮＭＴ１阻害が確認された結果である。 ＮＣＩ－Ｈ２３（Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）、ＨＣＴ－１１６（Ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）、およびＩＧＲＯＶ－１（Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）細胞株にＮＴＸ－３０１およびＴ－ｄＣｙｄ処理時、ＤＮＭＴ１阻害が確認された結果である。 ＭＶ４－１１細胞にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ処理時、ＤＮＭＴ１阻害によるｐ１５癌抑制遺伝子のｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎが確認された結果である。 ＭＶ４－１１細胞にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄおよびデシタビン処理時、ＤＮＭＴ１阻害によるｐ１５癌抑制遺伝子のｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ様相を比較解析したものである。 ＴＨＰ－１細胞にＮＴＸ－３０１（Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）を濃度別に処理時、誘導されるＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎ発現様相が確認された結果である。 多様なＡＭＬ細胞株（ＭＶ４－１１、ＨＬ－６０、ＫＧ－１ａ）にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを処理し、細胞内ＤＮＭＴ１、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎ、ＣＤＫＮ１Ｂの数値を確認した結果である。 ＮＴＸ－３０１ ｔａｒｇｅｔ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔを確認した結果である。 血液癌細胞株に対するＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの成長抑制効果を示す図である。 血液癌細胞株に対するＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄとデシタビンの成長抑制効果の比較図表である。 ＮＴＸ－３０１処理時、ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｌｅｖｅｌおよびＲＲＭ１発現の測定結果である。 ＮＴＸ－３０１処理時に形成されたＤＮＡ ａｄｄｕｃｔによるＤＮＡ複製ストレス関連遺伝子の発現増加および細胞株別の薬物に対する効能を確認した結果である。 ＮＴＸ－３０１処理時、ｐ５３パスウェイ活性化によるＤＮＡ 損傷応答マーカーの増加を確認した結果である。 ＭＶ４－１１、ＭＯＬＭ－１３細胞株にＮＴＸ－３０１処理時、誘導される選択的ＤＮＡジメチル化様相およびＲＮＡ－ｓｅｑデータ解析の結果である。 Ｍｏｌｍ１３ ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおける各治療群別のｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈおよび体重差の比較を示すものである。 ＮＴＸ－３０１のＭｏｌｍ１３ ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデル試験後、癌組織におけるＤＮＭＴ３Ｂ発現の抑制を示した結果である。 ＨＬ－６０ ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株ＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルにＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄおよびデシタビン処理後、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂの変化を確認した結果である。 ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、ＮＴＸ－３０１（０．５、１、１．５ｍｇ／ｋｇ）とベネトクラクス（１００ｍｇ／ｋｇ）の併用投与の薬効を示すＣＲＬの結果である。 ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、ＮＴＸ－３０１（０．５、１、１．５ｍｇ／ｋｇ）とベネトクラクス（１００ｍｇ／ｋｇ）の併用投与の薬効を示すＣＲＬの結果である。 ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、ＮＴＸ－３０１（０．５、１、２ｍｇ／ｋｇ）とベネトクラクス（５０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与の薬効を示すｐｈａｒｍａｒｏｎの結果である。 ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、ＮＴＸ－３０１（０．５、１、２ｍｇ／ｋｇ）とベネトクラクス（５０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与の薬効を示すｐｈａｒｍａｒｏｎの結果である。 ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、ＮＴＸ－３０１（０．５、１、２ｍｇ／ｋｇ）とベネトクラクス（５０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与の薬効を示すｐｈａｒｍａｒｏｎの結果である。 ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、ＮＴＸ－３０１（０．５、１、２ｍｇ／ｋｇ）とベネトクラクス（５０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与の薬効を示すｐｈａｒｍａｒｏｎの結果である。

以下、本発明を実施例を通じてより具体的に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を限定するものではない。

実施例１：インビトロ薬理学（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）

１－１．ＤＮＭＴ１阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの重要な薬理学マーカー（ＰＤマーカー）は、薬物標的ＤＮＭＴ１の阻害および細胞内のＤＮＭＴ１タンパク質量の減少である。

デシタビンなどのＣｙｔｉｄｉｎｅ様構造ヌクレオシド ＤＮＭＴ１阻害剤は、ＤＮＡに組み込まれ、ＤＮＭＴ１を不可逆的にトラップし、タンパク質分解酵素複合体を介して分解を誘導することが知られている。また、このようなＤＮＭＴ１タンパク質の損失は、分化誘導／抗癌遺伝子の発現を促進することが様々な基礎研究と臨床研究、患者におけるＤＮＭＴ１阻害剤の活用を通じて、 確立されている。

１－１－１．ＡＭＬ細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）における細胞内ＤＮＭＴ１タンパク質の減少を確認

ＡＭＬ細胞株において、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄのＤＮＭＴ１阻害効能を評価するために、標準ＡＭＬ細胞株ＭＶ４－１１（図１０）と、ＫＧ－１ａ（図１１）にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄと陽性対照物質であるデシタビンを処理し、ＤＮＭＴ１タンパク質に対して、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。図１０および１１からみられるように、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、両方の細胞株全部において、濃度依存的にＤＮＭＴ１タンパク質を減少させることを確認した。特に、非常に低い濃度の２０ｎＭレベルでもＤＮＭＴ１を完全に減少させることが確認された。

１－１－２．ＡＬＬ細胞株／固形癌細胞株

同一のＤＮＭＴ１阻害効能評価を、他の血液癌細胞株ＡＬＬ細胞株と固形癌細胞株で行い、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＬＬ）（図１２）および固形癌細胞株（図１３）において、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）が濃度依存的にＤＮＭＴ１阻害が可能であることを確認した。

１－２．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ

１－２－１．ｐ１５癌抑制遺伝子の再発現を確認。

ＭＤＳおよびＡＭＬ患者の造血幹細胞のＤＮＡには、多数の癌抑制遺伝子の発現プロモーター領域のｃｙｔｏｓｉｎｅの多数がメチル化されて、それらの発現が抑制され、これによりＤＮＡ損傷修復、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔなどの重要な機能が正常に比べて抑制される問題が惹起する。

多数の癌抑制遺伝子の異常なＤＮＡメチル化は、ＡＭＬを含む数多くの種類のＬｅｕｋｅｍｉａにて報告されており、特にｐ１５癌抑制遺伝子のＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ過メチル化による不活化により、異常な細胞増殖が誘導される。

