TW201402812A - 使用重組核酸組成物引發基因靜默效應而抑制標的細胞生長的方法 - Google Patents

Abstract

一種使用一重組核酸組成物來引發一基因靜默效應而抑制一標的細胞生長的方法。該重組核酸組成物產生一基因靜默效應子，以干擾複數個mir-302標的之細胞週期檢查點基因及致癌基因，從而抑制腫瘤及/或癌症細胞的生長及轉移之作用。該重組核酸組成物可作為普適性抗癌藥物及疫苗，且該方法促進普適性抗癌藥物及疫苗之發展。

Description

使用重組核酸組成物引發基因靜默效應而抑制標的細胞生長的方法

本發明一般而言係關於用來發育、生成及篩選不含腫瘤之類胚胎幹(ES)多能性細胞的一種手段及方法，其使用在感興趣之該等細胞中之一重組腫瘤抑制因子微型核醣核酸(miRNA)或小髮夾型RNA(shRNA)試劑的基因轉殖表現。更明確言之，本發明係關於用來生成一非自然發生之重組內含子及其組成物的一種基因轉殖方法及由可誘導性核酸組成，其可經剪接及處理而在哺乳動物細胞中形成小型核醣核酸(RNA)基因靜默效應子(如miRNA先驅物(pre-miRNA)及/或shRNA)內，然後誘發在發育及細胞分化相關之基因及致癌基因中的某些特定基因靜默效應，導致將該等細胞轉化成類ES多能性狀態中。較佳地，該等小型RNA基因靜默效應子包括類腫瘤抑制子之miRNA，像是：mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d，及其人造重設之shRNA同源衍生物與其組合。換句話說，如此生成之該等多能性類幹細胞可在無哺乳細胞(feeder-free)之細胞培養條件下培養。感興趣之該等細胞包括體外(in vitro)、離體(ex vivo)及/或體內(in vivo)分離之體細胞或癌症細胞。

近來在人類幹細胞之研究已顯示在移植治療中之一高度期望的潛力。然而，用來選殖人類幹細胞之該等來源受限，且極難控制其純度及品質。在1998年，James Thomson等人(如：美國專利第5,843,780號、第6,200,806號、第7,029,913號，及第7,220,584號)自人類胚胎之晚囊胚(late blastocysts)分離第一株人類胚胎幹(ES)細胞株(Thomson等人，(1998)Science 282：1145-1147)。H1及H9細胞係得自該等分離之人類ES細胞的兩株典型 細胞株。兩年後，Gearhart等人(如：美國專利第6,090,622號、第6,245,566號，及第6,331,406號)也發展出一種自後囊胚(post-blastocyst)人類胚胎分離類ES原生生殖細胞之方法。因為該等ES細胞分離方法的方式必須破壞原先胚胎，引發了許多倫理及人道關注，其質疑將該等ES細胞用於臨床治療上的正當性。

在最近幾年，治療安全及使用知情同意上的問題也受到注意。例如，因為ES細胞生長需要由周圍「哺乳細胞」纖維母細胞所釋放的一些不確定因子，所有人類ES細胞較佳地係在一層小鼠或人類纖維母細胞上生長(Reubinoff等人之美國專利第6,875,607號)。然而，該等纖維母細胞哺乳細胞呈現不同之表面抗原，其通常污染ES細胞抗原之純度並可引起病人的免疫排斥。儘管已發展了一些無哺乳細胞之培養條件，該等無哺乳細胞方法中沒有一個能將該未分化之ES細胞狀態維持一段長時間。不幸地，在目前任何可得之培養條件下，人類ES細胞株不能達到100%的群體純度。甚至是在最佳之含哺乳細胞培養條件下，一些(約5%-10%或更多)ES細胞總是傾向分化成其它組織細胞類型並失去其幹細胞特性。得自該等ES細胞之最常觀察到的細胞類型之一係畸胎瘤(teratoma)。畸胎瘤係通常得自人類生殖系細胞的一種腫瘤，其包含類似胚胎內胚層(endoderm)、中胚層(mesoderm)及外胚層(ectoderm)組織之多重類腫瘤細胞類型。因此，如何避免哺乳細胞之細胞污染、增加幹細胞純度並減少腫瘤形成之風險係本幹細胞研究的三個主要課題。

2006年時，Takahashi與Yamanaka引介誘導性多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)(Cell 126：663-676)。藉由使用四個轉錄因子基因[Oct3/4(Oct4)，Sox2，c-Myc及Klf4]之反轉錄病毒傳送進入小鼠纖維母細胞內，Takahashi與Yamanaka成功在體外將該等體纖維母細胞轉化並轉形成類ES之iPS細胞株。此方法之成功率在該全部所測試之細胞群中估計少於0.002%-2%。在2007年，該等iPS細胞之基因及行為特性經觀察係類似該等小鼠ES細胞的特性(Okita等人，(2007)Nature 448：313-317；Wernig等人，(2007)Nature 448：318-324)。同時，Yu等人使用類似的方法，但以另一組部分不同轉錄因子，發展出得自人類纖維母細胞之新穎iPS細胞株，該 等轉錄因子包括：Oct4、Sox2、Nanog及LIN28(Yu等人，(2007)Science 318：1917-1920)。然而，Yu的方法遠較Takahashi的方法效率低。該等iPS細胞應用之優點顯示出若配合體細胞核轉移(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技術，不僅解決了原先ES細胞方法的倫理問題，也提供了對病人友善的潛在療法(Meissner等人，(2006)Nature 439：212-215)。此iPS型SCNT治療已測試用來處理基因轉殖小鼠模型中的鐮刀細胞貧血症(Hanna等人，(2007)Science 318：1920-1923)。然而，仍有兩個未解決的問題；其一係反轉錄病毒之基因轉殖使用，其二係致癌基因之使用(如：c-Myc及Klf4)。反轉錄病毒感染係可將四個大型轉錄因子基因轉殖地傳送進標的細胞內的唯一有效手段；然而，多個反轉錄病毒載體隨機插入該標的細胞基因體也可能影響其它非標的基因。這造成疑問，因為由於不確定之反轉錄病毒插入通常會引起細胞變異，特別是當一或多個轉殖基因係致癌基因時。如何避免由該等轉錄因子誘發iPS細胞形成腫瘤目前為止係難解的。

iPS細胞之另一缺點係其非均質性。為生成一iPS細胞，至少三或更多個不同之轉錄因子基因必須經由反轉錄病毒感染來插入單一細胞基因體中。然而，由於不同之反轉錄病毒轉殖基因呈現不同比率之傳送效率及插入變異，多個反轉錄病毒插入通常造成宿主細胞基因體中各式各樣之轉殖基因組合。僅有具適當比率及數目之該等四個轉錄因子基因的細胞可變成具有良好多能性的iPS細胞。此係為何在反轉錄病毒插入後該等iPS細胞僅表現整個細胞群的0.002%-2%，而佔該等細胞超過98%之其它細胞係以複雜之不確定的轉殖細胞組合而轉形。為了收集具正確轉殖基因組合之純iPS細胞，需要一系列繁瑣的細胞篩選程序(Shinya Yamanaka之美國專利第7,250,255號)。雖然iPS細胞形成機制尚未清楚，但是此技術不需要多個轉錄調節子來協調在胚胎基因之再活化及發育訊息之去活化間的轉換。Oct4-Sox2-c-Myc-Klf4或Oct4-Sox2-Nanog-LIN28基因的組合效應似乎直接活化某些胚胎基因；然而，該等效應如何造成取消體細胞分化所必要之整體發育訊息尚未確定。除轉殖基因Oct4外，iPS方法所使用之所有其它轉殖基因實際上均包含在某些組織細胞發育的起始階段中。藉由將該等發育訊息放在一起，該等發育訊息之協調或擾亂以某種方式終止了細 胞分化，然後將該細胞轉形回類ES狀態。這非自然機制，且可包含不確定之風險，像是細胞變異及腫瘤形成。

體細胞核轉移(SCNT)之實驗已顯示體細胞核及卵母細胞之細胞質的雜合可形成多能性類幹細胞，其指出在該卵母細胞之細胞質中的某些母系元素而非該細胞核中之轉錄因子在核轉化中佔有重要角色(Simonsson and Gurdon，(2004)Nat Cell Biol.6：984-990)。在桑葚胚時期前之自然受精卵及早期接合子中，母系元素負責正常幹細胞再生及多能性的調節及維持，其全然無腫瘤形成之風險。這是為何在32-64細胞(桑葚胚)時期前之胚胎細胞係全部相同且全能的。母系元素在卵子生成期間產生並存在於最初胚胎形成時期所需之成熟卵母細胞中。缺乏Dicer(岱塞爾，微型核醣核酸生體合成作用時所需之一致性核醣核酸酶)之小鼠卵母細胞制止減數分裂I之分裂期，其指出微型核醣核酸係卵母細胞中的主要母系元素之一(Murchison等人，(2007)Genes Dev .21：682-693)。在鼠科動物卵母細胞中，核糖核酸佔據母系元素之一大部分，其相當於全部基因體轉錄分子之約45%(Stitzel等人，(2007)Science 316：407-408)。在母系-胚系轉變期間，該等母系RNA很快地降解，且該胚系基因之轉錄很早就在該2-4細胞時期時啟動，並產生用於胚胎發育的訊息(O’Farrell等人，(2004)Curr.Biol. 14：R35-45)。可以想見，許多該等母系RNA係該等胚系基因之抑制子，以在胚胎發育的最初時期同步化發育訊息並維持全能性/多能性之ES細胞再生。因此，母系RNA可能係ES細胞維持及再生所必要的該等主要母系元素之一。

總而言之，ES細胞維持及再生之自然方式係仰賴某些母系RNA(作為抑制子)而非用於iPS技術之該等四個轉錄因子(作為活化子)。為了生成模擬ES細胞維持及再生之自然機制的類ES多能性細胞，吾人極度需要一種新策略來識別及評估該等母系RNA的功能。可將該等已識別之母系RNA傳送進人類成人幹細胞或體細胞，以維持該等幹細胞特性或將該等體細胞轉化成一類ES狀態中，或兩者皆可。因此，吾人需要用來生成類ES多能性細胞之有效、簡單且安全之方法及試劑組成物，較佳地係使用母系RNA。

本發明提供一種方法，供至少一個哺乳動物細胞轉化為至少一個多能性類幹細胞。該方法包含以下步驟：提供至少一細胞基質，其表現複數個mir-302的標的細胞基因；提供至少一個重組核酸組成物，其可經傳送、轉錄及處理成在該細胞基質中與mir-302同源的至少一基因靜默效應子；及在mir-302所標的該等細胞基因受抑制的情況下，以該重組核酸組成物處理該細胞基質。換句話說，本發明提供一種用來發育、生成及篩選類胚胎幹(ES)多能性細胞之方法，其使用類小髮夾型之重組微型核醣核酸(miRNA)試劑的異位表現，這些miRNA如mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d，及其人造重設之miRNA先驅物(pre-miRNA)，及/或小髮夾型RNA(shRNA)同源衍生物與其組成物。非自然發生/人造/人工mir-302試劑之設計包括小髮夾型RNA(shRNA)及/或小干擾RNA(siRNA)同源衍生物或基因群的失配(mismatched)及完美配對(perfectly matched)結構(constructs)，這全部都可改善標的專一性並減少基因轉殖傳送及基因靜默所需之mir-302數量(拷貝數(copy number))。

天然微型核醣核酸(miRNA)通常係約長度18-27之核苷酸(nucleotides，nt)，並可依其相互之互補程度而直接降解其標的訊息RNA(messenger RNA，mRNA)或抑制該標的mRNA之轉譯。mir-302家族(mir-302s)係一群高同源性之基因間miRNA，其分享超過89%之同源性且在幾乎所有的哺乳動物間係一致的。Mir-302家族包含四個成員，其經共同轉錄作為一非編碼(non-coding)之RNA基因群，包括：mir-302b、mir-302c、mir-302a、mir-302d及mir-367，其以五端至三端之方向連接(Suh等人，(2004)Dev.Biol. 270：488-498)。雖然mir-367及mir-302家族係共同表現，由於其對抗不同組之標的基因係截然不同的種子基序(seed motif)，其功能實際上係彼此不同的。頃發現在許多哺乳動物之早期接合子及胚胎幹(ES)細胞中mir-302家族之表現量極高(Tang等人，(2007)Genes Dev. 21：644-648；Suh等人，(2004)Dev.Biol. 270：488-498)。在生長緩慢之ES細胞中表現量最豐富，並在細胞分化及/或增殖後快速地減少。小鼠的卵母細胞缺乏岱塞爾(Dicer)，其係miRNA生體合成作用所需的一種一致性核醣核酸酶，因此該 等卵母細胞停留於減數分裂第一階段的分裂期(meiosis I)，這表示該等miRNA在卵子生成中扮演決定性的角色(Murchison等人，(2007)Genes Dev. 21：682-693)。此外miRNA具有小型抑制RNA的特性，其可抑制具高互補程度(complementarity)之標的基因的轉譯(Bartel，D.P.(2004)Cell 116：281-297)，mir-302家族可能係負責避免ES細胞在早期胚胎形成期間任何可能之早熟分化的主要母系抑制子。該等發現暗示mir-302家族在正常ES細胞維持及再生中扮演重要的角色。

所有mir-302成員在其五端前十七個(17)核苷酸中分享一完全相同(100%)的序列(包括完全種子基序)，以及在其第23個核苷酸成熟miRNA序列中具有整體83%-96%的同源性。該種子基序位在成熟miRNA序列之五端前八個核苷酸中，其決定在該miRNA及其標的基因間的鍵合專一性及效率。根據連結至Sanger miRBase：：Sequences網站(http：//microrna.sanger.ac.uk/)資料庫之「TARGETSCAN」(http：//www.targetscan.org/vert_42/)及「PICTAR-VERT」(http：//pictar.bio.nyu.edu/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi？)程式的預測，其經導向幾乎對抗相同的細胞基因，包括在人類及小鼠中超過445株的一致性基因。此外，mir-302也與mir-93、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373，及mir-520家族成員分享某些重疊之標的基因。大多數之該等標的基因係發育訊息及轉錄因子，其與早期胚胎形成期間之譜系專一性細胞分化的初始及/或促進作用有關(Lin等人，(2008b)RNA 14：2115-2124)。許多該等標的基因也係熟知之致癌基因。因此，mir-302家族之功能更可能抑制發育訊息及分化相關轉錄因子的整體生成，而非如先前之iPS方法係在某些胚胎訊息傳遞路徑上建立轉錄刺激。此外，由於許多該等標的發育訊息及分化相關之轉錄因子係致癌基因，mir-302家族也可如一腫瘤抑制子般作用，以防止正常ES細胞再生偏差而形成腫瘤。換句話說，本發明提供一種方法，其用以生成不含腫瘤之類ES多能性細胞。例如，類胰島素生長因子(insulin-like growth factors，IGF)係用於專對神經元細胞譜系之分化的潛在發育訊息，該等訊息係經由Ras/Raf/有絲分裂劑活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)路徑或經由磷脂醯肌醇3-激酶(phosphatidylinosital 3-kinase；PI3K)/Akt之訊息傳導路徑。相同之訊息傳遞路 徑也與許多腫瘤/癌症轉形相關，像是：腦瘤、乳癌、肺癌、前列腺癌，及皮膚黑色素癌。本發明者發現IGF受體(IGFR)-Ras/PI3K訊息傳遞路徑中超過十八個成員係mir-302家族的強力標的，這表示在哺乳動物卵母細胞及ES細胞中有一極嚴密的封鎖以防止神經元細胞分化。在許多其它各種細胞譜系上也觀察到類似的mir-302家族抑制效應。根據上述證據，本發明者咸信mir-302家族係正常ES細胞之維持與再生的主要調節者，其可能將已分化之體細胞轉化為均質的類ES狀態。

為測試mir-302家族之功能，本發明者已根據天然內含子miRNA生體合成機制(圖1A)發展出第二型RNA聚合酶驅動(Pol-II-driven)之miRNA表現系統，並順利地使用此系統體外地及體內地產生天然miRNA家族以及人造shRNA(圖1B)。廣義而言，該內含子係一基因之非編碼序列，其包括同一讀框內含子(in-frame intron)、五端非轉譯區(5’-UTR)及三端非轉譯區(3’-UTR)。吾人先前之研究已證實有效成熟之miRNA可得自哺乳動物基因之該等內含子區域，稱之為內含子微型核醣核酸(intronic miRNA)(Lin等人，(2003)Biochem Biophys Res Commun. 310：754-760；Lin等人，(2005)Gene 356：32-38)(Lin等人，(2003)Biochem Biophys Res Commun.310：754-760；Lin等人，(2005)Gene 356：32-38)。因為約有50%之哺乳動物miRNA係存在蛋白質編碼基因之該等內含子內，故內含子miRNA表現係哺乳動物中常見之現象(Rodriguez等人，(2004)Genome Res. 14：1902-1910)。如圖1A所示，內含子miRNA生體合成係仰賴新生之第二型RNA聚合酶介導(nascent Pol-II-mediated)之pre-mRNA轉錄及內含子剪接/切除之間的結合交互作用，其係發生在靠近基因體核染質周圍纖絲的某些細胞核區域內(Ghosh等人，(2000)RNA 6：1325-1334；Lin等人，(2008a)Frontiers in Bioscience 13：2216-2230)。該等miRNA係在其宿主基因(pre-mRNAs)之先驅轉錄分子內以第二型RNA聚合酶(Pol-II)轉錄，並以剪接體及其它核醣核酸酶III(RNaseIII)等核酸內切酶剪接以形成成熟之miRNA(Lin等人，2003；Danin-Kreiselman等人，(2003)Mol Cell 11：1279-1289)；然而，Drosha可能不需要此種程序(Ruby等人，(2007)Nature 448：83-86)。結果，內含子miRNA生體合成係以多個細胞內監測系統嚴密調控，包括：第二型RNA聚合酶(Pol-II)轉錄、RNA剪 接、外體處理及無義介導RNA降解(nonsense-mediated RNA decay，NMD)。換句話說，該類miRNA基因靜默效應子係由一細胞內機制釋放，該機制係選自RNA剪接、外體處理、無義介導RNA降解、及其組合。由於此高度細胞內監測，可避免在其它shRNA/siRNA表現系統中所發現的RNA過飽和問題，因而造成在標的基因上一更有效、標的專一性且更安全的基因靜默效應(Lin等人，2008a)。

