CN113194967A - 治疗方法 - Google Patents

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P·M·卡罗尔
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L·K·迈克奈尔
W·J·布鲁姆
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Abstract

本文提供了用于鉴定人淋巴细胞的肿瘤抗原，以及用于治疗患有癌症的受试者的方法和组合物。

Description

治疗方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月27日提交的美国临时专利申请号62/737,862的权益，所述申请的内容以引用方式整体并入本文。
背景技术
检查点抑制剂和过继肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)转移疗法已在癌症患者中取得了应答，证明了新抗原T细胞靶向摧毁肿瘤的重要性。然而，只有一小部分患者从治疗中获益。检查点抑制剂容易产生脱靶毒性，对具有高突变负荷的肿瘤最有成效。TIL疗法仅限于大块肿瘤可及且TIL含量高的适应症。它们也来源于来自单一肿瘤的T细胞的非特异性扩增，这限制了新抗原靶向并且使治疗更容易发生转移性肿瘤逃逸。对T细胞进行工程化使其表达嵌合抗原受体(CAR-T)或抗原特异性T细胞受体(TCR)的其他细胞疗法也显示出有限的成功，但通常仅限于单一抗原特异性，因此也容易发生使肿瘤逃逸。仍然需要用于治疗肿瘤的其他治疗方法。
发明内容
本公开的一个方面包括一种治疗受试者的方法，所述方法包括：从患有肿瘤或癌症的受试者获得PBMC样品，在所述PBMC样品中鉴定对至少一种抑制性抗原有应答的多个T细胞，通过使所述T细胞与试剂或试剂组合接触来重新训练所述多个T细胞(或所述多个T细胞的至少一部分)，以及向所述受试者施用包含所述重新训练的T细胞的细胞治疗剂。在施用后，所述重新训练的T细胞介导增强对肿瘤或癌细胞的免疫控制的免疫应答。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述重新训练步骤之前，从所述PBMC样品中分离出所述多个T细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，将所述重新训练的T细胞与剩余的PBMC样品或所述剩余的PBMC样品的子集组合。
在一些实施方案中，重新训练使T细胞趋向于Th1表型(例如，相对于对照，增加Th1细胞，例如表达一种或多种Th1相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。在一些实施方案中，重新训练使T细胞趋向于Th2表型(例如，相对于对照，增加Th2细胞，例如表达一种或多种Th2相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，扩增(例如，特异性地或非特异性地扩增)所述重组的细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，扩增(例如，特异性地或非特异性地扩增)所述重新训练的T细胞。在一些实施方案中，所述重新训练步骤与扩增同时进行。在一些实施方案中，所述重新训练步骤在扩增之前进行。在一些实施方案中，所述重新训练步骤在扩增之后进行。在一些实施方案中，重新训练和扩增使T细胞趋向于Th1表型(例如，相对于对照，增加Th1细胞，例如表达一种或多种Th1相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。在一些实施方案中，重新训练和扩增使T细胞趋向于Th2表型(例如，相对于对照，增加Th2细胞，例如表达一种或多种Th2相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。
在一些实施方案中，通过将所述细胞在包含一种或多种刺激性细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40、IFN-γ)的培养基中培养来扩增所述细胞。在一些实施方案中，所述培养基还包含针对TGF-β和/或IL-10的阻断抗体。在一些实施方案中，所述培养基还包含至少一种抑制性抗原。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，将所述重新训练的T细胞与对至少一种刺激性抗原有应答的未扩增的或扩增的(例如，特异性地或非特异性地扩增的)T细胞组合。在一些实施方案中，通过使所述PBMC样品与分离珠粒(例如，磁珠)接触来分离所述多个T细胞。在一些实施方案中，所述珠粒可以与包含一种或多种特异性地结合所述抑制性抗原的T细胞受体(TCR)的四聚体偶联。
在一些实施方案中，通过使所述PBMC样品与针对T细胞激活标志物的抗体例如抗4-1BB抗体、抗CD40L抗体或IL-2R抗体接触来分离所述多个T细胞。在一些实施方案中，所述抗体与荧光团或磁珠缀合。
在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合包括佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是TLR激动剂、炎性体激活剂、NOD2激动剂、RIG1解旋酶抑制剂和/或STING激动剂。在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合包括检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂)。在一些实施方案中，所述试剂组合包括检查点抑制剂和佐剂。在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合包括病毒载体、细菌载体、外来体、脂质体、DNA、mRNA或saRNA、化学治疗剂或IDO抑制剂。
在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合包括细胞因子，或包含两种或更多种细胞因子的混合物。在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合包括Th1相关细胞因子，或包含两种或更多种Th1相关细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40、IFN-γ)的混合物。在一些实施方案中，所述试剂或试剂组合包括Th2相关细胞因子，或包含两种或更多种Th2相关细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-13)的混合物。
在一些实施方案中，所述抑制性抗原是肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原[TSA或新抗原]、肿瘤相关抗原[TAA]或癌症/睾丸抗原[CTA])。在一些实施方案中，所述免疫应答包括T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫应答包括抗原呈递细胞(APC)介导的免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫应答包括B细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，所述免疫应答包括由先天免疫系统的一种或多种细胞(例如，NK细胞、NKT细胞或单核细胞)介导的应答。
在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括一种或多种有益的临床应答。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括所述肿瘤或癌症的清除、消退或稳定化，例如一种或多种与癌症的清除、消退或稳定化相关的临床量度的水平。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括例如在限定的时间段(例如，至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周，或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年)内不存在癌症的复发、重现和/或转移。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括阳性癌症预后。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括癌症疗法或疗法组合的一种或多种毒性反应和/或副作用(例如，一种或多种可测量的毒性反应和/或副作用)的不存在或减少。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用癌症疗法或疗法组合。
本公开的另一方面包括一种治疗受试者的方法，所述方法包括：从患有肿瘤或癌症的受试者获得PBMC样品，从所述PBMC样品中除去对抑制性抗原有应答的多个T细胞以产生包含剩余PBMC的耗尽细胞群，以及向所述受试者施用包含所述耗尽细胞群的细胞治疗剂。在施用后，所述耗尽的细胞群介导增强对肿瘤或癌细胞的免疫控制的免疫应答。
在一些实施方案中，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，使所述耗尽细胞群与至少一种刺激性抗原接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，扩增(例如，特异性地或非特异性地扩增)所述耗尽细胞群中的T细胞。
在一些实施方案中，通过将所述耗尽细胞群在包含一种或多种刺激性细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40、IFN-γ)的培养基中培养来扩增所述细胞。在一些实施方案中，所述培养基还包含针对TGF-β和/或IL-10的阻断抗体。在一些实施方案中，所述培养基还包含至少一种刺激性抗原。
在一些实施方案中，通过使所述PBMC样品与分离珠粒(例如，磁珠)或荧光团接触来分离所述多个T细胞。在一些实施方案中，所述珠粒或荧光团与包含一种或多种特异性地结合所述抑制性抗原或刺激性抗原的T细胞受体(TCR)的四聚体偶联。在一些实施方案中，通过使所述PBMC样品与针对T细胞激活标志物的抗体例如抗4-1BB抗体、抗IL-2R抗体或抗CD40L抗体接触来分离所述多个T细胞。在一些实施方案中，所述抗体与荧光团或磁珠缀合。
在一些实施方案中，所述抑制性抗原是肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原[TSA或新抗原]、肿瘤相关抗原[TAA]或癌症/睾丸抗原[CTA])。
在一些实施方案中，所述细胞治疗剂诱导T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，所述细胞治疗剂诱导抗原呈递细胞(APC)介导的免疫应答。在一些实施方案中，所述细胞治疗剂诱导B细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，所述细胞治疗剂诱导由先天免疫系统的一种或多种细胞(例如，NK细胞、NKT细胞或单核细胞)介导的应答。
在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括一种或多种有益的临床应答。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括所述肿瘤或癌症的清除、消退或稳定化，例如一种或多种与癌症的清除、消退或稳定化相关的临床量度的水平。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括例如在限定的时间段(例如，至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周，或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年)内不存在癌症的复发、重现和/或转移。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括阳性癌症预后。在一些实施方案中，增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括癌症疗法或疗法组合的一种或多种毒性反应和/或副作用(例如，一种或多种可测量的毒性反应和/或副作用)的不存在或减少。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用癌症疗法或疗法组合。
本公开的另一方面包括一种重新训练T细胞群的方法，所述方法包括：从患有肿瘤或癌症的受试者获得PBMC样品，在所述PBMC样品中鉴定对抑制性抗原有应答的多个T细胞，以及通过使所述T细胞与试剂或试剂组合接触来重新训练所述多个T细胞(或所述多个T细胞的至少一部分)。在施用给所述受试者后，所述重新训练的T细胞介导增强对肿瘤或癌细胞的免疫控制的免疫应答。在一些实施方案中，所述方法产生多个重新训练的T细胞。
在一些实施方案中，用于在受试者中诱导免疫应答的方法还包括用于鉴定抑制性抗原和/或刺激性抗原的模块。所述模块可以通过测量与一种或多种有害或无益的癌症应答相关的一种或多种免疫介质的分泌来鉴定抑制性抗原和/或刺激性抗原。
在一些实施方案中，所述方法还包括：鉴定一种或多种抑制性抗原和/或一种或多种刺激性抗原。在一些实施方案中，所述方法包括：a)获得、提供或产生包含细菌细胞或珠粒的文库，所述细菌细胞或珠粒包含多种肿瘤抗原，其中所述文库的每个细菌细胞或珠粒包含不同的肿瘤抗原；b)使所述细菌细胞或珠粒与来自受试者的抗原呈递细胞(APC)接触，其中所述APC使所述细菌细胞或珠粒内化；c)在适于通过由一种或多种APC呈递的肿瘤抗原激活淋巴细胞的条件下，使所述APC与来自所述受试者的淋巴细胞接触；d)确定一种或多种淋巴细胞是否被由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原激活，或者是否对由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原没有应答，例如通过评估(例如，检测或测量)一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(例如，相对于对照增加或降低的水平)来确定；e)鉴定刺激、抑制和/或遏制一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平，并且/或者对一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平具有最小效应的一种或多种肿瘤抗原；以及(f)将增加与有害或无益的癌症应答相关的免疫介质的表达或分泌的一种或多种肿瘤抗原，和/或抑制和/或遏制与有益的癌症应答相关的免疫介质的表达和/或分泌的一种或多种肿瘤抗原鉴定为一种或多种抑制性抗原；和/或(g)将以下一种或多种肿瘤抗原鉴定为一种或多种刺激性抗原：(i)增加与一种或多种有益的癌症应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的一种或多种肿瘤抗原，和/或(ii)抑制和/或遏制与一种或多种有害或无益的癌症应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的一种或多种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，所述APC是分离自所述受试者的人APC；并且/或者所述细菌细胞还包含溶细胞素多肽；并且/或者所述溶细胞素多肽是李斯特菌溶血素O(LLO)；并且/或者所述APC以阵列形式提供，并且/或者所述阵列的每个位置中的所述APC与一组细菌细胞接触，每组包含不同的肿瘤抗原；并且/或者所述APC和淋巴细胞分离自外周血；并且/或者所述APC包含永生化细胞；并且/或者所述淋巴细胞来源于癌症或肿瘤。
在一些实施方案中，所述肿瘤抗原包含编码存在于癌症或肿瘤中的突变、剪接变体或易位的全长多肽；并且/或者所述肿瘤抗原包含多肽，所述多肽是编码存在于癌症或肿瘤中的突变、剪接变体或易位的全长多肽的片段；并且/或者所述肿瘤抗原包含由存在于癌症或肿瘤中的病毒或其他感染物编码的全长多肽；并且/或者所述肿瘤抗原包含多肽，所述多肽是由存在于癌症或肿瘤中的病毒或其他感染物编码的全长多肽的片段；并且/或者所述肿瘤抗原包含编码与癌症或肿瘤相关的自身抗原的全长多肽；并且/或者所述肿瘤抗原包含多肽，所述多肽是编码与癌症或肿瘤相关的自身抗原的全长多肽的片段。
附图说明
当与附图一起阅读时，通过以下各种说明性实施方案的描述，将更全面地理解本文所述的本教导内容。应当理解，下面描述的附图仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本教导内容的范围。
图1是示出了如通过针对不同的突变肿瘤蛋白，IFNγ(图A)或TNFα(图B)产生所测量的，归一化的CD8+T细胞应答水平的图。
图2是示出了使用本公开的方法和表位预测算法鉴定的CD8+T细胞刺激性抗原和抑制性抗原之间的有限重叠的Venn图。
图3示出了用于对本发明的刺激性抗原和抑制性抗原进行排名的示例性方法的图。运行三次筛选以测量IFNγ和TNFα(图A)，并基于三次筛选生成排名列表(图B和图C)。
图4示出了示例性抗原鉴定以及T细胞重新训练和扩增方法。
图5示出了T细胞从抑制性表型到刺激性表型的示例性重新训练。图A示出了膀胱癌患者的T细胞在于细胞因子混合物存在下培养之前对重叠肽(OLP)库刺激的IFNγ应答(左图)，并且图B示出了TNFα应答(右图)。图C示出了同一患者的T细胞在于细胞因子混合物存在下培养之后对重叠肽(OLP)库刺激的IFNγ应答(左图)，并且图D示出了TNFα应答(右图)。OLP跨越新抗原I1、I2、I3中的每一者或所有三种新抗原I1+I2+I3(库)。新抗原I1、I2和I3先前已通过ATLASTM筛查鉴定为具有抑制作用。二甲基亚砜(DMSO)用作对照刺激物。结果显示为每200,000个细胞(图A-B)或20,000个细胞(图C-D)中分泌的IFNγ或TNFα斑点形成细胞(SFC)的浓度。图上的每个竖线代表如在x轴上指示的经受刺激的T细胞的三次重复IFNγ或TNFα测定的平均值。每个点代表单个测定。
定义
激活：如本文所用，在允许发生抗原特异性识别的条件下，如果在暴露于由抗原呈递细胞(APC)呈递的肽之后，淋巴细胞的活性能够被检测到被调节了，则认为由所述APC呈递的所述肽“激活”了淋巴细胞。可以评估淋巴细胞活性的任何指标以确定淋巴细胞是否被激活，所述指标为例如，T细胞的增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌升高或降低、一种或多种细胞表面标志物的表达升高或降低。
施用：如本文所用，术语“施用”通常是指将组合物施用给受试者或系统。本领域普通技术人员应当意识到，在适当的情况下，可以使用各种途径向受试者(例如人)施用。例如，在一些实施方案中，施用可以是全身性的或局部的。在一些实施方案中，施用可以是肠内或肠胃外的。在一些实施方案中，可以通过注射(例如，肌肉内、静脉内或皮下注射)进行施用。在一些实施方案中，注射可以包括推注、滴注、灌注或输注。在一些实施方案中，施用可以是局部的。本领域技术人员应当知晓用于本文所述特定疗法的合适的施用途径，例如在www.fda.gov中列出的施用途径中的施用途径，其包括耳穴(耳部)、颊部、结膜、皮肤、牙部、宫颈内膜、内窦、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外(extracorporeal)、间质、腹腔内、羊膜腔内、动脉内、关节内、胆管内、支气管内、囊内(intrabursal)、心内、软骨内、尾部内、海绵体内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠状动脉内、阴茎海绵体内(intracorporuscavernosum)、皮内、结内、椎间盘内、管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、病灶内、管腔内、淋巴内、髓内、脑膜内、肌肉内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、鼻窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、玻璃体内、喉部、鼻腔、鼻胃管、眼部、口腔、口咽部、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸(例如，吸入)、眼球后部、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、经粘膜、经胎盘、经气管、输尿管、尿道或阴道施用。在一些实施方案中，施用可以涉及电渗透、血液透析、渗透、离子电渗疗法、冲洗和/或封闭敷料。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇给药(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或定期(例如，以相同的时间段分开的个体剂量)给药。在一些实施方案中，施用可以涉及连续给药。
过继细胞疗法：如本文所用，“过继细胞疗法”或“ACT”涉及将细胞(例如，免疫细胞)转移到受试者(例如，患有癌症的受试者)中。在一些实施方案中，ACT是一种治疗方法，其涉及使用具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞体外扩增合适数量，以及将它们输注到患有癌症的受试者中。
抗原：如本文所用，术语“抗原”是指引发特异性免疫应答的分子(例如，多肽)。抗原特异性免疫应答，也称为适应性免疫应答，由表达抗原受体(例如，T细胞受体、B细胞受体)的淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)介导。在某些实施方案中，抗原是T细胞抗原，并引发细胞免疫应答。在某些实施方案中，抗原是B细胞抗原，并引发体液(即，抗体)应答。在某些实施方案中，抗原既是T细胞抗原又是B细胞抗原。如本文所用，术语“抗原”涵盖全长多肽以及所述多肽的部分或免疫原性片段，以及所述多肽内的肽表位(例如，与主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如，MHC I类或MHC II类)结合的肽表位)。
抗原呈递细胞：“抗原呈递细胞”或“APC”是指呈递MHC I类和/或MHC II类分子上的肽以供T细胞识别的细胞。APC包括具有刺激初始淋巴细胞能力的专职APC(例如，树突状细胞、巨噬细胞、B细胞)，以及非专职APC(例如，成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经胶质细胞)。在某些实施方案中，APC能够内化(例如，内吞)表达有充当候选抗原的异源多肽的文库的成员(例如，细菌细胞文库的细胞)。
自溶素多肽：“自溶素多肽”是促进或介导已被真核细胞内化的细胞(例如，细菌细胞)的自溶的多肽。在一些实施方案中，自溶素多肽是细菌自溶素多肽。自溶素多肽包括但不限于在
Figure BDA0003071270850000111
中以登录号NP_388823.1、NP_266427.1和P0AGC3.1公开的多肽。
癌症：如本文所用，术语“癌症”是指疾病、病症或疾患，所述疾病、病症或疾患中细胞表现出相对异常的、不受控制的和/或自主的生长，使得它们显示出异常升高的增殖率和/或以细胞增殖显著失控为特征的异常生长表型。在一些实施方案中，癌症可以以一种或多种肿瘤为特征。本领域技术人员知晓多种类型的癌症，包括，例如，肾上腺皮质癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、类癌、心脏(cardiac)癌、胆管癌、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、颅咽管瘤、原位导管癌、室管膜瘤、眼内黑素瘤、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、组织细胞增生症、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性(myeloid)白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性(myelogenous)白血病(CML)、毛细胞白血病、髓性白血病、骨髓性白血病)、淋巴瘤(例如，伯基特淋巴瘤[非霍奇金淋巴瘤]、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、蕈样真菌病、Sezary综合征、AIDS相关淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)、黑素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、骨髓增生异常综合征、乳头状瘤病、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤(例如，尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、子宫肉瘤、血管肉瘤)、威尔姆氏瘤，和/或以下部位的癌症：肾上腺皮质、肛门、阑尾、胆管、膀胱、骨、脑、乳腺、支气管、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、眼、输卵管、胆囊、胃肠道、生殖细胞、头颈部、心脏、肠、肾(例如，威尔姆氏瘤)、喉、肝、肺(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、嘴、鼻腔、口腔、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、胃、睾丸、喉咙、甲状腺、阴茎、咽、腹膜、垂体、前列腺、直肠、唾液腺、输尿管、尿道、子宫、阴道或外阴。
溶细胞素多肽：“溶细胞素多肽”是具有在真核细胞的膜中形成孔的能力的多肽。当在已被真核细胞内化的宿主细胞(例如，细菌细胞)中表达时，溶细胞素多肽能促进将宿主细胞组分(例如，宿主细胞大分子如宿主细胞多肽)释放到所述具有内化作用的胞质溶胶中。在一些实施方案中，溶细胞素多肽是细菌溶细胞素多肽。在一些实施方案中，溶细胞素多肽是细胞质溶细胞素多肽。溶细胞素多肽包括但不限于在美国专利号6,004,815中以及在
Figure BDA0003071270850000121
中以登录号NP_463733.1、NP_979614、NP_834769、YP_084586、YP_895748、YP_694620、YP_012823、NP_346351、YP_597752、BAB41212.2、NP_561079.1、YP_001198769和NP_359331.1公开的多肽。
细胞质溶细胞素多肽：“细胞质溶细胞素多肽”是具有在真核细胞的膜中形成孔的能力并且在细菌细胞中被表达成细胞质多肽的溶细胞素多肽。细菌细胞不会显著分泌细胞质溶细胞素多肽。细胞质溶细胞素多肽可以通过多种方式提供。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是以编码所述细胞质溶细胞素多肽的核酸提供。在一些实施方案中，提供的细胞质溶细胞素多肽附着于珠粒。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽具有相对于分泌的溶细胞素多肽的序列改变的序列(例如，通过信号序列的缺失或变化而发生改变，从而使其无功能)。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是细胞质的，因为它在分泌不能的细胞中表达。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是细胞质的，因为其表达所在的细胞不识别与溶细胞素多肽连接的信号序列，也不介导其分泌。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是细菌溶细胞素多肽。
异源：本文中提及基因或多肽而使用的术语“异源”是指这样的基因或多肽：在其存在的和/或表达其的生物体中其不是天然存在的，和/或其已经被人为引入了生物体中。在一些实施方案中，异源多肽是本文所述的肿瘤抗原。
免疫介质：如本文所用，术语“免疫介质”是指影响免疫应答中涉及的细胞和过程的任何分子。免疫介质包括细胞因子、趋化因子、可溶性蛋白质和细胞表面标志物。
改善、提升、抑制、刺激、遏制或减少：如本文所用，术语“改善”、“提升”、“抑制”、“刺激”、“遏制”、“减少”或其语法等同物指示相对于基线或其他参考测量的值。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或者包括在除了不存在特定试剂或处理(例如，在其之前和/或之后)外其他都相当的条件下，或者在存在适当的相当的参考试剂的条件下，在特定系统中(例如，在单个个体中)的测量。特定试剂或处理的效应可以是直接的或间接的。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或者可以包括在相当的系统中的测量，所述系统已知或预期在存在相关试剂或处理的条件下以特定方式进行应答。在一些实施方案中，如果在允许发生抗原特异性识别的条件下，淋巴细胞在暴露于由抗原呈递细胞(APC)呈递的肽后被激活至与有益应答相关的表型，则由所述APC呈递的所述肽“刺激”所述淋巴细胞或对所述淋巴细胞是“刺激性的”，所述表型通过例如相对于对照的T细胞的增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌的增加或减少、一种或多种细胞表面标志物的表达的增加或减少观察得到。在一些实施方案中，如果在允许发生抗原特异性识别的条件下，淋巴细胞在暴露于由抗原呈递细胞(APC)呈递的肽后被激活至与有害或无益应答相关的表型，则由所述APC呈递的所述肽“遏制”、“抑制”所述淋巴细胞或对所述淋巴细胞是“抑制性的”，所述表型通过例如相对于对照的T细胞的增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌的增加或减少、一种或多种细胞表面标志物的表达的增加或减少观察得到。
抑制性抗原：“抑制性抗原”是抑制、遏制、削弱和/或降低对肿瘤或癌症的免疫控制的抗原。在一些实施方案中，抑制性抗原促进肿瘤生长，促成肿瘤生长，改善肿瘤生长，激活肿瘤生长，加速肿瘤生长，和/或增加和/或促成肿瘤转移。在一些实施方案中，抑制性抗原刺激一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答；并且/或者抑制和/或遏制一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答。在一些实施方案中，抑制性抗原是一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答的靶标；并且/或者抑制和/或遏制一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答。
侵袭素多肽：“侵袭素多肽”是促进或介导真核细胞摄取细胞(例如，细菌细胞)的多肽。侵袭素多肽在非侵入性细菌细胞中的表达赋予所述细胞进入真核细胞的能力。在一些实施方案中，侵袭素多肽是细菌侵袭素多肽。在一些实施方案中，侵袭素多肽是耶尔森氏菌侵袭素多肽(例如，包含在
Figure BDA0003071270850000141
中以登录号YP_070195.1公开的序列的耶尔森氏菌侵袭素多肽)。
李斯特菌溶血素O(LLO)：术语“李斯特菌溶血素O”或“LLO”是指单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌溶血素O多肽及其保留了成孔能力的截短形式(例如，LLO的细胞质形式、包括缺乏信号序列的截短形式)。在一些实施方案中，LLO是细胞质LLO。示例性LLO序列示于下面的表1中。
多肽：如本文所用，术语“多肽”通常具有其本领域公认的含义，即具有至少三个氨基酸的聚合物。但是，本领域普通技术人员应当理解，术语“多肽”应当足够通用至不仅涵盖具有本文(或在本文中具体提及的参考或数据库中)所述完整序列的多肽，而且还涵盖代表这些完整多肽的功能片段(即保留至少一种活性的片段)和免疫原性片段的多肽。此外，本领域普通技术人员理解，蛋白质序列通常能耐受一些取代而不破坏活性。因此，如本文所用的相关术语“多肽”涵盖任何这样的多肽：其保留了活性并且与同一类的另一多肽享有至少约30％-40％的总体序列同一性，所述总体序列同一性通常大于约50％、60％、70％或80％，并且还通常包括至少一个具有更高同一性的区域(在一个或多个高度保守的区域中通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％)，所述区域通常包括至少3-4个(通常多达20个或更多个)氨基酸。通过分析各种多肽的序列，本领域普通技术人员可以确定具有相似性和/或同一性的其他区域。
原代细胞：如本文所用，“原代细胞”是指来自生物体的在体外尚未永生化的细胞。在一些实施方案中，原代细胞是直接取自受试者(例如，人)的细胞。在一些实施方案中，原代细胞是取自受试者的细胞的后代(例如，已经在体外传代的细胞)。原代细胞包括在培养过程中已被刺激增殖的细胞。
重新训练(Re-educate)：如本文所用，在淋巴细胞应答的情形下，“重新训练”是指淋巴细胞对特定抗原的一种或多种应答的改变。在某些实施方案中，抗原初始刺激一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答，并且/或者所述抗原初始抑制和/或遏制一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答，并且这种淋巴细胞被重新训练，使得所述抗原不再刺激一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答，并且/或者所述抗原不再抑制和/或遏制一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答。在一些这样的实施方案中，这种淋巴细胞被重新训练，使得所述抗原刺激一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答，并且/或者所述抗原抑制和/或遏制一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答。