デシタビンのようにＤＮＡのメチル化を正常化することができる後成遺伝学の調節薬物の処理によってメチル化パターンを正常化する場合、これらの造血幹細胞が分化または死滅し、ＭＤＳ／ＡＭＬ患者の治療に有用に使用されることができ、このとき、細胞内ＰＤマーカーであるｐ１５の再発現が誘導される。既存のデシタビン／アザシチジン臨床試験および患者治療を通じてｐ１５がｓｉｌｅｎｃｉｎｇされた癌細胞および癌患者におけるｐ１５ ｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎは、ＤＮＭＴ１阻害剤のＰｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃをモニターするＰＤマーカーとして確立された。

したがって、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）処理時、ＤＮＭＴ１阻害による後成遺伝学調節機序を通じて、癌抑制遺伝子のｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ様式を確認するために、ＡＭＬ細胞株を対象とするＡＭＬ細胞株であるＭＶ４－１１細胞にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを濃度別に処理した。ＤＮＭＴ１阻害により誘導されるＰＤマーカーであるｐ１５癌抑制遺伝子のｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを確認し、ＲＴ－ＰＣＲによりｐ１５ ｍＲＮＡの強力な再発現を確認した（図１４）。

ＭＶ４－１１細胞におけるＤＮＭＴ１阻害剤の効能を比較するために、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）およびデシタビン処理したとき、ｐ１５癌抑制遺伝子の発現を確認するために、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲを行った結果、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを６０ｎＭ、２００ｎＭの濃度で処理した条件下で、ｐ１５癌抑制遺伝子の発現量が、有意に増加することが確認された（図１５と表１）。

以下の表１は、ＡＭＬ細胞であるＭＶ４－１１細胞株において、ＤＮＭＴ１阻害剤（Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ／デシタビン）処理後、ｐ１５ ｍＲＮＡ ｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎの程度を比較したものである（０ｎＭ基準で増加した倍数を示す）。

また、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄによってデシタビンよりもより優れたｐ１５ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎが誘導されることが確認できた。

したがって、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ処理時、ＤＮＭＴ１の減少およびｐ１５癌抑制遺伝子の再発現を確認した結果、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、新しい標的抗癌剤としての可能性が高い。

１－２－２．追加ＰＤマーカー（ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎ、ＣＤＫＮ１Ｂ）の変化を確認

ＭＤＳ／ＣＭＭＬ／ＡＭＬ患者の悪性細胞の場合、ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒ ＴＦであるＣＥＢＰ／ａｌｐｈａ、Ｐｕ．１、ＧＡＴＡ ｆａｃｔｏｒｓを高レベルで発現するのに対し、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎを含む後期発達段階転写因子の発現は、各遺伝子の過メチル化により低く維持されているという問題がある。

ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎは、未成熟な血球細胞の成熟を誘導し、異常な増殖を抑制するタンパク質であって、このタンパク質の発現が誘導されることによって、ＣＤＫＮ１ＢとＭｙｃ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ（ＭＡＤ）の発現増加が誘導される。ＣＤＫＮ１Ｂは、ＣＤＫ阻害タンパク質であって、細胞周期の増殖を停止したり、分化を誘導したりする機能を担う。このようなＣＥＢ／ｅｐｓｉｌｏｎとＣＤＫＮ１Ｂの発現は、ＡＭＬ悪性細胞の分化を誘導し、強力な抗癌効能を示す。

デシタビン薬物処理時、ＤＮＭＴ１を阻害し、ＤＮＡ脱メチル化誘導とともにＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎのｒｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを誘導し、アポトーシスおよび細胞分化をもたらし、これによって優れた抗癌効能を示すことが報告されたところがる。

多様なＡＭＬ細胞株を対象にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）処理時、ＤＮＭＴ１阻害により誘導されるｔａｒｇｅｔ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ様相を確認するために、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎおよびＣＤＫＮ１Ｂ発現を確認し、比較解析を行った（図１６）。

ＡＭＬ細胞株であるＴＨＰ－１細胞に濃度別にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを処理したとき、用量依存的にＤＮＭＴ１阻害が誘導され、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎ発現およびＣＤＫＮ１Ｂ発現が増加する相関関係を確認することにより、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの未成熟な血球細胞の成熟誘導および分化誘導機能を確認した。

ＡＭＬ細胞株であるＭＶ４－１１、ＨＬ－６０、ＫＧ－１ａ細胞にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）を７２時間処理した後、細胞内タンパク質の発現数値を確認した結果、ＤＮＭＴ１の発現は、阻害され、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎおよびＣＤＫＮ１Ｂの発現は増加することが確認された。特に、ＭＶ４－１１とＨＬ－６０細胞において最も大きく発現増加したことが確認された（図１７）。

１－３．Ｔａｒｇｅｔ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ

既存の実験を通じてＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄに対するｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ細胞株として確認されたＭＶ４－１１細胞にＤＮＭＴ１ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ（ｓｉＲＮＡ）を処理した時、細胞の生存、分裂、および増殖に影響を及ぼさないＫＯ細胞株を作製した。

作製したＤＮＭＴ１ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ細胞株にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）を濃度別に処理した時、細胞毒性が減少することが確認でき、このことはＭＶ４－１１細胞に対する薬理作用が弱まった結果であると判断される。これを通じてＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ＤＮＭＴ１を介して強力な薬物効力を有することを確認した（図１８）。

１－４．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ

Ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株を対象としたＤＮＭＴ１阻害剤であるＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの細胞増殖に対する阻害効果を確認するために、ｇｒｏｗｔｈ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定した。

１－４－１．ＡＭＬ

多様なＡＭＬ細胞株において、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）は、図１９に示すようなＩＣ_５０値を有し、優れた細胞生存阻害効果を示した。

１－４－２．Ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株の細胞増殖に対するＤＮＭＴ１阻害剤の効果の比較

Ｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株を対象としたＤＮＭＴ１阻害剤であるＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄおよびデシタビンの細胞増殖に対する効果を確認するために、ｇｒｏｗｔｈ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙを測定した。ＤＮＭＴ１阻害剤を各７２時間の間処理した結果、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈを抑制するのに効果があると知られたデシタビンのＧＩ_５０値（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）は、０．０２４μＭ～４．３μＭであり、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄのＧＩ_５０値は、０．０１４μＭ～０．６９μＭと測定された。全体的に細胞増殖に対する阻害効力を比較したとき、デシタビンに比べてＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの効能が極めて優れていることが確認された（図２０）。