藉由模擬該天然內含子miRNA路徑(圖1A)，本發明者發明一種新穎內含子miRNA表現系統來轉錄紅色色偏螢光蛋白質(red-shifted fluorescent protein，RGFP)之一重組轉殖基因，稱之為SpRNAi-RGFP，其包含可產生內含子miRNA及/或類shRNA基因靜默效應子的一種人造/人工剪接勝任內含子(splicing-competent intron，SpRNAi)。該SpRNAi在該SpRNAi-RGFP基因之pre-mRNA內以Pol-II共同轉錄，並藉由RNA剪接來切開。接著，進一步將所剪接之SpRNAi處理成成熟之基因靜默效應子，像是：天然miRNA及人造shRNA，因而在標的基因上引發特定之後轉錄基因靜默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)效應。同時，在內含子剪接後，將該SpRNAi-RGFP基因轉錄分子之外顯子鏈接在一起以形成用來轉譯之RGFP標記蛋白質的一成熟mRNA，該RGFP標記蛋白質可用來識別miRNA/shRNA表現。在其它實施例中，一些功能性蛋白質外顯子可用來代替RGFP以提供額外之基因功能，像是：用於體細胞轉化之胚胎幹(ES)基因標記。換句話說，該基因靜默效應子可經由後轉錄基因靜默、轉譯抑制、RNA干擾，及/或無義介導降解來誘發一細胞內基因靜默效應。由於目前在脊椎動物中所發現超過1000個天然miRNA種類尚未清楚其功能，且仍不斷地識別出更多新的miRNA，本發明之內含子miRNA表現系統可作為用來在體內及體外地測試該等miRNA功能的有力工具。

該SpRMAi內含子包括數個一致之核苷酸組成部分，其包含：一五端剪接位(5’-splice site；SEQ.ID.NO.4)、一分支點基序(branch-point motif，BrP；SEQ.ID.NO.6)、一多嘧啶段(poly-pyrimidine tract，PPT；SEQ.ID.NO.7及SEQ.ID.NO.8)，及一三端剪接位(3’-splice site；SEQ.ID.NO.5)。此外，一小髮夾型miRNA或shRNA先驅物係插在該五端剪接位及該分支點基序之 間。此部分之內含子通常在RNA剪接及處理期間形成一套馬索(lariat)結構。此外，該SpRNAi之三端包含一多重轉譯停止密碼子區域(T codon)，以增加內含子RNA剪接及NMD處理的正確性。當此T codon在一細胞質mRNA中出現時，其發出活化該NMD系統的訊息以降解該細胞中所累積的任何未建構之RNA。然而，會保留高度建構之shRNA及先驅miRNA(pre-miRNA)以供Dicer進一步地酶切來分別形成成熟之siRNA及miRNA。對於基因轉殖表現而言，吾人在RGFP基因(SEQ.ID.NO.22)之DraII限制位(第208個核苷酸)中人工地合併SpRNAi。此形成了一重組之SpRNAi-RGFP轉殖基因。酶切具DraII切位之RGFP可在每一端產生具有三個內凹核苷酸的AG-GN核苷酸斷口，其在SpRNAi插入後將分別形成五端剪接位及三端剪接位。因為此內含子插入中斷了RGFP蛋白質的完整性，其可藉由內含子剪接來恢復，故吾人能經由在該等轉染細胞中出現之紅色RGFP來判定該內含子miRNA/shRNA之釋放及該RGFP mRNA之成熟。該RGFP基因也包含多個外顯剪接促進子(exonic splicing enhancer，ESE)以增加RNA剪接之正確性及效率。

在較佳之具體實施例中，本發明係一可誘發miRNA/shRNA表現系統(圖2A及2B)，其改善體內及體外之miRNA/shRNA表現程度的控制。此種改善不僅適用於較安全之電穿孔法(electroporation)/顯微注射法(micro-injection)來進行轉殖基因傳送，以代替易發生腫瘤的反轉錄病毒感染(retroviral infection)，同時也避免了在該等轉染細胞中RNA過度累積的可能性。根據此種改善，本發明者已成功地生成各種mir-302轉導多能性幹(mir-302-transduced pluripotent stem，mirPS)細胞株，其係源自正常表皮皮膚細胞(mirPS-hpESC)、正常頭髮毛囊細胞(mirPS-hHFC)之人類原代培養(primary culture)與癌症乳腺癌MCF7(mirPS-MCF7)、前列腺癌PC3(mirPS-PC3)及皮膚黑色素癌Colo 829(mirPS-Colo)細胞。如圖2A及2B所示，本發明者首先將人造mir-302家族pre-miRNA/shRNA結構(圖3B)合併至SpRNAi-RGFP轉殖基因之內含子插入位(即：MluI-PvuI限制/選殖位)，然後將該SpRNAi-RGFP轉殖基因插進去氧羥(Dox)-可誘發pTet-On-tTS載體之多重選殖位(即：XhoI-ClaI限制位)，因而形成pTet-On-tTS-mir302s轉殖基因載體(圖3A)。換 句話說，該重組核酸組成物(如SpRNAi、SpRNAi-RGFP及諸如此類)包含藥物可誘發之基因表現載體。此外，該SpRNAi-RGFP也可合併進基因表現載體中，其係選自質體、病毒載體、反轉位子、及其組合。該SpRNAi-RGFP轉殖基因係以370鹼基對(base-pair，bp)同源區域為側翼，該同源區域係用來重組插入該宿主細胞基因體的標的位。在基因轉殖傳送方面，pTet-On-tTS-mir302s載體(10-30μg)與該等宿主細胞(200-2000)在一低滲性PH緩衝液(400μl；有蓋試管(Eppendorf))中混合，且在400-450伏特下實行電穿孔法100微秒(μsec)以將該轉殖基因傳送進該等宿主細胞基因體內。在72小時後，使用FACS流式細胞計數儀及anti-RGFP及anti-Oct3/4單株抗體兩者以供分離並收集基因轉殖mirPS成功之細胞(圖3C)。此新穎mir-302家族基因轉殖方法之成功率超過91%，其遠高於原先iPS方法所發現之0.002%-2%的成功率。該人造mir-302家族之所有序列係根據Sanger miRBase：：Sequences程式之序列資料庫而化學合成。pTet-On-tTS載體編碼CMV驅動tTS抑制子基因(CMV-driven tTS inhibitor gene)以去活化該轉殖基因之TRE-CMV啟動子。當出現去氧羥(Dox)時，tTS之抑制功能則經Dox中和，因此表現出SpRNAi-RGFP轉殖基因及其編碼mir-302家族。

在另一較佳具體實施例中，本發明提供一種基因工程方法，其用來建構包含至少一個所需之介子的一人工/人造SpRNAi內含子，該介子係用來產生mir-302家族或類mir-302之miRNA、shRNA及/或反義RNA基因靜默效應子。該SpRNAi係藉由合成寡核苷酸元素的鏈結而形成，以供RNA剪接，合成寡核苷酸元素像是：五端剪接位、BrP、PPT、三端剪接位，及一些鏈接寡核苷酸。寡核苷酸合成器可化學合成並鏈結該等元素。換句話說，該內含子(如：SpRNAi)係以一化學合成方法來合成。在其它實施例中，該等要素之鏈結可藉由酵素限制及接合來達成。換句話說，該內含子(如：SpRNAi)亦可藉由核苷酸重組方法來形成。所得之內含子(如：SpRNAi)可直接用來轉染至感興趣之該等細胞內或是進一步地合併在宿主基因中以與該基因轉錄分子(pre-mRNA)共同表現。因此，目前發明之重組核苷酸組成物進一步地包含重組內含子，其編碼至少一個像是mir-302的RNA基因靜默效應子。一般而言，該等內含子插入方法包括酵素限制/選殖、同源DNA重組、 轉位子合併、跳躍基因整合、反轉錄病毒感染，及其組合。該宿主基因係選自螢光蛋白質(GFP)標記基因、胚胎幹(ES)標記基因、螢光酵素、lac-Z乳糖表現基因、病毒基因、轉位子、跳躍基因、人工重組基因及天然細胞基因。換句話說，該重組核酸組成物進一步包括複數個外顯子，其係選自螢光蛋白質標記基因、螢光酵素基因、lac-Z乳糖表現基因、胚胎幹細胞標記基因、病毒基因、細菌基因、細胞標記基因、跳躍基因、轉位子、及其組合。在不受限制下，本發明較佳使用用來指出mir-302家族表現的修飾紅螢光蛋白質(RGFP)基因。

在一態樣中，該SpRNAi內含子包含一五端剪接位，其與5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU基序(SEQ.ID.NO.38)(即：5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.37)、5’-GTAAGAGT-3’(SEQ.ID.NO.39)、5’-GTAGAGT-3’(SEQ.ID.NO.40)以及5’-GTAAGT-3’(SEQ.ID.NO.41))任一者同源，而其三端係三端受體剪接位(3’-acceptor splice site)，該三端受體剪接位與GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG基序(即：5’-GATATCCTGC AG-3’(SEQ.ID.NO.42)、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’))任一者同源。換句話說，該重組核酸組成物之內含子包含五端供體剪接位(5’-donor splice site)、內含子插入位、分支點基序、多嘧啶段，及三端受體剪接位。此外，分支點序列位在該等五端及三端剪接位之間，其包含與5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)基序同源之基序，像是：5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’。換句話說，該分支點基序包括該SEQ.ID.NO.6序列或與該SEQ.ID.NO.6序列同源。該分支點序列之腺核苷「A」核苷酸在幾乎所有之剪接體內含子中，藉由細胞(2’-5’)寡腺苷合成酶及剪接體來形成一部分之(2’-5’)鏈接套馬索內含子RNA。此外，多嘧啶段係位在接近該分支點及三端剪接位之間，其包含與5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)基序任一者同源之高T或C含量序列。符號「m」及「n」指示多個重覆，其1；更佳地，m的數量等於1~3且n的數量等於7~12。符號「-」係指在該序列中可被略過之核苷酸。也有一些鏈接核苷酸序列係用來連接所有該等合成內含子元素。根據37 CFR 1.822中關於用於核苷酸及/或氨基酸序列資料之符號及格式的準則，符號W係指腺嘌呤(A)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號K係指鳥嘌呤(G)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號S係指胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)，符號Y係指胞嘧啶(C)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號R係指腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，且符號N係指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。

在另一態樣中，表現各種內含子基因靜默效應子之多個轉殖基因及/或載體可用來達成多個標的基因上的基因靜默。在其它實施例中，多個基因靜默效應子可由內含子介子產生。換句話說，該內含子插入位包含至少一個與mir-302同源的基因靜默效應子。例如：已報導在斑馬魚中之anti-EGFP含pre-miRNA內含子的異位表現產生兩個不同長度之miRNA，稱之為miR-EGFP(282/300)及miR-EGFP(280-302)，這指出該SpRNAi之介子可產生多個基因靜默效應子(Lin等人，2005)。在某些例子中，內含子基因靜默效應子可與標的基因轉錄分子(即：mRNA)雜合以形成用來引發二級RNA干擾效應(RNAi)的雙股siRNA。因為該等基因靜默效應子不斷地由該基因轉殖載體製造，其將紓解有關體內快速RNA降解之疑慮。此策略之優點係經由該載體型基因轉殖轉染或病毒感染的穩定傳送，其提供可靠之長期基因靜默效力。此外，本發明可在特定RNA啟動子之控制下生產RNAi相關之基因靜默效應子，包括：miRNA、shRNA及siRNA，該特定RNA啟動子係選自第二型RNA聚合酶(Pol-II)、病毒聚合酶、第三型RNA聚合酶(Pol-III)，及四環黴素反應元素控制RNA聚合酶(tetracycline responsive element-controlled RNA polymerase，TRE)啟動子。該等病毒啟動子係類Pol-II RNA啟動子，其係自巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、反轉錄病毒長終端區(retrovirus long-terminal region，LTR)、B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、腺病毒(adenovirus，AMV)及腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)中分離而得。例如：慢病毒LTR啟動子足以提供超過每一細胞5×10⁵個拷貝的pre-mRNA轉錄分子。也可在該病毒聚合酶啟動子之前插入藥敏感抑制子(即：tTS)以控制該等基因靜默效應子之轉錄率。該抑制子可用化學藥劑或抗生素來抑制，該等化學藥劑或抗生素係選自氨基醣類抗生素(G418)、四環黴素(tetracycline)、去氧羥(doxycyclin)、新黴素(neomycin)、安比西林 (ampicillin)、康黴素(kanamycin)及其衍生物等等之群。換句話說，目前發明之重組核酸組成物的表現可用一類藥物抗生素衍生物來調節，像是：四環黴素衍生物例如：去氧羥係四環黴素衍生物其中之一。

依據本發明，所需內含子RNA介子係以細胞內機制來切除並釋放，然後在特定基因標的上引發所欲之基因靜默效應，該特定基因標的與該RNA介子具有高互補性；而該宿主基因轉錄分子之該等外顯子係鏈接在一起以形成用來產生具所欲蛋白功能的成熟mRNA，這些報導或標記蛋白質可選自紅/綠螢光蛋白質(RGFP/EGFP)、胚胎基因標記、螢光酵素、β半乳醣苷酶(lac-Z)及其衍生物。該報導/標記蛋白之表現可用於識別在該等轉染細胞中該等內含子基因靜默效應子的數量程度及位置，以及有助於確認所得基因靜默效應。在其它實施例中，以該外顯子鏈接形成的成熟mRNA可用在習知之基因治療以代替受損或遺失之基因功能，或增加特定基因表現。換句話說，該等基因靜默效應子(與mir-302同源)也可包括反義RNA、核醣酵素(ribozyme)、短臨時RNA(short temporary RNA，stRNA)、細微非編碼RNA(tiny non-coding RNA，tncRNA)、Piwi交互作用RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)、雙股RNA(double-stranded RNA，dsRNA)、siRNA、shRNA、miRNA，及其前驅物(即：pri-/pre-miRNA)。該等內含子基因靜默效應子之使用係用來將不想要之標的基因靜默的有力工具，該等標的基因係選自外源基因、致病轉殖基因、病毒基因、突變基因、致癌基因、疾病相關非編碼RNA基因與許多其它類型之蛋白質編碼以及非編碼細胞基因。

因為一些天然pre-miRNA的幹環(stem-loop)結構太大且/或太複雜，無法配合該SpRNAi-RGFP轉殖基因，本發明者通常使用人造重設tRNA^met環(即5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3’)(SEQ.ID.NO.43)來代替該等天然pre-miRNA環。該tRNA^met環顯示出能如同天然miRNA般經由相同之Ran-GTP及Exportin-5傳送機制有效地協助將人造重設之miRNA自細胞核輸出至細胞質(Lin等人，(2005)Gene 356：32-38)。有利的是，本發明目前使用一對人造改善pre-mir-302環，包括：5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)，其提供與天然pre-miRNA相同的細胞核輸出效率，但不會干擾tRNA輸出。並且，此改善加強了 mir-302a-mir-302a*及mir-302c-mir-302c*雙鏈體(duplex)之形成，其可增加mir-302家族的整體功能及穩定度。該等新穎pre-miRNA環之設計係以mir-302b/mir-302a之tRNA^met環與短幹環(short stem-loop)的組合來修正，其係高度地表現在胚胎幹細胞中而非表現在其它分化組織細胞中。因此，在mir-302家族中使用該等重組/人造/人工pre-miRNA/shRNA環將不會干擾我們身體中之天然miRNA路徑，因而較不具細胞毒性且更加安全。

mir-302 pre-miRNA家族之基因群(cluster)係藉由合成mir-302同源衍生物之雜合及鏈結/接合來形成，其在五端至三端方向上包含四個部分：mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d pre-miRNA(圖3B)。所有該等人造重設之mir-302 miRNA/shRNA分子在其前十七個核苷酸中具有完全相同之五端(如：5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3))。以下列出用於mir-302 pre-miRNA基因群之DNA重組的合成寡核苷酸：包括：同義mir-302a(mir-302a-sense)，5’-GTCCGATCGT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGG ATCTCGAGCT C-3’(SEQ.ID.NO.29)；反義mir-302a(mir-302a-antisense)，5’-GAGCTCGAGA TCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTC AAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GACGATCGGA C-3’(SEQ.ID.NO.30)；同義mir-302b，5’-ATCTCGAGCT CGCTCCCTTC AACTTTAACA TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTAG CGCTA-3’(SEQ.ID.NO.31)；反義mir-302b，5’-TAGCGCTAGC GACTCCTACT AAAACATGGA AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTA AAGTTGAAGG GAGCGAGCTC GAGAT-3’(SEQ.ID.NO.32)；同義mir-302c，5’-CGCTAGCGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTG TGTGAAACAG AAGTAAGTGC TTCCATGTTT CAGTGGAGGC GTCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.33)；反義mir-302c，5’-ATGTCTAGAC GCCTCCACTG AAACATGGAA GCACTTACTT CTGTTTCACA CAGCAGGTAC CTCCATGTTA AAGCAAAGGT AGCGCTAGCG-3’ (SEQ.ID.NO.34)；同義mir-302d，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAA GCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.35)；及反義mir-302d，5’-ATGACGCGTC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.36)(Sigma-Genosys，St.Louis，MO)。在其它實施例中，吾人可使用人造重設之shRNA，其係以合成同義mir-302家族，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)與反義mir-302家族，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)之雜合來形成，以代替簡單內含子插入的mir-302 pre-miRNA基因群。換句話說，該等較佳的基因靜默效應子之一係以SEQ.ID.NO.27與SEQ.ID.NO.28.雜合形成的一重組核酸序列。該mir-302 shRNA向所有天然之mir-302成員分享超過91%的同源性，並標靶人類中相同之細胞基因。