重定向：如本文所用，在免疫应答的情形下，“重定向”是指免疫应答的一个或多个方面的改变。在某些实施方案中，初始免疫应答(例如，对抗原的初始免疫应答)削弱或降低对肿瘤或癌症的免疫控制，并且这种初始免疫应答被重定向使得免疫应答(例如，对抗原的免疫应答)不再削弱或降低对肿瘤或癌症的免疫控制。在一些这样的实施方案中，这样的重定向的免疫应答增强对肿瘤的免疫控制。
应答：如在受试者(患者或实验生物体)的情形下使用的“应答”、“应答的”或“应答性”是指由治疗导致或与治疗相关的受试者的疾患的改变。在某些实施方案中，应答是有益应答。在某些实施方案中，有益应答可以包括稳定受试者的疾患(例如，防止或延迟预期或通常在没有治疗的情况下被观察到发生的恶化)，缓解(例如，频率和/或强度的降低)疾患的一种或多种症状，和/或改善疾患治愈前景等。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，有益应答可以包括：所述受试者对癌症疗法或组合疗法具有阳性临床应答；所述受试者对癌症有自发的应答；所述受试者的癌症部分或完全缓解；所述受试者已经清除了癌症；所述受试者未发生过癌症的复发、重现或转移；所述受试者具有阳性癌症预后；所述受试者未经历过对癌症疗法或组合疗法的毒性应答或副作用。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，过去有过有益应答，或者有益应答正在进行中。
在某些实施方案中，应答是有害或无益的应答。在某些实施方案中，有害或无益的应答可以包括受试者疾患的恶化、疾患的一种或多种症状没有改善(例如，频率和/或强度没有降低)、和/或疾患的治愈前景退化等。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，有害或无益的应答可以包括：所述受试者对癌症疗法或组合疗法具有阴性临床应答；所述受试者的癌症没有缓解；所述受试者尚未清除癌症；受试者发生过癌症的复发、重现或转移；所述受试者具有阴性癌症预后；所述受试者经历过对癌症疗法或组合疗法的毒性应答或副作用。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，过去有过有害或无益的应答，或者有害或无益的应答正在进行中。
如本文中在细胞、器官、组织或细胞组分(例如，淋巴细胞)的情形下使用的“应答”、“应答的”或“应答性”是指细胞活性的改变，所述改变的发生是由施用或暴露于试剂(例如肿瘤抗原)导致或与施用或暴露于试剂(例如肿瘤抗原)相关。在某些实施方案中，有益应答可以包括与受试者中的阳性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的增加。在某些实施方案中，有益应答可以包括与受试者中的阴性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的减少。在某些实施方案中，有害或无益的应答可以包括与受试者中的阴性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的增加。在某些实施方案中，有害或无益的应答可以包括与受试者中的阳性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的减少。在某些实施方案中，应答是临床应答。在某些实施方案中，应答是细胞应答。在某些实施方案中，应答是直接应答。在某些实施方案中，应答是间接应答。在某些实施方案中，“无应答”、“无应答的”或“无应答性”是指最小应答或没有可测得的应答。在某些实施方案中，“最小应答”包括没有可测得的应答。在某些实施方案中，可以根据特定标准测量和/或表征应答的存在情况、程度和/或性质。在某些实施方案中，此类标准可以包括临床标准和/或客观标准。在某些实施方案中，用于评估应答的技术可以包括但不限于临床检查、正电子发射断层扫描、胸部X射线、CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、样品中特定标志物的存在情况或水平、细胞学和/或组织学。当目标应答是肿瘤对疗法的应答时，本领域技术人员应当知晓用于评估此类应答(包括例如用于确定肿瘤负荷、肿瘤大小、肿瘤阶段等)的各种已建立的技术。在Therasse等人,J.Natl.Cancer Inst.,2000,92(3):205-216；和Seymour等人,Lancet Oncol.,2017,18:e143-52中讨论了用于评估对治疗的应答的方法和指南。可以以任何适当的方式选择确切的应答标准，条件是当比较肿瘤、患者或实验生物体，和/或细胞、器官、组织或细胞组分的组别时，要基于相同或相当的应答率确定标准来评估待比较的组。本领域普通技术人员应能够选择适当的标准。
刺激性抗原：“刺激性抗原”是增强、改善、提升和/或刺激对肿瘤或癌症的免疫控制的抗原。在一些实施方案中，刺激性抗原是减少、杀灭、缩小、消溶和/或根除肿瘤生长的免疫应答的靶标；不促进、促成、改善、激活和/或加速肿瘤生长；减少肿瘤转移；并且/或者减缓肿瘤生长。在一些实施方案中，刺激性抗原抑制和/或遏制一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答；并且/或者刺激一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答。
肿瘤：如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长。在一些实施方案中，肿瘤可以包括癌前(例如，良性)的、恶性的、转移前的、转移的和/或非转移的细胞。在一些实施方案中，肿瘤与癌症相关或是癌症的表现。在一些实施方案中，肿瘤可以是分散肿瘤或液体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤可以是实体瘤。
具体实施方式
新抗原正在成为个性化癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。与被识别为自身的肿瘤相关抗原(TAA)不同，新抗原可以包含非同义突变，这些突变可能被识别为免疫系统的外源突变，并且不受中枢耐受的影响。
免疫检查点抑制剂疗法(如用于癌症免疫疗法的伊匹单抗、纳武单抗和派姆单抗)的最新进展显示，已经在患有NSCLC以及其他适应症的受试者中产生了显著的功效。美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)已经批准将纳武单抗和派姆单抗用于先前接受过化学疗法的晚期NSCLC患者。它们证实了T细胞应答在控制肿瘤中的重要性。新抗原，即，在正常人类基因组中完全不存在的潜在的癌症排斥抗原，被认为与肿瘤的控制有关；但是，由于缺乏可用的工具来以生物学相关且无偏倚的方式确定新抗原，所以很难确定它们以及它们在肿瘤清除中的作用(Schumacher和Schreiber,2015Science 348:69-74，Gilchuk等人,2015Curr Opin Immunol 34:43-51)。
以非小细胞肺癌(NSCLC)为例，来自用派姆单抗治疗的患者的NSCLC肿瘤的全外显子组测序显示，肿瘤中较高的非同义突变负荷与改善的客观应答、持久的临床益处和无进展生存期相关(Rizvi等人,(2015)Science 348(6230):124-8)。在这项研究中，该发现队列的中位非同义突变负荷为209，验证队列的为200。但是，由于突变是通过测序鉴定的，并不意味着它所产生的表位能够被T细胞识别或充当T细胞应答的保护性抗原(Gilchuk等人,2015Curr Opin Immunol 34:43-51)，这使得对新抗原这个词的使用有些不太恰当。在NSCLC中具有200个或更多个T细胞的潜在靶标，不可能对每个预测的表位都进行测试以确定哪些突变充当新抗原，以及哪些新抗原与肿瘤控制的临床证据相关。最近，McGranahan等人的一项研究表明，原发性肺腺癌的克隆性新抗原负荷与总生存期相关。但是，即使对克隆性新抗原进行富集化，仍然得到50个至约400个范围的潜在抗原靶标(McGranahan等人,2016Science 351:1463-69)。在对伊匹单抗疗法有应答的黑素瘤患者(Snyder等人,2015NEJM；Van Allen等人,2015Science)和用派姆单抗治疗的错配修复缺陷性结肠直肠癌患者(Le等人,2015NEJM)中也描述了类似的发现。
富集肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)新抗原靶向的过继T细胞疗法(ACT)已证明在转移性癌症中有临床反应，而脱靶毒性有限1,2。尽管过继TIL疗法在一些患者中产生了持久的肿瘤消退，但大多数患者并未受益。此外，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法仅限于TIL含量高的可切除的大肿瘤。
ATLASTM是目前唯一的无需使用算法或计算机软件下拉选择标准即可快速、高通量定量现存的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞应答的平台，而且先前已经产生了作为疫苗施用时具有临床功效的抗原4。在癌症中，ATLAS通过使用患者自身的自体免疫细胞，特别是单核细胞衍生的树突状细胞(MDDC)作为抗原呈递细胞(APC)以及分选的CD8+和CD4+T细胞，能够全面筛查肿瘤突变组。通过利用自体APC和T细胞，ATLAS与MHC类型无关，并评估现存的对任何给定突变的T细胞应答3。用有序排列的大肠杆菌诱导患者MDDC，大肠杆菌以短多肽形式表达患者特异性突变，使用或不使用共表达的李斯特菌溶血素O(cLLO)以分别促进MHC I类或II类呈递。随后添加CD8+或CD4+T细胞，并在过夜孵育后，通过相对于对照应答显著上调或下调T细胞细胞因子分泌，将抗原差异表征为刺激性或抑制性的；因此，ATLAS测定允许鉴定和表征所需的以及潜在不期望的抗原特异性T细胞应答。
本文所述的系统和方法通过使用ATLASTM技术从外周血中鉴定出新抗原或其他肿瘤特异性抗原反应性T细胞3，并特异性地扩增这些细胞以供T细胞输注，从而改善了ACT。这种个性化的ACT能够靶向多种新抗原，限制转移性肿瘤逃逸，平衡新抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的含量，并扩大适应症的选择范围。
本公开部分地提供用于快速鉴定引发T细胞应答特别是引发人类T细胞应答的肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)、肿瘤相关抗原(TAA)或癌症/睾丸抗原(CTA))，以及可能是潜在的肿瘤抗原的多肽的方法和系统。出于本公开的目的，“肿瘤抗原”包括肿瘤抗原和潜在的肿瘤抗原。如本文所述，本公开的方法鉴定出了已知算法未鉴定出的刺激性肿瘤抗原。此外，本公开的方法鉴定出了已知算法无法鉴定的遏制性和/或抑制性肿瘤抗原。本公开所述的方法还鉴定出了可能是潜在肿瘤抗原的多肽，即，激活非癌症受试者的T细胞但不激活癌症受试者的T细胞的多肽。本公开还提供了选择肿瘤抗原和潜在肿瘤抗原的方法、使用所选的肿瘤抗原和潜在肿瘤抗原的方法、包含所选的肿瘤抗原和潜在肿瘤抗原的免疫原性组合物、以及制备免疫原性组合物的方法。
另外，本公开提供了重新训练淋巴细胞以改变淋巴细胞对特定抗原(例如，抑制性抗原)的一种或多种应答的方法；重定向一种或多种免疫应答(例如，对抗原例如抑制性抗原的免疫应答)的方法；以及通过重新训练淋巴细胞以改变淋巴细胞对特定抗原(例如，抑制性抗原)的一种或多种应答和/或重定向一种或多种免疫应答(例如，对抗原例如抑制性抗原的免疫应答)来治疗受试者(例如，患有肿瘤或癌症的受试者)的方法。
文库的产生
文库是成员(例如，细胞或非细胞颗粒，如病毒颗粒、脂质体或珠粒(例如，用多肽(如体外翻译的多肽)包被的珠粒，例如亲和珠粒，例如抗体包被的珠粒，或结合目标多肽的NTA-Ni珠粒))的集合。根据本公开，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)本文所述的目标多肽。在一些实施方案中，文库成员是内部表达本文所述目标多肽的细胞。在一些实施方案中，文库成员是携带目标多肽，和/或与目标多肽结合的颗粒。在测定系统中使用文库可以在体外同时评估对多个候选抗原的细胞应答。根据本公开，将文库设计成被人抗原呈递细胞内化，使得来自文库成员的肽(包括来自内部表达的目标多肽的肽)被呈递在所述抗原呈递细胞的MHC分子上以供T细胞识别。
文库可以用于检测由人MHC I类和MHC II类分子呈递的肽的测定中。由内化的文库成员表达的多肽在人细胞的细胞内内吞区室(例如，吞噬体、内体、溶酶体)中被消化，并呈递在MHC II类分子上，其被人CD4+T细胞识别。在一些实施方案中，除目标多肽外，文库成员还包括溶细胞素多肽。在一些实施方案中，除目标多肽外，文库成员还包括侵袭素多肽。在一些实施方案中，除目标多肽外，文库成员还包括自溶素多肽。在一些实施方案中，向文库成员提供表达溶细胞素多肽的细胞(即，溶细胞素和目标多肽不在同一细胞中表达，并且将抗原呈递细胞暴露于包括溶细胞素的成员和包括目标多肽的成员，使得所述抗原呈递细胞将两者都内化，并且使得溶细胞素促进目标多肽向抗原呈递细胞的MHC I类途径的递送)。溶细胞素多肽可以在细胞中组成型表达，或者它可以受诱导型表达系统(例如诱导型启动子)的控制。在一些实施方案中，溶细胞素在诱导型启动子的控制下表达，以使对表达所述溶细胞素的细胞的细胞毒性最小化。
一旦被人细胞内化，溶细胞素多肽便穿透所述人细胞中的细胞内区室，从而允许由文库成员表达的多肽进入所述人细胞的胞质溶胶。释放到胞质溶胶中的多肽被呈递在MHC I类分子上，其被CD8+T细胞识别。
文库可以包括任何类型的细胞或颗粒，所述细胞或颗粒能被抗原呈递细胞内化并将目标多肽(和在需要溶细胞素多肽的应用中的溶细胞素多肽)递送给抗原呈递细胞以用于本文所述的方法。虽然在本说明书中通篇使用术语“细胞”来指代文库成员，但是应当理解，在一些实施方案中，所述文库成员是非细胞颗粒，如病毒颗粒、脂质体或珠粒。在一些实施方案中，文库的成员包括编码目标多肽(和溶细胞素多肽)的多核苷酸，并且可以在被抗原呈递细胞内化之前和/或期间被诱导以表达目标多肽(和溶细胞素多肽)。
在一些实施方案中，所述溶细胞素多肽对于表达它的文库细胞来说是异源的，并且有助于将由所述文库细胞表达的多肽递送到已经内化了所述文库细胞的人细胞的胞质溶胶中。溶细胞素多肽包括细菌溶细胞素多肽，如李斯特菌溶血素O(LLO)、链球菌溶血素O(SLO)和产气荚膜梭菌溶血素(perfringolysin)O(PFO)。其他的溶细胞素多肽描述于美国专利号6,004,815中。在某些实施方案中，文库成员表达LLO。在一些实施方案中，溶细胞素多肽不被文库细胞显著分泌(例如，细胞产生的溶细胞素多肽的少于20％、10％、5％或1％被分泌)。例如，溶细胞素多肽是细胞质溶细胞素多肽，如细胞质LLO多肽(例如，缺乏N末端信号序列的LLO形式，如Higgins等人,Mol.Microbiol.31(6):1631-1641,1999中描述的)。示例性的溶细胞素多肽序列示于表1中。表1第二行中所示的李斯特菌溶血素O(Δ3-25)序列与表1第一行中所示的LLO序列相比缺失第3-25位残基，并且是细胞质LLO多肽。在一些实施方案中，溶细胞素在文库宿主细胞中组成型表达。在其他实施方案中，溶细胞素在诱导型启动子的控制下表达。溶细胞素多肽可以由与目标多肽相同的载体或不同的载体在文库细胞中表达。
表1.示例性溶细胞素多肽
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在一些实施方案中，文库成员(例如，是细菌细胞的文库成员)包括促进被抗原呈递细胞摄取的侵袭素。在一些实施方案中，文库成员包括促进抗原呈递细胞内文库成员自溶的自溶素。在一些实施方案中，文库成员包括侵袭素和自溶素两者。在一些实施方案中，文库成员是大肠杆菌细胞，其包括侵袭素和/或自溶素。在各种实施方案中，在也利用非专职抗原呈递细胞或来自细胞系的抗原呈递细胞的方法中，使用表达侵袭素和/或自溶素的文库细胞。Isberg等人(Cell,1987,50:769-778)，Sizemore等人(Science,1995,270:299-302)和Courvalin等人(C.R.Acad.Sci.Paris,1995,318:1207-12)描述了侵袭素的表达以实现靶细胞对细菌的内吞作用。以下文献描述了自溶素：Cao等人,Infect.Immun.1998,66(6):2984-2986；Margot等人,J.Bacteriol.1998,180(3):749-752；Buist等人,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(7):2722-2728；Yamanaka等人,FEMSMicrobiol.Lett.,1997,150(2):269-275；Romero等人,FEMS Microbiol.Lett.,1993,108(1):87-92；Betzner和Keck,Mol.Gen.Genet.,1989,219(3):489-491；Lubitz等人,J.Bacteriol.,1984,159(1):385-387；和Tomasz等人,J.Bacteriol.,1988,170(12):5931-5934。在一些实施方案中，自溶素具有允许延迟裂解的特征，例如，自溶素是温度敏感的或时间敏感的(参见，例如，Chang等人,1995,J.Bact.177,3283-3294；Raab等人,1985,J.Mol.Biol.19,95-105；Gerds等人,1995,Mol.Microbiol.17,205-210)。可用的溶细胞素还包括成瘾(毒药/解毒剂)自溶素(参见，例如，Magnuson R,等人,1996,J.Biol.Chem.271(31),18705-18710；Smith A S,等人,1997,Mol.Microbiol.26(5),961-970)。
在一些实施方案中，文库的成员包括细菌细胞。在某些实施方案中，文库包括非致病性的、非毒性细菌细胞。用作文库成员的细菌的实例包括大肠杆菌、分枝杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或沙门氏菌(Salmonella)。
在一些实施方案中，文库的成员包括真核细胞(例如，酵母细胞)。在一些实施方案中，文库的成员包括病毒(例如噬菌体)。在一些实施方案中，文库的成员包括脂质体。制备包含溶细胞素的脂质体的方法和其他试剂描述于Kyung-Dall等人的美国专利号5,643,599中。在一些实施方案中，文库的成员包括珠粒。制备由珠粒组成的文库的方法描述于例如Lam等人,Nature 354:82-84,1991、美国专利号5,510,240和7,262,269，以及本文引用的参考文献中。
在某些实施方案中，通过将编码目标多肽或其部分的多核苷酸克隆到载体中来构建文库，所述载体在所述文库的细胞中表达目标多肽。可以以合成的方式合成多核苷酸。可以通过设计扩增多核苷酸的引物来克隆多核苷酸。可以使用可用的软件来设计引物，所述软件例如Primer3Plus(可从以下URL获取：bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi；参见Rozen和Skaletsky，于：Krawetz S,Misener S(编辑)Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.HumanaPress,Totowa,NJ,第365-386页,2000)。用于设计引物的其他方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，构建引物以产生截短的、和/或缺乏疏水区(例如，信号序列或跨膜区)的多肽以促进有效表达。可以使用可用的软件(参见，例如，
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等人,J.Mol.Biol.,340:783-795,2004，和以下URL：cbs.dtu.dk/services/SignalP/)确定预测的信号序列和预测的信号序列切割位点在给定的开放阅读框(ORF)序列中的位置。例如，如果预测信号序列位于给定多肽序列的N末端20个氨基酸处，则将引物设计成与编码所述N末端20个氨基酸的核苷酸的下游的编码序列退火，使得扩增的序列编码缺少该信号序列的产物。
引物也可以被设计成包括便于后续克隆步骤的序列。ORF可以直接从基因组DNA(例如，肿瘤细胞的基因组DNA)扩增得到，或者从由通过肿瘤细胞表达的mRNA的逆转录(RT-PCR)产生的多核苷酸扩增得到。例如当目标基因组序列含有内含子区域时，mRNA的RT-PCR是有用的。将PCR扩增得到的ORF克隆到合适的载体中，并且可以在用于免疫学测定之前验证ORF的大小、序列和表达。
在一些实施方案中，将编码目标多肽的多核苷酸与编码标签(例如，N末端或C末端表位标签)或报告蛋白(例如，荧光蛋白)的序列连接。表位标签和报告蛋白促进所表达多肽的纯化，并且可以允许人们验证给定多肽在文库宿主细胞中的正确表达(例如，在将所述细胞用于筛选之前进行验证)。可用的表位标签包括，例如，多组氨酸(His)标签、来自副粘病毒的P和V蛋白的V5表位标签、血凝素(HA)标签、myc标签等。在一些实施方案中，将编码目标多肽的多核苷酸与编码标签的序列融合，所述标签是已知的抗原表位(例如，模式抗原(如卵清蛋白)的MHC I类和/或MHC II类限制性T细胞表位)，并且其可以用于验证目标多肽是否被表达以及多肽-标签融合蛋白是否在抗原呈递测定中被加工和呈递。在一些实施方案中，标签包括鼠T细胞(例如鼠T细胞系)的T细胞表位。在一些实施方案中，将编码目标多肽的多核苷酸与促进纯化的标签和是已知的抗原表位的标签连接。可用的报告蛋白包括天然存在的荧光蛋白及其衍生物，例如绿色荧光蛋白(维多利亚多管发光水母(AequoreaVictoria))和霓虹绿(普通文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum))。也可以从商业来源获得以合成的方式衍生的荧光和生色蛋白质组。
将编码目标多肽的多核苷酸克隆到表达载体中以引入文库宿主细胞中。各种载体系统都可用于促进多核苷酸的克隆和操作(如
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克隆系统(Invitrogen))。本领域技术人员知道，表达载体包括驱动由文库宿主细胞中多核苷酸编码的目标多肽的产生的元件(例如，启动子和其他调控元件)。在一些实施方案中，多肽的表达受诱导型元件(仅举几个例子，例如，诱导型启动子如IPTG或阿拉伯糖诱导型启动子，或IPTG诱导型噬菌体T7 RNA聚合酶系统，乳糖(lac)启动子，色氨酸(trp)启动子，tac启动子，trc启动子，噬菌体λ启动子，碱性磷酸酶(phoA)启动子；参见Cantrell,Meth.in Mol.Biol.,235:257-276,HumanaPress,Casali和Preston编辑)的控制。在一些实施方案中，多肽被表达为细胞质多肽。在一些实施方案中，用于多肽表达的载体是在文库宿主细胞中具有高拷贝数的载体。在一些实施方案中，用于表达的载体具有大于25、50、75、100、150、200或250拷贝/细胞的拷贝数。在一些实施方案中，用于表达的载体具有ColE1复制起点。用于在细菌中表达多肽的可用载体包括pET载体(Novagen)、
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pDEST载体(Invitrogen)、pGEX载体(AmershamBiosciences)、pPRO载体(BD Biosciences)、pBAD载体(Invitrogen)、pLEX载体(Invitrogen)、pMALTM载体(New England BioLabs)、pGEMEX载体(Promega)和pQE载体(Qiagen)。用于产生噬菌体文库的载体系统是已知的，包括Novagen
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载体和NewEngland Biolabs的Ph.D.TM肽展示克隆系统(Peptide Display Cloning System)。
在一些实施方案中，文库宿主细胞表达(组成型地表达或在诱导下表达，取决于所选择的表达系统)的目标多肽占总细胞蛋白质的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，在文库成员(例如，细胞、病毒颗粒、脂质体、珠粒)中或文库成员上可得的多肽水平是这样的水平：其使得暴露于足够量的文库成员的抗原呈递细胞呈递在MHC分子的多肽表位的密度与由用纯化的肽诱导的抗原呈递细胞呈递的密度相当。
已有一些有效地、大规模地生产文库的方法。例如，位点特异性重组酶或稀有切割限制酶可以用于在正确方向上的表达载体和阅读框架之间转移多核苷酸(Walhout等人,Meth.Enzymol.328:575-592,2000；Marsischky等人,Genome Res.14:2020-202,2004；Blommel等人,Protein Expr.Purif.47:562-570,2006)。
对于产生脂质体文库，可以将表达的多肽(例如，纯化的或部分纯化的多肽)包埋在脂质体膜中，例如，如Wassef等人的美国专利号4,863,874；Wheatley等人的美国专利号4,921,757；Huang等人的美国专利号4,925,661；或Martin等人的美国专利号5,225,212中所述。
可以将文库设计成包括全长多肽和/或多肽的一部分。全长多肽的表达使得可用于由人抗原呈递细胞呈递的表位最大化，从而提升鉴定抗原的可能性。但是，在一些实施方案中，为了实现有效表达，表达多肽的一部分或以其他方式改变的多肽是有用的。例如，在一些实施方案中，对编码大(例如，大于1,000个氨基酸)的多肽且具有扩展的疏水区、信号肽、跨膜结构域或引起细胞毒性的结构域的多肽的多核苷酸进行修饰(例如，通过C末端截短、N末端截短或内部缺失进行修饰)以降低细胞毒性并允许文库细胞的有效表达，这反过来有助于在人细胞上呈递被编码的多肽。其他类型的修饰如点突变或密码子优化，也可以用于增强表达。
包含在文库中的多肽的数量是可以变化的。例如，在一些实施方案中，可以将文库设计成从靶细胞(例如肿瘤细胞)的ORF的至少5％、10％、15％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多表达多肽。在一些实施方案中，文库表达至少10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2500、5000、10,000或更多种不同的目标多肽，每种可以代表由单个全长多核苷酸或其部分编码的多肽。
在一些实施方案中，测定可以专注于鉴定分泌多肽、细胞表面表达的多肽或毒力决定簇等抗原，以鉴定可能是体液和细胞两者介导的免疫应答的靶标的抗原。
除目标多肽外，文库可以包括标签或报告蛋白，其允许人们容易地纯化、分析或评估目标多肽的MHC呈递情况。在一些实施方案中，由文库表达的多肽包括C末端标签，其包括来自模式抗原(如鸡卵清蛋白(OVA))的MHC I类和MHC II类限制性T细胞表位。使用这些表位验证文库蛋白的表达和MHC呈递。在一些实施方案中，表位分别是OVA247-265和OVA258-265，其对应于在
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中在登录号NP_990483下的氨基酸序列中的位置。可以使用特异性识别这些表位的T细胞杂交瘤(例如，通过H2-Kb限制的B3Z T杂交瘤细胞和通过H2-Ak限制的KZO T杂交瘤细胞)通过抗原呈递测定来验证连接后的ORF的表达和呈递。
可以在阵列上(例如，在固体支持物如96孔板上)提供多组文库成员(例如，细菌细胞)并分离，使得每个位置上的成员表达不同的目标多肽，或一组不同的目标多肽。
下文详细描述了使用文库成员鉴定T细胞抗原的方法。除这些方法外，文库成员还可以用于鉴定B细胞抗原的测定中。例如，从包含目标多肽的文库成员制得的裂解物可以用于筛选包含来自受试者(例如，已暴露于目标感染物的受试者，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的抗体(例如，血清样品)的样品，以确定存在于所述受试者中的抗体是否与目标多肽反应。用于评估抗体反应性的合适的方法是已知的并且包括例如ELISA测定。
目标多肽
在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可以用于鉴定和/或检测对目标多肽的免疫应答。在一些实施方案中，目标多肽由来自靶肿瘤细胞的ORF编码，并且文库成员包括(例如，内部表达或携带)来自靶肿瘤细胞的ORF。在一些这样的实施方案中，文库可以用于本文所述的方法中，以评估对由一种或多种ORF编码的一种或多种目标多肽的免疫应答。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为刺激性抗原(例如，刺激免疫应答，例如T细胞应答，例如一种或多种免疫介质的表达和/或分泌)。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为对免疫应答(例如，一种或多种免疫介质的表达和/或分泌)具有最小效应或没有效应的抗原或潜在抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为抑制性和/或遏制性抗原(例如，抑制、遏制、下调、削弱和/或阻止免疫应答，例如T细胞应答，例如一种或多种免疫介质的表达和/或分泌)。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为肿瘤抗原或潜在的肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)、肿瘤相关抗原(TAA)或癌症/睾丸抗原(CTA)。
在一些实施方案中，目标多肽是推定的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可以用于鉴定和/或检测对一种或多种推定的肿瘤抗原的免疫应答。例如，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)推定的肿瘤抗原(例如，先前被鉴定(例如，通过第三方鉴定)为肿瘤抗原的多肽，例如，使用除本公开方法外的其他方法鉴定为肿瘤抗原的多肽)。在一些实施方案中，推定的肿瘤抗原是本文所述的肿瘤抗原。在一些这样的实施方案中，此类文库可以用于评估此类推定的肿瘤抗原是否和/或以何种程度介导免疫应答。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种推定的肿瘤抗原鉴定为刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种推定的肿瘤抗原鉴定为对免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种推定的肿瘤抗原鉴定为抑制性和/或遏制性抗原。
在一些实施方案中，目标多肽是预先选择的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可以用于鉴定和/或检测对一种或多种预先选择的肿瘤抗原的免疫应答。例如，在一些实施方案中，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)使用本公开方法和/或使用除本公开方法外的其他方法鉴定为肿瘤抗原的一种或多种多肽。在一些这样的实施方案中，此类文库可以用于评估此类肿瘤抗原是否和/或以何种程度介导由来自一个或多个受试者(例如，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的免疫细胞产生的免疫应答，以获得本文所述的一个或多个应答谱。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种预先选择的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种预先选择的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种预先选择的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的抑制性和/或遏制性抗原。
在一些实施方案中，目标多肽是已知的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可以用于鉴定和/或检测对一种或多种已知肿瘤抗原的免疫应答。例如，在一些实施方案中，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)使用本公开方法和/或使用除本公开方法外的其他方法鉴定为肿瘤抗原的一种或多种多肽。在一些这样的实施方案中，此类文库可以用于评估此类肿瘤抗原是否和/或以何种程度介导由来自一个或多个受试者(例如，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的免疫细胞产生的免疫应答，以获得本文所述的一个或多个应答谱。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种已知的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种已知的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种已知的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的抑制性和/或遏制性抗原。