１－４－３．癌種別の細胞株におけるＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄのＩＣ_５０値の結果

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄのバイオマーカーを確保するために、２００個の細胞株に対する細胞毒性評価を行った薬物活性ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ解析を行った。

２００個の細胞株に対する薬物活性ｐｒｏｆｉｌｉｎｇおよび遺伝体解析の結果によるＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの薬物ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ解析の結果、様々な固形がんで強力な効力が確保できることを確認した（表２）。

実施例２：Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの作用機序の研究

図７および図８には、それぞれＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄのＤＮＡ損傷応答作用機序およびＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの作用機序が図式化されている。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ＤＮＭＴ１酵素をうまくｔｒａｐｐｉｎｇすることができるＡｚａｃｙｔｏｓｉｎｅ官能基を介してＤＮＡ取り込みおよびＤＮＭＴ１ Ｔｒａｐｐｉｎｇされることによって、デシタビンと比較したとき、より長く持続するＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔを形成し、より強いＤＮＡ ｄａｍａｇｅを誘導し、これによりＣＨＫ１－ｐ５３パスウェイを強く活性化することにより、デシタビンに比べてより強い抗癌効能を示す。

２－１．ＤＮＡ損傷応答誘導

（１）ＤＮＡ取り込みおよびピリミジン代謝（Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の阻害

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ａｎａｌｏｇであって、細胞内で多様なピリミジン代謝関連酵素によって代謝が進行する。

細胞にＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）を処理した時、ｄＮＴＰ ｄｅ ｎｏｖｏ合成に重要なリボヌクレオチド還元酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）であるＲＲＭ１タンパク質発現が抑制され、細胞内のｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ量が減少することにより、細胞内のピリミジン代謝過程に影響を与え得ることを確認した（図２１）。癌細胞がＤＮＡを複製する際に重要な前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）として作用するｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの減少は、複製ストレスを誘発し、強いＤＮＡ損傷応答を発生させることができる。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの代謝産物であるＡｚａ－Ｔ－ｄＣＴＰのＤＮＡ挿入は、塩基除去修復、ミスマッチ修復を引き起こし、ＤＮＡ複製を遅らせることによって、複製ストレスを誘発し、ＤＮＡ損傷応答の勢いを増すことができる。

（２）ＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔ形成によるＤＮＡ損傷応答誘導

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ処理時、細胞内ＤＮＡに挿入されたＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ＤＮＭＴ１との共有結合を通じてｔｒａｐされ、ＤＮＡ－ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔを形成する。

形成されたａｄｄｕｃｔは、ｂｕｌｋｙな構造を通じてＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋの進行を妨げることによって、ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋを崩壊させ、ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋを引き起こして、強いＤＮＡ損傷応答を引き起こすことが可能である。

ピリミジン代謝、ＤＮＡ取り込み、ＤＮＭＴ１ ａｄｄｕｃｔの形成は、結果的に強いＤＮＡ損傷応答を引き起こす。

図２２において、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ処理時に形成されたＤＮＡ ａｄｄｕｃｔにより、ＤＮＡ複製ストレス関連遺伝子の発現の増加および細胞株別の薬物に対する効力を確認した。

（３）ＤＤＲ－ｐ５３パスウェイ活性化によるＤＮＡ損傷応答の促進

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）処理時、ＤＮＡ損傷応答マーカーであるＨ２ＡＸリン酸化を増加させ、同時にＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｓｅｎｓｏｒであるＣｈｋ１のリン酸化増加、ＤＮＡ損傷反応において、細胞周期／死滅を調節するｐ５３タンパク質発現を増加させ、ＤＮＡ損傷応答が促進され、結果として血液癌のｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙが抑制されることが確認された（図２３）。

２－２．ＤＮＡ脱メチル化（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを処理すると、強いＤＮＭＴ１ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎを誘導し、全体的なＤＮＡメチル化レベルの低下を誘発する。

デシタビンは、ゲノム領域全体のジメチル化を誘発させるのに対し、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ｅａｒｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ中に複製されるＤＮＡ領域、遺伝子発現に重要なプロモータ領域、ＤＮＭＴ１－ｂｉｎｄｉｎｇ領域、複製ストレス領域などに偏向され、選択的ジメチル化を誘導する。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ処理によるＤＮＡジメチル化により、抑制されていた多様な癌抑制遺伝子およびＡＭＬ細胞の分化誘導に必要な遺伝子が再活性化され、ＲＮＡ－ｓｅｑデータ解析を通じて当該遺伝子の再活性化された発現パターンを確認した（図２４）。

実施例３：濃度別薬物動態学的評価－Ｍｉｃｅ／Ｒａｔ／Ｄｏｇ ＰＫプロファイル

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄをＭｉｃｅ、ＲａｔおよびＤｏｇに多様な濃度で経口および静脈投与しながらＰＫプロファイルを確認した。

実際の人体での薬物分布が最も似た動物種は、Ｍｉｃｅ（人体と同様に肝臓にＣＤＡ（シチジンデアミナーゼ；Ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）が主に分布し、最も類似した代謝パターンを示す）や種間の差なく吸収がよく起こるかを確認するために、Ｒａｔ／ＤｏｇでのＰＫプロファイルを確認した。Ｍｉｃｅ、ＲａｔおよびＤｏｇの全部においても、優れた経口投与の可能性を示しており、Ｍｉｃｅに投与した結果、優れた薬効を確保できるレベルのＣ_ｍａｘ／ＡＵＣ値を容易に確保できることを確認した。すなわち、経口投与で０．５ｍｐｋ以上のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを投与した時、ｉｎ ｖｉｖｏで薬物効力を容易に確保することが可能である。

表３および表４には、Ｍｉｃｅに対するＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの薬物動態評価結果、表５にはＲａｔに対するＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの薬物動態評価結果、表６にはＤｏｇに対するＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの薬物動態評価結果が示されている。

これらの結果に基づいて人体での効力を示す投与量の予測の結果、単独投与時、３２ｍｇ／ｄａｙ以下、併用投与時、８～１６ｍｇ／ｄａｙレベルと予測され、その結果は、後述する第１相臨床でのＭＴＤ以下の範囲に該当する。

実施例４：Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（ＰＫ／ＰＤ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）