關於該mir-302 pre-miRNA/shRNA之內含子插入，由於該重組SpRNAi-RGFP轉殖基因之插入位在其五端及三端分別以PvuI及MluI限制/選殖位作為切位，該先驅介子可藉由各種pre-miRNA/shRNA介子簡單地移除及取代(如：mir-302 pre-miRNA/shRNA)，其具有配合該等PvuI及MluI限制位的相配粘著端(cohesive end)。藉由針對各種基因轉錄分子來改變該等內含子的介子，本發明之內含子mir-302家族表現系統可用作體外及體內地誘發標的基因靜默的有力工具。對於長度確認及轉殖基因純化而言，該mir-302插入SpRNAi-RGFP結構(10ng)係以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)與一對寡核苷酸引子(即：5’-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3’(SEQ.ID.NO.23)及5’-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT-3’(SEQ.ID.NO.24))來複製，其在94℃、52-57℃及之後在68℃各執行一分鐘，共執行25-30個循環。所得之PCR產物(~900-1100bp)在2%洋菜膠上層析，然後以膠體萃取工具(gel extraction kit)來萃取及純化 (Qiagen，CA)。在確認該DNA序列後，該插入mir-302之SpRNAi-RGFP的純化轉殖基因經進一步地插入一pTet-On-tTS載體之限制/選殖位(即：XhoI-ClaI位)，以形成用於細胞內表現的pTet-On-tTS-mir302s轉殖基因表現載體(圖3A)。

可使用選自以下之一種方法來達成將該pTet-On-tTS-mir302s轉殖基因載體傳送進哺乳動物細胞內：微脂體/化學轉染法(liposomal/chemical transfection)、電穿孔法(electroporation)、基因槍穿透法(gene gun penetration)、轉位子/反轉位子插入法(transposon/retrotransposon insertion)、跳躍基因整合(jumping gene integration)、顯微注射(micro-injection)，及反轉錄病毒/慢病毒感染(retroviral/lentiviral infection)。為避免隨機轉殖基因插入及細胞變異的風險，本發明者較佳地使用與同源重組配合之電穿孔法以將該pTet-On-tTS-mir302s轉殖基因載體傳送進感興趣之宿主細胞。例如：該SpRNAi-RGFP轉殖基因係以一370鹼基對(bp)同源區域為側翼，以用來重組插入靠近LOC727977所在區域之三端鄰近處的人類染色體6中，在此區域中並無已知之基因編碼。頃偵測到在此單一位置中精確地插入SpRNAi-RGFP(圖4A)。因此在Dox存在時，該SpRNAi-RGFP轉殖基因及其編碼mir-302家族之表現全係依照該pTet-On-tTS載體之TRE-CMV啟動子的活化而定。本發明者已在人類正常及癌症體細胞兩者中測試了此種可誘發mir-302家族表現的新穎方法，該等體細胞包括：正常表皮皮膚細胞、正常頭髮毛囊細胞、癌症乳腺癌MCF7、前列腺癌PC3，及黑色素癌Colo細胞。換句話說，該哺乳動物細胞可轉化為一多能性類幹狀態，該哺乳動物細胞係選自人類細胞、正常體細胞、患病體細胞、腫瘤或癌症細胞、人類頭髮毛囊細胞、人類皮膚細胞及其組合。所得之該等mir-302轉導多能性幹(mir-302-transduced pluripotent stem，mirPS)細胞在相同之基因體位置處全都僅攜帶該SpRNAi-RGFP轉殖基因之一或二個共存的重覆序列(concomitant copies)(圖4A)，這表示該整個mir-302濃度可影響該等mirPS細胞的存活。吾人也已觀察到mir-302家族及其標記RGFP mRNA之表現程度將隨著Dox濃度提高而增加(圖4B)。整個mir-302濃度必須表現得超過30倍(folds)但低於50倍，以觸發將該體細胞轉化為類ES多能性幹細胞。由於在頭髮毛囊 及皮膚細胞中其極低的表現率(僅增加約16倍)，所以由Pol-III或CMV啟動子驅動之目前可得的直接(外顯)siRNA/shRNA表現系統無法運作。這可能是因為該天然mir-302基因群之樣板太短且具結構，以致無法以Pol-III或CMV啟動子直接地轉錄。因此，本發明提供一種可誘發機制，其以具體藥物(即：Dox)在體外及體內地控制mir-302家族的表現程度，這可作為除了該等細胞內監測系統外的一第二道防線。在本發明之該等mirPS細胞中不會偵測到因RNA累積或過飽和所造成的細胞毒性。

本發明已採用該可誘發轉殖基因表現系統的新穎設計及策略，稱之為如先前提及之pTet-On-tTS-mir302s，並將其用於基因轉殖地表現在人類體細胞/癌症細胞中之mir-302家族(mir-302s)的該等成員或同源衍生物，因此可將該等體細胞/癌症細胞轉化成類胚胎幹(ES)的多能性狀態。在較佳具體實施例中，本發明提供一種用於使用藥物可誘發重組核酸組成物之方法，該組成物可被傳送、轉錄及處理而成在人類細胞中之類mir-302miRNA/shRNA分子/同源衍生物，因此在該等細胞中之mir-302標的之發育及分化相關基因誘發特定之基因靜默效應，本方法包含以下步驟：a)提供：i)細胞基質，其表現mir-302家族標的之複數個發育及分化相關基因，及ii)重組核酸組成物，其可轉錄編碼複數個非編碼mir-302 miRNAs/shRNAs或其同源衍生物的分離RNA，該複數個非編碼mir-302 miRNAs/shRNAs或其同源衍生物藉由細胞內機制依次被處理成成熟之mir-302 miRNAs/shRNAs或其同源衍生物中，因此能抑制在該細胞基質中之該等標的基因的功能；b)以該重組核酸組成物來處理該細胞基質，其係在使在該細胞基質中之該等標的基因功能受抑制的狀況下處理。更佳的是，該藥物可誘發重組核酸組成物係Tet-On載體，其包含插入重組mir-302家族基因群(mir-302s；SEQ.ID.NO.29-SEQ.ID.NO.36之雜合)或人造重設mir-302 shRNA同源衍生物(即：SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28之雜合)任一個於SpRNAi-RGFP轉殖基因中。該細胞基質可用體外(in vitro)、離體(ex vivo)及/或體內(in vivo)任一種方式表現該mir-302 miRNA/shRNA及其標的基因。之後，將該細胞基質轉化或轉形成類ES狀態，其不僅呈現標準ES細胞標記，如：Oct3/4、SSEA3、SSEA4、Sox2、Nanog、及LIN-28，並且包含高度去甲基化基因體，其類似 經過幹細胞轉化之接合子基因體。

應用此發明，本發明者已在七個方面成功地達成mir-302誘發多能性幹(mirPS)細胞生成：第一，已生成源自相同細胞類型之兩個同族系的mirPS細胞株；其一係來自人類正常頭髮毛囊細胞(hHFC)，而另一者係來自癌症黑色素癌Colo細胞，兩者皆可體外地形成類胚胎體(圖5A-5C)。第二，已使用該等mirPS轉錄分子之微型核醣核酸(miRNA)微陣列及北方點墨分析法(northern blot analyses)證實mir-302家族之表現提高(圖6A-6B)。第三，已偵測到該標準胚胎幹(ES)細胞標記之表現提高，包括：Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及Nanog(圖6B、8B-8C及圖9B)。第四，已觀察到整體之基因體DNA去甲基化，其類似經過該轉化程序後之接合子基因體的狀態(圖7A-7C)。第五，該等mirPS細胞之泛基因體之基因表現型式已顯示出與人類ES WA01(H1)及WA09(H9)細胞之樣式有超過86%的高相似度(圖8A及圖9A)。第六，將該等mirPS細胞衍生之類胚胎體(embryoid bodies，EB)體內移植至免疫功能不足之SCID-beige小鼠中可形成類畸胎瘤組織囊腫，其包含所有三個胚胎生殖層(外胚層、中胚層及決定性的內胚層)(圖10)。然而，不像畸胎瘤，該等組織囊腫與其周圍組織間形成一極佳且清楚之邊界。並且，該等囊腫在小鼠中的成長在移植後約2.5週時中止。這看來似乎是有一種自我調節之機制可體內地限制該等mirPS衍生EB細胞的隨機生長。最後，可將mirPS細胞之分化導引以形成各種身體系及生殖系組織細胞類型，像是：神經元前身(neuronal progenitor)、軟骨細胞(chondrocyte)、纖維母細胞(fibroblast)及類精原細胞原生細胞(spermatogonia-like primordial cell)，其係體外地使用各種荷爾蒙及/或生長因子來處理(圖11A-11O)。此外，本發明者已成功地使用電穿孔型基因轉殖傳送來形成該等mir-302所誘發之mirPS細胞株，其避免反轉錄病毒感染及細胞突變的風險(圖2A及圖2B)。該等發現提供了微型核醣核酸(miRNA)誘發幹細胞生成的強力證據，其中mir-30家族之異位表現不僅能將成人身體細胞及癌症細胞兩者皆轉化為類ES多能性狀態，而且能在無哺乳細胞培養條件下維持該等類ES mirPS細胞的再生及多能性。由於mir-302家族之功能可用91%-93%之高成功率來將正常及癌症組織細胞兩者皆轉化為類ES多能性幹細胞，此新穎發明之該等發現可在幹細胞及癌症治 療兩者中提供有利之應用。

由以上發現可知，本發明者亦已習得mir-302不僅能大幅地抑制細胞週期素相關激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)、細胞週期素(cyclin)D1及D2的表現以減弱細胞增殖及遷移率，而且能抑制MECP2及MECP1-p66的活動以誘發基因體DNA的整體去甲基化(圖8B-8C及圖9B)。眾所周知細胞週期素cyclin E相關之CDK2係進入細胞循環S期所必須的，且CDK2之抑制可導致G1期檢驗點停滯，其中細胞週期素cyclin D1在回應DNA損害時可超越G1期停滯。根據此原則，以mir-302來抑制CDK2及細胞週期素cyclin D1兩者暗示一項事實：mirPS細胞具有一極慢的分裂率。如圖5A及圖5C中所示，mirPS細胞之平均細胞循環係約20-24小時，其遠慢於其身體/癌症對等物的平均細胞循環(每細胞循環約4-6小時)。腫瘤/癌症細胞無法在如此低之細胞增殖率下生存。藉由控制該細胞循環率，mir-302也可影響細胞之存活。因此，此癌症-幹細胞循環轉換的結果對癌症治療有極大的好處。此外，對MECP2及MECP1-p66活動的抑制與圖7A-7C的結果一致，其顯示將惡性癌症細胞後天轉化成良性mirPS細胞。可以想見，從病人處所得之該等mirPS細胞可進一步幫助修補癌症之組織傷害。藉由抑制基因體印痕(genomic imprinting)及細胞命運決定(cell fate determination)所必要的細胞基因，mir-302家族不僅能將分化體細胞/癌症細胞轉化為類ES多能性狀態，同時也能在無哺乳細胞培養條件下保持此類ES狀態。此外，由於CDK2，細胞週期素cyclin D1及D2之抑制亦可減弱腫瘤/癌症細胞之該等細胞增殖及遷移率，mir-302家族扮演了對抗腫瘤細胞生長及形成之強力腫瘤抑制子的角色(Lin等人，2008b)。mir-302家族之此腫瘤抑制子特徵可協助生成用於臨床移植、幹細胞及癌症治療上的無腫瘤誘發多能性幹細胞。根據吾人目前之發現，mir-302誘發mirPS細胞轉化之機制較該等轉錄因子誘發iPS細胞之機制更加安全、清楚及可理解。

總而言之，本新穎發明mir-302家族表現系統提供一安全且有力的工具以供新穎之類ES多能性幹細胞生成，特別是源自身體毛髮毛囊細胞之原生培養，因為毛髮較容易取得。由於內含子miRNA路徑係以多個細胞內監測系統(像是：mRNA轉錄、RNA剪接、外體處理及NMD)嚴密調 控，因此該路徑較習知之siRNA/shRNA路徑更加有效及安全(Lin等人，2008a)。本發明具有至少五個有益之突破。第一，mir-302表現轉殖基因可代替在該等先前之iPS方法中所用的所有四個大型轉錄因子基因，其用來生成僅源自一些病人體細胞之更具同源性的類ES多能性幹細胞，這可改善病人之免疫系統的幹細胞純度及相容性。第二，因為該mir-302表現轉殖基因之總長度係相對地較小(約千個鹼基)，與該等iPS方法中之最大值2%相較，本方法之轉殖基因傳送係極高的(成功率超過91%)。第三，該mirPS細胞之生成及培養完全在無哺乳細胞狀況下進行，避免了哺乳細胞抗原污染的風險。第四，本發明未使用致癌基因，此避免了細胞變異及腫瘤形成的風險。最後，本發明者使用電穿孔法代替反轉錄病毒感染來傳送單一mir-302表現轉殖基因，此避免了隨機反轉錄病毒插入該宿主細胞基因體的風險，其常會引起插入突變(insertional mutagenesis)。事實上，mir-302已顯示係強力之腫瘤抑制子，其甚至可將各種腫瘤/癌症細胞轉化為類ES多能性幹細胞(優先權由Lin等人之美國專利申請案第12/149,725號擁有)。總結來說，該等優點解決了該等iPS方法之三個主要問題，其避免了反轉錄病毒感染、致癌基因突變及不確定之腫瘤發生的風險。

本發明除了生成類ES多能性細胞株的一般功能外，本發明之可能應用進一步包括以下方法：維持無哺乳細胞及無腫瘤ES細胞培養狀況、避免癌症細胞分化及轉化、分離純或同源幹細胞群、成人幹細胞株之體外選殖及純化、體外導引幹細胞分化成純身體組織，以及使用所得之類ES多能性幹細胞進行移植及幹細胞治療的發展。本發明也可用來作為一種工具，其可研究幹細胞功能及機制，或是可提供用來針對特定用途而改變幹細胞之特性的組成物及方法。在其它具體實施例中，本發明之該等類ES多能性幹細胞可由正常及癌症體細胞以及哺乳動物(像是：人類、猴、狗、貓、大鼠及小鼠)之成年幹細胞生成。

明確言之，以下說明的圖示僅供舉例說明之用而非限制本發明： 圖1A-B描述內含子miRNA生體合成及其相對之基因靜默效應的機制。(圖1A)將內含子miRNA轉錄成先驅訊息RNA(pre-mRNA)之一部分，其包含蛋白質編碼的外顯子及非編碼內含子。將該等內含子從pre-mRNA中剪接出來，並將一些其二級結構進一步酶切而可誘發標的基因靜默的小型類miRNA分子內，而該等外顯子係結合在一起以形成成熟之mRNA以供標記蛋白質合成。(圖1B)將預先設計的內含子miRNA基因轉殖轉染到Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)品種斑馬魚的實施例顯示：在標的綠色EGFP表現上之強力的基因靜默效應(>80%之抑制，左邊第四列)，然而其它非標的介子則不受影響，包括(從第一列至第五列)：不含miRNA之一空內含子(1)，具對抗HIV-p24(2)或結合蛋白integrin β1(3)任一者之pre-miRNA介子的內含子，以及具anti-EGFPpre-miRNA介子但無功能性五端剪接位(functional 5’-splice site)的內含子(5)。將該anti-EGFPpre-miRNA插入紅色色偏螢光標記(red-shifted fluorescent marker，RGFP)基因的五端近端內含子區域(5’-proximal intron region)。北方點墨分析法(右圖)顯示成熟之miRNA家族僅由該pre-miRNA-插入RGFP之該等剪接產物生成，而非該空RGFP(-)或該有缺陷之RGFP(△)，這表示在內含子miRNA生體合成中需要RNA剪接。

圖2A及2B描述使用包含SpRNAi-RGFP轉殖基因之修飾Tet-On載體(即：pTet-On-tTS-mir302s)的結構及策略，以表現mir-302s pre-miRNA基因群或shRNA。一種電穿孔型基因轉殖傳送方法係用來將該表現mir-302 SpRNAi-RGFP之轉殖基因轉染入標的體細胞/癌症細胞。