在一些实施方案中，目标多肽是潜在的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可以用于鉴定和/或检测对一种或多种潜在肿瘤抗原的免疫应答。例如，在一些实施方案中，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)使用本公开的方法和/或使用除本公开的方法外的其他方法鉴定为目标多肽的一种或多种多肽，例如，编码与肿瘤相关的突变的多肽。在一些这样的实施方案中，此类文库可以用于评估此类多肽是否和/或以何种程度介导由来自一个或多个受试者(例如，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的免疫细胞产生的免疫应答，以获得本文所述的一个或多个应答谱。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种多肽鉴定为对一个或多个受试者的刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种多肽鉴定为对一个或多个受试者的免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种多肽鉴定为对一个或多个受试者的抑制性和/或遏制性抗原。
肿瘤抗原
本文所述的方法和系统中使用的目标多肽包括肿瘤抗原和潜在的肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)、肿瘤相关抗原(TAA)和/或癌症/睾丸抗原(CTA)。示例性肿瘤抗原包括例如MART-1/MelanA(MART-I或MLANA)、gp100(Pmel 17或SILV)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3(也称为HIP8)、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、降钙素、钙视网膜蛋白、癌胚抗原(CEA)、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、上皮细胞膜蛋白(EMA)、因子VIII、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、Gross囊性疾病液蛋白(GCDFP-15)、HMB-45、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、抑制素、淋巴细胞标志物、MART-1(Melan-A)、Myo D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、前列腺特异性抗原、PTPRC(CD45)、S100蛋白、平滑肌肌动蛋白(SMA)、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、肿瘤M2-PK、波形蛋白、p53、Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦巴尔病毒抗原(例如，EBNA1)、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6或E7(HPV_E6或HPV_E7)、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO-1(也称为CTAG1B)、erbB、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白(AFP)、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、MUC16、IL13Rα2、FRα、VEGFR2、Lewis Y、FAP、EphA2、CEACAM5、EGFR、CA6、CA9、GPNMB、EGP1、FOLR1、内皮受体、STEAP1、SLC44A4、Nectin-4、AGS-16、鸟苷酸环化酶C、MUC-1、CFC1B、整合素α3链(a3b1的、一种层粘连蛋白受体链)、TPS、CD19、CD20、CD22、CD30、CD31、CD72、CD180、CD171(L1CAM)、CD123、CD133、CD138、CD37、CD70、CD79a、CD79b、CD56、CD74、CD166、CD71、CD34、CD99、CD117、CD80、CD28、CD13、CD15、CD25、CD10、CLL-1/CLEC12A、ROR1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3)、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSCA、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、BCMA、GD-2、PSAP、Prostein(也称为P501S)、PSMA、存活蛋白(Survivin)(也称为BIRC5)，以及MAGE-A3、MAGEA2、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、BIRC5、CDH3、CEACAM3、CGB_同种型2、ELK4、ERBB2、HPSE1、HPSE2、KRAS_同种型1、KRAS_同种型2、MUC1、SMAD4、TERT,2.TERT.3、TGFBR2、EGAG9_同种型1、TP53、CGB_同种型1、IMPDH2、LCK、血管生成素1(Ang1)(也称为ANGPT1)、XIAP(也称为BIRC4)、半乳糖凝集素3(也称为LGALS3)、VEGF-A(也称为VEGF)、ATP6S1(也称为ATP6AP1)、MAGE-A1、cIAP-1(也称为BIRC2)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、半乳糖凝集素9(也称为LGALS9)、颗粒蛋白前体PGRN(也称为颗粒蛋白)、OGFR、MLIAP(也称为BIRC7)、TBX4(也称为ICPPS、SPS或T-Box4)、分泌性白细胞蛋白抑制因子(Slpi)(也称为抗白细胞蛋白酶)、Ang2(也称为ANGPT2)、半乳糖凝集素1(也称为LGALS1)、TRP-2(也称为DCT)、hTERT(端粒酶逆转录酶)酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1、TYRP1)、NOR-90/UBF-2(也称为UBTF)、LGMN、SPA17、PRTN3、TRRAP_1、TRRAP_2、TRRAP_3、TRRAP_4、MAGEC2、PRAME、SOX10、RAC1、HRAS、GAGE4、AR、CYP1B1、MMP8、TYR、PDGFRB、KLK3、PAX3、PAX5、ST3GAL5、PLAC1、RhoC、MYCN、REG3A、CSAG2、CTAG2-1a、CTAG2-1b、PAGE4、BRAF、GRM3、ERBB4、KIT、MAPK1、MFI2、SART3、ST8SIA1、WDR46、AKAP-4、RGS5、FOSL1、PRM2、ACRBP、CTCFL、CSPG4、CCNB1、MSLN、WT1、SSX2、KDR、ANKRD30A、MAGED1、MAP3K9、XAGE1B、PREX2、CD276、TEK、AIM1、ALK、FOLH1、GRIN2AMAP3K5以及任何前述肿瘤抗原的一种或多种同种型。示例性肿瘤抗原提供在随附的序列表中。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含提供在随附的序列表中的氨基酸序列的变体(例如，与提供在随附的序列表中的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的序列，和/或与提供在随附的序列表中的氨基酸序列相比包括至少一个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸)的突变、缺失和/或插入的序列)。
肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)是在正常宿主基因组中不被编码的肿瘤抗原(参见，，Yarchoan等人,Nat.Rev.Cancer.2017年2月24日.doi:10.1038/nrc.2016.154；Gubin等人,J.Clin.Invest.125:3413-3421(2015))。在一些实施方案中，TSA起因于体细胞突变和/或其他遗传改变。在一些实施方案中，TSA起因于错义或框内(in-frame)突变。在一些实施方案中，TSA起因于移码突变或终止密码子缺失突变。在一些实施方案中，TSA起因于插入或缺失突变。在一些实施方案中，TSA起因于复制或重复扩增突变。在一些实施方案中，TSA起因于剪接变体或不正确的剪接。在一些实施方案中，TSA起因于基因融合。在一些实施方案中，TSA起因于易位。在一些实施方案中，TSA包括致癌病毒蛋白。例如，就像与Merkel细胞多瘤病毒(MCPyV)相关的Merkel细胞癌(MCC)以及与人乳头瘤病毒(HPV)相关的宫颈癌、口咽癌和其他部位的癌症一样，TSA包括由病毒开放阅读框编码的蛋白质。出于本公开的目的，术语“突变”包括可以产生抗原的所有突变和遗传改变，所述抗原在受试者的癌症或肿瘤细胞的基因组中被编码但在同一受试者的正常细胞或非癌细胞中不被编码。在一些实施方案中，TSA对受试者是特异性的(个体的)。在一些实施方案中，超过一个受试者(例如，患有癌症的受试者中有少于1％、1％-3％、1％-5％、1％-10％或更多的受试者)共享TSA。在一些实施方案中，由超过一个受试者共享的TSA可以是已知的或预先选择的。
在一些实施方案中，TSA由来自病毒的开放阅读框编码。例如，可以将文库设计成表达来自以下病毒之一的多肽：免疫缺陷病毒(例如，人免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-1、HIV-2)、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒、非甲型肝炎病毒和非乙型肝炎病毒)、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、HHV-7、HHV-8)、痘病毒(例如，天花、牛痘、猴痘、传染性软疣病毒)、流感病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、柯萨奇病毒、人T细胞白血病病毒(I型、II型和III型)、副流感病毒、副粘病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、鼻病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、胡宁病毒、拉沙病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒。还可以根据本文所述的方法生产和使用其他病毒的文库。
肿瘤特异性抗原在本领域中是已知的，其中任何抗原都可以用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，通过使用下一代测序技术对来自患有癌症的受试者的肿瘤组织和健康组织的基因组和/或外显子组进行测序来确定编码作为潜在或推定的新抗原的多肽的基因序列。在一些实施方案中，使用下一代测序技术对基于突变频率和编码潜在或推定的新抗原的能力所选择的基因进行测序。下一代测序适用于基因组测序、基因组重测序、转录组分析(RNA-Seq)、DNA-蛋白质相互作用(ChIP-测序)和表观基因组表征(de Magalhaes等人(2010)Ageing Research Reviews 9(3):315-323；Hall N(2007)J.Exp.Biol.209(Pt9):1518-1525；Church(2006)Sci.Am.294(1):46-54；ten Bosch等人(2008)Journal ofMolecular Diagnostics 10(6):484-492；Tucker T等人(2009)The American Journal ofHuman Genetics 85(2):142-154)。下一代测序可以用于快速揭示离散突变的存在情况，例如单个肿瘤中的编码突变，例如单个氨基酸变化(如错义突变、框内突变)或由移码突变产生的新的氨基酸延伸、缺失、基因融合、终止密码子中的通读突变、复制或重复扩增突变、剪接变体或不正确剪接的内含子的翻译、以及易位(例如，“neoORF”)。
用于鉴定潜在或推定的新抗原的另一种方法是直接蛋白质测序。使用多维MS技术(MSn)(包括串联质谱法(MS/MS))对酶促消化物进行的蛋白质测序也可以用于鉴定新抗原。这种蛋白质组学方法可以用于快速、高度自动化的分析(参见，例如，Gevaert等人,Electrophoresis21:1145-1154(2000))。用于对未知蛋白质进行从头测序的高通量方法也可以用来分析受试者肿瘤的蛋白质组以鉴定表达的潜在或推定的新抗原。例如，元鸟枪蛋白质测序(meta shotgun protein sequencing)可以用于鉴定表达的潜在或推定的新抗原(参见，例如，Guthals等人(2012)Molecular and Cellular Proteomics 11(10):1084-96)。
还可以使用MHC多聚体鉴定潜在或推定的新抗原，以鉴定新抗原特异性T细胞应答。例如，可以通过使用基于MHC四聚体的筛选技术对患者样品中的新抗原特异性T细胞应答进行高通量分析(参见，例如，Hombrink等人(2011)PLoS One；6(8):e22523；Hadrup等人(2009)Nature Methods,6(7):520-26；van Rooij等人(2013)Journal of ClinicalOncology,31:1-4；以及Heemskerk等人(2013)EMBO Journal,32(2):194-203)。
在一些实施方案中，本文所述的文库可以包括通过使用这些方法中的一种鉴定的一种或多种已知或预先选择的肿瘤特异性抗原，或一种或多种潜在或推定的肿瘤特异性抗原。
肿瘤相关抗原(TAA)包括在正常基因组中编码的蛋白质(参见，例如，Ward等人,Adv.Immunol.130:25-74(2016))。在一些实施方案中，TAA是正常分化抗原或异常表达的正常蛋白质。过表达的具有生长/存活促进功能的正常蛋白质如威尔姆氏瘤1(WT1)(Ohminami等人,Blood 95:286-293(2000))或Her2/neu(Kawashima等人,Cancer Res.59:431-435(1999))是直接参与致癌过程的TAA。蛋白质的翻译后修饰(如磷酸化)也可以导致TAA的形成(Doyle,J.Biol.Chem.281:32676-32683(2006)；Cobbold,Sci.Transl.Med.5:203ra125(2013))。通常超过一个受试者(例如，患有癌症的受试者中有少于1％、1％-3％、1％-5％、1％-10％、1％-20％或更多的受试者)共享TAA。在一些实施方案中，TAA是已知的或预先选择的肿瘤抗原。在一些实施方案中，对于个体受试者来说，TAA是潜在的或推定的肿瘤抗原。癌症/睾丸抗原(CTA)由各种肿瘤类型和生殖组织(例如，睾丸、胎儿卵巢和滋养细胞)表达但是在成人的其他正常组织中表达有限或者检测不到表达，并且通常不在正常生殖细胞上呈递，因为这些组织不表达MHC I类分子(参见，例如，Coulie等人,Nat.Rev.Cancer 14:135-146(2014)；Simpson等人,Nat.Rev.Cancer 5:615-625(2005)；Scanlan等人,Immunol.Rev.188:22-32(2002))。文库筛选
用于抗原呈递的人细胞
本公开尤其提供了用于鉴定由人免疫细胞识别的肿瘤抗原的组合物和方法。人抗原呈递细胞表达人淋巴细胞上的抗原受体和其他免疫激活分子的配体。鉴于物种间在MHC肽结合特异性和抗原加工酶方面的差异，由人细胞加工和呈递的抗原比在非人系统中鉴定的抗原更可能是在体内生理学相关的人抗原。因此，这些抗原的鉴定方法利用人细胞来呈递候选的肿瘤抗原多肽。根据本公开，能内化文库成员并将由所述文库成员表达的多肽呈递在MHC分子上的任何人细胞都可以用作抗原呈递细胞。在一些实施方案中，用于抗原呈递的人细胞是原代人细胞。细胞可以包括人的外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，在用于抗原呈递测定之前，将外周血细胞分成亚群(例如，包括树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞或它们的组合的亚群)。在一些实施方案中，表达MHC II类的细胞亚群选自外周血。在一个实例中，包括树突状细胞的细胞群分离自外周血。在一些实施方案中，分离树突状细胞的亚群(例如，浆细胞样、骨髓性或其亚群)。人树突状细胞标志物包括CD1c、CD1a、CD303、CD304、CD141和CD209。可以基于这些标志物中的一种或多种的表达来选择细胞(例如，表达CD303、CD1c和CD141的细胞)。
可以使用市售试剂盒(例如，Miltenyi Biotec Inc.的试剂盒)通过阳性选择从外周血分离树突状细胞。在一些实施方案中，所述树突状细胞在用于测定之前进行离体扩增。也可以通过在体外将外周血细胞在促进单核细胞前体分化成树突状细胞的条件下进行培养来产生树突状细胞。这些条件通常包括在存在细胞因子如GM-CSF和IL-4的条件下培养细胞(参见，例如，Inaba等人,Isolation of dendritic cells,Curr.Protoc.Immunol.May；第3章:单元3.7,2001)。用于在体外扩增造血干细胞和祖细胞(例如，取自骨髓或外周血)以及在体外将这些细胞分化成树突状细胞的方法描述于美国专利号5,199,942和美国专利公开号20030077263中。简单地说，从外周血或骨髓中分离CD34+造血干细胞和祖细胞，并在包括Flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体中的一种或多种的培养条件下进行体外扩增。
在一些实施方案中，将表达人MHC分子的永生化细胞(例如，人细胞，或被工程化成表达人MHC分子的非人细胞)用于抗原呈递。例如，测定可以利用转染有人MHC分子的COS细胞或HeLa细胞。
在一些实施方案中，所述方法中使用的抗原呈递细胞和免疫细胞均来源于相同的受试者(例如，使用自体T细胞和APC)。在这些实施方案中，从受试者的外周血中依次分离细胞亚群是有利的，以使得可用于测定的细胞的产量最大化。例如，可以首先从外周血中分离出CD4+和CD8+T细胞亚群。接下来，从T细胞耗尽的细胞群中分离出树突状细胞(DC)。剩余的T及DC耗尽的细胞用于在测定中补充DC，或单独用作抗原呈递细胞。在一些实施方案中，DC在测定中与T及DC耗尽的细胞一起使用，比例为1:2、1:3、1:4或1:5。在一些实施方案中，所述方法中使用的抗原呈递细胞和免疫细胞来源于不同的受试者(例如，使用异源T细胞和APC)。
可以从除外周血外的其他来源分离出抗原呈递细胞。例如，抗原呈递细胞可以取自粘膜组织(例如，鼻、口、支气管组织、气管组织、胃肠道、生殖道(例如，阴道组织)或相关淋巴组织)、腹膜腔、淋巴节、脾、骨髓、胸腺、肺、肝、肾、神经元组织、内分泌组织或其他组织，以用于筛选测定。在一些实施方案中，细胞取自活跃免疫应答部位(例如溃疡、疮或脓肿)的组织。可以经由灌洗或其他方式，从通过外科手术移除的组织分离出细胞。
可以用于本文所述方法的抗原呈递细胞不限于“专职”抗原呈递细胞。在一些实施方案中，非专职抗原呈递细胞可以有效地用于实施本公开的方法。非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经元/神经胶质细胞、不是专职抗原呈递细胞的淋巴或骨髓细胞(例如，T细胞、中性粒细胞)、肌细胞、肝细胞和其他类型的细胞。
在抗原呈递细胞内化、加工由文库成员表达的多肽并将其呈递在MHC分子上的条件下，将所述抗原呈递细胞与表达目标多肽(和溶细胞素多肽(如果有需要))的文库成员一起培养。在一些实施方案中，文库成员在与抗原呈递细胞一起培养之前被杀死或灭活。可以通过任何适当的试剂灭活(例如，用有机溶剂固定、辐照、冷冻)细胞或病毒。在一些实施方案中，文库成员是表达与标签(例如，包含一种或多种已知T细胞表位的标签)或报告蛋白连接的ORF的细胞，ORF的表达已在培养之前得到验证。
在一些实施方案中，将抗原呈递细胞与文库成员在37℃下孵育30分钟至5小时(例如，45分钟至1.5小时)。孵育后，可以洗涤抗原呈递细胞以除去未被内化的文库成员。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞是非粘附的，并且洗涤需要离心细胞。洗后的抗原呈递细胞可以在暴露于淋巴细胞之前在37℃下再孵育一段时间(例如，30分钟至2小时)，以允许抗原加工。在一些实施方案中，需要在暴露于淋巴细胞之前固定并杀死抗原呈递细胞(例如，通过用1％多聚甲醛处理细胞)。
抗原呈递细胞和文库成员的数量可以是变化的，只要文库成员提供的目标多肽的数量足以在MHC分子上呈递即可以。在一些实施方案中，抗原呈递细胞以阵列的形式提供，并与多组文库细胞接触，每组文库细胞表达不同的目标多肽。在某些实施方案中，阵列中的每个位置包括1x103-1x106个抗原呈递细胞，并且所述细胞与1x103-1x108个文库细胞接触，所述文库细胞是细菌细胞。
在本文所述的任何实施方案中，在与文库细胞一起孵育之前或在与文库细胞一起孵育之后，抗原呈递细胞可以是新鲜分离的、维持在培养物中的、和/或从冷冻储存中解冻的。
人淋巴细胞
在本公开的方法中，测试人淋巴细胞对抗原呈递细胞(例如已经与上述表达目标多肽的文库一起孵育过的抗原呈递细胞)的抗原特异性反应。本公开所述的方法允许通过使用从个体分离的淋巴细胞库或细胞后代快速鉴定人抗原。抗原特异性应答的检测不依赖于费力的实验程序来分离单个T细胞克隆。在一些实施方案中，人淋巴细胞是原代淋巴细胞。在一些实施方案中，人淋巴细胞是NKT细胞、γ-δT细胞或NK细胞。正如可以在用于抗原呈递测定之前将抗原呈递细胞分离成亚群一样，可以使用具有特定标志物或其他特征的淋巴细胞群。在一些实施方案中，分离出T淋巴细胞群。在一些实施方案中，分离出CD4+T细胞群。在一些实施方案中，分离出CD8+T细胞群。CD8+T细胞识别MHC I类分子中呈递的肽抗原。因此，在一些实施方案中，将CD8+T细胞与已经暴露于文库宿主细胞的抗原呈递细胞一起使用，所述文库宿主细胞除表达目标多肽外，还共表达溶细胞素多肽。还可以分离表达其他细胞表面标志物的T细胞亚群，以提供具有特定表型的细胞。这些包括CLA(对于皮肤归巢T细胞)、CD25、CD30、CD69、CD154(对于激活的T细胞)、CD45RO(对于记忆T细胞)、CD294(对于Th2细胞)、表达γ/δTCR的细胞、CD3和CD56(对于NK T细胞)。也可以选择其他亚群。
可以通过本领域已知的任何方法分离和分开淋巴细胞(例如，使用基于抗体的方法如采用磁珠分离、淘选或流式细胞术的方法)。用于鉴定和分离人淋巴细胞及其亚群的试剂是众所周知的并且可以商购获得。
用于本文所述方法的淋巴细胞可以自人的外周血单核细胞或其他组织分离。在一些实施方案中，淋巴细胞取自肿瘤、淋巴结、粘膜组织(例如，鼻、口、支气管组织、气管组织、胃肠道、生殖道(例如，阴道组织)或相关的淋巴组织)、腹膜腔、脾、胸腺、肺、肝、肾、神经元组织、内分泌组织、腹膜腔、骨髓或其他组织。在一些实施方案中，细胞取自是活跃免疫应答部位(例如，溃疡、疮或脓肿)的组织。可以经由灌洗或其他方式，从通过外科手术移除的组织分离出细胞。
可以将取自个体的淋巴细胞保持在培养物中或冷冻直至用于抗原呈递测定。在一些实施方案中，可以通过暴露于上述文库细胞的抗原呈递细胞在体外刺激新鲜分离的淋巴细胞。在一些实施方案中，这些淋巴细胞表现出可检测的刺激，而不需要在之前有非抗原特异性扩增。但是，当首次在体外被非特异性刺激时，原代淋巴细胞也会引发可检测的抗原特异性应答。因此，在一些实施方案中，在用于抗原呈递测定之前，以非抗原特异性的方式刺激淋巴细胞体外增殖。在用于抗原呈递测定之前，还可以以抗原特异性的方式刺激淋巴细胞。在一些实施方案中，通过文库刺激细胞增殖(例如，在用于利用该文库的抗原呈递测定之前进行)。体外扩增细胞提供更多数量的细胞用于测定。可以刺激原代T细胞进行扩增，例如通过暴露于多克隆T细胞有丝分裂原如植物血凝素或伴刀豆球蛋白，通过用刺激增殖的抗体处理，或通过用包被有抗体的颗粒处理进行刺激。在一些实施方案中，通过用抗CD2、抗CD3和抗CD28的抗体处理来使T细胞扩增。在一些实施方案中，通过用白介素2处理来使T细胞扩增。在一些实施方案中，将淋巴细胞从冷冻储存中解冻并在与抗原呈递细胞接触之前使其扩增(例如，以例如非抗原特异性方式或以抗原特异性的方式刺激其增殖)。在一些实施方案中，将淋巴细胞从冷冻储存中解冻，并且在与抗原呈递细胞接触之前不使其扩增。在一些实施方案中，将淋巴细胞新鲜分离并在与抗原呈递细胞接触之前使其扩增(例如，以例如非抗原特异性方式或以抗原特异性的方式刺激其增殖)。
抗原呈递测定
在抗原呈递测定中，在允许T细胞识别由抗原呈递细胞上的MHC分子呈递的肽的条件下，将T细胞与根据上述方法制得的抗原呈递细胞一起培养。在一些实施方案中，将T细胞与抗原呈递细胞在37℃下孵育12-48小时(例如，24小时)。在一些实施方案中，将T细胞与抗原呈递细胞在37℃下孵育3、4、5、6、7或8天。抗原呈递细胞和T细胞的数量是可以变化的。在一些实施方案中，在给定的测定中T细胞与抗原呈递细胞的比例为1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、25:1、30:1、32:1、35:1或40:1。在一些实施方案中，以阵列形式(例如，在96孔板中)提供抗原呈递细胞，其中所述阵列的每个位置中的细胞已与多组文库细胞接触过，每组文库细胞包含不同的目标多肽。在某些实施方案中，阵列中的每个位置包括1x103-1x106个抗原呈递细胞，并且所述细胞与1x103-1x106个T细胞接触。
在T细胞与抗原呈递细胞一起孵育之后，测定培养物的激活。可以通过本领域已知的任何方法检测淋巴细胞的激活，例如T细胞增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌增加或减少、一种或多种细胞表面标志物的表达增加或减少。在一些实施方案中，收获培养物上清液并测定与激活相关的一种或多种多肽的表达和/或分泌的增加和/或减少，例如细胞因子、可溶性介质、细胞表面标志物或其他免疫介质。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自TRAIL、IFN-γ、IL-12p70、IL-2、TNF-α、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、MCP1、RANTES、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、CXCL11、IL-3、IL-5、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23A、IL-24、IL-27、IL-31、IL-32、TGF-β、CSF、GM-CSF、TRANCE(也称为RANKL)、MIP3-α和曲动蛋白(fractalkine)。在一些实施方案中，所述一种或多种可溶性介质选自颗粒酶A、颗粒酶B、sFas、sFasL、穿孔素和颗粒溶素。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞表面标志物选自CD107a、CD107b、CD25(IL-2RA)、CD69、CD45RA、CD45RO、CD137(4-1BB)、CD44、CD62L、CD27、CCR7、CD154(CD40L)、KLRG-1、CD71、HLA-DR、CD122(IL-2RB)、CD28、IL7Ra(CD127)、CD38、CD26、CD134(OX-40)、CTLA-4(CD152)、LAG-3、TIM-3(CD366)、CD39、PD1(CD279)、FoxP3、TIGIT、CD160、BTLA、2B4(CD244)和KLRG1。可以例如通过ELISA、珠粒阵列，例如用
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分析仪检测培养上清液中的细胞因子分泌情况。还可以通过对从T细胞分离的mRNA进行RT-PCR，或通过对T细胞释放的细胞因子进行ELISPOT分析来测定细胞因子的产生情况。在一些实施方案中，测定培养物中T细胞的增殖情况(例如，通过检测3H胸苷掺入进行测定)。在一些实施方案中，测定靶细胞的裂解情况(例如，通过检测用Na2 51CrO4标记的抗原呈递细胞的T细胞依赖性裂解情况进行测定)。通常用CD8+T细胞进行靶细胞裂解测定。这些检测方法的方案是已知的。参见，例如，Current Protocols In Immunology,JohnE.Coligan等人(编辑),Wiley and Sons,New York,N.Y.,2007。本领域技术人员理解，在这些检测方法中使用适当的对照，例如以调整非抗原特异性的背景激活，以确认抗原呈递细胞的呈递能力，以及以确认淋巴细胞的活力。
在一些实施方案中，所述方法中使用的抗原呈递细胞和淋巴细胞来自同一个体。在一些实施方案中，所述方法中使用的抗原呈递细胞和淋巴细胞来自不同的个体。
在一些实施方案中，使用来自同一个体的淋巴细胞重复抗原呈递测定，所述淋巴细胞先前已经在抗原呈递细胞下暴露了一轮或多轮，例如以增强对应答的检测，或增强微弱的初始应答。在一些实施方案中，使用来自同一个体的抗原呈递细胞重复抗原呈递测定，所述抗原呈递细胞已经先前在文库下暴露了一轮或多轮，例如以增强对应答的检测，或增强微弱的初始应答。在一些实施方案中，使用来自同一个体的淋巴细胞和来自同一个体的抗原呈递细胞重复抗原呈递测定，所述淋巴细胞先前已经在抗原呈递细胞下暴露了一轮或多轮，所述抗原呈递细胞先前已经在文库下暴露了一轮或多轮，例如以增强对应答的检测，或增强微弱的初始应答。在一些实施方案中，使用来自不同个体的抗原呈递细胞和淋巴细胞重复抗原呈递测定，例如以鉴定由多个个体识别的抗原，或比较个体之间不同的反应性。
鉴定肿瘤抗原的方法
本文所述方法的一个优点是它们具有鉴定临床相关的人抗原的能力。患有癌症的人可能具有特异性识别肿瘤抗原的淋巴细胞，这是由先前暴露引起的适应性免疫应答的产物。在一些实施方案中，这些细胞存在的频率比来自未患癌症的个体的细胞更高，并且/或者当再次暴露于适当的抗原刺激物时所述细胞容易再次激活(例如，所述细胞是“记忆”细胞)。因此，对于体外鉴定抗原，患有癌症或患过癌症的人是特别有用的细胞供体。个体可以是从癌症中恢复过来的人。在一些实施方案中，个体最近被诊断患有癌症(例如，个体被诊断的时间是在从个体分离淋巴细胞和/或抗原呈递细胞之前的一年以下、三个月以下、两个月以下、一个月以下或两周以下)。在一些实施方案中，个体首次被诊断患有癌症的时间是在分离淋巴细胞和/或抗原呈递细胞之前的三个月以上、六个月以上或一年以上。
在一些实施方案中，针对抗原呈递细胞筛选淋巴细胞，所述抗原呈递细胞已与细胞文库接触过，所述文库的成员表达或携带目标多肽，并且所述淋巴细胞来自未被诊断患有癌症的个体。在一些实施方案中，这种淋巴细胞用于确定背景(即，非抗原特异性)反应性。在一些实施方案中，此类淋巴细胞用于鉴定抗原，在非癌症个体中存在对所述抗原的反应性。
可以收集来自多个供体(例如，患有癌症的多个受试者)的细胞，并在本文所述的方法中进行测定。在一些实施方案中，测定来自多个供体的细胞以确定给定的肿瘤抗原在大部分群体中是否具有反应性，或者以鉴定多种肿瘤抗原，其可以随后进行组合以产生将在大部分群体中有效的免疫原性组合物。
抗原呈递测定法可以用于感染性和非感染性疾病情形。本文描述的方法适用于能得益于人细胞免疫的快速评估的任何情形。在一些实施方案中，评估对由肿瘤性细胞(例如，肿瘤细胞)差异表达的多肽的抗原反应性。已经使用已建立的技术(如消减杂交)鉴定了由肿瘤性细胞差异表达的核酸组。本文所述的方法可以用于鉴定在发生有抗肿瘤免疫应答的受试者中有功能性的抗原。在其他实施方案中，使用方法评估受试者是否具有对肿瘤抗原或肿瘤抗原组产生反应的淋巴细胞。
在一些实施方案中，抗原呈递测定用于检查个体(例如，易患或患有自身免疫性疾患的个体)的细胞中对自身抗原的反应性。此类方法可以用于提供个体疾病状态的诊断或预后指标，或用于鉴定自身抗原。对于这些测定，在一些实施方案中，制备包括人多肽阵列的文库。在一些实施方案中，制备包括来自感染物的多肽的文库，所述感染物被怀疑引发对自身抗原的交叉反应性应答。有关来自被认为引发交叉反应性自身免疫应答的感染物的抗原的实例参见Barzilai等人,Curr Opin Rheumatol.,19(6):636-43,2007；Ayada等人,AnnN Y Acad Sci.,1108:594-602,2007；Drouin等人,Mol Immunol.,45(1):180-9,2008；以及Bach,J Autoimmun.,25增刊:74-80,2005。
如所讨论的，本公开包括将目标多肽包括在文库中(例如，在文库细胞中表达或在颗粒或珠粒中或上携带)的方法。在文库成员被抗原呈递细胞内化后，目标多肽在抗原呈递细胞内被蛋白水解处理，并且所述多肽的肽片段被呈递到抗原呈递细胞中表达的MHC分子上。可以通过检查提供给产生刺激的抗原呈递细胞的文库细胞组来确定在本文所述测定中刺激人淋巴细胞的多肽的身份。在一些实施方案中，一种有用的方式是在与MHC分子结合以产生观察到的刺激的多肽中标示出表位。该表位或衍生出它的较长多肽(在本文中都称为“抗原”)可以构成免疫原性组合物的基础，或构成以后的抗原呈递测定中的抗原性刺激的基础。
用于鉴定与MHC分子结合的肽的方法是已知的。在一些实施方案中，通过产生目标多肽的缺失突变体并测试它们刺激淋巴细胞的能力来鉴定表位。当被抗原呈递细胞处理并呈递时，丧失刺激淋巴细胞能力的缺失突变体已经失去了肽表位。在一些实施方案中，通过合成对应于目标多肽的部分的肽并测试所述肽刺激淋巴细胞的能力来鉴定表位(例如，在抗原呈递细胞被所述肽诱导的抗原呈递测定中测试)。鉴定与MHC结合的肽的其他方法涉及裂解包括了抗原肽的抗原呈递细胞，从细胞裂解物中亲和纯化MHC分子，以及随后从MHC洗脱出肽并对其进行分析(Falk,K.等人Nature 351:290,1991，和美国专利号5,989,565)。
在其他实施方案中，一种有用的方式是鉴定已经在对抗原的应答中扩增了的克隆性T细胞受体。通过对T细胞受体库进行DNA测序来鉴定克隆性T细胞受体(Howie等人,2015Sci Trans Med 7:301)。通过鉴定TCR的特异性和功能，可以将TCR转染到其他细胞类型中，并用于功能性研究或用于新型免疫疗法。
在其他实施方案中，一种有用的方式是在受试者中鉴定和分离出对肿瘤抗原有应答的T细胞。可以将分离的T细胞进行离体扩增并施用给受试者以进行癌症治疗或预防。