４－１．ＭＤＳ／ＡＭＬ

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの動物モデルにおける有効性を確認するために、また、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄが用量依存的に優れた薬効を示すことを確認するために、Ｍｏｌｍ１３ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデル実験を行った（図２５）。

デシタビン／アザシチジンが治療効果を全く示さないＡＭＬ動物モデルであるＭｏｌｍ１３ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルを確立した後、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）を０．２～１．５ｍｇ／ｋｇの量で経口投与した。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの投与は、既存のデシタビン／アザシチジンに関する文献に記載されているものとは異なり、毒性シグナル（体重変化）なしに用量依存的に強力な抗癌効果を示すことが確認された。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ投与後、がん組織を採取して解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）した結果（図２６）、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、濃度依存的にＤＮＭＴ１とＤＮＭＴ３Ｂを強力に阻害することが確認され、このようなＤＮＭＴ３Ｂの阻害はＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの強力な抗癌効果に大きく寄与することが判断される。

Ｍｏｌｍ１３ ＡＭＬ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデル試験において、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの投与は、ＤＮＭＴ１の阻害と同時にＤＮＭＴ３Ｂの強力な発現抑制を介して強い抗癌効能を示した（０．４ｍｇ／ｋｇ濃度以上のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを処理したとき、約９０ｋＤａサイズのＤＮＭＴ３Ｂタンパク質の明確な減少が観察された）。

実際の人体における疾患をより正確に描写できる全身ＭＶ４－１１ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔモデルの樹立後、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを０．４～１．５ｍｇ／ｋｇの量で経口投与して行った。Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの投与は、０．４ｍｇ／ｋｇの最小用量投与でも統計的に有意なレベルのｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔをもたらすことを確認した。最大の投与群では、実験終了時まで全体群の半数以上のｍｃｉｅが生存／全ての投与から大きな毒性信号（体重変化）なしに用量依存的な強い抗癌効果を確認した。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの競合薬物に比べて優れた効能を確認するために、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄが用量依存的に優れた薬効を示すかを確認するためのＭＶ４－１１全身ＡＭＬモデル実験を行った。全身ＭＶ４－１１ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔモデルの樹立後、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを１．５、２．０、２．５ｍｇ／ｋｇの量で経口投与した（デシタビン／アザシチジンの場合、前臨床試験で使用される標準量／投与スケジュールを使用）。デシタビンが全く治療効果を示さず、アザシチジンの場合、血球検査の結果、ｌｅｕｋｅｍｉａの進行を全く抑制できない症状を示すことに比べて、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、非常に優れたＡＭＬ対象抗癌効能を示し、すべての投与量群において優れたｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔが見られることが確認された。

全身ＭＶ４－１１ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔモデルの樹立後、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄおよびデシタビン／アザシチジン投与群での治療前（Ｄａｙ ２１）と治療中間時点（Ｄａｙ ３６、５６、７７）での血液を採取し、ＣＢＣ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｕｎｔ）数値を解析した。Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ投与群において、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）および血小板（Ｐｌａｔｅｌｅｔ）などの主要項目に変化がないことを確認した。その反面、デシタビン群の場合、血液サンプルを取得する前に全ての個体が死亡し、アザシチジン群の場合、重篤な好中球減少症（Ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）が示されることが確認された。

全身ＭＶ４－１１ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔモデルにおける抗癌効能が直接的に癌細胞の数を抑制する能力と関連があるのか確認するために、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ Ｍｖ４－１１細胞株を用いて、全身ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ後、ｂｏｄｙ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを測定する実験を行った。Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ処理群において、実際、アザシチジン処理群よりも強くｂｏｄｙ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを抑制することを確認した。ＨＬ－６０ ＡＭＬ ＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルにＮＴＸ－３０１（Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）２．０ｍｇ／ｋｇ投与時、強力な腫瘍抑制効能を示すことに比べて、最大投与量のデシタビン０．７５ｍｇ／ｋｇ（該当用量以上投与時、動物死亡により実験進行不可）は、全く腫瘍抑制効果を示さなかった。

ＤＮＭＴ１阻害剤の効能は、ＤＮＭＴ１とｄｅ ｎｏｖｏ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂターゲットに対する選択的なｐｒｏｆｉｌｅに関連しているので、当該Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄおよびデシタビンを投与した群において、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂの発現が確認された（図２７）。

ＨＬ－６０ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｉｃｅモデルに２ｍｇ／ｋｇのＮＴＸ－３０１（Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ）または０．７５ｍｇ／ｋｇのデシタビンを腹腔内投与した後、１１日目腫瘍サンプルを採取し、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂの発現を確認したところ、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄとデシタビン投与群において、全部ＤＮＭＴ１発現が相当に減少したことが確認された。反面、ＤＮＭＴ３ＡとＤＮＭＴ３Ｂの発現ｌｅｖｅｌは、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄおよびデシタビン投与群において差が存在した。ＤＮＭＴ３Ａ発現程度は、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄには影響されず、ＤＮＭＴ３Ｂ発現ｌｅｖｅｌは、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄによって顕著に減少したが、デシタビンによる効果は観察されなかった。

高いＤＮＭＴ３Ｂ発現は、ＡＭＬの予後不良と関連しているという報告があり、これはＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄによるＤＮＭＴ３Ｂの阻害効果により、ＮＴＸ－３０１がｌｅｕｋｉｅｍｉａモデルにおいて、優れた抗癌効果があることを示唆する。

４－２．Ｔ－ＡＬＬ

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを別の適応症であるＴ－ＡＬＬでの効力を確認するために、患者由来のＡＬＬ動物モデルにおけるＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの効力評価を行った。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ＡＬＬ－Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ（ＰＤＸ）において、０．５、１、１．５、２ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、比較群としてＴ－ｄＣｙｄ（ＤＮＭＴ１阻害剤）を使用した。Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、１．５ｍｇ／ｋｇまでが耐えられる容量であり、ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ＡＬＬ ＰＤＸに非常に効果的で、非常に未充足ニーズ（ｕｎｍｅｔ ｎｅｅｄｓ）が高いＡＬＬのｓｕｂｔｙｐｅであるＥＴＰを含むＴ－ＡＬＬでも効果を確認することができた。特に、ＡＭＬでの投与用量と比較して、低用量でも強力な腫瘍退縮（ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を誘導し、このようなｒｅｍｉｓｓｉｏｎ状態を長期間維持することができることが確認され、将来、ＡＬＬ治療剤への開発可能性が非常に高い。