圖3A-3C顯示將人類正常頭髮毛囊hHFC細胞及癌症黑色素癌Colo細胞轉化為類ES多能性幹(mirPS)細胞，其使用預先設計之Tet-On mir-302-表現轉殖基因之電穿孔型轉染。(圖3A)在Tet-On可誘發載體(即：pTet-On-tTS-miR302s)中之重組mir-302-表現轉殖基因(即：SpRNAi-RGFP)的結構。該SpRNAi-RGFP轉殖基因係以370鹼基對(bp)同源區域為側翼，其用來重組插入人類細胞基因體的標的位。(圖3B)該mir-302 pre-miRNA基因群(mir-302s)之建構，其合併為該SpRNAi-RGFP轉殖基因之內含子的一部分。(圖3C)使用FACS流動式細胞計數儀(flow cytometry)選出陽性mir-302-轉導之mirPS細胞，該流式細胞計數儀係針對RGFP標記蛋白之抗體來分類細胞。 目前本發明之轉殖基因傳送的成功率經測量約為91%-93%。

圖4A-4B顯示在該mirPS細胞基因體之Tet-On mir-302-表現SpRNAi-RGFP轉殖基因的併入整合，其造成在各種去氧羥(Dox)濃度的控制下之該等mir-302家族成員(mir-302s)的可誘發表現。(圖4A)由不同mirPS細胞株分離之基因體DNA的定量PCR(qPCR；左圖)分析，其顯示所有的mirPS細胞僅攜帶該轉殖基因之一或兩個伴隨拷貝序列，其中在原先之hHFC及Colo細胞中未偵測到轉殖基因(控制組)。螢光原位雜合(Fluorescent in-situ hybridization，FISH；右圖)實驗進一步地顯示該轉殖基因被插進該等人類基因體之特定位置中。此種限制基因轉殖插入暗示整體mir-302表現之濃度可影響mirPS細胞之存活。(圖4B)對應於該Dox濃度之該可誘發mir-302s表現的北方點墨分析及柱形圖展示。

圖5A-5C顯示將人類正常頭髮毛囊(hHFC)及癌症黑色素癌Colo細胞轉化為類ES多能性幹(mirPS)細胞的變化。(圖5A)在該等mir-302-轉導細胞(即：mirPS-hHFC及mirPS-Colo細胞)中之形態的改變及細胞增殖率。在具去氧羥(Dox)誘發之mir-302-轉導細胞中發現類ES圓形細胞形狀及極慢之細胞再生率。(圖5B)源自該等mirPS細胞之類胚胎體(EB)的形成以及經導引分化成具陽性Tuj1及/或ABCA2標記之神經元前驅細胞。(圖5C)在限數稀釋法(limiting dilution)之後，由單一mirPS細胞形成EB的時程變化圖。該等細胞循環估計約為20-24小時。

圖6A-6B顯示mir-302s轉染及ES標記表現間的相關性。(圖6A)整體miRNA表現之微陣列分析，其顯示全部之mir-302家族成員(mir-302s)係高度表現在具Dox誘發之mirPS細胞中，而非在該等原始之體細胞中(n=3，p<0.01)。(圖6B)北方點墨及西方點墨分析法，其顯示具Dox誘發之該等mirPS細胞表現了豐富的ES細胞標記，包括：Oct3/4(Oct4)、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及Nanog，但表現較少的Klf4(n=4，p<0.01)，這與在人類ES WA01-H1及WA09-H9細胞中觀察到的細胞標記極為相似。

圖7A-7D顯示在各種mirPS細胞株中之基因體DNA去甲基化的型式。(圖7A)HpaII酶切顯示在mirPS細胞中泛基因體規模下之整體CpG甲基化的降低。(圖7B)將未甲基化之ACGT經二亞硫酸鹽修飾為Oct3/4啟 動子之9,400鹼基對調節區域中的AUGT位，其顯示在所有mirPS細胞中未甲基化之ACTG(或AUCT)位的顯著增加。(圖7C)二亞硫酸鹽DNA序列，其顯示在Oct3/4啟動子之起始位側面的詳細甲基化映像圖。黑色圓圈及白色圓圈分別表示該等甲基化及未甲基化之胞嘧啶位。(圖7D)與mirPS-PC3細胞之起始轉移性癌症PC3細胞相較，mirPS-PC3細胞中之遷移能力的喪失。

圖8A-8C顯示在Colo、mirPS-Colo及人類ES WA01-H1(H1)與WA09-H9(H9)細胞間之泛基因體基因表現分析。(圖8A)使用人類基因體基因晶片(Human genome GeneChip)U133A&B及plus 2.0陣列(Affymetrix)之改變基因表現樣式的比較，其顯示在mirPS-Colo與H1(89%)以及H9(86%)間的高相似度，但與癌症型Colo(53%)細胞較不相似。白點表示與該穩定表現基因(綠點)相較之高度可變基因。(圖8B)微陣列識別分化表現基因之功能性基因群集，其證明在mirPS細胞中偵測到：ES細胞標記之顯著增加與黑色素癌致癌基因、發育訊息以及mir-302-標的細胞增殖與DNA甲基化基因之顯著減少，其極為類似H1及H9細胞中所偵測到的現象(n=4，p<0.01)。圖8C顯示北方點墨及西方點墨分析，其確認在mirPS-Colo細胞中mir-302s、人類ES細胞標記及預測mir-302標的基因之表現樣式間的相關性，這與人類ES H1及H9細胞中之表現樣式類似，除了Klf4之表現以外(n=3，p<0.01)。

圖9A-9B顯示在hHFC、mirPS-hHFC及人類ES WA01-H1(H1)與WA09-H9(H9)細胞間之泛基因體基因表現分析。(圖9A)使用人類基因體基因晶片U133 plus 2.0陣列(Affymetrix)之改變基因表現樣式的比較，其顯示在mirPS-hHFC與H1(96%)以及H9(91%)間的高相似度，但與hHFC(47%-56%)體細胞較不相似。(圖9B)西方點墨分析，其確認在mirPS-hHFC細胞中mir-302s、人類ES細胞標記及預測mir-302標的基因之該等表現樣式間的相關性，這與人類ES H1及H9細胞中之該等表現樣式類似，除了Klf4及Klf5之表現以外。所列出之mir-302標的基因包括：十七個轉錄調節子、一個組織蛋白去乙醯酶(HDA4)、兩個甲基CpG-結合蛋白質(MECP1-p66及MECP2)，以及三個細胞循環檢驗點蛋白質(CDK2、細胞週期素cyclin D1及D2)。

圖10顯示源自在雌性假性懷孕免疫功能不足SCID-beige小 鼠之子宮或腹腔中之mirPS移植物的類畸胎瘤原生組織(n/total=6/6)。該等已分化組織包括所有三個胚胎生殖層：外胚層、中胚層及內胚層，此係在蘇木精(hematoxylin)及曙紅(eosin)(H & E)染色後以其截然不同的細胞形態來判定。顯微鏡照片係以Nikon TE2000系統在200x放大倍率下拍攝。

圖11A-11O顯示mirPS細胞之導引多能性。分別由上至下處理DHT、TGF-ß1及BMP4，將該mirPS細胞誘發分化成類精原細胞(圖11A-E)、纖維組織母細胞(圖11F-J)及軟骨細胞(chondrocyte)(圖11K-O)組織細胞，其係在免疫功能不足之小鼠中離體處理。該免疫功能不足之裸鼠係用於體內環境模擬移植治療中。由左至右顯示之顯微照片指出：使用微分干涉差之蘇木精染色(圖11A、F、K)、以轉殖基因mir-302標記RGFP標示之明視野(紅色)(圖11B、G、L)、以4,6-脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)標示之第一組織標記的免疫染色法(藍色DAPI)(圖11C、H、M)、以螢光素標示之第二組織標記的免疫染色法(綠色EGFP)(圖11D、I、N)，以及所有三個螢光標記之合併(圖11E、J、O)。在該等RGFP-明視野中之小窗口中顯示在高放大倍率(600x)下之分化mirPS細胞的形態。

儘管現將參考附圖描述本發明之特定具體實施例，但應了解此等具體實施例僅作為實施例之用，並僅例示性舉出少數之可能特定具體實施例，其可代表本發明之原理的應用。熟習本技術者人士顯然應了解各種改變及修正皆屬隨附申請專利範圍中所進一步定義的本發明之精神、範疇及構想內。

本發明提供一種新穎核酸組成物及基因轉殖方法，其使用一可誘發重組類微型核醣核酸(miRNA)小髮夾型核醣核酸(shRNA)，將哺乳動物體細胞/癌細胞之基因及行為特徵轉化成一類胚胎幹(ES)多能性狀態。換句話說，本發明提供一種方法，其將至少一個哺乳動物細胞轉化為至少一個多能性類幹細胞。該方法包含以下數個步驟：提供至少一個細胞基質，其表現複數個由mir-302所標的之細胞基因；提供至少一個重組核酸組成物，其可被傳送、轉錄及處理成在該細胞基 質中與mir-302同源的至少一個基因靜默效應子；及在由mir-302所標的之該等細胞基因受抑制的一條件下，以該重組核酸組成物處理該細胞基質。不同於原先shRNA之設計，本發明之shRNA可包含類似於天然mir-302先驅物(pre-mir-302)的一失配(mismatched)幹臂(stem-arm)。另外，本發明之shRNA亦可包含一改良之pre-mir-302幹環(stem-loop)，如：5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)，其可提供與天然pre-miRNA相同的核輸出效率，且不會干擾tRNA輸出。換句話說，該基因靜默效應子包含與SEQ.ID.NO.1序列或SEQ.ID.NO.2序列任一者同源的一序列。在未受限於任何特定理論下，此種轉化係應用於一新發現之mir-302-介導基因靜默機制，其可由能夠表現一mir-302家族基因群(mir-302s)或一mir-302-同源shRNA任一者之一重組轉殖基因的轉染來觸發。

在一較佳具體實施例中，本發明之基因轉殖表現的設計係基於天然內含子miRNA生體合成之路徑(圖1A)。本發明者設計了一種新穎核酸組成物，其表現編碼一紅色色偏螢光蛋白質(RGFP)之一重組轉殖基因，即：SpRNAi-RGFP，其包含可經由細胞內RNA剪接及處理機制來製造內含子miRNA及/或類shRNA基因靜默效應子的一人造/人工剪接勝任內含子(SpRNAi)(Lin等人，2003，2006a、2006b)。實施例1中描述用來設計及建構該SpRNAi內含子及SpRNAi-RGFP轉殖基因的操作程序。該SpRNAi在該SpRNAi-RGFP基因之先驅轉錄分子(pre-mRNA)內以哺乳動物第二型RNA聚合酶(Pol-II)共同轉錄，並以RNA剪接/處理來切開。之後，進一步將所剪接之SpRNAi處理成成熟之基因靜默效應子，如：天然miRNAs及人造shRNAs，以使得在標的基因上觸發特定的後轉錄基因靜默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)效應。在此例中，本發明生成一種重組mir-302s及/或一種與該mir-302s同源之shRNA。同時，在內含子剪接後，將該SpRNAi-RGFP基因轉錄分子之外顯子鏈接在一起以形成一成熟之RGFPmRNA，用來轉譯成有益於識別所需miRNA/shRNA表現之一紅色螢光標記蛋白質。在其它實施例中，可使用一些功能性蛋白質外顯子來代替RGFP 以提供額外之基因功能，如：ES細胞標記基因Oct4、Sox2、Nanog、LIN-28、SSEA3及SSEA4。

在另一較佳具體實施例中，本發明提供一種用來將哺乳動物體細胞/癌細胞轉化為類ES多能性幹細胞之新穎方法(圖2A及圖2B)，其使用一分離之藥物可誘發核酸組成物，該組成物可被傳送、轉錄及處理成在哺乳動物細胞中之類mir-302 miRNA/shRNA分子/同源物；因此在該等細胞中之mir-302所標的之發育及分化相關基因中誘發特定之基因靜默效應，該方法包含以下步驟：a)提供一細胞基質，其表現複數個由mir-302家族所標的之發育及分化相關基因，及b)提供一重組核酸組成物，其能夠轉錄編碼複數個非編碼mir-302 miRNAs/shRNAs或其同源物的一分離RNA，其可藉由細胞內機制依次被處理為成熟之mir-302 miRNAs/shRNAs或其同源物，因此能抑制該等標的基因在該細胞基質中的功能；c)在該細胞基質中之該等標的基因功能受抑制的條件下，以該重組核酸組成物處理該細胞基質。更佳地係，該藥物可誘發重組核酸組成物係一Tet-On載體，其包含以一重組mir-302家族基因群(mir-302s；SEQ.ID.NO.29-SEQ.ID.NO.36之雜合物)或一人造重設mir-302 shRNA同源物(即：SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28之雜合物)任一者插入的SpRNAi-RGFP轉殖基因。換句話說，該重組核酸組成物包含一藥物可誘發之基因表現載體。此外，該重組核酸組成物可包含一基因表現載體，其係選自質體、病毒載體、反轉位子、及其組合組成之群。另外，重組核酸組成物包含一Tet-On或Tet-Off基因表現載體。該細胞基質可用體外(in vitro)、離體(ex vivo)或體內(in vivo)任一種方式表現該mir-302 miRNA/shRNA及其標的基因。實施例2及3描述用於mir-302 miRNA/shRNA建構及基因轉殖傳送的操作程序。

本發明利用細胞內剪接體、外體及NMD系統之優點來催化內含子mir-302 miRNA/shRNA因劑自該SpRNAi-RGFP轉殖基因的釋放。在實施例1及圖2A與圖2B中分別描述，經由在該SpRNAi之數個snRNP辨識位上之細胞內剪接體成分的一序列DNA重組[例如：snRNPs U1、U2及U4/U6.U5 tri-snRNP所需之結合基序，其包括：五端 剪接位(SEQ.ID.NO.4)、分支點基序(BrP；SEQ.ID.NO.6)、多嘧啶段(PPT；SEQ.ID.NO.7或SEQ.ID.NO.8)、及三端剪接位(SEQ.ID.NO.5)]，用來將合成snRNP辨識元素組合到一SpRNAi內含子以及將此一人工重組之SpRNAi合併到一分離可誘發RGFP基因以形成該SpRNAi-RGFP轉殖基因的方法。此外，該SpRNAi進一步包含一內含子插入位，其位在用來選殖及表現一重組mir-302 miRNA/shRNA因劑的五端剪接位及BrP基序之間。實施例2及圖3B描述一重組mir-302家族基因群(mir-302s)或一人造重設mir-302 shRNA同源物之建構。實施例3及圖3C描述將該重組mir-302s miRNA/shRNA轉染成感興趣之細胞，以及成功基因轉殖細胞的篩選。換句話說，該多能性類幹細胞係選擇性地使用mir-302微型核醣核酸或Oct3/4作為標記來分離。實施例4-12描述用來評估將哺乳動物體細胞/癌細胞轉化為類ES多能性細胞的測驗。圖4至圖11顯示該等測驗之結果。

能表現類mir-302 miRNA或shRNA之一可誘發SpRNAi-RGFP基因轉殖表現系統的設計及建構

本發明使用一可誘發Tet-On/Off內含子miRNA/shRNA表現系統，即pTet-On-tTS-miR302s(圖3A)，用以在去氧羥誘發之控制下並經由細胞內內含子miRNA生體合成之機制來觸發類mir-302基因靜默效應子的基因轉殖表現(圖1A)。實施例1及2描述pTet-On-tTS-miR302s之建構。當pTet-On-tTS-miR302s表現載體轉染成感興趣之其細胞後，其轉錄一TRE-Pol-II-驅動重組轉殖基因，即SpRNAi-RGFP，其包含可生成內含子基因靜默效應子之一人工剪接勝任內含子(SpRNAi)(圖3A及圖3B)，如類髮夾型miRNA及shRNA。實施例1中顯示藉由序列接合數個合成DNA序列的基因工程，將SpRNAi合併到一紅色色偏螢光蛋白質基因(RGFP)。SpRNAi包含一先驅miRNA或shRNA介子(插入位)，其可由細胞內RNA剪接及處理機制釋出，如：剪接體、外顯子及NMD系統之成分，然後觸發一內含子RNA-介導基因靜默機制。其它可用來攜帶並生成SpRNAi的RNA轉錄分子包括： hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、smnRNA、病毒RNA、pre-microRNA及其先驅物與衍生物。

如實施例1所示，合成SpRNAi並將其合併到一不含內含子之紅色色偏螢光蛋白質基因(RGFP或rGFP)中，以形成一SpRNAi-RGFP轉殖基因，其係自紫點海葵(Heteractis crispa)之HcRed1色素蛋白(chromoproteins)變異而成。由於所插入之SpRNAi中斷了RGFP之功能性螢光蛋白質結構，故在一成功轉染之細胞或有機體中於570-nm波長下，吾人可經由該紅色螢光放射的再出現來判定內含子遭移除及RGFP-mRNA變異(圖1B)。此重組SpRNAi-RGFP轉殖基因之建構係基於一先驅訊息RNA(pre-mRNA)中之一剪接體內含子的天然結構。SpRNAi之主要成分包括數個snRNP辨識位及鏈結子，如：在末端中用於精確酶切之五端及三端剪接位、用於剪接辨識之一分支點基序(BrP)、用於剪接體交互作用之一多嘧啶段(PPT)、用於連接每一該等成分之鏈結子、以及用於所需之內含子插入的一些限制位。本發明之SpRNAi包含，由五端往三端方向按結構依序列出：一五端剪接位、與類mir-302基因靜默效應子同源之一內含子介子、一分支點基序(BrP)、一多嘧啶段(PPT)、及一三端剪接位。此外，一些轉譯終止密碼子(T codon)可位在接近SpRNAi之該三端剪接位的鏈接子序列中。