鉴定受试者的免疫应答的方法
本公开提供了鉴定受试者的一种或多种免疫应答的方法。图4的左侧部分中示意性地描绘了一种示例性的鉴定肿瘤抗原的方法。在一些实施方案中，通过以下方式确定受试者的一种或多种免疫应答：a)提供本文所述的文库，所述文库包括一组肿瘤抗原(例如，已知的肿瘤抗原，本文所述的肿瘤抗原，或使用本文所述的方法鉴定的肿瘤抗原、潜在的肿瘤抗原和/或其他目标多肽)；b)使所述文库与来自所述受试者的抗原呈递细胞接触；c)使所述抗原呈递细胞与来自所述受试者的淋巴细胞接触；以及d)确定一种或多种淋巴细胞是否被由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原刺激、抑制和/或遏制、激活，或者对一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原无应答。在一些实施方案中，所述文库包括约1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，通过评估本文所述的一种或多种表达或分泌的细胞因子或其他免疫介质的水平来确定淋巴细胞的刺激、非刺激、抑制和/或遏制、激活和/或无应答性。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平高至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％或更高，表明淋巴细胞受到刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值高至少1、2、3、4或5个标准差，表明淋巴细胞受到刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平高至少1、2、3、4或5个绝对中位差(MAD)，表明淋巴细胞受到刺激。在一些实施方案中，对照是阴性对照(例如，表达霓虹绿(NG)的克隆)。
在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平低至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％或更高，表明淋巴细胞受到抑制和/或遏制。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值低至少1、2、3、4或5个标准差，表明淋巴细胞受到抑制和/或遏制。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平低至少1、2、3、4或5个绝对中位差(MAD)，表明淋巴细胞受到抑制和/或遏制。在一些实施方案中，对照是阴性对照(例如，表达霓虹绿(NG)的克隆)。
在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平高或低至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％或更高，表明淋巴细胞的激活。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值高或低至少1、2、3、4或5个标准差，表明淋巴细胞的激活。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平高或低至少1、2、3、4或5个绝对中位差(MAD)，表明淋巴细胞的激活。在一些实施方案中，对照是阴性对照(例如，表达霓虹绿(NG)的克隆)。
在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平在对照水平的约20％、15％、10％、5％或更少之内，表明淋巴细胞无应答性或未受刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值高或低1或2个标准差以下，表明淋巴细胞无应答性或未受刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平高或低1或2个绝对中位差(MAD)以下，表明淋巴细胞无应答性或未受刺激。
在一些实施方案中，受试者应答谱可以包括对一组不同的细胞因子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或更多种细胞因子)和肿瘤抗原总数(例如，文库中不同的肿瘤抗原的所有或部分)的定量、鉴定、和/或展示，所述肿瘤抗原刺激、不刺激、抑制和/或遏制、激活所述细胞因子组中每个成员的产生、表达或分泌，或者对所述细胞因子组中每个成员的产生、表达或分泌没有影响或影响最小。
选择肿瘤抗原的方法和在受试者中诱导或抑制免疫应答的方法
一般来讲，可以在其整体的功能性终末效应方面来对免疫应答进行有效定义。Dhabar等人(2014)提出，可以将免疫应答分为免疫保护性、免疫病理性和免疫调节/抑制性。虽然这些类别提供了有用的构架来组织思想，但总体上的体内免疫应答可能由几种类型的应答组成，每种类别的比重(dominance)各不相同。免疫保护性的或有益的应答被定义成是促进有效伤口愈合、消除感染和癌症并介导疫苗诱导的免疫记忆的应答。这些应答与如IFN-γ、IL-12、IL-2、颗粒酶B、CD107等细胞因子和介质相关。免疫病理性的或有害的应答被定义成是针对自身(自身免疫性疾病如多发性硬化症、关节炎、狼疮)或无害抗原(哮喘、过敏)的应答和涉及慢性、非可控性(non-resolving)炎症的应答。这些应答还可以与参与免疫保护性应答的分子相关，但也包括免疫介质如TNF-α、IL-10、IL-13、IL-17、IL-4、IgE、组胺等。免疫调节性应答被定义成是涉及调节(主要是下调)其他免疫细胞功能的免疫细胞和因子。最近的研究表明，免疫系统的一部分可以抑制免疫应答。例如，调节性CD4+CD25+FoxP3+T细胞、IL-10和TGF-β等已显示具有免疫调节/抑制功能。这些因子的生理功能是控制促炎性、过敏性和自身免疫应答，但它们也可能遏制抗肿瘤免疫力，并预示癌症的阴性预后。在肿瘤的情形下，共刺激分子的表达通常变少，而共抑制配体的表达增加。MHC分子通常在肿瘤细胞上被下调，这有利于其逃逸。肿瘤微环境(包括基质细胞、肿瘤相关免疫细胞和其他细胞类型)产生许多抑制因子(如IL-10、TGF-β和IDO)。在肿瘤微环境中可能存在抑制性免疫细胞，包括T reg、Tr1细胞、未成熟DC(iDC)、pDC和MDSC。(Y Li UT GSBS Thesis2016)。介质及其免疫效应的实例示于表2中。
表2：免疫介质
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Figure BDA0003071270850000531
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Figure BDA0003071270850000561
ID＝感染性疾病
IA＝自身免疫性疾病
本公开提供了用于鉴定和选择(或不选择)肿瘤抗原(例如，刺激性和/或抑制性抗原)的方法和系统。在一些实施方案中，刺激性抗原是刺激对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答的肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)。在一些实施方案中，刺激性抗原是抑制和/或遏制对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答的肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)。可能导致有益的抗肿瘤应答的免疫应答(例如，可能增强对肿瘤的免疫控制的免疫应答)的实例包括但不限于1)细胞毒性CD8+T细胞，其可以有效地杀死癌细胞并释放穿孔素和/或颗粒酶等介质来驱动肿瘤细胞死亡；和2)CD4+Th1 T细胞，其在宿主防御中起重要作用且可以分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α。这些由IL-12、IL-2和IFNγ等细胞因子诱导。
在一些实施方案中，抑制性抗原是刺激对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答的肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)。在一些实施方案中，抑制性抗原是抑制和/或遏制对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答的肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)。可能导致有害或无益的抗肿瘤应答的免疫应答(例如，可能削弱或降低对肿瘤的控制的免疫应答)的实例包括但不限于1)T调节性细胞，其是T细胞群，所述T细胞可以遏制免疫应答并分泌免疫抑制性细胞因子(如TGF-β和IL-10)并表达CD25和FoxP3分子；和2)Th2细胞，其靶向针对过敏原的应答，但不能产生抗癌作用。它们由增加的IL-4和IL-10诱导且可以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13。
另外地或可替代地，可以基于与期望的或有益的应答(例如，临床应答)的关联来鉴定和/或选择(或不选择)肿瘤抗原。另外地或可替代地，可以基于与不期望的、有害的或无益应答(例如，临床应答)的关联来鉴定和/或选择(或不选择)肿瘤抗原。可以基于前述方法的组合来鉴定和/或选择(或不选择)肿瘤抗原，所述方法以任何顺序进行应用。
将以下应答称为“有益应答”：通过所述应答，肿瘤抗原或其免疫原性片段(i)刺激对受试者有益的淋巴细胞应答，(ii)刺激对受试者有益的细胞因子表达，(iii)抑制和/或遏制对受试者有害或无益的淋巴细胞应答，或(iv)抑制和/或遏制对受试者有害或无益的细胞因子表达。
在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原刺激对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答。
在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原提升对受试者有益的细胞因子表达和/或分泌。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有害或无益的细胞因子表达。
在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原引发所述受试者的免疫应答。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原引发所述受试者的有益免疫应答。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原引发所述受试者的有益应答。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原提升所述受试者对肿瘤疗法的临床应答。
将以下应答称为“有害或无益应答”：通过所述应答，肿瘤抗原或其免疫原性片段(i)刺激对受试者有害或无益的淋巴细胞应答，(ii)刺激对受试者有害或无益的细胞因子表达，(iii)抑制和/或遏制对受试者有益的淋巴细胞应答，或(iv)抑制和/或遏制对受试者有益的细胞因子表达。
在一些实施方案中，基于与期望的或有益的免疫应答的关联来选择(或不选择)一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，基于与不期望的、有害的或无益的免疫应答的关联来选择(或不选择)一种或多种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原刺激对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答。
在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原提升对受试者有害或无益的细胞因子表达和/或分泌。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有益的细胞因子表达。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法不选择一种或多种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，不向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原。
选择潜在的肿瘤抗原的方法
在充分发展(well-established)的肿瘤中，内源性抗肿瘤T细胞应答的激活通常不足以导致肿瘤完全消退。而且，已经在肿瘤微环境的情形下被训练的T细胞有时并未被最优地激活，亲合力(avidity)低，并且最终不能识别表达抗原的肿瘤细胞。另外，肿瘤很复杂，并且包括许多细胞类型，这些细胞类型具有不同程度的突变基因表达，使得难以产生足以控制肿瘤生长的多克隆T细胞应答。因此，该领域的研究人员提出，在癌症受试者中，除了在癌症受试者中被确认能被T细胞识别的突变外，鉴定是“潜在的肿瘤抗原”的突变也很重要。
目前还没有可靠的方法能以全面的方式鉴定潜在的肿瘤抗原。虽然已经开发出了计算方法来试图预测哪个是抗原，但是这些方法存在许多局限性。首先，对表位的预测和呈递进行建模需要考虑到超过12,000个编码MHC分子的HLA等位基因，每个受试者表达其中的多达14个，这14个都具有不同的表位亲和力。其次，当使用质谱法评估时，绝大多数的预测表位都没有被肿瘤呈递。第三，预测性算法未考虑T细胞对抗原的识别，而且对于大多数预测表位来说，即使它们被呈递，也无法引发T细胞应答。最终，细胞免疫的第二个分支，即CD4+T细胞亚群常常被忽视；大多数计算机软件工具都集中在MHC I类结合因子上。用于预测MHC II类表位的工具尚不完善，而且变化更大。
本公开提供了以下方法：a)在本公开的抗原呈递测定中鉴定可能是潜在的肿瘤抗原的多肽，以及b)基于多肽的抗原潜力对多肽进行选择。在执行这些方法时无需预测哪个可能是T细胞应答的靶标或被MHC呈递，也无需进行反褶积(deconvolution)可以扩展这些方法，以探索具有与受试者相同的MHC等位基因的健康受试者中的抗原潜力，以鉴定最适合包含在免疫原性组合物或疫苗制剂中的潜在的肿瘤抗原。所述方法确保潜在的肿瘤抗原在受试者MHC分子的环境中被加工和呈递，并且确保T细胞在适当条件下(例如，在带有来自佐剂或递送系统的强烈危险信号的疫苗情形下)暴露于所述潜在的肿瘤抗原时，能对所述潜在的肿瘤抗原做出应答。
前述用于选择肿瘤抗原的方法可以用于选择潜在的肿瘤抗原(即，编码存在于或表达于受试者癌症或肿瘤细胞中的一种或多种突变的多肽)。
使用过继细胞疗法重定向免疫应答和/或重新训练淋巴细胞的方法
如本文所讨论，本公开提供了例如通过重新训练一种或多种淋巴细胞来重定向一种或多种免疫应答(例如，本文所述的一种或多种免疫应答)的方法。
如本文所讨论，在一些实施方案中，本公开提供了与重定向受试者中的一种或多种免疫应答有关的方法和系统。在一些实施方案中，受试者中的初始免疫应答削弱或降低了受试者中对肿瘤或癌细胞的免疫控制(例如，受试者具有临床阴性应答或临床无应答)。在一些实施方案中，重定向受试者中削弱或降低受试者中的对肿瘤或癌细胞的免疫控制的初始免疫应答(例如，使用本公开的方法)，使得受试者中的免疫应答增强受试者中对肿瘤或癌细胞的免疫控制(例如，受试者具有临床阳性应答)。
可以根据特定标准来测量和/或表征免疫应答是否削弱或增强对肿瘤或癌细胞的免疫控制。在某些实施方案中，此类标准可以包括临床标准和/或客观标准。在某些实施方案中，用于评估应答的技术可以包括但不限于临床检查、正电子发射断层扫描、胸部X射线、CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、样品中特定标志物的存在情况或水平、细胞学和/或组织学。本领域技术人员可以使用各种已建立的用于评估此类应答(包括例如用于确定肿瘤负荷、肿瘤大小、肿瘤阶段等)的技术来评估肿瘤的阳性应答、阴性应答和/或无应答。在Therasse等人,J.Natl.Cancer Inst.,2000,92(3):205-216；和Seymour等人,LancetOncol.,2017,18:e143-52中讨论了用于评估对治疗的应答的方法和指南。
在一些实施方案中，增强的对肿瘤或癌症的免疫控制导致肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤阶段的测得到的降低。在一些实施方案中，削弱的对肿瘤或癌症的免疫控制不导致肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤阶段的测得到的降低。在一些实施方案中，削弱的对肿瘤或癌症的免疫控制导致肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤阶段的测得到的增加。
可用于重新训练T细胞和/或重定向免疫应答的示例性试剂包括佐剂、细胞因子、免疫检查点阻断疗法(例如，本文所述的)、病毒载体、细菌载体、外来体、脂质体、DNA、mRNA、saRNA、化学治疗剂和IDO抑制剂。
在一些实施方案中，方法包括从受试者获得淋巴细胞，离体重新训练所述淋巴细胞，以及将所述重新训练的淋巴细胞作为癌症疗法施用给受试者。在一些实施方案中，从患者获得一种或多种T细胞并使用有效量的试剂或试剂组合进行离体重新训练。在一些实施方案中，从患者获得具有一种或多种特异性的T细胞，并使用有效量的试剂或试剂组合进行离体重新训练。
在一些实施方案中，方法包括将T细胞与有效量的试剂或试剂组合一起培养一定时间段。在一些实施方案中，可以将T细胞与有效量的试剂或试剂组合一起培养例如至少6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时或更长时间。在一些实施方案中，可以将T细胞与有效量的试剂或试剂组合一起培养例如至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天、21天或更长时间。在一些实施方案中，扩增步骤执行不超过5天、4天、3天、2天或1天。
一旦T细胞被重新训练，就可以将其重新施用给受试者。例如，可以将包含重新训练的T细胞的细胞治疗剂施用给受试者。为了确定T细胞群得到重新训练，可以如前所述使用抗原呈递测定和/或测定在T细胞上表达的某些细胞标志物来测定T细胞。
在另一个实施方案中，可以从受试者的PBMC中分离出对抑制性抗原有应答的T细胞。可以在存在抑制性抗原的情况下，使用试剂和培养基的特定组合从PBMC中分离出对抑制性抗原有应答的T细胞。例如，可以使用四聚体、双特异性细胞因子捕获试剂和抗体。可以使用有效量的试剂或试剂组合对T细胞进行重新训练。在另一个实施方案中，在施用给受试者之前，分离的和重新训练的T细胞可以与从其分离的PBMC合并和/或可以与未扩增的或扩增后的刺激性T细胞合并。在一些实施方案中，可以离体扩增T细胞，然后将其施用给受试者。在一些实施方案中，可以同时对T细胞进行重新训练和离体扩增，然后将其施用给受试者。
在其他实施方案中，从癌症患者获得PBMC，并且鉴定PBMC中对抑制性抗原有应答的T细胞的存在情况。然后可以离体耗尽鉴定出的T细胞。PBMC剩余部分中的T细胞可以用一种或多种刺激性抗原刺激，并且可以任选地进行非特异性扩增。然后可以将包括刺激过的T细胞的PBMC施用给癌症患者。
在一些实施方案中，用一种或多种抑制性抗原刺激自体或HLA匹配的同种异体PBMC以诱导一种或多种有益的免疫应答，并且将此类PBMC施用给受试者。在一些实施方案中，分离出来自对抑制性抗原具有特异性的T细胞的T细胞受体，并将其转导至来自同一受试者或与HLA匹配的同种异体个体的新T细胞中，以引发有益应答。
在图4的示例性方法中，将自体患者APC和T细胞用有序阵列的以短多肽表达患者特异性突变的大肠杆菌诱导(pulsed)，并通过炎性细胞因子分泌鉴定现存的患者T细胞对新抗原的应答。随后，使用ATLAS确定的肽和细胞因子进行ACT治疗，从患者的PBMC中选择性地扩增新抗原特异性T细胞。
佐剂
在一些实施方案中，用于重新训练淋巴细胞的试剂可以是佐剂。佐剂可以根据其主要作用机制大致分为两类：疫苗递送系统和免疫刺激性佐剂(参见，例如，Singh等人,Curr.HIV Res.1:309-20,2003)。疫苗递送系统通常是颗粒剂制剂，例如乳剂、微粒、免疫刺激复合物(ISCOM，其可以是例如颗粒和/或基质)，和脂质体。与其不同的是，免疫刺激佐剂在某些情况下是由病原体衍生而来并且可以呈现病原体相关分子模式(PAMP)，例如脂多糖(LPS)、单磷酰脂质(MPL)或含CpG的DNA，它们可以激活先天免疫系统的细胞。
或者，佐剂可分为有机和无机佐剂。无机佐剂包括铝盐，如磷酸铝、无定形羟基磷酸硫酸铝和氢氧化铝，它们常用于人疫苗中。有机佐剂包括有机分子，包括大分子。有机佐剂的一个实例是霍乱毒素。
佐剂还可以根据其诱导的应答来分类，并且佐剂可以激活不止一种类型的应答。在一些实施方案中，佐剂诱导CD4+T细胞的激活。佐剂可以诱导TH1细胞的激活和/或TH17细胞的激活和/或TH2细胞的激活。或者，佐剂可以诱导TH1细胞和/或TH17细胞的激活，但不诱导TH2细胞的激活，反之亦然。在一些实施方案中，佐剂诱导CD8+T细胞的激活。在进一步的实施方案中，佐剂可以诱导自然杀伤T(NKT)细胞的激活。在一些实施方案中，佐剂诱导TH1细胞或TH17细胞或TH2细胞的激活。在其他实施方案中，佐剂诱导B细胞的激活。在其他实施方案中，佐剂诱导抗原呈递细胞的激活。这些类别不是互斥的；在一些情况下，佐剂可以激活不止一种类型的细胞。
在某些实施方案中，佐剂是提高抗原呈递细胞如树突状细胞的数量或活性的物质。在某些实施方案中，佐剂促进抗原呈递细胞如树突状细胞的成熟。在一些实施方案中，佐剂是炎性体激活剂。在一些实施方案中，炎性体激活剂是硫酸铝钾、RIG-1激动剂(如聚(dA:dT))、TLR5激动剂(如鞭毛蛋白)或dectin-1拮抗剂(如凝胶多糖(Curdlan))。在一些实施方案中，佐剂是皂苷或者包括皂苷。通常，皂苷是三萜糖苷，如从皂皮树(Quillajasaponaria)的树皮中分离的三萜糖苷。自生物来源提取的皂苷可以被进一步分级(例如，通过色谱法)，以分离出具有最佳佐剂活性和可接受毒性的提取物部分。皂皮树提取物中用作佐剂的典型级分称为级分A和C。示例性的皂苷佐剂是QS-21，其可从Antigenics获得。QS-21是缀合寡糖的小分子。任选地，QS-21可以与脂质如3D-MPL或胆固醇混合。
可用于本文所述的疫苗制剂中的皂苷的特定形式是免疫刺激复合物(ISCOM)。ISCOM是本领域公知的一类佐剂，通常包含皂树皂苷级分和脂质(例如，胆固醇，和磷脂如磷脂酰胆碱)。在某些实施方案中，ISCOM与目标多肽或核酸组装在一起。但是，不同的皂苷级分可以以不同的比例使用。另外，不同的皂苷级分可以在同一颗粒中共同存在，或者在每个颗粒中基本上只有一种级分(由此，通过将带有不同级分的颗粒混合在一起而生成所示的级分A和C的比例)。在这种情形下，“基本上”是指少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或者甚至1％。此类佐剂可以包含级分A和级分C，混合比例为70-95A:30-5C，如70A:30C至75A:25C、75A:25C至80A:20C、80A:20C至85A:15C、85A:15C至90A:10C、90A:10C至95A:5C或95A:5C至99A:1C。CSL生产的ISCOMatrix和Isconova生产的AbISCO 100和300是包含皂苷、胆固醇和磷脂(来自细胞膜的脂质)的ISCOM基质，它们形成笼状结构，直径通常为40-50nm。Nordic Vaccines生产的Posintro是一种ISCOM基质，其中免疫原可以通过多种不同的机制结合在颗粒上，例如，通过电荷修饰的静电相互作用、掺入螯合基团或直接结合。
在一些实施方案中，佐剂是TLR激动剂、STING激动剂或触发炎性体的分子。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR2激动剂，如Pam3CSK4。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR3激动剂，如Poly-IC或Poly-ICLC(Hiltonol)。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR4激动剂，如3D-PHAD。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR7激动剂，如咪喹莫特或R848。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR5激动剂，如鞭毛蛋白。在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR9激动剂，如CpG。
在一些实施方案中，佐剂是纳米乳液，其是大小为150-400纳米的高能量水包油乳剂，并且包含表面活性剂以提供稳定性。
佐剂可以与抗原(例如，上述多肽)共价结合。在一些实施方案中，佐剂可以是通过激活抗原呈递细胞(APC)而诱导炎症反应的蛋白。在一些实施方案中，一种或多种这样的蛋白可以通过重组与选择的抗原融合，从而使得到的融合分子能够促进树突状细胞成熟、激活树突状细胞产生细胞因子和趋化因子，并且最终增加抗原向T细胞的呈递并且引发T细胞应答(参见Wu等人,Cancer Res 2005；65(11),第4947-4954页)。其他可以与抗原共价结合的示例性佐剂包括多糖、小分子、合成肽、脂肽和核酸。
佐剂可以单独使用或两种或更多种组合使用。佐剂可以直接与抗原缀合。佐剂还可以组合使用，以增强对抗原的免疫应答的强度。通常，在每一刺激事件(例如，疫苗接种、初免注射、加强注射、离体或体外细胞培养)中施用或存在相同的佐剂或佐剂混合物。然而，任选地，可以在第一次刺激中施用或提供佐剂，但是在随后的刺激中不施用或提供佐剂。或者，可以在初始刺激时施用或提供强佐剂，而在后续的再刺激时施用或提供较弱佐剂或较低剂量的强佐剂。向受试者施用或提供佐剂的时间可以在抗原施用之前，与抗原施用同时或在抗原施用之后(某些情况下在1、2、6或12小时之内；某些情况下在1、2或5天之内；某些情况下在1、2或3个月之内；某些情况下在6、12或18个月之内；某些情况下在2、3、4、5、10或15年内)，或在将抗原提供给PBMC或T细胞培养物后(某些情况下在1、2、6或12小时之内；且某些情况下在1、2或5天之内)。在一些实施方案中，佐剂可以与抗原直接组合或与抗原配制在一起以用于体外培养或制备适于施用给受试者的疫苗组合物。在某些实施方案中，佐剂可以与抗原分开施用或提供。佐剂可以与抗原分开但同时施用或提供，或者可以在抗原剂量之间施用或提供。
所使用的佐剂可以包括本文先前描述的任何佐剂，例如TLR激动剂和/或STING激动剂。用于重新训练T细胞的佐剂类型可以是一种或多种佐剂的组合。在一些实施方案中，试剂可包括免疫检查点抑制剂。
在一些实施方案中，用于重新训练淋巴细胞的试剂可以是单独的一种或多种佐剂或一种或多种佐剂与另一种试剂(包括例如细胞因子、免疫检查点阻断疗法(例如，本文所述的)、病毒载体、细菌载体、外来体、脂质体、DNA、mRNA、saRNA、化学治疗剂和IDO抑制剂)的组合。在一些实施方案中，用于重新训练淋巴细胞的一种或多种佐剂和另一种试剂(如细胞因子、免疫检查点阻断疗法(例如，本文所述的)、病毒载体、细菌载体、外来体、脂质体、DNA、mRNA、saRNA、化学治疗剂和IDO抑制剂)同时使用或相继使用。
细胞因子
在一些实施方案中，用于重新训练淋巴细胞的试剂可以是细胞因子，或包含两种或更多种细胞因子的混合物。在一些实施方案中，重新训练使淋巴细胞趋向于Th1表型(例如，相对于对照，增加Th1细胞，例如表达一种或多种Th1相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。在一些实施方案中，用于重新训练淋巴细胞的试剂可以是Th1相关细胞因子，或包含两种或更多种Th1相关细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40、IFN-γ)的混合物。在一些实施方案中，重新训练使淋巴细胞趋向于Th2表型(例如，相对于对照，增加Th2细胞，例如表达一种或多种Th2相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。在一些实施方案中，用于重新训练淋巴细胞的试剂可以是Th2相关细胞因子，或包含两种或更多种Th2相关细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-13)的混合物。
在一些实施方案中，用于同时重新训练和扩增淋巴细胞的试剂可以是细胞因子，或包含两种或更多种细胞因子的混合物。在一些实施方案中，重新训练使淋巴细胞趋向于Th1表型(例如，相对于对照，增加Th1细胞，例如表达一种或多种Th1相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。在一些实施方案中，用于同时重新训练和扩增淋巴细胞的试剂可以是Th1相关细胞因子，或包含两种或更多种Th-1细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40、IFN-γ)的混合物。在一些实施方案中，同时重新训练和扩增使淋巴细胞趋向于Th2表型(例如，相对于对照，增加Th2细胞，例如表达一种或多种Th2相关细胞因子的细胞的数量和/或比例)。在一些实施方案中，用于同时重新训练和扩增淋巴细胞的试剂可以是Th2相关细胞因子，或包含两种或更多种Th2相关细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-13)的混合物。
化学治疗剂
在一些实施方案中，用于重新训练淋巴细胞的试剂可以包括化学治疗剂。“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物，无论作用机制如何。化学治疗剂的类别包括但不限于：烷基化剂、抗代谢物、纺锤体毒素植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化学治疗剂的非限制性实例包括：厄洛替尼(
Figure BDA0003071270850000671
Genentech/OSI Pharm.)、多西他赛(
Figure BDA0003071270850000672
Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS号51-21-8)、吉西他滨(
Figure BDA0003071270850000673
Lilly)、PD-0325901(CAS号391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺-二胺，二氯化铂(II)，CAS号15663-27-1)、卡铂(CAS号41575-94-4)、紫杉醇(
Figure BDA0003071270850000674
Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS号85622-93-1，
Figure BDA0003071270850000675
Figure BDA0003071270850000676
Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基-乙胺，
Figure BDA0003071270850000677
Figure BDA0003071270850000681
)，和多柔比星
Figure BDA0003071270850000682
Akti-1/2、HPPD和雷帕霉素。
化学治疗剂的其他实例包括：奥沙利铂(
Figure BDA0003071270850000683
Sanofi)、硼替佐米(
Figure BDA0003071270850000684
Millennium Pharm.)、sutent(
Figure BDA0003071270850000685
SU11248，Pfizer)、来曲唑(
Figure BDA0003071270850000686
Novartis)、伊马替尼甲磺酸盐(
Figure BDA0003071270850000687
Novartis)、XL-518(MEK抑制剂，Exelixis，WO2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma，AstraZeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟维司群(
Figure BDA0003071270850000688
AstraZeneca)、亚叶酸钙(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，
Figure BDA0003071270850000689
Wyeth)、拉帕替尼(
Figure BDA00030712708500006810
GSK572016，Glaxo Smith Kline)、氯那法尼(SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough)、索拉非尼(
Figure BDA00030712708500006811
BAY43-9006，Bayer Labs)、吉非替尼(
Figure BDA00030712708500006812
AstraZeneca)、伊立替康(
Figure BDA00030712708500006813
CPT-11，Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含氢化蓖麻油(Cremophor-free))、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American PharmaceuticalPartners，Schaumberg，Ill.)、凡德他尼(rINN，ZD6474，
Figure BDA00030712708500006814
AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、坦罗莫司(