４－３．各種固形がん

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、既存のＤＮＭＴ１阻害剤とは異なり、多様な固形がん動物モデルにおいても優れた効能を確認することができた。大腸がん、膀胱がん、卵巣がん、肺がんなどの動物モデルにおいて、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ投与時、表７（固形がん動物モデルの細胞株、動物、投与用量および投与期間）のように非常に優れた効力を確認することができた。

様々な固形がんｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを投与した後のｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓによりＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの効能を確認した。１～２ｍｇ／ｋｇ用量のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを、ＱＤ×５、２～６ ｃｙｃｌｅの間に繰り返し投与した群において、優れた抗癌効果を示した（ｔｅｓｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔ／Ｃ）値≦４０％であることが証明された）。

Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ（ＨＣＴ－１１６）ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを投与した群において、腫瘍成長抑制が観察され、ｏｐｔｉｍａｌ Ｔ／Ｃは２１％である。その反面、デシタビンのＴ／Ｃは、４５％とあまり効果がなかった。

非小細胞肺癌（Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）（ＮＣＩ－Ｈ５２２）ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ投与後、腫瘍増殖抑制が観察されており、ｏｐｔｉｍａｌ Ｔ／Ｃは３１％であった。

Ｏｖａｒｉａｎ（ＯＶＣＡＲ－３）ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、１ｍｇ／ｋｇ用量のＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを投与した群から腫瘍退縮が観察されており、ｏｐｔｉｍａｌ Ｔ／Ｃは４％であった。０．５ｍｇ／ｋｇ用量でＴ／Ｃ値が４０％であり、このことから用量依存的な効果を示すことが確認できた。

Ｂｌａｄｄｅｒ Ｔｕｍｏｒ（ＢＬ０３８２ＰＤ ＰＤＸ）ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルにおいて、１ｍｇ／ｋｇ用量のＮＴＸ－３０１を投与した群から腫瘍退縮が観察されており、ｏｐｔｉｍａｌ Ｔ／Ｃは２３％であった。デシタビンの場合、０．７５ｍｇ／ｋｇ用量の投与群において、２サイクル後に毒性が現れた。

実施例５：Ｓａｆｅｔｙ（ＧＬＰ－Ｔｏｘｉｃｉｔｙ）

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ化合物に対する予備毒性評価により、２週間全身投与した後、ｍｉｃｅにおける毒性症状（組織変化）および骨髄におけるＤＮＡ損傷の有無を確認する実験、および４週間の全身投与後、ｍｉｃｅの骨髄における細胞組成を評価する予備毒性実験を行った。

Ｃｏｍｅｔ ａｓｓａｙ実験時、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ投与群別、体重変化測定の結果、２週間の全身投与期間中、有意な体重変化が観察されず、２週間後、解剖進行時、臓器での損傷も現れなかったことが確認された。

また、２週間投与後に骨髄を採取し、ＤＮＡ損傷を確認するＣｏｍｅｔ ａｓｓａｙを進行した際、薬物を全く処理しなかった対照群に比べて、ＤＮＡ損傷を示す各種指標の変化が現れないことが確認された。

４週間連続投与後、ｍｉｃｅ骨髄における細胞組成を評価し、当該実験の結果、骨髄を構成する各種細胞の変化が現れず、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄが正常動物における造血能力に有意な影響を及ぼさないことが確認された。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）は、ＧＬＰ毒性試験の結果、動物試験において、非常に優れた安全性と広い治療窓が確認された。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、前記毒性試験の結果から治療濃度を十分に確保できる安全な薬物であることを使用可能な安全な範囲のＡＵＣ値から確認した。

ＭＤＳ／ＡＭＬモデルにおいて、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄは、ＡＵＣ値が６０ｈ＊ｎｇ／ｍｌでも薬効を示し、約２００～２５０ｈ＊ｎｇ／ｍｌで最も優れた治療効果を示した。このことは最も敏感な種において、ＮＯＡＥＬ値が約５０％であり、ＨＮＳＴＤの約２５％程度であり、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄが非常に広い治療窓を有することを意味する。

その他の固形がんとＡＬＬなどの他の動物モデルでは、より低いＡＵＣ暴露でも優れた治療効果を示した。

ＧＬＰ－Ｔｏｘ実験は、Ｒａｔ、Ｄｏｇで行われ、ＰＯを用いてＱＤ×５ｄ ２サイクルを行った。

ＧＬＰ ｒａｔ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ研究では、Ｒａｔは１日２．５、５、１０ｍｇ／ｋｇのＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（１５、３０、６０ｍｇ／ｍ^２）を投与を受けた。毒性対象機関は、骨髄、胸腺、心臓、精巣であった。減少した精子を含む精巣毒性は、投与中断時、修復が可能であり、最大耐量（ＭＴＤ）は１日に１０ｍｇ／ｋｇ以上（＞６０ｍｇ／ｍ^２）であった。

ＧＬＰ ｄｏｇ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ研究では、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを１日に０．１５、０．５、１．０ｍｇ／ｋｇ（３、１０、２０ｍｇ／ｍ^２）投与した。対象器官は、骨髄、胸腺、胃腸管、扁桃腺、精巣であり、最大耐量（ＭＴＤ）は、１日に０．５～１ｍｇ／ｋｇ（１０～２０ｍｇ／ｍ^２）の間であり、最も高い非毒性用量（ＨＮＳＴＤ）は、１日０．５ｍｇ／ｋｇ（１０ｍｇ／ｍ^２）で観察不可逆効力レベル（ＮＯＡＥＬ）は、１日＜０．１５ｍｇ／ｋｇ（３ｍｇ／ｍ^２）であった。

実施例６：Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄとベネトクラクスの併用療法

最近、ＡＭＬ治療薬の標準療法が既存のデシタビン／アザシチジンの単独投与からこれらの薬物をＢＣＬ－２の阻害剤であるベネトクラクスと併用することに変更されている。そこで、ＭＶ４－１１細胞株でＡＭＬ疾病動物モデルを確立した後、これらの薬物を併用投与した時の薬物効果と、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄとベネトクラクスを併用投与した時のｉｎ ｖｉｖｏでの薬物効果を比較評価した。

６－１．ＮＴＸ－３０１ Ｍｏｕｓｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ

５－アザシチジン誘導体の主要な代謝経路のうちの１つは、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）を不活性化することができるシチジン脱アミノ酵素（ＣＤＡ）によって媒介される脱アミノ化である。