一般而言，該五端剪接位係包含5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU基序任一者或與其同源的一核苷酸序列(如：5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.37)、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)，而該三端剪接位係包含GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG基序任一者或與其同源的一核苷酸序列(如：5’-GATATCCTGC AG-3’(SEQ.ID.NO.42)、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’)。而且，一分支點基序係位在該五端剪接位及該三端剪接位之間，其包含與5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)基序同源之同源物，如：5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’。該分支點序列之腺核苷「A」核苷酸在幾乎所有之剪接體內含子中以細胞(2’-5’)寡腺苷合成酶及剪接體形成一部分之 (2’-5’)鏈結套馬索內含子RNA。此外，一多嘧啶段係位在接近該分支點及該三端剪接位之間，其包含與5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)基序任一者同源之一高T或C含量的寡核苷酸序列。符號「m」及「n」表示多個重覆，其1；更佳地，m的數量等於1~3且n的數量等於7~12。符號「-」係指在該序列中可被略過之一核苷酸。也有一些鏈接子核苷酸序列係用來連接所有該等內含子成分。根據37 CFR 1.822中關於用在核苷酸及/或氨基酸序列資料之符號及格式的準則，符號W係指一腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號K係指一鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號S係指一胞嘧啶(C)或鳥嘌呤(G)，符號Y係指一胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號R係指一腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，及符號N係指一腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。關於上列所有的剪接體辨識成分，去氧胸苷(deoxythymidine，T)核苷酸可用尿核苷(uridine，U)代替。

為測試一經剪接SpRNAi介子之功能，可將各種基因靜默效應子建構選殖至該重組SpRNAi-RGFP轉殖基因之內含子插入位中。該內含子插入位包含多個限制及選殖位，其可藉由限制酶來辨識，該等限制酶係選自AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MIuI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI核酸內切酶及其組合組成之群。該等內含子介子係DNA模板(DNA template)，其可轉錄成高度二級結構，該等結構係選自：套馬索型RNA(lariat-form RNA)、短臨時RNA(stRNA)、反義RNA、小干擾RNA(siRNA)、雙股RNA(dsRNA)、短髮夾型RNA(shRNA)、微型核醣核酸(miRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)、核醣酵素、及同 義或反義構造形態(conformation)任一種之其先驅物與衍生物、或以上兩者、及其組合組成之群。

為了方便基因轉殖傳送進感興趣之細胞或有機體，本發明之SpRNAi-RGFP轉殖基因較佳地係合併在一表現勝任載體中，其係選自DNA轉殖基因、質體、反轉位子、轉位子、跳躍基因、病毒載體、及其組合組成之群。所得之此一基因轉殖表現載體較佳地係以一高效率基因傳送方法引入該細胞或有機體中，該基因傳送方法係選自化學/微脂體轉染法、電穿孔法、轉位子介導DNA重組、跳躍基因插入、病毒感染、顯微注射、基因槍穿透、及其組合組成之群。換句話說，該重組核酸組成物係以一基因傳送方法引進該哺乳動物細胞中，該基因傳送方法係選自微脂體轉染(liposomal transfection)、化學轉染(chemical transfection)、基因轉殖DNA重組(transgenic DNA recombination)、病毒感染(viral infection)、轉位子插入(transposon insertion)、跳躍基因插入(jumping gene insertion)、顯微注射(micro-injection)、電穿孔法(electroporation)、基因槍穿透(gene-gun penetration)、及其組合組成之群。 該載體可進一步包含至少一個病毒、Pol-II、或Pol-III啟動子、或其組合，用以表現該SpRNAi-RGFP轉殖基因。更佳地係，以電穿孔法將該轉殖基因合併至一Tet-On/Off載體中並基因轉殖地傳送入標的細胞內，如實施例3所示。此外，該載體可包含：用以增加真核細胞之轉譯效率之一Kozak一致性轉譯初始位(Kozak consensus translation initiation site)、該SpRNAi-RGFP轉殖基因下游之多個SV40聚腺苷酸化訊息(SV40 polyadenylation signal)、用來在原核生物細胞內繁殖之一pUC複製來源(pUC origin of replication)、用來將該SpRNAi-RGFP建構合併在該載體中之至少兩個限制位、用來在表現SV40 T抗原之哺乳動物細胞中複製的一任選SV40複製來源、以及用來在複製勝任原核生物細胞中表現一抗生素抗藥性基因的一任選SV40早熟啟動子(SV40 early promoter)。換句話說，該重組核酸組成物係選自一四環黴素反應元素、一病毒或第二型RNA聚合酶(Pol-II)啟動子、或以上兩者、一Kozak一致性轉譯起始位、聚腺苷酸化訊息、複數個限制/選殖位、及其組合組 成之群。此外，該重組核酸組成物係選自一pUC複製來源、用來在複製勝任原核生物細胞中表現至少一個抗生素抗藥性基因的一SV40早熟啟動子、用來在哺乳動物細胞中複製的一任選SV40複製來源、及其組合組成之群。該抗生素抗藥性基因之表現可用來作為一選擇標記，其可用來分離具該基因轉殖表現的成功選殖細胞。該等抗生素係選自盤尼西林G(penicillin G)、安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、巴龍黴素(paromycin)、康黴素(kanamycin)、鏈黴素(streptomycin)、紅黴素(erythromycin)、斯派克黴素(spectromycin)、霍火黴素(phophomycin)、四環黴素(tetracycline)、利福黴素(rifapicin)、兩性黴素B(amphotericin B)、健他黴素(gentamycin)、氯黴素(chloramphenicol)、頭孢黴素(cephalothin)、泰黴素(tylosin)、及其組合組成之群。

已在一Tg(actin-GAL4：USA-gfp)品種斑馬魚中體內地測試使用該SpRNAi-RGFP轉殖基因之內含子miRNA/shRNA的表現策略，以針對其綠色EGFP基因表現來標的。如實施例6及圖1B中所示，表現一人工重組anti-EGFP pre-miRNA介子(第四列)之一SpRNAi-RGFP質體的微脂體轉染，在EGFP上顯示一極強之基因靜默效應(>80%基因減弱(gene knockdown))，然而在下列指出之自左列至右列的該等介子中並未觀察到其它靜默效應：(1)空白載體控制(Ctl)；(2)標的HIV-p24之pre-miRNA介子(mock)；(3)不具髮夾型環狀結構之反義EGFP介子(anti)；及(5)反向之pre-miRNA序列，其與該anti-EGFPpre-miRNA完全互補(miR*)。並且，在非標的(off-target)基因上並未偵測到任何效應，如：標記RGFP及管家(house-keeping)肌動蛋白(β-actin)基因，其暗示此種內含子miRNA-介導基因靜默具有高度標的專一性(target-specific)。另外，藉由北方點墨分析法(圖1B，右方)，吾人觀察到小型內含子基因靜默效應子之生成僅源自該設計之SpRNAi-RGFP基因轉錄分子(左列)，而非源自不含內含子之RGFP的一天然轉錄分子(中間列)或不含功能性五端剪接位之一缺陷性SpRNAi-RGFP建構的一轉錄分子(右列)，而經剪接之RGFP外顯子係鏈接在一起以形成用來轉譯該標記紅色螢光蛋白質的成熟RNA。

一重組mir-302家族基因群及一類mir-302 shRNA同源物的設計及建構

因為一些天然pre-miRNA的髮夾型環狀結構太大及/或太複雜，無法配合該SpRNAi-RGFP轉殖基因，所以本發明者設計了一修飾後tRNA^met環(即：5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3’)(SEQ.ID.NO.43)來代替該等天然pre-miRNA環。該tRNA^met環顯示能如同天然miRNAs般經由相同之Ran-GTP及Exportin-5傳送機制有效地促進將人造重設之miRNA自細胞核輸出至細胞質(Lin等人，2005)。有利地係，本發明目前使用一對人造改良之pre-mir-302環，包括：5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)及5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)，其提供與天然pre-miRNAs相同的核輸出效率，且不會干擾tRNA輸出。並且，此改良加強了mir-302a-mir-302a*及mir-302c-mir-302c*雙鏈體之形成，其可穩定mir-302家族的整體功能。該等新穎pre-miRNA環之設計係以mir-302b/mir-302a之tRNA^met環及短幹環的結合來修飾，其高度地表現在胚胎幹細胞中而非在其它分化組織細胞中。因此，在mir-302家族中使用該等人造/人工pre-miRNA環將不會干擾我們身體中的天然miRNA路徑，因而細胞毒性較少且更加安全。

該等mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d之成熟序列分別為’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3’(SEQ.ID.NO.12)、及5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。該等mir-302家族基因靜默效應子在其前十七個核苷酸中分享一高度一致性的五端區域(100%同源性)，其與5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)完全相同。換句話說，該基因靜默效應子包含與SEQ.ID.NO.3同源或互補、或兩者皆是的一序列。在設計與該等mir-302序列同源的序列中，胸腺嘧啶(T)可用來代替尿嘧啶(U)。

如實施例2中所述，家族mir-302 pre-miRNAs之基因群 係以合成mir-302同源物之雜合及鏈結/接合來形成，其在一五端至三端方向包含四個部分：mir-302a、mir-302b、mir-302c及mir-302d pre-miRNA(圖3B)。所有該等人造重設之mir-302 miRNA/shRNA同源物在其前十七個核苷酸中具有一完全相同的五端[例如：5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)]。在其它實施例中，吾人可使用一人造重設之mir-302 shRNA來代替用於內含子插入的mir-302 pre-miRNA基因群。該重設之mir-302 shRNA係以合成同義mir-302家族(mir-302s-sense)，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)及反義mir-302家族(mir-302s-antisense)，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)之雜合來形成。此重設之mir-302 shRNA對所有天然之mir-302成員分享超過91%的同源性，並標的人類中相同的mir-302-標的基因。

將可誘發mir-302-表現SpRNAi-RGFP轉殖基因傳送進人類正常頭髮毛囊(hHFC)及癌症黑色素癌Colo細胞之原生培養中

由於該重組SpRNAi-RGFP轉殖基因之內含子插入位在其五端及三端分別以一PvuI及一MluI限制/選殖位為側翼，故該原生介子可簡單地以各種pre-miRNA/shRNA介子(例如：mir-302 pre-miRNA/shRNA)加以移除及取代，其具有配合該等PvuI及一MluI限制位的相配粘著端。藉由針對各種基因轉錄分子來改變該等內含子的介子，該內含子miRNA/shRNA表現系統可用作體外及體內地誘發標的基因靜默的一有力工具。在實驗中，首先將該mir-302 pre-miRNA/shRNA插入該SpRNAi-RGFP轉殖基因中，然後將該轉殖基因合併到該pTet-On-tTS載體之該選殖位(即：一XhoI-ClaI位)內，因而形成一pTet-On-tTS-miR302s轉殖基因表現載體(圖3A)。其後，將該pTet-On-tTS-mir302載體(10-30μg)與該等宿主細胞(200-2000)在一低滲 性PH緩衝液(400μl；Eppendorf)中混合，且在400-450伏特下實行電穿孔法100微秒(μsec)以將該轉殖基因傳送進該等宿主細胞基因體內。在72小時後分離並收集基因轉殖成功之細胞，使用FACS流式細胞計數儀經anti-RGFP及anti-Oct3/4單株抗體來篩選(圖3C)。此新穎mir-302s基因轉殖方法的成功率經測量超過91%。因為該SpRNAi-RGFP轉殖基因係以一同源區域為側翼而重組插入至不包含基因的一特定基因體位(圖4A)，故該SpRNAi-RGFP轉殖基因所編碼之mir-302 miRNA/shRNA效應子之表現全依照該pTet-On-tTS載體之TRE-CMV啟動子的Dox誘發活化而定。該pTet-On-tTS載體包含一CMV驅動之tTS抑制劑基因，以去活化該轉殖基因之TRE-CMV啟動子。當去氧羥(Dox)存在時，tTS之功能被Dox抑制住，因此表現出該SpRNAi-RGFP轉殖基因及其編碼mir-302家族(圖4B)。

在一不含哺乳細胞培養條件下將人類正常及癌症體細胞轉化成一類ES狀態

如實施例1-2及圖3A-3B所述，吾人已設計並建構一可誘發SpRNAi-RGFP轉殖基因，其編碼一人造鏈結之mir-302a-mir-302b-mir-302c-mir-302d(mir-302s)pre-miRNA或一重設之類mir-302 shRNA[例如：一類髮夾型序列，包含5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)]，然後測試該轉殖基因以用來靜默各種體細胞及癌細胞(如人類正常頭髮毛囊細胞(hHFC)及癌症黑色素癌Colo細胞)中之發育及分化相關標的基因。

依循圖2A及圖2B中所示之程序，本發明者分別將該重組mir-302s pre-miRNA基因轉殖地傳送入hHFC細胞內，以及將該重設之mir-302 shRNA同源物(SEQ.ID.NO.9)基因轉殖地傳送入Colo細胞內。換句話說，該基因靜默效應子係一重組類髮夾型RNA，其包括與SEQ.ID.NO.9同源的一序列。在以Dox誘發異位mir-302表現後，所有該等mir-302轉導/誘發多能性幹(mirPS)細胞株的形態從梭形(spindle)轉形為圓形(round)(下方圖)，這表示其不只可能會喪失遷移之能力，亦 可能具有一類似ES細胞生長之極慢的細胞再生率(圖5A)。比較DNA含量與一細胞週期階段之流式細胞儀分析(上方圖；實施例7)進一步顯示：在mirPS細胞之有絲分裂細胞群體中有超過67%的減少，這暗示該等細胞增殖率遠較其身體/癌症來源之增殖率為低。平均來說，該等細胞群體在一不含哺乳細胞之培養條件下每20-24小時分裂一次，其包含在37℃及5% CO₂下之DMEM/F12或RPMI 1640/B27培養液，其補充成分為10%炭吸附(charcoal-stripped)胎牛血清(FBS)、4mM L-麩醯胺(glutamine)、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、5ng/ml活化素(activin)、5ng/ml Noggin蛋白、3ng/ml bFGF、以及0.5μM Y-27632與0.5μM GSK-3抑制劑XV之一等量混合物(即：mirPS細胞培養基)。換句話說，可在DMEM/F12或RPMI 1640/B27培養液中不含哺乳細胞地培養該等多能性類幹細胞，該培養液的補充成分為10%炭吸附FBS、4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉、5ng/ml活化素、3ng/ml bFGF、以及0.5μM Y-27632與0.5μM GSK-3抑制劑XV之一等量混合物。流式細胞計數儀圖表之第一(左)及第二(右)波峰表示在該整個測試受之細胞群體中休眠之G0/G1及有絲分裂M期之細胞群體的含量。在該mir-302s轉染後，該有絲分裂細胞群體(M期)在hHFC中自41%減少到11%且在Colo細胞中自36%減少到11%，然而在以一空SpRNAi-RGFP載體及Dox(+Dox)或不含Dox之一mir-302表現SpRNAi-RGFP載體(+mir-302s-Dox)轉染後，其細胞形態或細胞增殖率皆不會有明顯的改變。根據該等發現，吾人展示異位mir-302s表現能將正常及癌症人類體細胞轉化為一類ES細胞的形態及細胞分裂率。

源自各種mirPS細胞之類胚胎體的形成

所有該等mirPS細胞皆能形成源自人類胚胎幹(ES)細胞之類胚胎體(EB)的緊密細胞叢(圖5B)。換句話說，這證明本發明所轉化之該等多能性類幹細胞可形成類胚胎體。當以胰蛋白酶EDTA(trypsin-EDTA)及膠原蛋白酶IV(collagenase IV)之一混合物分離該等類EB細胞，然後在僅具有10%FBS補充成分之RPMI 1640培養液中 培養該等類EB細胞後，該等類EB細胞會分化成神經元源祖細胞(progenitor cell)，其中有許多該等神經元源祖細胞表現神經元標記Tuj1及/或ABCA2。在限數稀釋法及進一步在該不含哺乳細胞之DMEM/F12培養液(補充成分為10%炭吸附FBS、4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉、5ng/ml活化素、3ng/ml bFGF、以及0.5μM Y-27632與0.5μM GSK-3抑制劑XV之一等量混合物)中培養後，每一mirPS細胞可繼續形成用來繼代培養(sub-culturing)及/或移植/植入測驗的一純類胚胎體(圖5C)。鑑於該等類ES幹細胞特性，吾人接著在該等mirPS細胞中檢驗mir-302s及ES細胞標記的表現，並與人類ES WA01-H1及WA09-H9細胞作比較。