Figure BDA00030712708500006815
Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、坎磷酰胺(
Figure BDA00030712708500006816
Telik)、塞替派和环磷酰胺
Figure BDA00030712708500006817
烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(特别是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；海绵多烯酮(callystatin)；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝基脲，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)、加利车霉素γ1I、加利车霉素ωI1(AngewChem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；dynemicin，dynemicinA；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)；丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、酶酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培来霉素(peplomycin)、porfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲酶素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘧啶、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0003071270850000701
多糖复合物(JHS天然产物，Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；西交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(特别是T-2毒素、抚孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(Ara-C)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)
Figure BDA0003071270850000711
能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)(
Figure BDA0003071270850000712
Roche)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸，如视黄酸；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
获得T细胞的方法
在本公开的某些实施方案中，首先可以例如从受试者获得T细胞来源。受试者的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。如本文所述，可以将T细胞或耗尽某些T细胞群的PBMC施用给受试者。因此，T细胞将与接受者受试者具有免疫相容性关系，并且根据本公开可以考虑使用任何这种关系。
例如，T细胞可以与接受者受试者是同基因的。术语“同基因的”是指来源于、起源于在遗传上相同的、特别是在抗原或免疫反应方面相同的相同物种或是所述物种的成员这样一种状态。这些包括具有匹配的MHC类型的同卵双胞胎。
如果转移的细胞是从同一受试者获得并移植到同一受试者中，则T细胞可为“自体的”。
如果转移的细胞是从相同物种的不同成员获得并移植到相同物种的不同成员中，但具有足够匹配的主要组织相容性复合物(MHC)抗原从而避免不良的免疫原性应答，则T细胞可为“匹配的同种异体的”。可以根据本领域已知的和使用的标准测试确定MHC错配的程度(参见，例如，Mickelson and Petersdorf(1999)Hematopoietic CellTransplantation,Thomas,E.D.等人编辑,第28-37页,Blackwell Scientific,Malden,Mass；Vaughn,Method.Mol.Biol.MHC Protocol.210:45-60(2002)；Morishima等人,Blood99:4200-4206(2002))。
T细胞可为“错配的同种异体的”，这是指如通常通过本领域中使用的标准测定法测定的，例如通过对限定数量的MHC抗原进行血清学或分子分析测定的，来源于、起源于具有足以引发不良的免疫原性应答的不同主要组织相容性复合物(MHC)抗原(即，蛋白质)的相同物种或是所述物种的成员。“部分错配”是指在成员之间，通常是在供体和受体之间测试的MHC抗原的部分匹配。例如，“半错配”(单倍错配)是指两个成员之间在测试的MHC抗原中有50％显示出不同的MHC抗原类型。“全部”或“完全”错配是指两个成员之间所测试的所有MHC抗原都不同。
T细胞可能是“异种的”，指的是来源于、起源于不同物种(例如，人和啮齿动物，人和猪，人和黑猩猩等)，或是所述物种的成员。
T细胞可以获自多种来源，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脾组织、胸腺组织和脐带。在某些实施方案中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在某些实施方案中，使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离，从收集自受试者的单位血液中获得T细胞。例如，可以通过单采血液成分术或白细胞去除术从受试者的循环血液中获得细胞。单采血液成分术的产物通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞，其他有核白血球、红细胞和血小板。在一些实施方案中，通过单采血液成分术收集的细胞可以经洗涤除去血浆级分，并放入适当的缓冲液或培养基中，以供后续加工步骤。
在另一种方法中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞(例如，通过PERCOLLTM梯度离心)从外周血中分离出T细胞。或者，可以从脐带血中分离出T细胞。
然后可以从初始来源(例如，PBMC样品)获得或分离(例如，分选)多个目标T细胞(例如，介导削弱或降低对肿瘤或癌症的免疫控制的针对抑制性抗原的免疫应答的T细胞)。在一个实施方案中，使用荧光激活细胞分选(FACS)或磁性激活细胞分选(MACS)来分选、分析和/或分离目标T细胞。例如，具有细胞标志物或其他特异性目标标志物的细胞可以用结合所述一种或多种细胞标志物的抗体或抗体混合物标记。可以将针对不同标志物的每种抗体缀合至可检测的分子，例如荧光染料，该荧光染料可以与偶联至其他抗体的其他荧光染料区分开。可以使标记的或“染色的”细胞的流通过光源，光源激发荧光染料，检测来自细胞的发射光谱，以确定特定标记抗体的存在情况。通过同时检测不同的荧光染料(多色荧光细胞分选)，可以鉴定出显示不同细胞标志物组的细胞，并将其与群体中的其他细胞分离。其他FACS参数，包括例如侧向散射(SSC)、正向散射(FSC)和活体染料染色(例如，用碘化丙啶)，允许基于大小和活力选择细胞。FACS和MACS分选和分析在本领域中是众所周知的，并且描述于例如美国专利号5,137,809；5,750,397；5,840,580；6,465,249；Miltenyi等人,Cytometry 11:231-238(1990)中。关于荧光激活细胞分选的一般指南描述于例如Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,第4版,Wiley-Liss(2003)and Ormerod(2000)FlowCytometry:A Practical Approach,第3版,Oxford University Press。
另一种分离目标T细胞的方法涉及固体或不溶性基质，所述固体或不溶性基质上结合有与特异性细胞表面标志物相互作用的抗体或配体。在免疫吸附技术中，可以使细胞与含有抗体的基质(例如，珠粒、烧瓶、磁性颗粒等的柱)接触，并将任何未结合的细胞除去。免疫吸附技术可以扩大规模，以直接处理临床收获中的大量细胞。合适的基质包括例如塑料、纤维素、右旋糖酐、聚丙烯酰胺、琼脂糖和本领域已知的其他基质(例如，PharmaciaSepharose 6MB大珠粒)。当使用包含磁性或顺磁性珠粒的固体基质时，可以容易地通过磁性分离器分离结合至珠粒的细胞(参见，例如，Kato等人,Cytometry 14:384-92(1993))。亲和色谱细胞分离可包括使细胞悬浮液通过支持物，所述支持物带有固定在其表面上的选择性配体。配体与其特异性靶分子在细胞上相互作用，并被捕获在基质上。通过将洗脱剂添加到柱的运行缓冲液中来释放结合的细胞，并通过色谱柱洗涤游离细胞，并收集为均质群体。对于技术人员显而易见的是，吸附技术可以使用非特异性吸附。
FACS、MACS和大多数分批免疫吸附技术都可以适用于阳性和阴性选择程序(参见，例如，美国专利号5,877,299)。在阳性选择中，将所需细胞用抗体标记，并从剩余的未标记/不期望的细胞中移出。在阴性选择中，将不期望的细胞标记并除去。可以采用的另一种类型的阴性选择是使用抗体/补体处理或免疫毒素来除去不期望的细胞。
在一些实施方案中，可以(例如，使用本文所述的分选方法)获得细胞群，并用于本公开的方法中，所述细胞群包含超过约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如，约65％至约90％、约65％至约95％、约80％至约90％、约80％至约95％、约85％至约90％、约85％至约95％、或约90％至约95％)的目标细胞(例如，介导针对至少一种抑制性抗原的免疫应答的T细胞)。在一些实施方案中，可以(例如，使用本文所述的分选方法)获得细胞群(例如，本文所述的耗尽的细胞群)，并用于本公开的方法中，所述细胞群包含少于约40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少(例如，约5％至约10％、约4％至约10％、约3％至约10％、约2％至约10％、约1％至约10％、约1％至约5％、或约2％至约5％)的目标细胞(例如，介导针对至少一种抑制性抗原的免疫应答的T细胞)，或缺乏任何可检测的所述目标细胞。
所获得的细胞群可以直接用于本公开的方法中，或者可以使用已知方法冷冻以供以后使用。例如，可以使用包含5％-10％DMSO、10％-90％血清白蛋白和50％-90％培养基的冷冻培养基冷冻细胞。可用于保存细胞的其他添加剂包括例如二糖(如海藻糖，Scheinkonig等人,Bone Marrow Transplant.34:531-536(2004))、血浆容量扩充剂(如羟乙基淀粉(hetastarch))和/或等渗的缓冲溶液(如磷酸盐缓冲盐水)。用于低温保存的组合物和方法在本领域中是众所周知的(参见，例如，Broxmeyer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:645-650(2003))。
激活T细胞的方法
本公开的方法可以包括激活细胞群(例如，所获得的本文所述的T细胞群)的步骤。例如，可以通过使T细胞群与激活剂接触来激活T细胞群。激活T细胞的试剂在本领域中是已知的，并且任何这样的试剂都可以用于激活步骤。示例性的非限制性激活剂包括抗CD3抗体、抗Tac抗体、抗CD28抗体和/或植物血凝素(PHA)。在一些实施方案中，通过使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触来激活T细胞群。例如，可以使T细胞群与包含抗CD3抗体和抗CD28抗体的珠粒接触。此类珠粒在本领域中是已知的，并且可从例如ThermoFisherScientific商购获得。
激活步骤可以执行例如至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32、36、40、48小时或更多小时，或1、2、3、4周或更多周。
扩增T细胞的方法
本公开的方法可以包括扩增T细胞群(例如，所获得的本文所述的T细胞群)的步骤。例如，在本文所述的激活或重新训练步骤之前或之后，可以通过将T细胞群在缺乏激活剂或重新训练剂的合适的细胞培养基中培养来进行扩增。或者，可以同时激活或重新训练和扩增T细胞群(即，在存在本文所述的一种或多种激活剂或重新训练剂的情况下)。另外或可替代地，扩增步骤可以包括在包含但不限于IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40和/或IFN-γ的培养基中培养T细胞群。在一些实施方案中，扩增步骤可以包括培养包含两种或更多种此类细胞因子的组合的T细胞群。
在一些实施方案中，T细胞以抗原特异性方式扩增(例如，通过使T细胞与一种或多种特异性抗原和一种或多种其他介质(不包括抗CD3)接触)。在一些情况下，多种抗原结合在一起。在一些实施方案中，T细胞以非特异性方式扩增(例如，在不存在抗原的情况下)。
扩增步骤可以执行例如至少6、12、18、24、30、36、42、48小时或更多小时，或1、2、3、4周或更多周。在一些实施方案中，扩增步骤执行至少1、2、3、4、5、6天或更多天。在一些实施方案中，扩增步骤执行不超过5天、4天、3天、2天或1天。
可以执行扩增步骤，直至群体中的细胞数量达到至少约104、105、106、107、108或更多个细胞。
一般细胞培养方法
可以在一般适合于T细胞培养的条件下培养分选的T细胞。条件可以包括适当的培养基，所述培养基可以含有用于增殖和活力的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-15、TGFβ、TNF-α或本领域技术人员已知的任何其他用于细胞生长的添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。可用于培养T细胞的示例性培养基包括RPMI 1640、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1、X-Vivo 5、X-Vivo 15、X-Vivo 20和Optimizer。培养基可以含有或补充有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素和/或一种或多种足量的用于T细胞生长和扩增的细胞因子。如本领域技术人员已知的，可以将T细胞保持在支持生长的条件下，例如保持在适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)下。
施用T细胞的方法
一旦分离、重新训练和/或扩增了T细胞群，就可以使用各种向受试者施用T细胞的方法，并且在本文中进行了描述。在一些实施方案中，所述方法有效治疗受试者的癌症。
可将本文所述的重新训练的T细胞群和/或耗尽的细胞群配制成细胞治疗剂。在一些实施方案中，细胞治疗剂还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。本文所述的药学上可接受的载体，例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂是本领域技术人员众所周知且容易获得的。优选地，药学上可接受的载体对一种或多种活性剂(例如细胞治疗剂)而言是化学惰性的，并且在使用条件下不引发任何有害的副作用或毒性。
可以配制细胞治疗剂以通过任何合适的途径，例如静脉内、肿瘤内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、硬膜外和/或皮下施用途径施用。优选地，将细胞治疗剂配制成用于肠胃外施用途径。在一些实施方案中，通过输注将细胞治疗剂施用给受试者。
适于肠胃外施用的细胞治疗剂可以是水性或非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和例如使组合物与预期接受者的血液等渗的溶质。水性或非水性的无菌悬浮液可以含有一种或多种悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
施用给受试者，特别是人的剂量将随特定实施方案、所采用的细胞治疗剂、施用方法以及要治疗的特定部位和受试者而变化。但是，剂量应足以提供治疗应答，例如免疫应答。本领域的临床医师可以确定要施用给人或其他受试者以便治疗或预防特定医学病症的细胞治疗剂的治疗有效量。细胞治疗剂治疗有效所需的精确量将取决于许多因素，例如细胞治疗剂的比活性和施用途径，以及许多受试者特异性的考虑因素，这些因素均在本领域技术人员认知范围之内。
可以将任何合适数量的本文所述的细胞施用给受试者。尽管单个本文所述的治疗性细胞能够扩展并提供治疗益处，但在一些实施方案中，施用102个或更多，例如103个或更多、104个或更多、105个或更多或108个或更多个治疗性细胞作为细胞疗法。可替代地或另外地，将1012个或更少，例如1011个或更少、109个或更少、107个或更少、或105个或更少的本文所述的治疗性细胞作为细胞治疗剂施用给受试者。在一些实施方案中，施用102-105个、104-107个、103-109个或105-1010个本文所述的治疗性细胞作为细胞治疗剂。
本文所述的细胞治疗剂的剂量可以一次施用或在合适的时间段内以一系列亚剂量施用给哺乳动物，例如按照需要每天一次、每半周一次、每周一次、每两周一次、每半月一次、每月一次、每半年一次或每年一次。包含有效量的细胞治疗剂的剂量单位可以按日剂量单次施用，或者可以按照需要按每天两次、三次、四次或更多次分剂量的总日剂量施用。在一些实施方案中，将细胞治疗剂与检查点阻断物、一种或多种细胞因子如IL-2或IL-7联合施用(同时、之前或之后)，或在体内消融疗法如氟达拉滨和环磷酰胺之后施用。
测量淋巴细胞应答变化的方法
可以通过测量对一种或多种抗原的淋巴细胞应答的变化来确定免疫应答的重定向或淋巴细胞的重新训练。
在一些实施方案中，可以在细胞水平上测量淋巴细胞应答。在一些实施方案中，可以通过进行测定以测量某些免疫介质的水平来测定淋巴细胞应答。测定可以包括但不限于先前描述的抗原呈递测定。所测量的免疫介质可以是已知的免疫介质和本文所述的免疫介质，例如细胞因子。测量淋巴细胞应答的示例性测定可以是使用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术的测定，如ELISPOT测定。分析还可以包括通过流式细胞术分析细胞表面分子，如共刺激分子(即，CD28、LFA-1、CD137[4-1BB]、CD154[CD40L])、效应记忆标志物(即，CD45RO、CD62L)或HLA分子的上调。分析还可以包括通过基因芯片分析评估有益的基因。
在细胞水平上，免疫应答的重定向或淋巴细胞的重新训练可以通过与未呈递抗原的对照水平相比，响应于鉴定出的抗原细胞因子分泌的变化百分比例如超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％来确定。对照水平可以是不呈递抗原或不添加诱导免疫应答重定向或重新训练的组合物，如佐剂。免疫应答的重定向或重新训练可以通过与结合佐剂呈递抗原相比，响应于仅呈递抗原的免疫介质水平的变化来确定。免疫应答的重定向或重新训练可以通过随时间推移一种或多种免疫介质的水平的变化例如超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％来确定。在一些实施方案中，免疫应答的重定向或淋巴细胞的重新训练可以通过响应于抗原呈递，淋巴细胞产生的不同免疫介质的水平的变化，或淋巴细胞产生的免疫介质的主要类型的变化来确定。例如，针对IFN-γ，IL-10的表达和/或分泌的变化可以指示从免疫抑制性应答到免疫刺激性应答的重定向或重新训练。
在组织水平上，可以通过受试者组织的病理学来测量免疫应答。在一些实施方案中，RECIST标准(http://recist.eortc.org/publications/)可用于确定肿瘤是否缩小，生长或保持不变。在一些实施方案中，表征肿瘤的病理学可以用于表征随时间的免疫应答，并且可以包括肿瘤大小、遗传标志物表达改变、肿瘤细胞对邻近器官和/或淋巴结的侵袭。在一些实施方案中，可以使用如肿瘤面积和/或体积的量度通过肿瘤的大小来证明免疫应答。可以随时间测量肿瘤面积和/或体积，并且可以通过肿瘤的大小和/或生长动力学的变化来指示免疫应答。在一些实施方案中，可以将用免疫原性组合物免疫的受试者的肿瘤大小或生长速率的变化与未免疫的对照受试者的肿瘤大小或生长速率的变化进行比较。在一些实施方案中，可以用多参数免疫组织化学，T细胞受体测序或使用常规免疫测定评估富集的肿瘤浸润淋巴细胞来监测免疫细胞对肿瘤的浸润。免疫应答的重定向或淋巴细胞的重新训练可以通过T细胞的肿瘤浸润的增加来确定。
在组织水平上，免疫应答的重定向或淋巴细胞的重新训练可以通过与对照相比，用抗原免疫的受试者中随时间推移肿瘤生长的变化例如超过5％、6％、7％、8％、9％、10％或20％来确定。在组织水平上，淋巴细胞的重新训练可以通过与对照相比，用抗原治疗的受试者的肿瘤面积或体积的差异例如超过％、6％、7％、8％、9％、10％或20％来证明。对照水平可以是不呈递抗原或不添加诱导免疫应答重定向或重新训练的组合物，如佐剂。
肿瘤抗原的产生
适用于本公开的任何方法或组合物的肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)可以通过任何可用的方式，例如重组或合成的方式产生(参见，例如，Jaradat Amino Acids 50:39-68(2018)；Behrendt等人,J.Pept.Sci.22:4-27(2016))。例如，可以通过利用经工程化成表达编码肿瘤抗原的核酸的宿主细胞系统重组产生肿瘤抗原。可替代地或另外地，可以通过激活内源基因来产生肿瘤抗原。可替代地或另外地，可以通过化学合成来部分地或完全地制备肿瘤抗原。
当以重组的方式产生蛋白质时，可以使用任何表达系统。仅举几个例子，已知的表达系统包括例如大肠杆菌、卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，在哺乳动物细胞中产生适于本发明的重组肿瘤抗原。根据本发明可以使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC号：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell,Leiden,The Netherlands)；转化有SV40的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(HEK293或293细胞，其进行了亚克隆以在悬浮培养基中生长，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如，HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK21，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub and Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。
在一些实施方案中，本发明提供了从人细胞产生的重组肿瘤抗原。在一些实施方案中，本发明提供了从CHO细胞或HT1080细胞产生的重组肿瘤抗原。
通常，被工程化成表达重组肿瘤抗原的细胞可以包含编码本文所述的重组肿瘤抗原的转基因。应当理解，编码重组肿瘤抗原的核酸可以包含调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列和/或用于表达重组肿瘤抗原的其他适当的序列。通常，编码区与这些核酸组分中的一种或多种可操作地连接。
转基因的编码区可以包括一个或多个沉默突变，以针对特定细胞类型优化密码子的使用。例如，可以优化肿瘤抗原转基因的密码子以用于在脊椎动物细胞中表达。在一些实施方案中，可以优化肿瘤抗原转基因的密码子以用于在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，可以优化肿瘤抗原转基因的密码子以用于在人细胞中表达。
癌症和癌症疗法
本公开提供了与患有或被诊断出癌症(如肿瘤)的受试者相关的方法和系统。在一些实施方案中，所述受试者对癌症疗法或组合疗法具有(或曾经具有)阳性临床应答。在一些实施方案中，所述受试者对癌症曾经具有自发应答。在一些实施方案中，所述受试者的癌症部分缓解或完全缓解。在一些实施方案中，所述受试者已经清除了癌症。在一些实施方案中，所述受试者未发生过癌症的复发、重现或转移。在一些实施方案中，所述受试者具有阳性癌症预后。在一些实施方案中，所述受试者未经历过对癌症疗法或组合疗法的毒性应答或副作用。在一些实施方案中，所述受试者对癌症疗法或组合疗法具有(或曾经具有)阴性临床应答。在一些实施方案中，所述受试者尚未清除癌症。在一些实施方案中，所述受试者已经发生过癌症的复发、重现或转移。在一些实施方案中，所述受试者具有阴性癌症预后。在一些实施方案中，所述受试者经历过对癌症疗法或组合疗法的毒性应答或副作用。
在一些实施方案中，在用本文所述的细胞治疗剂治疗后，受试者的一种或多种免疫应答适应。例如，成功的癌症疗法使得一种或多种肿瘤抗原的水平降低，针对所述一种或多种肿瘤抗原的免疫应答提升。
在一些实施方案中，肿瘤是或者包括血液恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、AIDS相关淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、多发性骨髓瘤或骨髓增生性肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤是或者包括实体瘤，包括但不限于乳腺癌、鳞状细胞癌、结肠癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、间皮瘤、泌尿生殖道癌、膀胱癌、直肠癌、胃癌或食道癌。
在一些特定的实施方案中，肿瘤是或者包括晚期肿瘤和/或难治性肿瘤。在一些实施方案中，当在肿瘤中(例如，在从肿瘤获得的组织样品如活检样品中)观察到某些病理时和/或当患有此类肿瘤的癌症患者通常不被考虑成是常规化疗的候选者时，将肿瘤表征为晚期。在一些实施方案中，将肿瘤表征为晚期的病理可以包括肿瘤大小、遗传标志物表达改变、肿瘤细胞对邻近器官和/或淋巴结的侵袭。在一些实施方案中，当患有肿瘤的患者对一种或多种已知的治疗方式(例如，一种或多种常规化学疗法方案)具有抗性和/或当特定患者已针对此类已知治疗方式中的一种或多种已显示出抗性(例如，缺乏应答性)时，将这种肿瘤表征为难治性。
在一些实施方案中，本文所述的细胞治疗剂可以与癌症疗法联合施用。本公开不限于任何特定的癌症疗法，并且本公开涵盖任何已知的或开发的癌症疗法。已知的癌症疗法包括，例如，施用化学治疗剂、放射疗法、手术切除、肿瘤手术切除后的化学疗法、辅助疗法、局部低温或高温、抗肿瘤抗体和抗血管生成剂。在一些实施方案中，癌症和/或辅助疗法包括TLR激动剂(例如，CpG、Poly I:C等，参见，例如，Wittig等人,Crit.Rev.Oncol.Hematol.94:31-44(2015)；Huen等人,Curr.Opin.Oncol.26:237-44(2014)；Kaczanowska等人,J.Leukoc.Biol.93:847-863(2013))、STING激动剂(参见，例如，US20160362441；US20140329889；Fu等人,Sci.Transl.Med.7:283ra52(2015)；和WO2014189805)、先天免疫的非特异性刺激，和/或树突状细胞，或施用GM-CSF、白介素12、白介素7、Flt-3或其他细胞因子。在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括溶瘤病毒疗法，例如talimogene leherparepvec。(参见，例如，Fukuhara等人,Cancer Sci.107:1373-1379(2016))。在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括双特异性抗体疗法(例如，Choi等人,2011Expert Opin Biol Ther；Huehls等人,2015,Immunol and Cell Biol)。在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括细胞疗法，如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞、TCR转导的T细胞、树突状细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或自然杀伤(NK)细胞(例如，如Sharpe and Mount,2015,Dis Model Mech 8:337-50中所综述)。
抗肿瘤抗体疗法(即，涉及施用一种或多种抗肿瘤抗体剂的治疗方案)正迅速成为许多肿瘤治疗的护理标准。已经设计或选择了抗体试剂以结合肿瘤抗原，特别是在肿瘤细胞表面上表达的抗原。已经发表了描述了可用的抗肿瘤抗体剂的各种综述文章(参见，例如，Adler等人,Hematol.Oncol.Clin.North Am.26:447-81(2012)；Li等人,DrugDiscov.Ther.7:178-84(2013)；Scott等人,Cancer Immun.12:14(2012)；以及Sliwkowski等人,Science 341:1192-1198(2013))。下面的表8列出了被已知的可用抗体剂靶向的某些人抗原的不全面列表，并显示了
已提出抗体剂可能对其有效的某些癌症适应症：
表8：
Figure BDA0003071270850000841
Figure BDA0003071270850000851
Figure BDA0003071270850000861
在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括免疫检查点阻断疗法(参见，例如，Martin-Liberal等人,Cancer Treat.Rev.54:74-86(2017)；Menon等人,Cancers(Basel)8:106(2016))或免疫遏制阻断疗法。某些癌细胞通过将免疫检查点通路用作免疫抵抗的主要机制而得以壮大，特别是对于特异性针对肿瘤抗原的T细胞而言更是如此。例如，某些癌细胞可能过表达一种或多种负责抑制细胞毒性T细胞应答的免疫检查点蛋白。因此，可以施用免疫检查点阻断疗法以克服抑制性信号并允许和/或增强针对癌细胞的免疫攻击。免疫检查点阻断疗法可以通过减少、抑制或废除通过免疫应答的负调节因子(例如CTLA-4)进行的信号传导来促进免疫细胞针对癌细胞的应答。在一些实施方案中，癌症疗法可以刺激或增强免疫应答的正调节因子(例如，CD28)的信号传导。
免疫检查点阻断物和免疫遏制阻断疗法的实例包括靶向以下一项或多项的试剂：A2AR、B7-H4、BTLA、CTLA-4、CD28、CD40、CD137、GITR、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、OX40、TIM-3和VISTA。免疫检查点阻断剂的具体实例包括以下单克隆抗体：伊匹单抗(靶向CTLA-4)；替西木单抗(tremelimumab)(靶向CTLA-4)；阿特珠单抗(atezolizumab)(靶向PD-L1)；派姆单抗(靶向PD-1)；纳武单抗(靶向PD-1)；阿维鲁单抗；德瓦鲁单抗；和西米普利单抗(cemiplimab)。
免疫遏制阻断剂的具体实例包括：Vista(B7-H5，T细胞激活的v结构域Ig抑制剂)抑制剂；Lag-3(淋巴细胞激活基因3，CD223)抑制剂；IDO(吲哚胺-吡咯-2,3,-双加氧酶-1,2)抑制剂；KIR受体家族(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)抑制剂；CD47抑制剂；和Tigit(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)抑制剂。
在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括免疫激活疗法。免疫激活剂的具体非限制性实例包括：CD40激动剂；GITR(糖皮质激素诱导的TNF-R相关蛋白，CD357)激动剂；OX40(CD134)激动剂；4-1BB(CD137)激动剂；ICOS(诱导型T细胞刺激剂)；CD278激动剂；IL-2(白介素2)激动剂；和干扰素激动剂。
在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括一种或多种免疫检查点阻断剂、免疫遏制阻断剂和/或免疫激活剂的组合，或一种或多种免疫检查点阻断剂、免疫遏制阻断剂的组合和/或免疫激活剂以及其他癌症疗法的组合。
本文所述的方法可以包括准备和/或提供报告，如电子、基于网络的或纸质形式的报告。所述报告可以包括来自本文所述的方法的一个或多个输出(例如，本文所述的受试者应答)。在一些实施方案中，例如以纸质或电子形式生成报告，所述报告鉴定癌症患者中一种或多种肿瘤抗原(例如，本文所述的一种或多种刺激性和/或抑制性和/或遏制性肿瘤抗原，或淋巴细胞对其具无应答性的肿瘤抗原)存在或不存在的情况，以及任选地，推荐的癌症疗法疗程。在一些实施方案中，所述报告包括用于癌症患者的标识符。在一个实施方案中，所述报告是基于网络的形式。
在一些实施方案中，另外地或可替代地，报告包括有关预后、抗性或潜在的或建议的治疗选项的信息。报告可以包括有关以下方面的信息：治疗选项的可能有效性、治疗选项的可接受性，或将治疗选项应用于癌症患者(例如，报告中标识的癌症患者)的可取性。例如，报告可以包括有关癌症疗法施用的信息或建议，例如，向患者施用预先选择的剂量或以预先选择的治疗方案(例如，与一种或多种替代癌症疗法组合)进行施用。报告可以自执行本文所述方法之后的7、14、21、30或45天内被递送至例如本文所述的实体。在一些实施方案中，所述报告是个性化的癌症治疗报告。