ＮＴＸ－３０１の人体用量を３～４で割って、マウスの曝露量を調整する必要がある。

人体ＰＫシミュレーション研究では、ＮＴＸ－３０１単一製剤の人体有効用量は、９６ｍｇ／ｄａｙで計算され、これはマウス２．０ｍｇ／ｋｇ用量の３６９ｎｇ^＊ｈ／ｍＬのＡＵＣ値に基づいたものである。９６ｍｇ／ｄａｙを３～４で割らなければならないので、２４～３２ｍｇ／ｄａｙになる。

参考までに、ＮＣＩの１相試験において、１６ｍｇ／ｄａｙ用量のＡＵＣ値は、約５０ｎｇ＊ｈ／ｍＬであり、これをマウスのＡＵＣ値に換算すると（３～４倍）１５０～２００ｎｇ＊ｈ／ｍＬとなる。これはマウスにて安全で効果的な用量であった。

また、マウスモデルにおいて、ベネトクラクスとの併用結果に基づいて、０．５～１．０ｍｇ／ｋｇが有効用量と判断され、これを人体用量に換算すると、８～１６ｍｇ＋ベネトクラクスとなる。

６－２．マウス

雌のＮＣＧマウス（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６Ｃｄ２２／ＮｊｕＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）は、研究１日目に９週齢であり、研究１日目の体重（ＢＷ）範囲は、１９．８～２５．３ｇであった。動物に、任意の水（逆浸透圧、１ｐｐｍ Ｃｌ）および１８．０％の粗タンパク質、５．０％の粗脂肪および５．０％の粗繊維からなるＮＩＨ ３１ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｌａｂ Ｄｉｅｔ（登録商標）を供給した。マウスを、２０～２２℃（６８～７２°Ｆ）および４０～６０％の湿度で、１２時間光周期で静的マイクロアイソレータ（ｓｔａｔｉｃ ｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒｓ）内で照射されたＥｎｒｉｃｈ－ｏ’Ｃｏｂｓ（商標）実験室動物寝具に収容した。拘束、飼育、手術手順、飼料および水分調節、獣医学的管理に関連しては、「実験動物の管理および使用に関するガイドの推奨事項」に従った。動物管理および使用プログラムは、国際実験動物管理公認協会（ＡＡＡＬＡＣ）から認定を受けており、これは実験室動物の管理および使用に関する標準の遵守を保証する。

６－３．腫瘍細胞培養

ＭＶ－４－１１ヒト二重表現型Ｂ－骨髄単球性白血病細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９５９１（商標））から入手し、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリンＧナトリウム塩、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンスルフェートおよび２５／ｍＬのゲンタマイシンを含むＩｓｃｏｖｅのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中で懸濁培養で維持した。

培地に１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのグルタミンを補充した。白血病細胞は、５％のＣＯ_２と９５％空気の雰囲気で３７℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコで培養した。

６－４．イン・ビボ移植

移植当日、ＭＶ４１１細胞を指数増殖期の間採取し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。各マウスに１×１０^７細胞（０．２ｍＬ懸濁液）を尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。

研究１日で指定された腫瘍細胞移植の１４日後、動物は体重に応じて７個群（ｎ＝８）にランダム化され、平均体重は、２１．９～２２．９ｇであった。

６－５．治療薬

製剤は、剤形化前に光から保護された－２０℃で保存された。

各投与日に、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）の投与溶液を調製した。具体的には、必要量の化合物をボルデックスしながらＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）と混合した後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００を混合し、超音波処理して透明な溶液を得た。次いで食塩水を加え、さらにボルデックスおよび超音波処理し、２０％のＮＭＰ／４０％のＰＥＧ４００／４０％の食塩水の透明な溶液を得た。各動物の体重に合わせて調整された１０ｍＬ／ｋｇ（０．２ｍＬ／２０ｇ動物）で投与したとき、生成された０．０５、０．１、０．１５または０．２ｍｇ／ｍＬの投与溶液は、それぞれ０．５、１、１．５または２ｍｇ／ｋｇの投与量を提供する。

ベネトクラクス（ＡＢＴ－１９９）およびアザシチジン（ＶＩＤＡＺＡ）を購入した。ベネトクラクス粉末は、ｐｈｏｓａｌ ５０プロピレングリコール（ＰＧ）に続いてＰＥＧ ４００およびエタノールで各用量を新たに剤形化した。６０％のＰｈｏｓａｌ ５０ ＰＧ／３０％のＰＥＧ ４００／１０％のＥｔＯＨ中に生成した１０ｍｇ／ｍＬの投与溶液を、１０ｍＬ／ｋｇ（０．２００ｍＬ／２０ｇマウス）の投与体積で投与したときに、各体重に合わせて調整した。各投与日にアザシチジン粉末をＰＢＳに溶解させて、各動物の体重に応じて調整し、１０ｍＬ／ｋｇ（０．２００ｍＬ／２０ｇマウス）の投与体積で投与した場合、２．５ｍｇ／ｋｇを送達する０．２５ｍｇ／ｍＬの投与溶液を得た。

６－６．治療

ベネトクラクスを１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与した先行実験デザインで、投与用量および投与スケジュールは、以下の通りであり、治療の結果を図２８、図２９に示した。

ビヒクル（２０％のＮＭＰ／４０％のＰＥＧ４００／４０％の食塩水）、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）またはベネトクラクスを用いた治療は、経口で（ｐ．ｏ．）、アザシチジンを用いた治療は、腹腔内（ｉ．ｐ．）で投与した。全ての製剤は、各動物の体重に比例して１０ｍＬ／ｋｇ（０．２ｍＬ／２０ｇマウス）の体積で投与した。

グループ１を対照群として使用し、５日間１日１回、次に２日間休薬し、次に５日間１日１回、その次に９日間休薬するという３回のサイクルでビヒクルを投与するように設定した（ｑｄ×５、２ ｏｆｆ、ｑｄ×５、９ ｏｆｆ－３ｃｙｃｌｅｓ）。

グループ２には、２ｍｇ／ｋｇのＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）（ｑｄ×５、２ｏｆｆ、ｑｄ×５、９ｏｆｆ－３サイクル）を投与した。