在mirPS細胞中之mir-302s表現的微型核醣核酸(miRNA)微陣列分析

為確認該等mirPS細胞中的基因轉殖mir-302表現，吾人實行實施例9中所述之微型核醣核酸(miRNA)微陣列分析。如圖6A所示，miRNA微陣列分析顯示，與原始體細胞(控制組)相較，在Dox處理(100μM)後所有mir-302成員之表現率(最右下方，白色方框中之圓圈)在該等mirPS-hHFC細胞中明顯地增加。mir-302s在mirPS細胞中的表現程度與Dox誘發之濃度成比例對應(圖4B)，如北方點墨法所判定般。在mirPS-Colo細胞中也觀察到相同的結果(Lin等人，2008b)。在早期EB階段，使用一mirVana^TM miRNA分離工具(Ambion Inc.，Austin，TX)自每一細胞株分離出多個小型RNA。該等分離之小型RNA的純度及品質係使用3.5%甲醛-洋菜膠電泳及光譜儀測量(Bio-Rad，Hercules，CA)來評估，然後立刻送交至LC Sciences(San Diego，CA)進行微陣列分析。在Cy3及Cy5強度影像(藍背景)中，當訊號強度自第1級增加至第65,535級時，對應之色彩由藍色轉變成綠色、黃色，再到紅色。在Cy5/Cy3比之影像(黑背景)中，當Cy3級高於Cy5時，色彩為綠色；當Cy3級等於Cy5級時，色彩為黃色；及當Cy5級高於Cy3級時，色彩為紅色。由於在天然mir-302家族成員及本發明之人造重設mir-302 pre-miRNA/shRNA因劑之間的該等成熟RNA序列分享極高的同源性(> 91%)，此結果表示該等重設mir-302因劑可取代天然mir-302s之功能。

根據此結果，吾人也發現mir-302表現之提高可進一步地增加一些其它miRNA的表現，如：mir-92、mir-93、mir-200c、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373、mir-374、及整個mir-520家族成員。根據對該等miRNAs之預測標的基因的分析，使用連結至Sanger miRBase：：Sequences網站(http：//microrna.sanger.ac.uk/)之「TARGETSCAN」(http：//www.targetscan.org/vert_42/)及「PICTAR-VERT」(http：//pictar.bio.nyu.edu/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi？)程式展示mir-302與該等miRNA分享超過400株標的基因，這表示該等miRNA在維持幹細胞多能性與再生方面亦可能扮演了重要的角色。該等一致性標的基因包括(但不限於)：RAB/RAS-相關致癌基因之成員、ECT相關致癌基因、型態多樣化腺瘤基因(pleiomorphic adenoma genes)、E2F轉錄因子、細胞週期素cyclin D結合類Myb轉錄因子、HMG-box轉錄因子、Sp3轉錄因子、轉錄因子類CP2蛋白質、NFkB活化蛋白基因、細胞週期素相關激酶(CDK)、MAPK相關激酶、SNF相關激酶、肌凝蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinases)、TNF-α-誘發蛋白基因、DAZ相關蛋白基因、LIM相關同位序列基因、DEAD/H box蛋白基因、叉頭盒(forkhead box)蛋白基因、BMP調節子、Rho/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子、IGF受體、內皮素(endothelin)受體、左右決定因子、細胞週期素、p53可誘發核蛋白基因、類RB 1、RB結合蛋白基因、最大結合蛋白基因(Max-binding protein genes)、免疫識別c-MIR細胞調節子(c-MIR cellular modulator of immune recognition)、類Bcl2凋亡促進子(apoptosis facilitator)、連接蛋白(protocadherins)、整合蛋白(integrin)ß4/ß8、抑制素(inhibin)、錒克力(ankyrins)、SENP1、NUFIP2、FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF、MECP2、組織蛋白乙醯轉化酶(histone acetyltransferase)MYST3、細胞核核醣核蛋白H3(nuclear RNP H3)、以及許多細胞核受體與因子。大多數之該等基因與腫瘤/癌症之胚胎發育及/或腫瘤發生高度地相關。

標準人類ES標記表現之識別，即：Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及 Nanog

如圖6B及9B所示，該等mirPS細胞強烈地表現許多標準人類ES細胞標記，如：Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2及Nanog，然而在原始體細胞(hHFC控制組)中未偵測到任何該等標記，且該等體細胞係以一空SpRNAi-RGFP載體及去氧羥(hHFC+Dox)或是不含去氧羥之一mir-302s載體(mirPS-Dox)來轉染。如北方及西方點墨分析法所判定之mRNA及蛋白質含量，該等ES標記之表現型式極類似於人類ES WA01-H1及WA09-H9細胞之表現型式。此等結果表示mir-302s之異位表現能將成人體細胞/癌細胞轉化為類ES多能性幹細胞，其呈現許多標準人類ES標記。在mirPS-Colo細胞中也觀察到相同的結果(圖8C)。

Oct3/4(也稱為Oct-3或Oct-4)係該等POU轉錄因子其一，其主要並高度地表現在全能之胚胎幹及生殖細胞中(Scholer等人，(1989)EMBO J.8：2543-2550；Rosner等人，(1990)Nature 345：686-692)。吾人需要一臨界含量之Oct3/4表現來維持幹細胞自我再生及多能性。Oct3/4之抑低調節(down-regulation)導致胚胎幹細胞分化進入分歧發育程序。SSEA蛋白、SSEA-1、SSEA-3及SSEA-4原先係以單株抗體來識別，該等單株抗體辦識在著床前期階段之鼠科動物胚胎及畸形癌(teratocarcinoma)幹細胞之表面上的lacto-及globo-醣脂類，但不辨識在其分化衍生物上的lacto-及globo-醣脂類(Solter等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565-5569)。未分化之靈長類胚胎幹(ES)細胞、人類胚胎癌(embryonic cancer，EC)及ES細胞全都表現SSEA-3及SSEA-4，但未表現SSEA-1(Thomson等人，(1998)Science 282：1145-1147)。SSEA-3及SSEA-4係於卵子生成期間合成，並主要呈現在卵母細胞、接合子及早期酶切階段胚胎之該等膜中(Shevinsky等人，(1982)Cell 30：697-705)。在維持多能性方面，Sox2具有如一核轉錄因子之功能，但此功能並非專對胚胎幹細胞(Boyer等人，(2005)Cell 122：947-956)。因此，根據此種認知，該等mirPS細胞很可能呈現該等人類ES標記之所有特性。

基因體DNA去甲基化(轉化)之評估

後天修飾之改變特別強調ES細胞之另一獨特的功能：基因體去甲基化(Hochedlinger等人，(2006)Nature 441：1061-1067)。為了將一細胞轉化成其ES狀態，許多胚胎基因需要藉由DNA去甲基化來再次活化，如：Oct3/4。為了評估在該等mirPS細胞中之此種後天效應，吾人首先以Hpall進行整個基因體解消，Hpall係一對CpG甲基化敏感的限制酶，並僅切開一未甲基化之CCGG位而非一甲基化之CCGG位。圖7A顯示來自體細胞控制組之解消的DNA片段，其比來自該等mirPS細胞之解消DNA片段超過兩倍大，這表示整個mirPS細胞基因體係高度地去甲基化。使用二亞硫酸鹽-基因體PCR及核酸定序來實行Oct3/4基因啟動子區域中的進一步評估(Takahashi及Yamanaka，2006)。二亞硫酸鹽可將所有未甲基化之胞嘧啶轉換為尿嘧啶。因為未甲基化之ACGT位會被改變成AUGT位，ACGT-切割限制酶之解消無法切開在該等mirPS細胞基因體中的分離區域(圖7B)。由該二亞硫酸鹽DNA定序來顯示之詳細去甲基化映像圖進一步展示該Oct3/4基因啟動子區域在該等mirPS細胞中喪失超過90%之甲基化位，其類似在該等人類ES WA09-H9細胞中所發生的狀況(圖7C)，這表示的確發生一泛基因體轉化事件以再活化該Oct3/4基因表現。實施例8顯示上述之CpG去甲基化實驗。

在判定Oct3/4基因啟動子中之該等去甲基化位的實驗中，吾人首先以二亞硫酸鹽(CpGenome DNA修飾工具，Chemicon，CA)處理該等分離之基因體DNA，其將所有未甲基化之胞嘧啶轉換成尿嘧啶，然後使用聚合酶鏈反應來分離Oct3/4 5’-上游啟動子區域(長模板PCR延伸工具，Roche，IN)。其後，以多個ACGT切割限制酶之一相等混合物(每一限制酶5U)來收集並解消PCR產物，該等ACGT切割限制酶包含：AclI(AACGTT)、BmgBI(CACGTC)、PmlI(CACGTG)、SnaBI(TACGTA)及HpyCH4IV(ACGT)。因為在此區域中之該等未甲基化之ACGT位係以二亞硫酸鹽改變成AUGT位，其無法用該等ACGT切割限制酶來切開，故圖7B之結果指出在該控制組hHFC、PC3及Colo細 胞中超過四個甲基化ACGT位被改變成在對應之mirPS細胞中的去甲基位。因此，該Oct3/4基因啟動子之此mir-302-介導去甲基化可促成在該等mirPS細胞中之Oct3/4基因表現的再活化。

源自轉移性癌症之該等mirPS細胞中遷移能力之喪失

人類ES細胞不會遷移。源自快速轉移性癌症細胞株之該等mirPS細胞(如：mirPS-PC3細胞)中常可觀察到細胞失去遷移能力。由於ES細胞傾向在一處休眠並在原位(in situ)形成類胚胎體，此可解釋為何轉移性人類前列腺癌PC3細胞在異位mir-302轉染後會喪失其遷移能力。在其它實施例中，mir-302可將某些細胞遷移相關基因靜默，以避免正常細胞遷移及癌細胞侵入，該等細胞遷移相關基因如：細微管相關蛋白質基因1B(MAP1B)、類肌動蛋白蛋白質(ACTL6A)、錒克力2(ANK2)、澱粉樣蛋白ß先驅物A4(APP)、肌凝蛋白輕多肽激酶(myosin light polypeptide kinase，MYLK)。如圖7D及實施例12中所示，轉移性PC3細胞很快地隨時間而遷移，然而mirPS-PC3細胞保持靜止不動。在所有其它控制組中沒有觀察到任何形態上的改變。因此，本發明之基因轉殖mir-302s表現足以將人類癌症細胞轉形成一更類似ES之細胞形態及細胞分裂率，這暗示一種在癌症治療上極有益的利用。此結果暗示用來將該等mir-302傳送進癌症/腫瘤細胞中的一潛在治療應用，其不僅可將該等惡性之癌症/腫瘤細胞轉化為有用之類ES幹細胞，也可減少癌症轉移的機會。更有利的係，由於該等mirPS細胞係由病人自身之細胞生成，且因此其和病人具有免疫相容性，故可利用該等mirPS細胞來發展一種新穎移植治療，以修補該等癌症/腫瘤受損組織而不會有免疫排斥之風險。

使用基因微陣列分析識別整體ES標記表現

泛基因體基因圖譜可提供對與該mir-302-介導轉化事件有關之基因變化的理解。在確認標準ES細胞標記及基因轉殖mir-302s的共同表現後，吾人進一步在該異位mir-302表現之前及之後，在該等 細胞中以及在該等mirPS及其它人類ES細胞(如：WA01-H1及WA09-H9)間進行人類基因體微陣列分析來篩選泛基因體基因表現型式的變化。實施例10中顯示詳細之操作程序。使用Affymetrix基因微陣列(GeneChip U133A&B及U133 plus 2.0陣列)來評估超過47,000種人類基因表現型式之改變。吾人首先使用相同之mirPS樣本來複製該等微陣列測試，並從該等測試中之一選擇兩百株最可變之基因(白點)以供進一步之比較。如圖8A(mirPS-Colo)及圖9A(mirPS-hHFC)所示，複製測試之整體變化少於一倍(最左側)，這表示背景變化係極有限的。根據所有微陣列識別之基因的分散型式，吾人接著計算兩組比較轉錄體資料庫之結果間的相關係數(correlation coefficiency，CC)。再提供一CC率以顯示在該泛基因體基因表現型式中之相似度百分比，該等泛基因體基因表現型式具有的臨限值僅有1倍的表現量差異(one-fold change)。在此種嚴謹之CC率定義下，吾人發現mirPS細胞之該等基因表現型式極類似於人類ES WA01-H1(>89%)及WA09-H9(>86%)細胞之表現型式，然而在該等mirPS細胞及其體細胞/癌細胞來源之間僅顯示一低的47%-53% CC率。在人類ES及mirPS細胞間之此種強大基因相關性暗示mir-302s可能需要改變數千種細胞基因表現，其包括將一體細胞/癌細胞轉化為一類ES mirPS細胞的過程。例如，如圖8B所示，在該等mirPS及人類ES細胞結果中持續並同時觀察到，多個ES基因表現提高以及許多個致癌、發育與mir-302標的細胞週期相關的基因停擺。參考圖9B，針對該等mirPS細胞之基因表現型式而論，也可注意到SSEA-1適度地表現在該等mirPS細胞中，而Klf4則無。

圖8B顯示在Colo及mirPS-Colo細胞之間之一些主要分化表現基因的清單。在圖8B中，吾人注意到細胞週期檢查點基因(即：CDK2、細胞週期素cyclin D1及D2)以及DNA甲基促進子(即：MECP2及MECP1-p66)全經確認為mir-302s之強力標的。換句話說，該等多能性類幹細胞表現豐富之mir-302微型核醣核酸及Oct4，但僅表現有限之CDK2、cyclin D1、MECP1-p66及MECP2。在圖8C及圖9B中也觀察到相同的結果。已知cyclin E相關CDK2係進入S期細胞週期所必需的， 且抑制CDK2會造成G1期檢查點停滯，然而，cyclin D1在回應DNA損害時可無視於G1期的停滯。根據此原則，在mirPS細胞中CDK2及cyclin D1兩者之抑制揭露一項事實：mir-302-轉染癌症細胞之細胞週期可達到一極慢的細胞分裂率，如圖5A所示。因此，此種癌細胞-幹細胞週期轉換的結果對癌症治療可有極大的好處。此外，抑制MECP2及MECP1-p66活動的結果與圖7A-C的該等結果一致，這表示惡性癌症細胞後天轉化為良性mirPS細胞。可以想見從病人處所得之該等mirPS細胞可進一步地幫助修補腫瘤/癌症之組織損害。總結來說，所有該等發現顯示本發明之mir-302基因轉殖方法可用來將人類體細胞/癌細胞之基因圖譜轉化成一高度類ES表現型式，其類似人類ES細胞之表現型式。

MirPS細胞之多能性

多能性定義一ES細胞最重要之特性。經由以不同因子及/或賀爾蒙之體外操縱，人類ES細胞可分化成三層胚胎生殖層(外胚層、中胚層及決定性之內胚層)，其係所有成人組織之基礎。在不進行任何處理下，將該等mirPS衍生類胚胎體異種移植至雌性假性懷孕免疫功能不足之SCID-beige小鼠的子宮或腹腔中可形成類畸胎瘤之組織囊腫(圖10)。在其它組織位置中未觀察到該等囊腫。然而，不同於畸胎瘤，該等組織囊腫會對其周圍組織形成一極佳且清楚之邊界。並且，在小鼠中之該等囊腫結構的成長在移植後約2.5週時減緩。此似乎有一自我調節之機制可體內地限制該等mirPS細胞的隨機生長。此種自我調節機制也可避免從該等mirPS細胞形成腫瘤，這提供了在臨床試驗及治療上用來設計及發育不含腫瘤之多能性幹細胞的一種手段。

MirPS細胞分化之體外分子導引

在定義上，一多能性幹細胞可分化為類似源自胚胎外胚層、中胚層及/或內胚層之該等組織細胞的各種細胞類型。例如，使用各種生長因子及/或賀爾蒙之體外處理，吾人可導引類ES mirPS細胞分 化為數種身體及/或生殖細胞系組織細胞類型，包括：神經元源祖(圖5B)、類精原細胞(圖11A-E)、纖維母細胞(圖11F-J)、及軟骨細胞(圖11K-O)。已利用免疫組織化學(immunohistochemical，IHC)偵測來識別該等特別組織譜系之標記，其分別顯示神經元特異性之Tuj1與ABCA2、生殖細胞系特異性之Dazla與EE2、纖維組織母細胞特異性atlastin1與第一類原膠原蛋白(COL1A1)、及軟骨細胞特異性原彈性蛋白與第二類原膠原蛋白(COL2A1)。換句話說，本發明所生成之多能性類幹細胞可分化為一類生殖細胞系細胞、類精原細胞、正常體細胞、纖維組織母細胞、軟骨細胞、及其一組合。在該等分化之mirPS細胞中沒有觀察到腫瘤形成的跡象。事實上，根據Sanger網站之「TARGETSCAN」及「PICTAR-VERT」程式的預測，已知許多致癌基因係mir-302s之標的。此外，mir-302s可壓抑細胞週期素相關激酶2(CDK2)、細胞週期素D1與D2以避免腫瘤細胞之快速生長(Lin等人，2008b)。該等發現表示該等mirPS細胞之不含腫瘤的多能性。可以想見，可使用各種分子處理從該等mirPS細胞中誘導出更多組織細胞類型。