在一些实施方案中，每次使用本文所述的方法测试癌症患者时，都会生成报告以记录。可以每隔一段时间(例如，每月、每两个月、每六个月或每年，或者更频繁或更不频繁地)重新评估癌症受试者，以监测受试者对癌症疗法的应答性和/或一种或多种癌症症状(例如，本文所述的症状)的改善。在一些实施方案中，所述报告可以至少记录癌症受试者的治疗历史。
在一个实施方案中，所述方法还包括向另一方提供报告。另一方可以是例如癌症受试者、护理人员、医师、肿瘤科医生、医院、诊所、第三方付款人、保险公司或政府机关。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用方式整体并入。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不是限制性的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解含义相同的含义。虽然本文描述了合适的方法和材料，然而与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中。
通过以下实施例进一步说明本公开。仅出于说明的目的提供这些实施例。它们不应以任何方式解释为限制本公开的范围或内容。
实施例
下面详细描述了用于鉴定在肿瘤环境中刺激和抑制免疫应答的抗原的方法。除了鉴定刺激性或抑制性抗原外，还展示了通过施用一种或多种佐剂或其他免疫调节剂来重定向免疫应答和/或重新训练T细胞的方法。
实施例1.使用mATLAS筛选鉴定刺激性和抑制性抗原
方法
对一群携带B16F10肿瘤的C57BL/6J小鼠实施安乐死，并收获其肿瘤和脾脏。对从合并肿瘤中获得的DNA进行测序，并分析非同义突变。鉴定出超过1600个此类突变，将这些突变合成为以碱基对变化为中心的399bp的DNA片段，并单独转化到表达cLLO的大肠杆菌中，以构建候选新抗原文库。将从荷瘤小鼠的合并脾脏中冷冻的脾细胞解冻，并使用阴性选择珠粒试剂盒对CD8+T细胞进行分选。随后将它们用CD3/CD28珠粒和IL-2扩增7天，之后在除去珠粒和细胞因子后静息1天。将小鼠APC(RAW309 Cr.1巨噬细胞系)培养过夜，用PBS洗涤，然后与细菌文库一起共培养2小时，用PBS洗涤，然后与非特异性扩增的和静息的CD8+T细胞一起培养过夜。通过定制的小鼠384孔Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光测定，测试从共培养物中收获的上清液中的IFNγ和TNFα。
结果
对于IFNγ、TNFα或这两者，有68种抗原被鉴定为刺激性的(超过阴性对照的统计阈上值，阴性对照为399bp的小鼠肌动蛋白基因片段)，有57种抗原被鉴定为抑制性的(降低到低于阴性对照的统计阈下值)(图1)。NetMHCpan(Nielsen等人,PLoS One.2007年8月29日；2(8):e796)预测的结合抗原中仅2％(6/283)经mATLAS凭经验鉴定为刺激性抗原。NetMHCpan预测的抗原中有6％(17/283)经mATLAS鉴定为抑制性抗原(图2)。
将前50种刺激性抗原和前50种抑制性抗原，以及最接近阴性对照(无应答)的50种抗原用于另外两个重复性更高的重复mATLAS筛选中。在所有3个筛选中将每种抗原按其IFNγ信号排名，并在所有3个筛选中按其TNFα信号单独排名。将排名靠前的10种抗原(刺激性)和排名靠后的10种抗原(抑制性)中的8种各自合成为27聚体合成长肽(SLP)用于小鼠疫苗接种，以及四个15聚体重叠肽(OLP)用于离体测定(图3图A-C)。
实施例2.用于过继细胞治疗(ACT)的个性化抗原特异性T细胞
将经ATLAS鉴定的刺激性和抑制性抗原用于扩增来自癌症患者外周血的肿瘤特异性CD4+和CD8+T细胞，用于个性化过继细胞疗法(ACT)。将对抑制性抗原有应答的T细胞重新训练成期望的表型，即，增强对肿瘤的免疫控制的表型。这些研究为ATLAS促成的ACT提供了临床前概念证明，并为早期人体试验铺平了道路。
目的1：扩增来自小鼠脾细胞的经ATLAS鉴定的抗原特异性T细胞的方法：
·里程碑：
1.确定一种快速的方法来扩增有益的抗原特异性T细胞并通过ELISpot确认特异性。
2.扩增后使用流式细胞术证明Th1效应子记忆表型的建立和维持。
方法：本目的的目标是为小鼠中抗原特异性T细胞的扩增确定最佳条件。随后使用这些方法证明B16F10小鼠肿瘤功效模型中基于ATLAS的ACT疗法的临床前概念证明(目的2)。先前已发表的研究表明了当通过ACT递送时，小鼠中通过肽刺激实现的体外抗原特异性T细胞扩增的可行性以及相应的抗肿瘤功效[Starobinets H等人(2018).Ex vivo ATLAS-identification of neoantigens for personalized cancer immunotherapy in mousemelanoma.American Association for Cancer Research Annual Meeting；Li等人,2016]。
ο里程碑1：为了确定体外扩增抗原特异性鼠T细胞的最佳条件，测试了多种因素的组合。将根据实施例1鉴定的前8种刺激性抗原和抑制性抗原合成为重叠肽(OLP)，所述肽长度为15个氨基酸(以11aa重叠)，跨越以每个抗原突变为中心的27个氨基酸序列。通过阴性珠粒选择对来源于B16F10荷瘤小鼠的脾T细胞进行分选，并接种到含有小鼠APC的培养物中，所述小鼠APC已用跨越刺激性抗原和/或抑制性抗原的OLP诱导。小鼠模型中已发表的文献表明，多种细胞因子的组合极大地影响了体外扩增的T细胞的扩增和表型[Li等人,2016；Zoon等人,2015]。测试多种因素，包括细胞因子添加(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21)和OLP浓度，以使T细胞增殖以及抑制性T细胞应答转变为刺激性应答的潜力最大化。如果此过程未能产生足够的有益抗原特异性T细胞，则通过激活标志物(如CD137)对抗原特异性T细胞进行分选，然后进行抗CD3/CD28非特异性扩增。通过细胞数量和活力监测T细胞的扩增。通过ELISpot测定、中尺度发现(MSD)和流式细胞术评估抗原特异性反应。
目标：最大化小鼠ACT疗法中有益的抗原特异性T细胞扩增(约105-106个总抗原特异性T细胞至多达16种ATLAS确定的刺激性和/或抑制性抗原)。
ο里程碑2：对于成功的ACT疗法，充分确定的是转移的T细胞的表型很重要。为了确保用于ACT的扩增的抗原特异性T细胞的质量，评估T细胞激活的标志物(例如，IFN-γ、TNF-α、CD44、CD69)和T细胞记忆的标志物(CD44、CD62L)。与里程碑1并行，使用流式细胞术分析来分析扩增的T细胞群，以指导最佳T细胞扩增条件。
目标：开发用于T细胞激活和记忆的小鼠T细胞扩增条件，同时针对T细胞耗竭表型进行选择。
目的2：扩增的抗原特异性T细胞在B16F10黑素瘤模型中的功效
·里程碑：
1.在体内研究中证明ATLAS确定的ACT的功效。
2.探究ATLAS确定的ACT与检查点抑制相结合的功效。
·初步数据：使用疫苗的方式，ATLAS鉴定的刺激性抗原候选物在初步研究中显示出显著的T细胞应答以及针对B16F10肿瘤攻击的抗肿瘤功效[美国临时申请号为62/737,832，于2018年9月27日提交]。令人惊讶的是，用抑制性抗原肽进行的治疗性免疫导致肿瘤生长动力学的明显和显著提高。这些初步数据证明了ATLAS平台能够在侵袭性体内小鼠肿瘤模型中鉴定和表征所需要的以及潜在的不期望的抗原特异性T细胞应答的能力。通过选择性地扩增可能增强对肿瘤的免疫控制的T细胞并滤出可能削弱对肿瘤的免疫控制的T细胞，将ATLAS抗原选择的优势应用于提出的ACT疗法。
·研究方法：进行体内研究，以证明C57BL/6小鼠中使用高度侵袭性黑素瘤模型B16F10细胞系时ATLAS衍生的T细胞疗法的临床前概念证明。先前的研究已经证明了有效ACT在荷瘤小鼠中作为单一疗法或与检查点抑制剂的组合的可行性[Mahvi等人,2015]。本研究通过富集靶向肿瘤以进行破坏的抗原特异性T细胞，对现有方法进行了改进。
ο里程碑1：将6-8周龄的C57BL/6小鼠预先分到含有阴性对照或不同的T细胞剂量(105-106个细胞)的扩增的抗原特异性T细胞的多个组中(目的1)。将B16F10黑素瘤细胞(1x105个肿瘤细胞/小鼠)皮下注射到右前侧。肿瘤植入后7天，将根据目的1衍生的抗原特异性T细胞静脉内过继转移到荷瘤小鼠中。使用肿瘤测量、流式细胞术和/或局部和全身性T细胞应答的ELISpot分析，从动力学上监测功效。
目标：证明与非特异性扩增的T细胞转移相比，抗原特异性ACT后更快的肿瘤清除率。
ο里程碑2：评估检查点抑制剂施用与提议ACT的潜在协同作用。ACT与检查点抑制的组合已在某些患者中显示出显著的临床应答[Zacharakis等人,2018]。在本研究中，在存在或不存在ATLAS衍生的ACT疗法的情况下，腹膜内施用抗PD1抗体。如里程碑1所述，使用肿瘤测量、流式细胞术和/或局部和全身性T细胞应答的ELISpot分析，从动力学上监测功效。
目标：证明检查点阻断疗法与抗原特异性ACT相结合的功效
目的3：来自外周血单核细胞的经ATLAS鉴定的抗原特异性人T细胞的扩增
·里程碑：
1.确定扩增人抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的方法。
2.开发抗原特异性CD4+和CD8+T细胞分离方法。
3.开发保持具有期望表型的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞或将其重新训练成期望表型的方法。
4.开发以快速和非特异性地扩增具有期望表型的抗原特异性T细胞的方法。
·初步数据：使用ATLAS，已从人白细胞去除术样品中鉴定了刺激性病毒特异性抗原。这些抗原将被用于开发方法，因为来自健康人供体的单采血液成分术产物很容易获得。
·研究方法：该目的的目标是开发利用肽、细胞因子混合物(IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21)和其他试剂对通过白细胞去除术获得的人T细胞进行抗原特异性扩增的方法。
由于血液中抗原特异性T细胞的频率较低，因此在几个阶段进行扩增。第一阶段使用与细胞因子组合的抗原的重叠肽(15聚体，重叠11个氨基酸)诱导增殖来特异性地扩增T细胞。然后通过T细胞激活标志物对抗原特异性细胞进行分选，并暴露于适当的培养基和试剂中以保持期望表型，或将其重新训练成期望表型。在最后阶段，对具有期望表型的富集的抗原特异性T细胞实施快速的非特异性扩增方案，以生成适于施用给患者的>109个抗原特异性T细胞[Gerdemann等人,2012；Huarte等人,2009；Wolf等人,2014；Yee等人,2002]。
如初步数据所述，使用来自多种病毒的免疫显性的ATLAS鉴定的抗原扩增来自健康供体PBMC的T细胞。确定以下每个里程碑是为了优化健康供体中T细胞扩增过程的每个阶段，随后使用癌症患者的全血和抗原特异性T细胞进行验证。近20年前，几个小组观察到可以在外周血中检测到肿瘤反应性T细胞，并且可以在保持抗肿瘤活性的同时分离和扩增这些细胞。随着工程化的CAR-T细胞和基于TIL的癌症疗法等最新进展，使用ATLAS平台鉴定抗原并开发利用肽的抗原特异性T细胞疗法的方法是可行的。但是，与需要在所有肿瘤细胞上产生可操作靶标的CAR-T细胞和通常产生具有单一特异性和亚群的T细胞的TIL疗法不同，本申请人的方法产生了具有广泛特异性的CD4+和CD8+T细胞，从而增加了根除肿瘤的可能性以及限制转移性肿瘤逃逸的潜力。
ο里程碑1：为了确定抗原特异性T细胞扩增的基础条件，评估了三个因素：1)抗原呈递细胞(APC)，2)CD4+和CD8+共培养物，以及3)使用单一确定的T细胞培养基和肽浓度进行的合并或单独的抗原刺激。将使用专职APC(如树突状细胞)呈递肽与直接刺激外周血单核细胞(PBMC)进行比较。尽管专职APC最适合抗原呈递，但与从CD14+单核细胞分选和衍生树突状细胞相比，使用最少操作的PBMC更实用，也更简单。PBMC(例如，B细胞、单核细胞和巨噬细胞)中存在多种APC亚型，包括非专职APC，使得这种方法可行。一旦确定了APC的来源，就可以在共培养物中扩增抗原特异性CD4+和CD8+T细胞，或者独立地培养。(CD4+T细胞比CD8+T细胞扩增得更快，因此，如果一起生长，则可能在培养物中占主导地位)。对于T细胞亚群，确定增殖和存活的最佳细胞因子需求。为了解决肽合并会诱导抗原竞争的问题，将抗原合并与单一抗原刺激进行比较。另外，分别比较或组合比较刺激性肽和抑制性肽，目标是重新训练抑制性T细胞以便以有益的方式应答(即，对肿瘤的免疫控制)。
一旦确定了扩增的初始条件，评估多个参数以确定最大的扩增：1)T细胞扩增培养基，2)用以诱导增殖的细胞因子和其他试剂的组合，优选地保持天然或中枢记忆表型，或诱导期望的激活效应子表型，3)肽浓度和4)起始细胞浓度。为了监测T细胞扩增的有效性，在整个扩增培养过程中评估细胞数量和活力。通过响应抗原刺激的细胞因子分泌以及基于流式细胞术的激活和耗竭标志物组来监测抗原特异性应答，从而鉴定T细胞的表型。
目标：鉴定使有益的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的数量增加而不会使T细胞耗竭的培养条件，这些T细胞保持天然或中枢记忆表型，或期望的激活效应子表型(即，增强对肿瘤的免疫控制的表型)。
ο里程碑2：此里程碑的目标是确定一种合适的策略，用于分离在里程碑1下开发的扩增的抗原特异性T细胞。扩增的T细胞使用抗原特异性激活标志物进行分选。抗原识别后，激活标志物在T细胞上表达。使用抗体标记合并的或单独的CD4+和CD8+T细胞亚群上的激活标志物4-1BB(CD137)、IL-2R(CD25)和CD40L(CD154)，并使用Miltenyi微珠试剂和磁柱捕获激活的细胞。通过ELISpot或细胞内细胞因子染色测定评估分离前和分离后抗原特异性T细胞群的纯度。希望纯度为>80％抗原特异性。如果激活标志物不能充分分离T细胞，则可以使用其他方法，如额外的激活标志物，使用IFN-γ细胞因子捕获系统或基于流式细胞术的分选方法。出于某些目的，期望在里程碑2下仅分离对抑制性抗原有应答的T细胞。对抑制性抗原有应答的T细胞可以在这个阶段丢弃。
目标：有益抗原特异性T细胞的纯度≥80％。
ο里程碑3：此里程碑的目标是开发一种方法，以维持具有期望表型(即，增强对肿瘤的免疫控制的表型)的抗原特异性CD4+和CD8+T细胞，或从不期望的表型(即，削弱对肿瘤的免疫控制的表型)重新训练成期望的表型(即，增强对肿瘤的免疫控制的表型)。将来自里程碑2的分离的T细胞与细胞因子和其他试剂一起孵育，以确定表型的稳定性或可塑性。优化组合以1)保持期望的激活效应子表型，以及2)从不期望的表型重新训练成期望的激活的效应子表型。在对刺激性抗原有应答的T细胞的存在下对分离出的对抑制性抗原有应答的T细胞进行重新训练，或与之分离地进行重新训练。在下面的非特异性扩增之前，可以将单独重新训练的T细胞与对刺激性抗原有应答的T细胞重组。在一些情况下，仅非特异性地扩增对刺激性抗原有应答的T细胞。
ο里程碑4：此里程碑的目标是开发里程碑3的分离的抗原特异性T细胞的快速非特异性扩增方法，以达到高达10x109个抗原特异性细胞的细胞数量。将T细胞添加到G-Rex封闭培养瓶中，并用CD3/CD28磁珠或CD3/CD28/CD2可溶性抗体激活，以促进T细胞的非特异性扩增。测试生长培养基、激活剂浓度、促增殖和促存活细胞因子组合(IL-2、IL-7、IL-15和IL-21)以及向培养物中添加辐照的PBMC的影响。通过流式细胞术，包括记忆、激活和耗竭标志物评估细胞的生长速率、活力和T细胞表型。
目标：确定实现最大的抗原特异性T细胞增殖同时保持期望的激活效应子或中枢记忆表型(即，增强对肿瘤的免疫控制的表型)，并保持>70％活力的条件。
实施例3.在体外对抑制性T细胞进行重新训练以形成推定的有益的T细胞应答
方法
对患有膀胱癌的患者(患者Ig)的肿瘤和正常组织进行全外显子组测序，以鉴定其肿瘤中存在的所有突变(推定的新抗原)。使用ATLASTM技术(如美国专利9,873,870所述)，对从患者Ig外周血中富集的T细胞针对用表达在其肿瘤中发现的八个突变中的每一个的大肠杆菌克隆诱导的单核细胞衍生的树突状细胞进行筛选。鉴定引发抑制性应答的三种新抗原，定义为IFNγ细胞因子分泌统计水平降低至基线对照水平(表达非抗原多肽的大肠杆菌)以下。抑制性新抗原标记为I1、I2和I3。没有鉴定到刺激性新抗原。
合成重叠肽(OLP；15聚体，重叠11个氨基酸)，并合并以跨越三种抑制性新抗原中的每一种。将来自同一名患者Ig的有活力冷冻的外周血单核细胞(PBMC)解冻，并立即通过双色荧光斑点测定离体评估其对跨越每种抑制性新抗原(I1、I2或I3)的OLP库或对跨越三种抑制性新抗原(I1+I2+I3)的所有OLP的完整库的应答性。此外，使用ImmunoCult试剂对单核细胞进行分选并将其衍生为树突状细胞(MDDC)。八天后，解冻来自患者Ig的新的PBMC小瓶，并使用Miltenyi阳性选择珠粒对T细胞进行分选。将分选的T细胞等分到6孔板的各个孔中，并在存在IL-7、IL-2、IL-15和IL-21细胞因子的情况下用以4μg/mL各OLP库诱导的MDDC、阴性对照感染性疾病抗原，或无刺激物刺激10天。将经培养的、刺激的T细胞洗涤，并再次经由过夜双色荧光斑点测定评估其对各OLP库的应答性。
对于荧光斑点测定，对细胞计数并归一化为4x106/mL，并接种到带有OLP的TNFα/IFNγELISPOT板中进行过夜培养。将各单独样品分到重复的孔中。在过夜的ELISPOT培养板中以1μg/ml使用各OLP。阴性对照包括无抗原孔；阳性对照包括抗CD3抗体和有丝分裂原刺激。
结果
如图5所示，在与抗原和细胞因子一起培养之前，没有对任何OLP库的IFNγ或TNFα应答(图A＝IFNγ；图B＝TNFα)。评估总PBMC和耗尽单核细胞的PBMC获得了相同的结果。图C和图D示出了将T细胞与细胞因子和一种或多种抗原一起离体培养后的荧光斑点结果。正如预期的，在未刺激的样品中未测量到抗原特异性应答，当用阴性对照感染性疾病抗原刺激T细胞时，在共培养期间也未检测到针对目的抗原的应答。出乎意料的是，如通过IFNγ(图C)和TNFα(图D)测得，与跨越抑制性新抗原2(I2)的OLP库或多个OLP(库)的完整库和细胞因子混合物一起培养的细胞表现出强大的刺激性应答。在相同条件下与相同的细胞因子混合物和跨越I1和I3的OLP库一起培养的细胞保持抑制性应答(I1)，或相对于对照显示无应答。这些结果证明T细胞应答是可塑的。在适当条件下，将具有抑制性表型(先前已证明会削弱或降低对肿瘤的免疫控制)的T细胞重新训练成可增强、改善、提升和/或刺激对肿瘤的免疫控制的刺激性表型。
序列表
肝素酶同种型1，前原蛋白，NP_001092010.1，NP_006656.2(SEQ ID NO:6)
Figure BDA0003071270850000991
肝素酶同种型2，前原蛋白，NP_001159970.1(SEQ ID NO:7)
Figure BDA0003071270850000992
SMAD家族成员4，母亲对抗十足瘫痪同系物4，NP_005350.1(SEQ ID NO:8)
Figure BDA0003071270850000993
钙粘蛋白3，同种型1前原蛋白，NP_001784.2
Figure BDA0003071270850001001
钙粘蛋白3，同种型2前体，NP_001304124.1
Figure BDA0003071270850001002
钙粘蛋白3，同种型3，NP_001304125.1
Figure BDA0003071270850001003
绒毛膜促性腺激素β亚基3，前体，NP_000728.1
Figure BDA0003071270850001004
绒毛膜促性腺激素β亚基5，前体，NP_149032.1
Figure BDA0003071270850001011
细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型a，NP_001308126.1，NP_001308127.1，NP_001308128.1，NP_001308129.1，NP_001337853.1，NP_001337854.1，NP_001337855.1，NP_001337856.1，NP_060694.2
Figure BDA0003071270850001012
细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型b，NP_001308130.1
Figure BDA0003071270850001013
细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型c，NP_001308131.1，NP_001308132.1，NP_001308133.1，NP_001308134.1
Figure BDA0003071270850001014
细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型d，NP_001337857.1
Figure BDA0003071270850001015
雌激素受体结合位点相关的抗原，9，NP_001265867.1，NP_004206.1，NP_936056.1，NP_001308129.1，
Figure BDA0003071270850001016
ETS转录因子，同种型a，NP_001964.2
Figure BDA0003071270850001021
ETS转录因子，同种型b，NP_068567.1
Figure BDA0003071270850001022
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型a前体，NP_004439.2
Figure BDA0003071270850001023
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型b，NP_001005862.1
Figure BDA0003071270850001031
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型c，NP_001276865.1
Figure BDA0003071270850001032
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型d前体，NP_001276866.1
Figure BDA0003071270850001041
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型e，NP_001276867.1
Figure BDA0003071270850001042
肌苷一磷酸脱氢酶2，NP_000875.2
Figure BDA0003071270850001043
KRAS原癌基因，GTP酶，同种型a，NP_203524.1
Figure BDA0003071270850001044
KRAS原癌基因，GTP酶，同种型b，NP_004976.2
Figure BDA0003071270850001051
转化生长因子β受体2，同种型A前体，NP_001020018.1
Figure BDA0003071270850001052
转化生长因子β受体2，同种型B前体，NP_003233.4
Figure BDA0003071270850001053
辅肌动蛋白α4，同种型1，NP_004915.2
Figure BDA0003071270850001054
辅肌动蛋白α4，同种型2，NP_001308962.1
Figure BDA0003071270850001061
激活素A受体类1型，NP_001096.1，NP_001104537.1，NP_001334592.1，NP_001334593.1，NP_001334594.1，NP_001334595.1，NP_001334596.1
Figure BDA0003071270850001062
乙醇脱氢酶1C(I类)，γ多肽，NP_000660.1
Figure BDA0003071270850001063
腺苷A2a受体，NP_000666.2，NP_001265426.1，NP_001265427.1，NP_001265428.1，NP_001265429.1
Figure BDA0003071270850001064
Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子16，NP_055263.2
Figure BDA0003071270850001071
B细胞接头蛋白，同种型1，NP_037446.1
Figure BDA0003071270850001072
B细胞接头蛋白，同种型2，NP_001107566.1
Figure BDA0003071270850001073
B细胞接头蛋白，同种型3，NP_001245369.1
Figure BDA0003071270850001074
B细胞接头蛋白，同种型4，NP_001245370.1
Figure BDA0003071270850001081
B细胞接头蛋白，同种型5，NP_001245371.1
Figure BDA0003071270850001082
碱核蛋白1，同种型a，NP_001708.3
Figure BDA0003071270850001083
碱核蛋白1，同种型b，NP_001288135.1
Figure BDA0003071270850001084
含A家族成员1的BPI折叠，前体，NP_001230122.1，NP_057667.1，NP_570913.1
Figure BDA0003071270850001091
钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型1，NP_000716.2
Figure BDA0003071270850001092
钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型2，NP_001193844.1
Figure BDA0003071270850001093
钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型3，NP_001193845.1
Figure BDA0003071270850001094
钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型4，NP_001193846.1
Figure BDA0003071270850001101
半胱天冬酶3，前原蛋白，NP_001341706.1，NP_001341707.1，NP_004346.3，NP_116786.1
Figure BDA0003071270850001102
半胱天冬酶3，同种型b，NP_001341708.1，NP001341709.1
Figure BDA0003071270850001103
半胱天冬酶3，同种型c，NP_001341710.1，NP001341711.1
Figure BDA0003071270850001104
半胱天冬酶3，同种型d，NP_001341712.1
Figure BDA0003071270850001105
半胱天冬酶3，同种型e，NP_001341713.1
Figure BDA0003071270850001106
小窝蛋白1，同种型α，NP_001744.2
Figure BDA0003071270850001107
小窝蛋白1，同种型β，NP_001166366.1，NP_001166367.1，NP_001166368.1
Figure BDA0003071270850001111
钙粘蛋白1，同种型1前原蛋白，NP_004351.1
Figure BDA0003071270850001112
钙粘蛋白1，同种型2前体，NP_001304113.1
Figure BDA0003071270850001113
钙粘蛋白1，同种型3，NP_001304114.1
Figure BDA0003071270850001114
钙粘蛋白1，同种型4，NP_001304115.1
Figure BDA0003071270850001121
细胞色素c氧化酶亚基8C，NP_892016.1
Figure BDA0003071270850001122
肉毒碱棕榈酰转移酶1A，同种型1，NP_001867.2
Figure BDA0003071270850001123
肉毒碱棕榈酰转移酶1A，同种型2，NP_001027017.1
Figure BDA0003071270850001124
癌症/睾丸抗原1A，NP_640343.1
Figure BDA0003071270850001125
C-X-C基序趋化因子配体13，NP_006410.1
Figure BDA0003071270850001126
二酰基甘油激酶eta，同种型1，NP_001191433.1，NP_690874.2
Figure BDA0003071270850001131
二酰基甘油激酶eta，同种型2，NP_821077.1
Figure BDA0003071270850001132
二酰基甘油激酶eta，同种型3，NP_001191434.1
Figure BDA0003071270850001141
二酰基甘油激酶eta，同种型4，NP_001191435.1
Figure BDA0003071270850001142
二酰基甘油激酶eta，同种型5，NP_001284358.1
Figure BDA0003071270850001151
真核翻译延伸因子2，NP_001952.1
Figure BDA0003071270850001152
真核翻译起始因子5A，同种型A，NP_001137232.1
Figure BDA0003071270850001153
真核翻译起始因子5A，同种型B，NP_001137233.1，NP_001137234.1，NP_001961.1
Figure BDA0003071270850001154
纤粘蛋白1，同种型1前体，NP_997647.1
Figure BDA0003071270850001161
纤粘蛋白1，同种型3前体，NP_002017.1
Figure BDA0003071270850001162
Figure BDA0003071270850001171
纤粘蛋白1，同种型4前体，NP_997643.1
Figure BDA0003071270850001172
Figure BDA0003071270850001181
纤粘蛋白1，同种型5前体，NP_997641.1
Figure BDA0003071270850001182
纤粘蛋白1，同种型6前体，NP_997639.1
Figure BDA0003071270850001191
纤粘蛋白1，同种型7前体，NP_473375.2
Figure BDA0003071270850001192
纤粘蛋白1，同种型8前体，NP_001293058.1
Figure BDA0003071270850001193
Figure BDA0003071270850001201
纤粘蛋白1，同种型9前体，NP_001293059.1
Figure BDA0003071270850001202
Figure BDA0003071270850001211
纤粘蛋白1，同种型10前体，NP_001293060.1
Figure BDA0003071270850001212
Figure BDA0003071270850001221
纤粘蛋白1，同种型11前体，NP_001293061.1
Figure BDA0003071270850001222
主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_001230894.1
Figure BDA0003071270850001223
主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_001346122.1
Figure BDA0003071270850001231
主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_001346123.1
Figure BDA0003071270850001232
主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_002115.2
Figure BDA0003071270850001233
主要组织相容性复合物，II类，DRβ5，前体，NP_002116.2
Figure BDA0003071270850001234
羟基类固醇17-β脱氢酶3，NP_000188.1
Figure BDA0003071270850001235
胰岛素降解酶，同种型1，NP_004960.2
Figure BDA0003071270850001241
胰岛素降解酶，同种型2，NP_001159418.1
Figure BDA0003071270850001242
胰岛素降解酶，同种型3，NP_001309722.1
Figure BDA0003071270850001243
胰岛素降解酶，同种型4，NP_001309723.1
Figure BDA0003071270850001251
胰岛素降解酶，同种型5，NP_001309724.1，NP_001309725.1
Figure BDA0003071270850001252
胰岛素降解酶，同种型6，NP_001309726.1
Figure BDA0003071270850001253
吲哚胺2,3-双加氧酶1，NP_002155.1
Figure BDA0003071270850001261
胰岛素样生长因子结合蛋白5，前体，NP_000590.1
Figure BDA0003071270850001262
胰岛素样生长因子结合蛋白7，同种型1前体，NP_001544.1
Figure BDA0003071270850001263
胰岛素样生长因子结合蛋白7，同种型2前体，NP_001240764.1
Figure BDA0003071270850001264
钾两孔域通道亚族K成员1，NP_002236.1
Figure BDA0003071270850001265
溶酶体相关膜蛋白3，前体，NP_055213.2
Figure BDA0003071270850001266
MAGE家族成员B2，NP_002355.2
Figure BDA0003071270850001271