グループ３には、０．５ｍｇ／ｋｇ Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）（ｑｄ×５、２ ｏｆｆ、ｑｄ×５、９ ｏｆｆ－３ｃｙｃｌｅｓ）を、１００ｍｇ／ｋｇベネトクラクス（５日間１日１回、その次は続けて２日間休薬する９回のサイクル、５／２×９）と一緒に投与した。

グループ４には、１ｍｇ／ｋｇのＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）（ｑｄ×５、２ ｏｆｆ、ｑｄ×５、９ ｏｆｆ－３ｃｙｃｌｅｓ）を、１００ｍｇ／ｋｇベネトクラクス（５／２×９）と共に投与した。

グループ５には、１．５ｍｇ／ｋｇのＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）（ｑｄ×５、２ ｏｆｆ、ｑｄ×５、９ ｏｆｆ－３ ｃｙｃｌｅｓ）を、１００ｍｇ／ｋｇのベネトクラクス（５／２×９）と一緒に投与すように設定された。この群で２匹が治療関連（ＴＲ）死亡し、８日目投与を中止し、１０日目に０．５ｍｇ／ｋｇ Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）および１００ｍｇ／ｋｇベネトクラクスで再開した。

グループ６には、８週間連続して毎週２回２．５ｍｇ／ｋｇのアザシチジン（ｂｉｗｋ×８）を１００ｍｇ／ｋｇベネトクラクス（５／２×９）と共に投与した。

グループ７には、１００ｍｇ／ｋｇのベネトクラクス（５／２×９）を投与した。

その後、ベネトクラクス用量を１／２下げた５０ｍｇ／ｋｇ用量で併用投与した動物モデルの結果を、図３０および図３１、図３２、図３３に示す。

この時、研究１日目にマウスを７個群（ｎ＝８）に分類した。実際の治療療法は、表８にまとめた。

Ｂｉｗ：週２回（ｔｗｏ ｔｉｍｅｓ ｐｅｒ ｗｅｅｋ）

６－７．生存研究のエンドポイント（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｆｏｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｔｕｄｙ）

治療結果は、エンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）および当該寿命の増加／減少（ＩＬＳ）に基づいて評価された。個々の動物は、瀕死状態のエンドポイントまたは研究の最終日（６３日）に達したときにエンドポイントで安楽死した。後肢機能障害、眼球突出、体重減少または神経学的徴候（突起、行動の変化など）を含む腫瘍進行の瀕死の兆候は安楽死が必要であり、腫瘍進行によるすべての死亡は、生存研究（ＤＳＳ）で死亡として分類された。ＴＴＥ（日単位、ｉｎ ｄａｙｓ）は、病気で死亡したり、広範な腫瘍の進行のために安楽死した各マウスについて記録した。

処理したマウスの中央値ＴＴＥは、対照群マウスの中央値ＴＴＥの百分率（％Ｔ／Ｃ）で表され、寿命の増加（ＩＬＳ）を以下のように計算した。
ＩＬＳ＝％Ｔ／Ｃ－１００％
ここで、Ｔ＝中央値ＴＴＥ処理、Ｃ＝中央値ＴＴＥ制御。したがって、Ｔ＝Ｃであれば、ＩＬＳ＝０％である。
（参考までに、Ｌ１２１０モデルにおいて、薬剤の抗急性骨髄単球性白血病活性に対する国立がん研究所の閾値は２５％のＩＬＳである。）

６－８．毒性

動物の体重を１～５日目に測定してから、研究終了（６３日目）まで毎週３回体重（Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ）を測定した。動物は、不利な治療関連（ＴＲ）副作用の明白な徴候が頻繁に観察され、注目すべき臨床観察が記録された。個々のＢＷは、プロトコルに従って監視し、１回の測定で３０％を超過したり、３回の測定で２５％を超過する体重減少のあるすべての動物を安楽死させ、ＴＲ死亡とみなした。グループの平均ＢＷ損失もＣＲ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓプロトコルに従って監視した。許容可能な毒性は、研究期間中の２０％未満のグループの平均ＢＷ損失と１０匹の処理された動物（１０％）のうち１回以下のＴＲ死亡と定義された。平均体重減少が許容可能な限度を超えた群では、投与は中止した。グループの平均ＢＷが許容可能なレベルに修復すると、より低いレベルおよび／または減少した頻度で投与を再開した。死亡は、臨床徴候および／または剖検によって立証される治療的副作用に起因する場合にＴＲとして分類された。ＴＲ分類はまた、投与期間中または最後の投与後１４日以内に未知の原因による死亡に割り当てることができる。死亡が治療に関連するのではなく、腫瘍モデルに関連しているという証拠がある場合、死亡は、非治療関連（ＮＴＲ）として分類された。ＮＴＲ死は、ＮＴＲ（事故またはヒトのミスによる）、ＮＴＲｍ（剖検で確認された浸潤または転移による腫瘍の伝播による）およびＮＴＲｕ（病因が不明）にさらに分類される。

６－９．Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（ＮＴＸ－３０１）とベネトクラクスの併用実験の結果

Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ

図３０および図３１に示すように、ＭＶ４－１１ＡＭＬ細胞をｍｉｃｅ皮下に移植した異種移植（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）ＡＭＬモデルを確立した後、Ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅを単独投与した場合、ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅを減少させることができず、ベネトクラクスのみを単独投与した場合にも限られたレベルの腫瘍退縮様相を示すのに対して、ベネトクラクスとＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄを併用投与したとき、０．５ｍｐｋ（１５ｍｇ）を使用してもＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ ２ｍｐｋ単独投与と同様に優れた抗癌効果を示すことを確認した。

すなわち、ＮＴＸ－３０１単独でも十分にウォーキングすることを確認し、ＮＴＸ－３０１（０．５ｍｐｋ）およびベネトクラクスを併用投与したときにも、単独投与に相当する効果がある（完全な腫瘍退縮）を確認した。

図２８（ＭＶ４－１１ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）においても、ＮＴＸ－３０１をベネトクラクスの標準投与量（１００ｍｇ／ｋｇ）と併用投与する場合、非常に低用量のＮＴＸ－３０１投与だけでも競合薬物に比べて優れた効能を示すことが確認された。

Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ

ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞をｍｉｃｅ皮下に移植した異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＭＬモデルを確立した後、Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ単独で２．０ｍｐｋを１ ｃｙｃｌｅ（５日経口投与、２日休薬、５日経口投与、９日休薬）で投与（ＰＯ）またはＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ ０．５、１．０または２．０ｍｐｋとベネトクラクス ５０ｍｐｋまたは１００ｍｐｋを経口投与（ＰＯ）で１サイクル（ベネトクラクスは、５日経口投与、２日休薬を３週間繰り返し）で併用投与し、対照群としてアザシチジン５．０ｍｐｋを腹腔投与（ＩＰ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）で単独投与またはアザシチジン最適投与量（２．５ｍｐｋ）とベネトクラクス５０ｍｐｋまたは１００ｍｐｋを併用投与した疾患モデルにおいて抗癌効能を確認した。

その結果、図２８、図２９、図３２および図３３に示すように、アザシチジンとベネトクラクスを併用投与した群またはベネトクラクスを単独で投与した群よりもベネトクラクスとＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ（０．５ｍｐｋ）を併用投与した群における生存率がより向上したことから、ベネトクラクスとＡｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄの併用投与時の優れた抗癌効果を確認した。

結論

ＭＶ４－１１細胞株を皮下に移植した異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）ＡＭＬ疾病モデルにおいて、ＮＴＸ－３０１単独でも十分に抗癌効能を確認し、ＮＴＸ－３０１およびベネトクラクスを併用投与した時、単独投与時よりも１／４少ない量を投与したにもかかわらず、これに対応する薬物効果があることが確認できた。

Ａｚａ－Ｔ－ｄＣｙｄ ０．５ｍｐｋ投与群においても完全な腫瘍退縮を誘導し、アザシチジンとベネトクラクスの併用投与群よりも強力な癌増殖抑制効能を示すことが確認できた（図２８）。

図２８に示すように、既存の同一機序薬物デシタビン／アザシチジンの場合、ベネトクラクスと併用投与するために、ＭＴＤから５０％の用量減量が必要であった。また、ＭＴＤの２５％で容量を減量する場合、優れた安全性を示したが、効力が弱くなる問題が発生した。反面、ＮＴＸ－３０１の場合、ＭＴＤの２５％で用量を減量し、ベネトクラクスと併用投与した場合、アザシチジン／ベネトクラクスの投与群に比べて効果が著しく高いことが確認され、既存の標準治療療法に比べてＮＴＸ－３０１が人体において優れた安全性と高い効果を示すことを示唆する。

Claims (15)

1. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、前記両薬物ともに同一の剤形または相異する剤形で併用－投与される、薬学的組成物。
2. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）の薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、前記両薬物ともに被験者に同じ経路または相異する経路を介して投与されることを意図する、薬学的組成物。
3. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、前記両薬物ともに被検者に非経口投与または経口投与として投与されることを意図する、薬学的組成物。
4. 同時にまたは順次投与される４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）薬物を含む、癌の治療または予防のための薬学的組成物。
5. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、ベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）薬物と同時に投与される、薬学的組成物。
6. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物を含む癌の治療または予防のための薬学的組成物であって、ベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）薬物と順次投与される、薬学的組成物。
7. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、８ｍｇ／ｄａｙ以上３２ｍｇ／ｄａｙ未満で投与されることが特徴である、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
8. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、最大耐量（ｍａｘｉｍｕｍ ｔｏｌｅｒａｂｌｅ ｄｏｓｅ）の２５％用量～７５％用量で投与されることを特徴とある、請求項７に記載の薬学的組成物。
9. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、濃度依存的にＤＮＭＴ１タンパク質の減少するまたはＤＮＭＴ１を阻害することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
10. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物は、ＤＮＡ損傷修復（Ｄａｍａｇｅ ｒｅｐａｉｒ）法の１つである、ＢＥＲ（Ｂａｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ）を過活性化する耐性発生機序が機能しないように高い投与量で投与されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
11. ＤＮＭＴ１阻害剤によって耐性が発生した患者群；正常細胞に比べて癌細胞に後成遺伝学的ＤＮＡメチル化パターン変化が蓄積された患者群；ＤＮＭＴ１阻害剤を投与したときに、予後不良または耐性発生の可能性に関する情報提供または診断を受けた患者群；健常人に比べてＣＥＢＰ／ａｌｐｈａ、Ｐｕ．１およびＧＡＴＡ ｆａｃｔｏｒｓからなる群から選択されるｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒ転写因子を高い水準で発現する一方、ＣＥＢＰ／ｅｐｓｉｌｏｎまたは後期発達段階の転写因子の発現は、各遺伝子の過メチル化によって低く維持される患者群；ヌクレオシド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）系抗癌剤の投与時、ヌクレオシド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）代謝耐性が発生する可能性がある患者群；白金系抗癌剤の投与対象患者群；白金系抗癌剤に対して耐性が発生する可能性があるまたは耐性が発生した患者群；および／または健常人対比癌抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）および／またはＳＬＦＮ１１に対する後成遺伝学的にサイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）された患者群に投与されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
12. ＤＮＭＴ１阻害剤投与時、がん細胞だけでなく正常組織にも損傷を与える問題により、標準治療剤であるＤＮＭＴ１阻害剤の標準投与量が制限される患者群に標的抗癌剤として４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物を前記制限された標準投与量以上で投与されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
13. ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）またはＡＬＬ（急性リンパ性白血病）と診断された患者群、白金耐性再発性末期卵巣癌の患者群または白金耐性転移性膀胱癌の患者群、転移性膀胱癌の患者群、治療対象細部バイオマーカーであるｐ５３変異膀胱癌の患者群またはｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＳＬＦＮ１１膀胱癌の患者群、または３期または４期として卵巣癌と診断された患者群に投与されることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
14. 慢性骨髄細胞白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃａｌ ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ）の患者群、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｔ－ＡＬＬ）の患者群、慢性リンパ性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）の患者群、ゲノム異常がある高危険患者群、再発したｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＡＭＬ（ｓＡＭＬ）の患者群、過去の治療履歴に起因したｔ－ＡＭＬ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｒｅｌａｔｅｄ ＡＭＬ）の患者群、薬物耐性／不応性患者群に投与されることを特徴とする、請求項１３に記載の薬学的組成物。
15. ４’－チオ－５－アザ－２’－デオキシシチジン薬物およびベネトクラクス（ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ）薬物を含むキット（ｋｉｔ）。