在一不含哺乳細胞培養條件下體外地進行實驗，顯示吾人已成功地導引mirPS細胞分化成三種相對同質性之體細胞類型(圖11A-O及實施例11)。首先，藉由以一天然雄激素-二氫睪固酮(dihydrotestosterone，DHT 50ng/ml)在一不含哺乳細胞培養皿中處理該等mirPS細胞達六小時，然後將該等已處理之細胞(10⁵)體內移植到一六週大雌性免疫不全SCID-beige小鼠的子宮內，於一週後在該移植位上生成類精原細胞之一囊腫(圖11A-E)。其次，藉由以轉形生長因子β 1(TGF-ß1 100ng/ml)來處理該等mirPS細胞達12小時，然後再依循相同之移植程序，該等mirPS細胞分化為纖維母細胞並在僅一週內開始分泌膠原蛋白(圖11F-J)。最後，藉由以骨成形蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4 100ng/ml)處理該等mirPS細胞達12小時，然後將該等細胞異體移植到一六週大之免疫功能不足SCID-beige小鼠的肝臟內，該等mirPS細胞分化為以鈣化沈澱物圍繞的軟骨細胞(圖11K-O)。該免疫功能不足之裸鼠係用來提供模擬移植治療之一體內環境。該等發現 提供強而有力的證據：吾人已成功地利用本發明之mir-302基因轉殖方法來生成新的類ES多能性幹細胞株，其可在一不含哺乳細胞的條件下體外及體內地導引成多種組織細胞類型。因此，本發明不僅能將分化後之體細胞/癌細胞轉化成一類ES狀態，同時也能在一不含哺乳細胞培養條件下維持類ES之再生與多能性。

因此，利用一可誘發mir-302表現轉殖基因，本發明提供一有力的新工具及策略，其可用來生成類ES mir-302-誘發多能性幹細胞(mirPS)，特別是源自人類體細胞及癌細胞之原生培養的mirPS細胞。更佳地，該等mirPS細胞係得自人類正常頭髮毛囊，因為其較容易取得。由於該內含子miRNA生體合成路徑係以多個細胞內監測系統良好地調節，包括：mRNA轉錄之成分、RNA剪接、外體處理及NMD機制，因此本發明之內含子mir-302表現可視為較原先之Pol-III(U6/H1)驅動的siRNA/shRNA表現系統更加安全。事實上，本發明者已觀察到該Pol-III驅動之表現系統傾向於過度表現mir-302，並引起細胞週期在G1期停滯及死亡。本發明在結合一藥物可誘發(Tet-On/Off)載體下可進一步提供一種可控制手段，其不僅可將哺乳動物體細胞/癌細胞轉化為類ES mirPS細胞，且可導引其形成有用的正常組織細胞。因為已發現mir-302係一強力之腫瘤抑制基因，故本發明所生成之該等mirPS細胞沒有腫瘤形成的風險。

本發明具有至少五個有益之突破。第一，一株mir-302表現轉殖基因可代替在該等先前之iPS方法中所用的所有四株大型轉錄因子基因，用以生成更具同源性的類ES多能性幹細胞(僅源自病人之少數體細胞)，此可改善病人之免疫系統的幹細胞純度及相容性。第二，因為該mir-302表現轉殖基因之總長度相對地較小(約一千個鹼基)，與該等先前iPS方法中之基因轉殖傳送最大值為2%相較，本方法之基因轉殖傳送係極高的(成功率超過91%)。第三，mirPS細胞之生成及培養完全係在一不含哺乳細胞的條件下進行，此避免了哺乳細胞抗原污染的風險。第四，未使用致癌基因，此避免了細胞變異及腫瘤形成的風險。最後，本發明使用電穿孔法來代替反轉錄病毒感染以傳送 該單一mir-302表現轉殖基因，此避免了隨機反轉錄病毒插入宿主細胞基因體的風險，其通常會引起插入突變(insertional mutagenesis)。總結來說，該等優點解決了該等先前iPS方法之三個主要問題，其避免了反轉錄病毒感染、致癌基因突變及不確定之腫瘤發生的風險。

A. 定義

為方便理解本發明，以下定義一些術語： 核苷酸(Nucleotide)：一單分子之去氧核醣核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)，其包含：一醣部份體(戊醣pentose)、一磷酸根(phosphate)及一含氮雜環鹼基(nitrogenous heterocyclic base)。該鹼基係經由醣苷碳(glycosidic carbon，該戊醣之1端碳)與該醣部份體鏈結，且該鹼基及醣的組合係一核苷(nucleoside)。包含與該戊醣之三端與五端位置鍵結之至少一個磷酸基的一核苷係一核苷酸(nucleotide)。

寡核苷酸(Oligonucleotide)：包含兩個以上之去氧核醣核酸或核醣核酸的一分子，其較佳地係超過三個，而通常超過十個。其確切長度取決於許多因素，其依次係依照該寡核苷酸之最佳功能或用途而定。該寡核苷酸可用任何方式生成，包括：化學合成、DNA複製、反轉錄、或其一組合。

核酸(Nucleic Acid)：核苷酸(nucleotide)之一聚合物，其可為單股或雙股。

核苷酸相似物(Nucleotide Analog)：一嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)核苷酸，在結構上A、T、G、C或U不同但足夠相似，因此可在一核酸分子中取代正常核苷酸。

核酸組成物(Nucleic Acid Composition)：一核酸組成物係指多核苷酸(polynucleotide)，如：去氧核醣核酸(DNA)或核醣核酸(RNA)，其可以單股或雙股分子結構的形式存在。

基因(Gene)：一核酸，其核苷酸序列係針對一RNA及/或一多肽類(蛋白質)編碼。一基因可以是RNA或DNA。

鹼基對(Base Pair，bp)：於一雙股DNA分子中之胸腺嘧 啶(thymine，T)與腺嘌呤(adenine，A)，或鳥嘌呤(guanine，G)與胞嘧啶(cytosine，C)之聯合(partnership)。在RNA中，尿嘧啶(uracil，U)取代胸腺嘧啶(thymine，T)。一般來說，該聯合係透過氫鍵(hydrogen bonding)來連接。

先驅訊息核醣核酸(Precursor messenger RNA，pre-mRNA)：一基因之前驅核醣核酸轉錄分子(primary ribonucleotide transcript)，其經由一細胞內機制在真核細胞中以第二型RNA聚合酶(Pol-II)結構產生，該機制稱為轉錄(transcription)。一pre-mRNA序列包含：五端非轉譯區(5’-end untranslated region)、三端非轉譯區(3’-end untranslated region)、外顯子(exon)、及內含子(intron)。

內含子(Intron)：一基因轉錄分子序列之一部分或多個部分，其編碼非蛋白質讀框，如：同一讀框內含子(in-frame intron)、五端非轉譯區(5’-UTR)及三端非轉譯區(3’-UTR)。

外顯子(Exon)：一基因轉錄分子序列之一部分或許多部分，其編碼蛋白質讀框。

訊息核醣核酸(Messenger RNA，mRNA)：pre-mRNA外顯子之組合，其在以核內剪接結構除去內含子之後形成，並作為用於蛋白質合成的一蛋白質編碼RNA。

互補去氧核醣核酸(cDNA)：與一mRNA序列互補之單股DNA，且其不含任何內含子序列。

同義核酸(Sense)：一核酸分子，其序列順序及組成與同源之mRNA相同。以「+」、「s」或「sense」符號來表示此同義核酸構造形態。

反義核酸(Antisense)：與個別mRNA分子互補之一核酸分子。以「-」符號來表示此反義核酸構造形態，或是在DNA或RNA之前加上「a」或「antisense」，例如：「aDNA」或「aRNA」。

五端(5’-end)：在連續核苷酸之5端位置處缺少一核苷酸的一端，其中，一個核苷酸之五端氫氧基係以一磷酸二酯鏈接連接至下一個核苷酸之三端氫氧基。在該端可以有其它基，如一或多個磷 酸根。

三端(3’-end)：連續核苷酸之3端位置處缺少一核苷酸的一端，其中，一個核苷酸之五端氫氧基係以一磷酸二酯鏈接連接至下一個核苷酸之三端氫氧基。在該端可以有其它基，通常係一氫氧根。

模板(Template)：能以一核酸聚合酶拷貝之一核酸分子。根據不同的聚合酶，一模板可為單股、雙股或部分雙股。合成後之拷貝係與該模板、或一雙股或部分雙股模板中之至少一股互補。RNA與DNA皆在五端到三端的方向合成。一核酸雙鏈體之兩股總是排列在一起，使得該等兩股之五端係在該雙鏈體之相對端上(必要的話，該等兩股之三端亦然)。

核酸模板(Nucleic Acid Template)：一雙股DNA分子、雙股RNA分子、雜合分子(如：DNA-RNA或RNA-DNA雜合物)、或單股DNA或RNA分子。

一致性(Conserved)：若一核苷酸序列係與一預選(參考)序列之確切互補物非隨機地雜合，則兩者的序列為一致性。

互補(Complemetary或complementarity或complementation)：用來參照依該等鹼基對原則(base-pairing rule)關聯之多核苷酸(即：一序列之核苷酸)。例如：序列「A-G-T」與序列「T-C-A」及「T-C-U」互補。互補可以在兩股DNA之間、一股DNA與一股RNA之間、或是在兩股RNA之間。互補可以是「部分」或「完全」或是「整體」的。僅當一些核酸鹼基係根據該等鹼基對原則相配對時才會發生部分互補(partial complementarity或complementation)。完全或整體互補則是當該等鹼基在該等核酸股之間完全相配時才會發生。在核酸股之間的互補程度對於核酸股之間的雜合效率及強度有重大之影響。此對於擴增(amplification)反應特別重要，且對於根據核酸間之鍵合(binding)的偵測方法也很重要。互補率(Percent complementarity或complementation)係指在該核酸之一股中失配鹼基數與全部鹼基數的比。因此，50%的互補率意指一半的鹼基失配，而另一半的鹼基相配對。即使核酸之兩股與鹼基數不同，核酸之兩股也能互補。在此情況下，互補發生於部分 之較長股間，該較長股之鹼基與較短股之鹼基成對。

同源(homologous或homology)：意指一多核苷酸序列，其與一基因或mRNA序列相似。例如：一核酸序列可能部分或完全與一特定基因或mRNA序列同源。同源也可用全部核苷酸數與相似核苷酸數的比率所定的一百分比表示。

互補鹼基(complemetary base)：當DNA或RNA形成一雙股配置時正常配對之核苷酸。

互補核苷酸序列(Complemetary Nucleotide Sequence)：在一單股分子之DNA或RNA中的一核苷酸序列，其足以與在另一單股上的核苷酸序列互補，以在該等兩股之間用所需之氫鍵專對地雜合。

雜合(Hybirdize及Hybridization)：在核苷酸序列之間雙鏈體的形成，其充分地互補以藉由鹼基配對形成複合體。其中一引子(或剪接模板)與標的(模板)「雜合」，因此複合體(或雜合物)係充分地穩定以提供一DNA聚合酶引發DNA合成所需的引子功能。在兩條互補多核苷酸之間有一可競爭性抑制(competitively inhibited)的特殊交互作用(即：非隨機)。

後轉錄基因靜默(Posttranscriptional Gene Silencing)：在mRNA降解或轉譯抑制階段下之一標的基因剔除(knockout)或減弱(knockdown)效應，其通常以外來/病毒DNA轉殖基因或小型抑制性RNA任一者來觸發。

核醣核酸干擾(RNA interference，RNAi)：一種在真核細胞中之後轉錄基因靜默機制，其可用小RNA分子觸發，如：微型核醣核酸(miRNA)、小髮夾型RNA(shRNA)及小干擾核醣核酸(siRNA)。該等小RNA分子通常可作為基因靜默子，其干擾細胞內基因的表現，包含對該等小RNA的完全或部分互補。

非編碼RNA(Non-coding RNA)：無法用來經由細胞內轉譯機制合成肽類或蛋白質的一RNA轉錄分子。

微型核醣核酸(MicroRNA，miRNA)：能夠與對該miRNA部分互補之標的基因轉錄分子鍵合的一單股RNA。MiRNA通常係長約 17到27個寡核苷酸，並能依照在該miRNA與其標的mRNA之間的互補程度來直接降解其細胞內之mRNA標的，或抑制其標的mRNA之蛋白質轉譯。幾乎能在所有真核細胞中發現天然的miRNAs，其如對抗病毒感染之一防衛物般作用，並允許在動植物發育期間調節基因表現。

先驅微核醣核酸(Pre-miRNA)：類髮夾型單股RNAs，其包含用來與細胞內RNaseIII內切酶交互作用的幹臂(stem-arm)及幹環(stem-loop)區域，以產生一或多個微型核醣核酸(miRNAs)，其可靜默與該等微型核醣核酸序列互補之標的基因。一pre-miRNA的幹臂結構可形成一完美(100%)或部分(失配)之雜合雙鏈體，而其幹環結構係連接至該幹臂雙鏈體之一端以形成一圓形或一髮夾型環狀構造形態。

小干擾核醣核酸(small interfering RNA，siRNA)：短雙股核醣核酸，其係約18到25個完美鹼基對之核醣核苷酸雙鏈體，並可降解具幾乎完美互補的標的基因轉錄分子。

小髮夾型或短髮夾型RNA(small hairpin或short hairpin RNA，shRNA)：單股核醣核酸，其包含一對部分或完全相配之幹臂核苷酸序列，該序列係以一失配環狀寡核苷酸分割而形成一類髮夾型結構。許多天然miRNAs係源自類髮夾型RNA先驅物，即：先驅微核型醣核酸(pre-miRNA)。

載體(Vector)：能於不同基因環境中移動或滯留之一重組核酸組成物，如：重組DNA(rDNA)。一般來說，另一核酸分子係在此操作性地鏈結。該載體能於一細胞中自動複製，其中該載體及所貼附之片段也會複製。一類型之較佳載體係一游離基因組(episome)，即：可染色體外複製的一核酸分子。較佳的載體係可自動複製及表現核酸的該等載體。能夠引導為一或多個多肽及/或非編碼RNA編碼之表現基因的載體在此稱為「表現載體(expression vector)」。特別重要之載體允許由使用一反轉錄酶所製造之mRNAs來選殖cDNA。

作用子(Cistron)：在一DNA分子中之一核苷酸序列，其編碼一胺基酸殘基序列並包括上游及下游DNA表現控制元素。

啟動子(Promoter)：一核酸，其由一聚合酶分子所辨識(或 與其鍵合)並引發合成。針對本發明之目的，一啟動子可以係一已知之聚合酶鍵合位、一增強子及類似者，以及任何序列可用一所需聚合酶引發合成。

抗體(Antibody)：一肽類或蛋白質分子，其具有一預選之一致範圍結構，該結構編碼一可鍵合一預選配位子(ligand)的受體。

B. 組成物

一重組核酸組成物，其用來表現一分離之mir-302因劑，然後在哺乳動物細胞中誘發mir-302介導基因靜默，該重組核酸組成物包含：a)一重組轉殖基因，其中該轉殖基因編碼與mir-302家族之成員同源的一重組非編碼RNA；及b)一表現勝任載體，其中該載體可用來傳送並表現哺乳動物細胞中之重組轉殖基因。

上述之重組轉殖基因進一步包含：a)複數個外顯子，其中該等外顯子可鏈結以形成具有一所需功能之一基因轉錄分子；及b)至少一個內含子，其中該內含子包含一重組mir-302同源物，並可經由細胞內RNA剪接及處理機制來切除該等外顯子。

上述之重組轉殖基因的內含子進一步包含：a)用於剪接體鍵合之一五端受體剪接位；b)與該mir-302家族之成員同源的一基因靜默效應子介子；c)用於剪接體辨識之一分支點基序；d)用於剪接體交互作用之一多嘧啶段；e)用於剪接體鍵合之一三端受體剪接位；及f)複數個鏈接子，其用來在一五端至三端方向連接每一該等上述成分。

較佳地，該基因靜默效應子編碼與5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)同源之一核酸組成 物。該五端受體剪接位係包含5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU基序任一者或與其同源的一核苷酸序列(如：5’-GTAAGAGGAT-3’(SEQ.ID.NO.37)、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’及5’-GTAAGT-3’)，而該三端受體剪接位係包含GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG基序任一者或與其同源的一核苷酸序列(如：5’-GATATCCTGC AG-3’(SEQ.ID.NO.42)、5’-GGCTGCAG-3’及5’-CCACAG-3’)。此外，一分支點序列係位在該五端剪接位及該三端剪接位之間，其包含與5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)同源之一基序，如：5’-TACTAAC-3’及5’-TACTTAT-3’。另外，一多嘧啶段係位在接近該分支點及三端剪接位之間，其包含與5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)任一者同源的一高T或C含量序列。符號「m」及「n」表示多個重覆，其1；更佳地，m的數量等於1~3且n的數量等於7~12。符號「-」係指在該序列中可被略過之一核苷酸。根據37 CFR 1.822中關於用於核苷酸及/或氨基酸序列資料之符號及格式的準則，符號W係指一腺嘌呤(adenine，A)或胸腺嘧啶(thymine，T)/尿嘧啶(uracil，U)，符號K係指一鳥嘌呤(guanine，G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號S係指一胞嘧啶(cytosine，C)或鳥嘌呤(G)，符號Y係指一胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符號R係指一腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)，及符號N係指一腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。關於上列所有的剪接體辨識成分，去氧胸苷(thymine/deoxythymidine，T)核苷酸可用尿核苷(uridine，U)代替。

C. 方法

一種用來將哺乳動物細胞轉化為多能性幹細胞之方法，其使用能夠在由mir-302所標的之基因上誘發特定基因靜默效應的一重組核酸組成物，該方法包含以下步驟：a)提供：i)一細胞基質，其表現複數個由mir-302所標的之發育及細胞分化相關基因，及ii)一重組核酸組成物，其可被傳送、 轉錄並處理成在該細胞基質中與mir-302同源的非編碼RNA；b)在該細胞基質中之mir-302-標的基因功能受抑制的條件下，以該重組核酸組成物處理該細胞基質。