有丝分裂原激活蛋白激酶13，NP_002745.1
Figure BDA0003071270850001272
具有胶原结构的巨噬细胞受体，NP_006761.1
Figure BDA0003071270850001273
苹果酸酶1，NADP依赖性苹果酸酶，NP_002386.1
Figure BDA0003071270850001274
迁移和侵袭抑制蛋白，NP_068752.2
Figure BDA0003071270850001275
基质金属肽酶12，巨噬细胞金属弹性蛋白酶前原蛋白，NP_002417.2
Figure BDA0003071270850001281
基质金属肽酶7，基质裂解蛋白前原蛋白，NP_002414.1
Figure BDA0003071270850001282
髓磷脂蛋白零样蛋白1，髓磷脂蛋白零样蛋白1同种型a前体，NP_003944.1
Figure BDA0003071270850001283
髓磷脂蛋白零样蛋白1，髓磷脂蛋白零样蛋白1同种型b前体，NP_078845.3
Figure BDA0003071270850001284
髓磷脂蛋白零样蛋白1，髓磷脂蛋白零样蛋白1同种型c前体，NP_001139663.1
Figure BDA0003071270850001285
巨噬细胞清道夫受体1，巨噬细胞清道夫受体I型和II型同种型1，NP_619729.1
Figure BDA0003071270850001291
巨噬细胞清道夫受体1，巨噬细胞清道夫受体I型和II型同种型2，NP_002436.1
Figure BDA0003071270850001292
巨噬细胞清道夫受体1，巨噬细胞清道夫受体I型和II型同种型3，NP_619730.1
Figure BDA0003071270850001293
肌神经蛋白，同种型A，NP_001172047.1，NP_061127.1
Figure BDA0003071270850001294
肌神经蛋白，同种型B，NP_001172048.1
Figure BDA0003071270850001301
N-乙酰基葡糖胺激酶，同种型1，NP_060037.3
Figure BDA0003071270850001302
N-乙酰基葡糖胺激酶，同种型2，NP_001317354.1，NP_001317355.1
Figure BDA0003071270850001303
新天冬氨酸蛋白酶A天冬氨酸肽酶，前原蛋白，NP_004842.1
Figure BDA0003071270850001304
核转录因子Y亚基γ，同种型1，NP_001136060.1
Figure BDA0003071270850001305
核转录因子Y亚基γ，同种型2，NP_055038.2
Figure BDA0003071270850001311
核转录因子Y亚基γ，同种型3，NP_001136059.1
Figure BDA0003071270850001312
核转录因子Y亚基γ，同种型4，NP_001136061.1
Figure BDA0003071270850001313
核转录因子Y亚基γ，同种型5，NP_001136062.1
Figure BDA0003071270850001314
核转录因子Y亚基γ，同种型6，NP_001295043.1
Figure BDA0003071270850001315
核转录因子Y亚基γ，同种型7，NP_001295044.1
Figure BDA0003071270850001316
Figure BDA0003071270850001321
NFKB阻遏因子，同种型1，NP_001166958.1
Figure BDA0003071270850001322
NFKB阻遏因子，同种型2，NP_001166959.1，NP_060014.2
Figure BDA0003071270850001323
纤溶酶原激活物，尿激酶，尿激酶型纤溶酶原激活物同种型1前原蛋白，NP_002649.1
Figure BDA0003071270850001324
纤溶酶原激活物，尿激酶，尿激酶型纤溶酶原激活物同种型2，NP_001138503.1
Figure BDA0003071270850001331
纤溶酶原激活物，尿激酶，尿激酶型纤溶酶原激活物同种型3，NP_001306120.1
Figure BDA0003071270850001332
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1，非活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1同种型1前体，NP_005003.2
Figure BDA0003071270850001333
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1，非活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1同种型2前体，NP_001077061.1
Figure BDA0003071270850001334
Runt相关转录因子1，runt相关转录因子1同种型AML1a，NP_001116079.1
Figure BDA0003071270850001341
Runt相关转录因子1，runt相关转录因子1同种型AML1b，NP_001001890.1
Figure BDA0003071270850001342
Runt相关转录因子1，runt相关转录因子1同种型AML1c，NP_001745.2
Figure BDA0003071270850001343
表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型1前体，NP_001158116.1，NP_001158119.1，NP_005402.3
Figure BDA0003071270850001344
表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型2前体，NP_001087239.2
Figure BDA0003071270850001345
表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型3前体，NP_001158117.1
Figure BDA0003071270850001351
表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型4前体，NP_001158118.1
Figure BDA0003071270850001352
表面活性物质蛋白A2，肺表面活性物质相关蛋白A2同种型1前体，NP_001092138.1，NP_001307742.1
Figure BDA0003071270850001353
表面活性物质蛋白A2，肺表面活性物质相关蛋白A2同种型2前体，NP_001307743.1
Figure BDA0003071270850001354
表面活性物质蛋白B，肺表面活性物质相关蛋白B前体，NP_000533.3，NP_942140.2
Figure BDA0003071270850001355
表面活性物质蛋白C，肺表面活性物质相关蛋白C同种型1前体，NP_001165881.1，NP_003009.2
Figure BDA0003071270850001361
表面活性物质蛋白C，肺表面活性物质相关蛋白C同种型2前体，NP_001165828.1，NP_001304707.1，NP_001304709.1
Figure BDA0003071270850001362
表面活性物质蛋白C，肺表面活性物质相关蛋白C同种型3前体，NP_001304708.1
Figure BDA0003071270850001363
表面活性物质蛋白D，肺表面活性物质相关蛋白D前体，NP_003010.4
Figure BDA0003071270850001364
溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型1，NP_001315548.1，NP_003030.1
Figure BDA0003071270850001365
溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型2，NP_001129057.1
Figure BDA0003071270850001371
溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型3，NP_001315549.1
Figure BDA0003071270850001372
溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型4，NP_001315550.1
Figure BDA0003071270850001373
精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型1，NP_001124000.1
Figure BDA0003071270850001374
精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型2，NP_001123999.1
Figure BDA0003071270850001381
精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型3，NP_003962.3
Figure BDA0003071270850001382
精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型4，NP_001238900.1
Figure BDA0003071270850001391
SGT1同系物，MIS12动粒复合物组装伴侣蛋白，蛋白SGT1同系物同种型A，NP_006695.1
Figure BDA0003071270850001392
SGT1同系物，MIS12动粒复合物组装伴侣蛋白，蛋白SGT1同系物同种型B，NP_001124384.1
Figure BDA0003071270850001393
SGT1同系物，MIS12动粒复合物组装伴侣蛋白，蛋白SGT1同系物同种型C，NP_001307760.1
Figure BDA0003071270850001394
磺基转移酶家族1C成员2，磺基转移酶1C2同种型a，NP_001047.1
Figure BDA0003071270850001401
磺基转移酶家族1C成员2，磺基转移酶1C2同种型b，NP_789795.1
Figure BDA0003071270850001402
跨膜蛋白52B，同种型1，NP_694567.1
Figure BDA0003071270850001403
跨膜蛋白52B，同种型2前体，NP_001073283.1
Figure BDA0003071270850001404
输出蛋白7，NP_055839.3
Figure BDA0003071270850001405
YES原癌基因1，Src家族酪氨酸激酶，酪氨酸蛋白激酶Yes，NP_005424.1
Figure BDA0003071270850001411
含卷曲螺旋结构域的蛋白质80，含卷曲螺旋结构域的蛋白质80前体，NP_955805.1，NP_955806.1
Figure BDA0003071270850001412
顶体蛋白结合蛋白前体NP_115878.2
Figure BDA0003071270850001413
甲胎蛋白，同种型1 NP_001125.1
Figure BDA0003071270850001421
甲胎蛋白，同种型2 NP_001341646.1
Figure BDA0003071270850001422
缺乏于黑素瘤1蛋白NP_001615.2
Figure BDA0003071270850001423
Figure BDA0003071270850001431
A激酶锚定蛋白4，同种型1 NP_003877.2
Figure BDA0003071270850001432
A激酶锚定蛋白4，同种型2 NP_647450.1
Figure BDA0003071270850001433
ALK酪氨酸激酶受体，同种型1 NP_004295.2
Figure BDA0003071270850001441
ALK酪氨酸激酶受体，同种型2 NP_001340694.1
Figure BDA0003071270850001442
血管生成素2，同种型a NP_001138.1
Figure BDA0003071270850001443
血管生成素2，同种型b NP_001112359.1
Figure BDA0003071270850001451
血管生成素2，同种型c NP_001112360.1
Figure BDA0003071270850001452
血管生成素1，同种型1前体NP_001137.2
Figure BDA0003071270850001453
血管生成素1，同种型2前体NP_001186788.1
Figure BDA0003071270850001454
血管生成素1，同种型3前体NP_001300980.1
Figure BDA0003071270850001455
含锚定蛋白重复序列结构域的蛋白30A NP_443723.2
Figure BDA0003071270850001461
雄性激素受体，同种型1 NP_000035.2
Figure BDA0003071270850001462
雄性激素受体，同种型2 NP_001011645.1
Figure BDA0003071270850001463
雄性激素受体，同种型3 NP_001334990.1
Figure BDA0003071270850001471
雄性激素受体，同种型4 NP_001334992.1
Figure BDA0003071270850001472
雄性激素受体，同种型5 NP_001334993.1
Figure BDA0003071270850001473
ATP酶H+转运辅助蛋白1 NP_001174.2
Figure BDA0003071270850001474
B黑素瘤抗原1前体NP_001178.1
Figure BDA0003071270850001475
BCR/ABL融合蛋白e14ab NG_050673.1
Figure BDA0003071270850001481
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf，同种型1 NP_004324.2
Figure BDA0003071270850001491
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf，同种型2 NP_001341538.1
Figure BDA0003071270850001492
碳酸酐酶9前体NP_001207.2
Figure BDA0003071270850001493
G/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1，同种型1 NP_114172.1
Figure BDA0003071270850001494
G/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1，同种型2 NP_001341773.1
Figure BDA0003071270850001501
G/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1，同种型3 NP_001341774.1
Figure BDA0003071270850001502
CD276，同种型a前体NP_001019907.1
Figure BDA0003071270850001503
CD276，同种型b前体NP_001316557.1，NP_079516.1
Figure BDA0003071270850001504
CD276，同种型c NP_001316558.1
Figure BDA0003071270850001505
癌胚抗原相关细胞粘附分子3，同种型1前体NP_001806.2
Figure BDA0003071270850001511
癌胚抗原相关细胞粘附分子3，同种型2前体NP_001264092.1
Figure BDA0003071270850001512
癌胚抗原相关细胞粘附分子5，同种型1前蛋白NP_001278413.1，NP_004354.3
Figure BDA0003071270850001513
癌胚抗原相关细胞粘附分子5，同种型2前蛋白NP_001295327.1
Figure BDA0003071270850001514
含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质2，同种型1 NP_001157.1，NP_001243092.1
Figure BDA0003071270850001515
Figure BDA0003071270850001521
含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质2，同种型2，NP_001243095.1
Figure BDA0003071270850001522
软骨肉瘤相关基因2/3蛋白，同种型X1 XP_006724920.1
Figure BDA0003071270850001523
软骨肉瘤相关基因2/3蛋白，同种型X2 XP_016885512.1
Figure BDA0003071270850001524
硫酸软骨素蛋白聚糖4前体NP_001888.2
Figure BDA0003071270850001531
癌症/睾丸抗原2同种型LAGE-1a NP_758965.2
Figure BDA0003071270850001532
癌症/睾丸抗原2同种型LAGE-1b NP_066274.2
Figure BDA0003071270850001533
转录阻遏因子CTCFL，同种型1 NP_001255969.1，NP_001255970.1，NP_542185.2
Figure BDA0003071270850001541
转录阻遏因子CTCFL，同种型2 NP_001255971.1
Figure BDA0003071270850001542
转录阻遏因子CTCFL，同种型3 NP_001255972.1
Figure BDA0003071270850001543
转录阻遏因子CTCFL，同种型4 NP_001255973.1
Figure BDA0003071270850001544
转录阻遏因子CTCFL，同种型5 NP_001255974.1
Figure BDA0003071270850001551
转录阻遏因子CTCFL，同种型6 NP_001255975.1
Figure BDA0003071270850001552
转录阻遏因子CTCFL，同种型7 NP_001255976.1
Figure BDA0003071270850001553
转录阻遏因子CTCFL，同种型8 NP_001255977.1
Figure BDA0003071270850001554
转录阻遏因子CTCFL，同种型9 NP_001255978.1
Figure BDA0003071270850001561
转录阻遏因子CTCFL，同种型10 NP_001255979.1
Figure BDA0003071270850001562
转录阻遏因子CTCFL，同种型11 NP_001255980.1，NP_001255981.1
Figure BDA0003071270850001563
转录阻遏因子CTCFL，同种型12 NP_001255983.1
Figure BDA0003071270850001564
转录阻遏因子CTCFL，同种型13 NP_001255984.1
Figure BDA0003071270850001565
细胞色素P450 1B1 NP_000095.2
Figure BDA0003071270850001571
表皮生长因子受体，同种型a前体NP_005219.2
Figure BDA0003071270850001572
表皮生长因子受体，同种型b前体NP_958439.1
Figure BDA0003071270850001573
表皮生长因子受体，同种型c前体NP_958440.1
Figure BDA0003071270850001574
Figure BDA0003071270850001581
表皮生长因子受体，同种型d前体NP_958441.1
Figure BDA0003071270850001582
表皮生长因子受体，同种型e前体NP_001333826.1
Figure BDA0003071270850001583
表皮生长因子受体，同种型f前体NP_001333827.1
Figure BDA0003071270850001591
表皮生长因子受体，同种型g前体NP_001333828.1
Figure BDA0003071270850001592
表皮生长因子受体，同种型h NP_001333829.1
Figure BDA0003071270850001601
表皮生长因子受体，同种型i前体NP_001333870.1
Figure BDA0003071270850001602
上皮细胞粘附分子NP_002345.2
Figure BDA0003071270850001603
肝配蛋白A型受体2，同种型1前体NP_004422.2
Figure BDA0003071270850001611
肝配蛋白A型受体2，同种型2 NP_001316019.1
Figure BDA0003071270850001612
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型a前体，NP_004439.2
Figure BDA0003071270850001613
Figure BDA0003071270850001621
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型b，NP_001005862.1
Figure BDA0003071270850001622
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型c，NP_001276865.1
Figure BDA0003071270850001623
Figure BDA0003071270850001631
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型d，NP_001276866.1
Figure BDA0003071270850001632
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型e NP_001276867.1
Figure BDA0003071270850001633
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-4，同种型JM-a/CVT-1前体NP_005226.1
Figure BDA0003071270850001641
受体酪氨酸蛋白激酶erbB-4，同种型JM-a/CVT-2前体NP_001036064.1
Figure BDA0003071270850001642
脯氨酰肽链内切酶FAP，同种型1 NP_004451.2
Figure BDA0003071270850001651
脯氨酰肽链内切酶FAP，同种型2 NP_001278736.1
Figure BDA0003071270850001652
谷氨酸羧肽酶2，同种型1 NP_004467.1
Figure BDA0003071270850001653
谷氨酸羧肽酶2，同种型2 NP_001014986.1
Figure BDA0003071270850001661
谷氨酸羧肽酶2，同种型3 NP_001180400.1
Figure BDA0003071270850001662
谷氨酸羧肽酶2，同种型4 NP_001180401.1
Figure BDA0003071270850001663
谷氨酸羧肽酶2，同种型5 NP_001180402.1
Figure BDA0003071270850001664
谷氨酸羧肽酶2，同种型6 NP_001338165.1
Figure BDA0003071270850001671
Fos相关抗原1，同种型1 NP_005429.1
Figure BDA0003071270850001672
Fos相关抗原1，同种型2 NP_001287773.1
Figure BDA0003071270850001673
Fos相关抗原1，同种型3 NP_001287784.1
Figure BDA0003071270850001674
Fos相关抗原1，同种型4 NP_001287785.1
Figure BDA0003071270850001675
Fos相关抗原1，同种型5 NP_001287786.1
Figure BDA0003071270850001676
G抗原1 NP_001035753.1
Figure BDA0003071270850001681
G抗原12I NP_001465.1
Figure BDA0003071270850001682
半乳糖凝集素1 NP_002296.1
Figure BDA0003071270850001683
半乳糖凝集素3同种型1 NP_002297.2
Figure BDA0003071270850001684
半乳糖凝集素3，同种型3 NP_001344607.1
Figure BDA0003071270850001685
半乳糖凝集素9短NP_002299.2
Figure BDA0003071270850001686
半乳糖凝集素9长NP_033665.1
Figure BDA0003071270850001687
半乳糖凝集素9同种型3 NP_001317092.1
Figure BDA0003071270850001691
前黑素体蛋白，同种型1前蛋白NP_001186983.1
Figure BDA0003071270850001692
前黑素体蛋白，同种型2前体NP_001186982.1
Figure BDA0003071270850001693
前黑素体蛋白，同种型3前蛋白NP_008859.1
Figure BDA0003071270850001694
前黑素体蛋白，同种型4前蛋白NP_001307050.1
Figure BDA0003071270850001701
前黑素体蛋白，同种型5前蛋白NP_001307051.1
Figure BDA0003071270850001702
离子型谷氨酸受体，NMDA 2A，同种型1前体NP_000824.1，NP_001127879.1
Figure BDA0003071270850001703
离子型谷氨酸受体，NMDA 2A，同种型2前体NP_001127880.1
Figure BDA0003071270850001711
代谢型谷氨酸受体3前体NP_000831.2
Figure BDA0003071270850001712
HPV E6癌蛋白，NP_041325.1
Figure BDA0003071270850001713
HPV E7癌蛋白，NP_041326.1
Figure BDA0003071270850001714
GTP酶HRas，同种型1 NP_001123914.1，NP_005334.1
Figure BDA0003071270850001721
GTP酶HRas，同种型3 NP_001304983.1
Figure BDA0003071270850001722
GTP酶HRas，同种型2 NP_789765.1
Figure BDA0003071270850001723
血管内皮生长因子受体2前体NP_002244.1
Figure BDA0003071270850001724
肥大/干细胞生长因子受体KIT，同种型1前体NP_000213.1
Figure BDA0003071270850001731
肥大/干细胞生长因子受体KIT，同种型2前体NP_001087241.1
Figure BDA0003071270850001732
血浆激肽释放酶同种型1前蛋白NP_001639.1
Figure BDA0003071270850001733
血浆激肽释放酶同种型3前蛋白NP_001025218.1
Figure BDA0003071270850001734
血浆激肽释放酶同种型4前蛋白NP_001025219.1
Figure BDA0003071270850001741
酪氨酸蛋白激酶LCK，同种型a NP_001036236.1，NP_005347.3
Figure BDA0003071270850001742
酪氨酸蛋白激酶LCK，同种型b NP_001317397.1
Figure BDA0003071270850001743
豆荚蛋白前蛋白NP_001008530.1，NP_005597.3
Figure BDA0003071270850001744
巨噬细胞迁移抑制因子NP_002406.1
Figure BDA0003071270850001745
MAGE家族成员A1 NP_004979.3
Figure BDA0003071270850001746
黑素瘤相关抗原10 NP_001011543.2，NP_001238757.1，NP_066386.2
Figure BDA0003071270850001751
黑素瘤相关抗原12 NP_001159858.1，NP_001159859.1，NP_005358.2
Figure BDA0003071270850001752
黑素瘤相关抗原2 NP_001269430.1，NP_001269431.1，NP_001269433.1，NP_001269434.1，NP_005352.1，NP_786884.1，NP_786885.1
Figure BDA0003071270850001753
MAGE家族成员A3 NP_005353.1
Figure BDA0003071270850001754
黑素瘤相关抗原4 NP_001011548.1，NP_001011549.1，NP_001011550.1，NP_002353.3
Figure BDA0003071270850001761
黑素瘤相关抗原6 NP_005354.1，NP_787064.1
Figure BDA0003071270850001762
黑素瘤相关抗原9 NP_005356.1
Figure BDA0003071270850001763
黑素瘤相关抗原C2 NP_057333.1
Figure BDA0003071270850001764
黑素瘤相关抗原D1，同种型a NP_001005333.1
Figure BDA0003071270850001765
黑素瘤相关抗原D1，同种型b NP_001005332.1，NP_008917.3
Figure BDA0003071270850001771
有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶5 NP_005914.1
Figure BDA0003071270850001772
有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型1 NP_149132.2
Figure BDA0003071270850001781
有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型2 NP_001271159.1
Figure BDA0003071270850001782
有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型3 NP_001271160.1
Figure BDA0003071270850001783
Figure BDA0003071270850001791
有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型4 NP_001271161.1
Figure BDA0003071270850001792
有丝分裂原激活蛋白激酶1 NP_002736.3，NP_620407.1
Figure BDA0003071270850001793
Melan-A NP_005502.1
Figure BDA0003071270850001794
黑素转铁蛋白，同种型1前蛋白NP_005920.2
Figure BDA0003071270850001795
黑素转铁蛋白，同种型2前体NP_201573.1
Figure BDA0003071270850001801
含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质7，同种型αNP_647478.1
Figure BDA0003071270850001802
含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质7，同种型βNP_071444.1
Figure BDA0003071270850001803
中性粒细胞胶原酶，同种型1前蛋白NP_002415.1
Figure BDA0003071270850001804
中性粒细胞胶原酶，同种型2 NP_001291370.1，NP_001291371.1
Figure BDA0003071270850001805
间皮素，同种型1前蛋白NP_001170826.1，NP_005814.2
Figure BDA0003071270850001811
间皮素，同种型2前蛋白NP_037536.2
Figure BDA0003071270850001812
粘蛋白1，同种型1前体NP_002447.4
Figure BDA0003071270850001813
粘蛋白2，同种型1前体NP_001018016.1
Figure BDA0003071270850001814
粘蛋白3，同种型1前体NP_001018017.1
Figure BDA0003071270850001815
粘蛋白5，同种型1前体NP_001037855.1
Figure BDA0003071270850001821
粘蛋白6，同种型1前体NP_001037856.1
Figure BDA0003071270850001822
粘蛋白7，同种型1前体NP_001037857.1
Figure BDA0003071270850001823
粘蛋白8，同种型1前体NP_001037858.1
Figure BDA0003071270850001824
粘蛋白9，同种型1前体NP_001191214.1
Figure BDA0003071270850001825
粘蛋白10，同种型1前体NP_001191215.1
Figure BDA0003071270850001826
粘蛋白11，同种型1前体NP_001191216.1
Figure BDA0003071270850001831
粘蛋白12，同种型1前体NP_001191217.1
Figure BDA0003071270850001832
粘蛋白13，同种型1前体NP_001191218.1
Figure BDA0003071270850001833
粘蛋白14，同种型1前体NP_001191219.1
Figure BDA0003071270850001834
粘蛋白15，同种型1前体NP_001191220.1
Figure BDA0003071270850001835
粘蛋白16，同种型1前体NP_001191221.1
Figure BDA0003071270850001836
粘蛋白17，同种型1前体NP_001191222.1
Figure BDA0003071270850001837
粘蛋白18，同种型1前体NP_001191223.1
Figure BDA0003071270850001841
粘蛋白19，同种型1前体NP_001191224.1
Figure BDA0003071270850001842
粘蛋白20，同种型1前体NP_001191225.1
Figure BDA0003071270850001843
粘蛋白21，同种型1前体NP_001191226.1
Figure BDA0003071270850001844
N-myc原癌基因蛋白，同种型1 NP_001280157.1，NP_005369.2
Figure BDA0003071270850001845
N-myc原癌基因蛋白，同种型2 NP_001280160.1
Figure BDA0003071270850001846
N-myc原癌基因蛋白，同种型3 NP_001280162.1
Figure BDA0003071270850001847
癌症/睾丸抗原1B NP_001318.1
Figure BDA0003071270850001851
阿片类生长因子受体NP_031372.2
Figure BDA0003071270850001852
P抗原家族成员4 NP_001305806.1，NP_008934.1
Figure BDA0003071270850001853
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3a NP_000429.2
Figure BDA0003071270850001854
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3i NP_001120838.1
Figure BDA0003071270850001855
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3b NP_039230.1
Figure BDA0003071270850001856
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3 NP_852122.1
Figure BDA0003071270850001861
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3d NP_852123.1
Figure BDA0003071270850001862
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3e NP_852124.1
Figure BDA0003071270850001863
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3h NP_852125.1
Figure BDA0003071270850001864
配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3g NP_852126.1
Figure BDA0003071270850001865
配对盒蛋白Pax-5，同种型1 NP_057953.1
Figure BDA0003071270850001871
配对盒蛋白Pax-5，同种型2 NP_001267476.1
Figure BDA0003071270850001872
配对盒蛋白Pax-5，同种型3 NP_001267477.1
Figure BDA0003071270850001873
配对盒蛋白Pax-5，同种型4 NP_001267478.1
Figure BDA0003071270850001874
配对盒蛋白Pax-5，同种型5 NP_001267479.1
Figure BDA0003071270850001875
配对盒蛋白Pax-5，同种型6 NP_001267480.1
Figure BDA0003071270850001876
配对盒蛋白Pax-5，同种型7 NP_001267481.1
Figure BDA0003071270850001881
配对盒蛋白Pax-5，同种型8 NP_001267482.1
Figure BDA0003071270850001882
配对盒蛋白Pax-5，同种型9 NP_001267483.1
Figure BDA0003071270850001883
配对盒蛋白Pax-5，同种型10 NP_001267484.1
Figure BDA0003071270850001884
配对盒蛋白Pax-5，同种型11 NP_001267485.1
Figure BDA0003071270850001885
血小板衍生生长因子受体β，同种型1 NP_002600.1
Figure BDA0003071270850001886
Figure BDA0003071270850001891
血小板衍生生长因子受体β，同种型2 NP_001341945.1
Figure BDA0003071270850001892
血小板衍生生长因子受体β，同种型3 NP_001341946.1
Figure BDA0003071270850001893
胎盘特异性蛋白1前体NP_001303816.1，NP_001303817.1，NP_001303818.1，NP_068568.1
Figure BDA0003071270850001901
优先在肿瘤中表达的黑素瘤抗原，同种型a NP_001278644.1，NP_001278645.1，NP_006106.1，NP_996836.1，NP_996837.1，NP_996838.1，NP_996839.1
Figure BDA0003071270850001902
优先在肿瘤中表达的黑素瘤抗原，同种型b NP_001278646.1，NP_001278648.1，NP_001305055.1，NP_001305056.1
Figure BDA0003071270850001903
磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸依赖性Rac交换因子蛋白2，同种型NP_079146.2
Figure BDA0003071270850001911
磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸依赖性Rac交换因子蛋白2，同种型bNP_079446.3
Figure BDA0003071270850001912
鱼精蛋白2，同种型1 NP_002753.2
Figure BDA0003071270850001913
鱼精蛋白2，同种型2 NP_001273285.1
Figure BDA0003071270850001921
鱼精蛋白3，同种型2 NP_001273286.1
Figure BDA0003071270850001922
鱼精蛋白4，同种型2 NP_001273287.1
Figure BDA0003071270850001923
鱼精蛋白5，同种型2 NP_001273288.1
Figure BDA0003071270850001924
颗粒蛋白前体NP_002078.1
Figure BDA0003071270850001925
成髓细胞素前体NP_002768.3
Figure BDA0003071270850001926
前列腺干细胞抗原前蛋白NP_005663.2
Figure BDA0003071270850001927
Ras相关的C3肉毒毒素底物1同种型Rac1b NP_061485.1
Figure BDA0003071270850001931
再生胰岛衍生蛋白3-α前体NP_002571.1，NP_620354.1，NP_620355.1
Figure BDA0003071270850001932
G蛋白信号传导调节因子5，同种型1 NP_003608.1
Figure BDA0003071270850001933
G蛋白信号传导调节因子5，同种型2 NP_001182232.1，NP_001241677.1
Figure BDA0003071270850001934
G蛋白信号传导调节因子5，同种型3 NP_001241678.1
Figure BDA0003071270850001935
Rho相关GTP结合蛋白RhoC前体NP_001036143.1，NP_001036144.1，NP_786886.1
Figure BDA0003071270850001936
肉瘤抗原1 NP_061136.2
Figure BDA0003071270850001941
T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3 NP_055521.1
Figure BDA0003071270850001942
分泌性白细胞蛋白抑制剂NP_003055.1
Figure BDA0003071270850001943
转录因子SOX-10 NP_008872.1
Figure BDA0003071270850001944
精子表面蛋白Sp17 NP_059121.1
Figure BDA0003071270850001951
蛋白SSX2，同种型a NP_003138.3
Figure BDA0003071270850001952
蛋白SSX2，同种型b NP_783629.1
Figure BDA0003071270850001953
蛋白SSX2，同种型c NP_001265626.1
Figure BDA0003071270850001954
乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型1 NP_003887.3
Figure BDA0003071270850001955
乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型2 NP_001035902.1
Figure BDA0003071270850001956
乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型3 NP_001341152.1，NP_001341153.1，NP_001341155.1，NP_001341162.1，NP_001341163.1，NP_001341177.1
Figure BDA0003071270850001961
乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型4 NP_001341156.1，NP_001341158.1，NP_001341167.1
Figure BDA0003071270850001962
乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型5 NP_001341176.1
Figure BDA0003071270850001963
α-N-乙酰基神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶，同种型1 NP_003025.1
Figure BDA0003071270850001964
α-N-乙酰基神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶，同种型2 NP_001291379.1
Figure BDA0003071270850001965
存活蛋白，同种型1 NP_001159.2
Figure BDA0003071270850001966
存活蛋白，同种型2 NP_001012270.1
Figure BDA0003071270850001971
存活蛋白，同种型3 NP_001012271.1
Figure BDA0003071270850001972
T-box 4，同种型1 NP_001308049.1
Figure BDA0003071270850001973
T-box 4，同种型2 NP_060958.2
Figure BDA0003071270850001974
血管生成素1受体，同种型1 NP_000450.2
Figure BDA0003071270850001975
Figure BDA0003071270850001981
血管生成素2受体，同种型1 NP_001277006.1
Figure BDA0003071270850001982
血管生成素3受体，同种型1 NP_001277007.1
Figure BDA0003071270850001983
端粒酶逆转录酶，同种型1 NP_937983.2
Figure BDA0003071270850001991
端粒酶逆转录酶，同种型2 NP_001180305.1
Figure BDA0003071270850001992
细胞肿瘤抗原p53，同种型a NP_000537.3，NP_001119584.1
Figure BDA0003071270850001993
细胞肿瘤抗原p53，同种型b NP_001119586.1
Figure BDA0003071270850002001
细胞肿瘤抗原p53，同种型c NP_001119585.1
Figure BDA0003071270850002002
细胞肿瘤抗原p53，同种型d NP_001119587.1
Figure BDA0003071270850002003
细胞肿瘤抗原p53，同种型e NP_001119588.1
Figure BDA0003071270850002004
细胞肿瘤抗原p53，同种型f NP_001119589.1
Figure BDA0003071270850002005
细胞肿瘤抗原p53，同种型g NP_001119590.1，NP_001263689.1，NP_001263690.1
Figure BDA0003071270850002006
细胞肿瘤抗原p53，同种型h NP_001263624.1
Figure BDA0003071270850002011
细胞肿瘤抗原p53，同种型i NP_001263625.1
Figure BDA0003071270850002012
细胞肿瘤抗原p53，同种型j NP_001263626.1
Figure BDA0003071270850002013
细胞肿瘤抗原p53，同种型k NP_001263627.1
Figure BDA0003071270850002014
细胞肿瘤抗原p53，同种型l NP_001263628.1
Figure BDA0003071270850002015
多巴色素互变异构酶，同种型1 NP_001913.2
Figure BDA0003071270850002016
多巴色素互变异构酶，同种型2 NP_001123361.1
Figure BDA0003071270850002021
多巴色素互变异构酶，同种型3 NP_001309111.1，NP_001309112.1，NP_001309113.1，NP_001309114.1
Figure BDA0003071270850002022
多巴色素互变异构酶，同种型4，NP_001309115.1
Figure BDA0003071270850002023
转化/转录结构域相关蛋白，同种型1 NP_001231509.1
Figure BDA0003071270850002024
Figure BDA0003071270850002031
转化/转录结构域相关蛋白，同种型2 NP_003487.1
Figure BDA0003071270850002041
Figure BDA0003071270850002051
酪氨酸酶前体NP_000363.1
Figure BDA0003071270850002052
血管内皮生长因子A，同种型a NP_001020537.2
Figure BDA0003071270850002053
血管内皮生长因子A，同种型b NP_003367.4
Figure BDA0003071270850002054
血管内皮生长因子A，同种型c NP_001020538.2
Figure BDA0003071270850002055
血管内皮生长因子A，同种型d NP_001020539.2
Figure BDA0003071270850002061
血管内皮生长因子A，同种型e NP_001020540.2
Figure BDA0003071270850002062
血管内皮生长因子A，同种型f NP_001020541.2
Figure BDA0003071270850002063
血管内皮生长因子A，同种型g NP_001028928.1
Figure BDA0003071270850002064
血管内皮生长因子A，同种型h NP_001165093.1
Figure BDA0003071270850002065
血管内皮生长因子A，同种型i NP_001165094.1
Figure BDA0003071270850002066
血管内皮生长因子A，同种型j NP_001165095.1
Figure BDA0003071270850002071
血管内皮生长因子A，同种型k NP_001165096.1
Figure BDA0003071270850002072
血管内皮生长因子A，同种型l NP_001165097.1
Figure BDA0003071270850002073
血管内皮生长因子A，同种型m NP_001165098.1
Figure BDA0003071270850002074
血管内皮生长因子A，同种型n NP_001165099.1
Figure BDA0003071270850002075
血管内皮生长因子A，同种型o NP_001165100.1
Figure BDA0003071270850002076
血管内皮生长因子A，同种型p NP_001165101.1
Figure BDA0003071270850002077
血管内皮生长因子A，同种型q NP_001191313.1
Figure BDA0003071270850002081
血管内皮生长因子A，同种型r NP_001191314.1
Figure BDA0003071270850002082
血管内皮生长因子A，同种型s NP_001273973.1
Figure BDA0003071270850002083
血管内皮生长因子A，同种型VEGF-Ax前体NP_001303939.1
Figure BDA0003071270850002084
含WD重复序列的蛋白46，同种型1 NP_005443.3
Figure BDA0003071270850002085
含WD重复序列的蛋白46，同种型2 NP_001157739.1
Figure BDA0003071270850002086
威尔姆氏瘤蛋白，同种型A NP_000369.4
Figure BDA0003071270850002091
威尔姆氏瘤蛋白，同种型B NP_077742.3
Figure BDA0003071270850002092
威尔姆氏瘤蛋白，同种型D NP_077744.4
Figure BDA0003071270850002093
威尔姆氏瘤蛋白，同种型E NP_001185480.1
Figure BDA0003071270850002094
威尔姆氏瘤蛋白，同种型F NP_001185481.1
Figure BDA0003071270850002095
X抗原家族成员1，同种型a NP_001091063.2
Figure BDA0003071270850002101
X抗原家族成员1，同种型d NP_001091065.1
Figure BDA0003071270850002102
X连锁凋亡抑制因子NP_001158.2，NP_001191330.1
Figure BDA0003071270850002103
等效方案
应当理解，虽然描述了本公开连同其详细描述，但是前述描述旨在说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改均在权利要求书的范围之内。
参考文献列表：
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Claims (58)

1.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
从患有肿瘤或癌症的受试者获得PBMC样品；
在所述PBMC样品中鉴定对至少一种抑制性抗原有应答的多个T细胞；
通过使所述T细胞与试剂或试剂组合接触来重新训练所述多个T细胞(或所述多个T细胞的至少一部分)；以及
向所述受试者施用包含所述重新训练的T细胞的细胞治疗剂，
其中，在施用后，所述重新训练的T细胞介导增强对肿瘤或癌细胞的免疫控制的免疫应答。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所述重新训练步骤之前，从所述PBMC样品中分离出所述多个T细胞。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括扩增所述分离的多个T细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中对所述分离的多个T细胞进行重新训练和扩增的步骤是同时进行的。
5.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，将所述重新训练的T细胞与剩余的PBMC样品或所述剩余的PBMC样品的子集组合。
6.如权利要求5所述的方法，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，扩增(例如，特异性地或非特异性地扩增)所述重组的细胞。
7.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，扩增(例如，特异性地或非特异性地扩增)所述重新训练的T细胞。
8.如权利要求4、6或7所述的方法，其中通过将所述细胞在包含一种或多种Th1相关细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40、IFN-γ)的培养基中培养来扩增所述细胞。
9.如权利要求4、5或7所述的方法，其中通过将所述细胞在包含一种或多种Th2相关细胞因子(例如，IL-4、Il-5、IL-13)的培养基中培养来扩增所述细胞。
10.如权利要求3所述的方法，其中所述扩增步骤进行至少1天、2天、3天、4天、5天或6天或更长时间。
11.如权利要求1所述的方法，其中使所述T细胞与试剂或试剂组合接触至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、14天或21天或更长时间。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述培养基还包含针对TGF-β和/或IL-10的阻断抗体。
13.如权利要求8或9所述的方法，其中所述培养基还包含至少一种抑制性抗原肽或多肽。
14.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，将所述重新训练的T细胞与对至少一种刺激性抗原有应答的未扩增的或扩增的(例如，特异性地或非特异性地扩增的)T细胞组合。
15.如权利要求2所述的方法，其中通过使所述PBMC样品与分离珠粒(例如，磁珠)接触来分离所述多个T细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述珠粒与包含一种或多种特异性地结合所述抑制性抗原的T细胞受体(TCR)的四聚体偶联。
17.如权利要求2-14中任一项所述的方法，其中通过使所述PBMC样品与针对T细胞激活标志物的抗体例如抗4-1BB抗体、抗CD40L抗体或IL-2R抗体接触来分离所述多个T细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述抗体与荧光团或磁珠缀合。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述试剂或试剂组合包括佐剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述佐剂是TLR激动剂、炎性体激活剂、NOD2激动剂、RIG1解旋酶抑制剂或STING激动剂。
21.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述试剂或试剂组合包括检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂)。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述试剂组合包括检查点抑制剂和佐剂。
23.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述试剂或试剂组合包括病毒载体、细菌载体、外来体、脂质体、DNA、mRNA或saRNA。
24.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述试剂或试剂组合包括化学治疗剂或IDO抑制剂。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述抑制性抗原是肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原[TSA或新抗原]、肿瘤相关抗原[TAA]或癌症/睾丸抗原[CTA])。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括T细胞介导的免疫应答。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括抗原呈递细胞(APC)介导的免疫应答。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括B细胞介导的免疫应答。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包括由先天免疫系统的一种或多种细胞(例如，NK细胞、NKT细胞或单核细胞)介导的应答。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括一种或多种有益的临床应答。
31.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括所述肿瘤或癌症的清除、消退或稳定化，例如一种或多种与癌症的清除、消退或稳定化相关的临床量度的水平。
32.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括例如在限定的时间段(例如，至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周，或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年)内不存在癌症的复发、重现和/或转移。
33.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括阳性癌症预后。
34.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括癌症疗法或疗法组合的一种或多种毒性反应和/或副作用(例如，一种或多种可测量的毒性反应和/或副作用)的不存在或减少。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用癌症疗法或疗法组合。
36.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
从患有肿瘤或癌症的受试者获得PBMC样品；
从所述PBMC样品中除去对抑制性抗原有应答的多个T细胞，以产生包含剩余PBMC的耗尽细胞群；以及
向所述受试者施用包含所述耗尽细胞群的细胞治疗剂，
其中，在施用后，所述耗尽细胞群介导增强对肿瘤或癌细胞的免疫控制的免疫应答。
37.如权利要求36所述的方法，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，使所述耗尽细胞群与至少一种刺激性抗原接触。
38.如权利要求33所述的方法，所述方法还包括在施用给所述受试者之前，扩增(例如，特异性地或非特异性地扩增)所述耗尽细胞群中的T细胞。
39.如权利要求38所述的方法，其中通过将所述耗尽细胞群在包含一种或多种刺激性细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12p40、IFN-γ)的培养基中培养来扩增所述细胞。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述培养基还包含针对TGF-β和/或IL-10的阻断抗体。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述培养基还包含至少一种刺激性抗原。
42.如权利要求36-41中任一项所述的方法，其中通过使所述PBMC样品与分离珠粒(例如，磁珠)或荧光团接触来分离所述多个T细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述珠粒或荧光团与包含一种或多种特异性地结合所述抑制性抗原或刺激性抗原的T细胞受体(TCR)的四聚体偶联。
44.如权利要求36-41中任一项所述的方法，其中通过使所述PBMC样品与针对T细胞激活标志物的抗体例如抗4-1BB抗体、抗IL-2R抗体或抗CD40L抗体接触来分离所述多个T细胞。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述抗体与荧光团或磁珠缀合。
46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其中所述抑制性抗原是肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原[TSA或新抗原]、肿瘤相关抗原[TAA]或癌症/睾丸抗原[CTA])。
47.如权利要求36-46中任一项所述的方法，其中所述细胞治疗剂诱导T细胞介导的免疫应答。
48.如权利要求36-47中任一项所述的方法，其中所述细胞治疗剂诱导抗原呈递细胞(APC)介导的免疫应答。
49.如权利要求36-48中任一项所述的方法，其中所述细胞治疗剂诱导B细胞介导的免疫应答。
50.如权利要求36-49中任一项所述的方法，其中所述细胞治疗剂诱导由先天免疫系统的一种或多种细胞(例如，NK细胞、NKT细胞或单核细胞)介导的应答。
51.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括一种或多种有益的临床应答。
52.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括所述肿瘤或癌症的清除、消退或稳定化，例如一种或多种与癌症的清除、消退或稳定化相关的临床量度的水平。
53.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括例如在限定的时间段(例如，至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周，或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年)内不存在癌症的复发、重现和/或转移。
54.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括阳性癌症预后。
55.如权利要求36-50中任一项所述的方法，其中增强对所述肿瘤或癌症的免疫控制的免疫应答包括癌症疗法或疗法组合的一种或多种毒性反应和/或副作用(例如，一种或多种可测量的毒性反应和/或副作用)的不存在或减少。
56.如权利要求36-50中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用癌症疗法或疗法组合。
57.一种重新训练T细胞群的方法，所述方法包括：
从患有肿瘤或癌症的受试者获得PBMC样品；
在所述PBMC样品中鉴定对抑制性抗原有应答的多个T细胞；以及
通过使所述T细胞与试剂或试剂组合接触来重新训练所述多个T细胞(或所述多个T细胞的至少一部分)，
其中，在施用给所述受试者后，所述重新训练的T细胞介导增强对肿瘤或癌细胞的免疫控制的免疫应答。
58.多个重新训练的T细胞，所述多个重新训练的T细胞通过如权利要求57所述的方法产生。
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