更佳地係，該重組核酸組成物係可表現一重組轉殖基因之一藥物可誘發Tet-On或Tet-Off載體，其編碼一重組mir-302家族基因群(pre-mir-302s；SEQ.ID.NO.29-SEQ.ID.NO.36之鏈結雜合物)或一人造重設之mir-302 shRNA同源物(SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28之雜合物)。該細胞基質可用體外(in vitro)、離體(ex vivo)或體內(in vivo)任一種方式來表現pre-mir-302s/mir-302 shRNA及其標的基因。

實施例

以下實施例係作為舉例說明本發明之某些較佳具體實施例及態樣，其不應視為限制本發明之範疇。

在以下揭示之實驗文件中，所用的簡稱如下：M(莫耳，molar)；mM(毫莫耳，millimolar)；μm(微莫耳，micromolar)；mol(摩耳，moles)；pmol(微微莫耳，picomolar)；gm(公克，grams)；mg(毫克，milligrams)；μg(微克，micrograms)；ng(奈克，nanograms)；L(公升，liters)；ml(毫升，milliliters)；μl(微升，microliters)；℃(攝氏度，degrees Centigrade)；cDNA(DNA之拷貝或互補；copy or complementary DNA)；DNA(去氧核醣核酸，deoxyribonucleic acid)；ssDNA(單股DNA，single stranded DNA)；dsDNA(雙股DNA，double-stranded DNA)；dNTP(去氧核苷酸三磷酸，deoxyribonucleotide triphosphate)；RNA(核醣核酸，ribonucleic acid)；PBS(磷酸鹽緩衝液，phosphate buffered saline)；NaCl(氯化鈉，sodium chloride)；HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸，N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid)；HBS(HEPES緩衝液，HEPES buffered saline)；SDS(十二烷基硫酸鈉，sodium dodecylsulfate)；Tris-HCl(三羥甲基胺基甲烷-氫氯化物，tris-hydroxymethylaminomethane-hydrochloride)；及ATCC(美國菌種培養中心，American Type Culture Collection，Rockville，MD)。

實施例1 包含SpRNAi重組RGFP基因(SpRNAi-RGFP)之建構

以下列出用來生成包含同義、反義或髮夾型EGFP介子之SpRNAi內含子的合成寡核苷酸：同義N1(N1-sense)，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GA-3’(SEQ.ID.NO.14)；反義N1(N1-antisense)，5’-CGCGTCTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGC GATCGGATCC TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.15)；同義N2，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCTT GAAGAAGATG GTGCGCTCCT GA-3’(SEQ.ID.NO.16)；反義N2，5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGC GATCGGATCC TCTTAC-3’(SEQ.ID.NO.17)；同義N3，5’-GTAAGAGGAT CCGATCGCAG GAGCGCACCA TCTTCTTCAA GTTAACTTGA AGAAGATGGT GCGCTCCTGA-3’(SEQ.ID.NO.18)；反義N3，5’-CGCGTCAGGA GCGCACCATC TTCTTCAAGT TAACTTGAAG AAGATGGTGC GCTCCTGCGA TCGGATCCTC TTAC-3’(SEQ.ID.NO.19)；同義N4，5’-CGCGTTACTA ACTGGTACCT CTTCTTTTTT TTTTTGATAT CCTGCAG-3’(SEQ.ID.NO.20)；反義N4，5’-GTCCTGCAGG ATATCAAAAA AAAAAGAAGA GGTACCAGTT AGTAA-3’(SEQ.ID.NO.21)。從SEQ.ID.NO.14-SEQIDNO.21所列出之所有序列在其五端皆經磷酸根化。

此外，兩個RGFP外顯子係藉由在一紅色螢光RGFP基因(SEQ.ID.NO.22)之第208個核苷酸(nt)位酶切Drall限制酶來生成。該五端RGFP外顯子進一步地以T₄ DNA聚合酶來使端點鈍化(blunt-ended)。關聯一新穎紅色色偏螢光色素蛋白質基因之RGFP係藉由自紫點海葵(Heteractis crispa，BD Biosciences，CA)分離之HcRed1色素蛋白質的第69個胺基酸(amino acid，a.a.)位插入一額外之天門冬胺酸(aspartate)來生成，其造成較少之聚集以及幾乎兩倍強度之波長570-nm的紅外線螢光放射。

同義N1-sense至反義N1-antisense、同義N2-sense至反義N2-antisense、同義N3-sense至反義N3-antisense、以及同義N4-sense至反義N4-antisense之雜合分別以下列步驟實行：將每一同義及反義(1：1)序列之互補混合物加熱至94℃兩分鐘，然後置於70℃的1倍PCR緩衝液中10分鐘(例如：50mM Tris-HCl，pH 9.2，25℃；16mM(NH₄)₂SO₄；1.75mM MgCl₂)。之後立即在1小時期間內，藉由把N1+N4、N2+N4或N3+N4(1：1)雜合之混合物從50℃分別逐漸地冷卻至10℃，以執行N1、N2或N3雜合物與N4雜合物的序列接合，然後將T₄ DNA接合酶及緩衝液(Roche，IN)加進該混合物中並在12℃下一起培育12小時。此可形成該等SpRNAi內含子。其後，將該等兩個RGFP外顯子加進該反應中(1：1：1)，並相應地調整T₄ DNA接合酶及緩衝液以在12℃下再次進行該接合反應12小時。

關於選殖正確重組之SpRNAi插入RGFP(SpRNAi-RGFP)基因方面，以一對RGFP特異性引子5’-CTCGAGCATG GTGAGCGGCC TGCTGAA-3’(SEQ.ID.NO.23)及5’-TCTAGAAGTT GGCCTTCTCG GGCAGGT-3’(SEQ.ID.NO.24)藉由PCR來擴增10ng之接合序列，其係在94℃進行一分鐘，在52-57℃進行一分鐘，然後在68℃進行兩分鐘，共進行25至30個循環。將所得之PCR產物在一2%洋菜膠上層析，然後使用一膠體萃取工具(Qiagen，CA)來萃取及純化一900到1100鹼基對(bp)之核苷酸序列。藉由定序進一步確認此~1-kb的SpRNAi-RGFP基因之組成物。較佳地，在沒有內含子插入下，該SpRNAi內含子序列之同義股係5’-GTAAGTGGTC CGATCGTCGC GACGCGTCAT TACTAACTAT CAATATCTTA ATCCTGTCCC TTTTTTTTCC ACAGTAGGAC CTTCGTGCA-3’(SEQ.ID.NO.25)，而該SpRNAi內含子序列之反義股係5’-TGCACGAAGG TCCTACTGTG GAAAAAAAAG GGACAGGATT AAGATATTGA TAGTTAGTAA TGACGCGTCG CGACGATCGG ACCACTTAC-3’(SEQ.ID.NO.26)。

在其它實施例中，該重組SpRNAi-RGFP轉殖基因可藉由接合具有DraII切開RGFP外顯子之限制片段之SEQ.ID.NO.25與 SEQ.ID.NO.26的雜合物(SpRNAi)來直接製成，並依以上所示之相同操作程序處理。依此方式形成用以測試該人造重設之mir-302 shRNA介子(編碼SEQ.ID.NO.9)的SpRNAi-RGFP轉殖基因。

由於該重組SpRNAi-RGFP轉殖基因在其五端及三端分別具有一XhoI及一XbaI限制位，其可容易地被選殖至具有黏著至該等XhoI與XbaI選殖位之黏著端的一載體中。該載體必須是一表現勝任有機體或子有機體，其係選自DNA轉殖基因、質體、跳躍基因、轉位子及病毒載體組成之群。此外，由於在該內含子內之插入位係分別在其五端及三端以一PvuI及一MluI限制位為側翼，吾人可移除及取代具有另一不同之插入序列的內含子介子，該不同之插入序列具有黏著至該等PvuI及Mlul選殖位之黏著端。該插入序列較佳地係類髮夾型基因靜默效應子，其對一標的基因具有高互補度，該標的基因係選自螢光蛋白質(GFP)基因、螢光酵素基因、lac-Z乳糖表現基因、病毒基因、細菌基因、植物基因、動物基因及人類基因組成之群。在該基因靜默效應子及其標的基因間的互補及/或同源比率係在約30%-100%的範圍內，更佳地係用於一髮夾型shRNA介子之範圍35%-49%，及用於同義RNA及反義RNA介子兩者之範圍90%-100%。

實施例2 將該等SpRNAi-RGFP基因選殖至一表現勝任載體中以及將重組mir-302同源物插入該SpRNAi-RGFP基因中

由於該重組SpRNAi-RGFP轉殖基因在其五端及三端分別具有一XhoI及一XbaI限制位，其可輕易地被選殖進一載體中，該載體具備黏著至該等XhoI及XbaI限制位的相對黏著端。如圖3A所示，吾人將該SpRNAi-RGFP轉殖基因以1：1重量比(w/w)合併至一XhoI/XbaI線性化(linearized)~6,900-bp pTet-On-tTS的質體中，將該混合物在50分鐘之一期間內自65℃冷卻至15℃，然後相應地將T₄接合酶及緩衝液加進該混合物中以在12℃下接合12小時。此形成了一可誘發SpRNAi-RGFP表現載體。以RGFP特異性引子SEQ.ID.NO.23及 SEQ.ID.NO.24藉由PCR來確認該載體之組成物，其在94℃下進行一分鐘，然後在68℃下進行兩分鐘，共進行30個循環，再進一步地定序。在選殖至一病毒載體中方面，除了使用一XhoI/XbaI-線性化pLNCX2反轉錄病毒載體(BD Clontech)來代替之外，其餘進行相同之限制及接合程序。由於該SpRNAi內含子之插入位在其五端及三端分別以一PvuI及一MluI限制位為側翼，吾人可移除及取代具有一人造重設mir-302 shRNA介子之anti-EGFP shRNA介子，該人造重設mir-302 shRNA介子具有黏著至該等PvuI及Mlul選殖位的黏著端。該重設mir-302 shRNA介子包含與5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)同源的一序列，其包括：5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUGG UGA-3’(SEQ.ID.NO.10)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UAG-3’(SEQ.ID.NO.11)、5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUCAG UGG-3’(SEQ.ID.NO.12)、或5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUGAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.13)。更佳地係，該重設mir-302 shRNA介子包含5’-UAAGUGCUUC CAUGUUUUAG UGU-3’(SEQ.ID.NO.9)。換句話說，該基因靜默效應子包括至少一個重組RNA序列，其與SEQ.ID.NO.9、SEQ.ID.NO.10、SEQ.ID.NO.11、SEQ.ID.NO.12、SEQ.ID.NO.13、及其一組合組成之群同源。

以下列出用於該重組mir-302家族pre-miRNA或該人造重設mir-302 shRNA介子之DNA重組的合成寡核苷酸：同義mir-302a，5’-GTCCGATCGT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGG ATCTCGAGCT C-3’(SEQ.ID.NO.29)；反義mir-302a，5’-GAGCTCGAGA TCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTC AAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GACGATCGGA C-3’(SEQ.ID.NO.30)；同義mir-302b，5’-ATCTCGAGCT CGCTCCCTTC AACTTTAACA TGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTAG CGCTA-3’(SEQ.ID.NO.31)；反義mir-302b，5’-TAGCGCTAGC GACTCCTACT AAAACATGGA AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTA AAGTTGAAGG GAGCGAGCTC GAGAT-3’(SEQ.ID.NO.32)；同義mir-302c，5’-CGCTAGCGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTG TGTGAAACAG AAGTAAGTGC TTCCATGTTT CAGTGGAGGC GTCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.33)；反義mir-302c，5’-ATGTCTAGAC GCCTCCACTG AAACATGGAA GCACTTACTT CTGTTTCACA CAGCAGGTAC CTCCATGTTA AAGCAAAGGT AGCGCTAGCG-3’(SEQ.ID.NO.34)；同義mir-302d，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAA GCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.35)；反義mir-302d，5’-ATGACGCGTC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.36)；及同義miR-302s，5’-GTCCGATCGT CATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCTAA GCCAGGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TCGACGCGTC AT-3’(SEQ.ID.NO.27)；反義mir-302s，5’-ATGACGCGTC GATAAGTGCT TCCATGTTTT AGTGTGCCTG GCTTAGCACA CTAAAACATG GAAGCACTTA TGACGATCGG AC-3’(SEQ.ID.NO.28)(Sigma-Genosys，MO)。所有該等合成序列係在接合之前以PAGE膠體萃取來純化。換句話說，該基因靜默效應子係以SEQ.ID.NO.29、SEQ.ID.NO.30、SEQ.ID.NO.31、SEQ.ID.NO.32、SEQ.ID.NO.33、SEQ.ID.NO.34、SEQ.ID.NO.35、SEQ.ID.NO.36、及其一組合的雜合物之接合鏈結來形成。

該重組mir-302家族pre-miRNA基因群係以四組mir-302a-d雜合物之鏈結來形成，包括：同義mir-302a與反義mir-302a、同義mir-302b與反義mir-302b、同義mir-302c與反義mir-302c、以及同義mir-302d與反義mir-302d。該等mir-302a、mir-302b、mir-302c、及mir-302d之雜合物分別以PvuI/XhoI、XhoI/NheI、NheI/XbaI、 及XbaI/MluI限制酶來解消，並在35μl高壓蒸氣滅菌二次水(autoclaved ddH₂O)中藉由一膠體萃取過濾柱(gel extraction filter column)(Qiagen，CA)收集在一起。之後，立即將該等混合之雜合物接合以形成具T₄ DNA接合酶之mir-302家族pre-miRNA介子的一基因群(Roche，20U)，並進一步地插入該等PvuI/MluI線性化SpRNAi-RGFP表現載體中。在其它實施例中，該人造重設mir-302 shRNA係藉由雜合SEQ.ID.NO.27及SEQ.ID.NO.28的兩個合成序列來製成，然後以PvuI/MluI限制酶切開以插入該等PvuI/MluI線性化SpRNAi-RGFP表現載體中。依循圖2A及圖2B所列之程序，包含該重組mir-302家族pre-miRNA(即：pTet-On-tTS-mir302s)之可誘發SpRNAi-RGFP表現載體係基因轉殖地被傳送進hHFC細胞內，然而包含該重設mir-302 shRNA之載體則係被引進Colo 829細胞內。

該等SpRNAi-RGFP表現載體可繁殖進包含100μg/ml之安比西林的E.coli DH5α LB培養液中(Sigma Chemical，St.Louis，MO)。該等繁殖之SpRNAi-RGFP表現載體係使用一小量製備(mini-prep)或大量製備(maxi-prep)之質體萃取工具(Qiagen，CA)來分離及純化。在pLNCX2反轉錄病毒載體方面，吾人也可使用一包裝細胞株GP2-293(Clontech，CA)以製造有感染力但無法自我複製(replication-incompetent)的病毒。該等轉染之GP2-293細胞係在37℃及5% CO₂下於1倍之DMEM培養液中生長，該培養液的補充成分為10%炭吸附胎牛血清(FBS)，其含有4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉、100μg/ml硫酸鏈黴素(streptomycin sulfate)及50μg/ml新黴素(Sigma Chemical，MO)。依照一retro-X qRT-PCR滴定工具(Clontech，CA)的操作程序，病毒滴定量在轉染前經測量係超過感染複數(multiplicity of infection，MOI)30。

實施例3 mir-302s之細胞培養及基因轉殖傳送

人類癌症PC3及Colo 829細胞株係取自美國菌種培養中 心(ATCC，Rockville，MD)，而hHFC及hpESC細胞係分別以膠原蛋白酶/胰蛋白酶(4：1)分解2至10個頭髮毛囊根或外殖自本發明者之頭髮或手臂的2mm³皮膚來製備。在37℃及5% CO₂下之RPMI 1640培養液中培養該等細胞，該培養液的補充成分為10%胎牛血清(FBS)、4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉及100μg/ml健他黴素(Sigma Chemical，MO)。藉由將細胞暴露在trypsin-EDTA溶液1分鐘並以RPMI淋洗一次，以及將該等分離之細胞在1：10稀釋度下於新鮮的培養基(growth medium)中重新覆蓋(replate)，來製成70%~80%滿盤的培養物。關於以電穿孔法基因轉殖mir-302s傳送方面，該pTet-On-tTS-mir302s載體(10-30μg)與該等宿主細胞(200-2000)在一低滲性PH緩衝液(400μl；Eppendorf)中混合，且電穿孔法係在400-450伏特下實行100微秒以將該載體傳送進該等宿主細胞基因體內。在72小時後分離並收集正向基因轉殖的mirPS細胞，使用FACS流式細胞計數儀經anti-RGFP單株抗體來篩選細胞(圖3C)。此新穎mir-302s基因轉殖方法的成功率經測量超過91%。

在其它實施例中，在反轉錄病毒載體傳送方面，吾人首先培養pVSV-G共轉染GP2-293細胞(Clontech，CA)，其具有包含一重組mir-302家族pre-miRNA介子之SpRNAi-RGFP插入pLNCX2反轉錄病毒載體。在37℃及5% CO₂下培育36小時後，過濾該等GP2-293細胞之培養基(每一培養基10ml)(0.25μm)並於37℃及5% CO₂下將其直接轉移到該等受測試之細胞培養物內持續12小時。其後，加入新鮮之mirPS細胞培養基來代替該病毒培養基，每三天置換一次。由於該等培養基包含極高之設計反轉錄病毒載體的滴定量，幾乎所有的受測細胞(99.4%-99.8%)係由該等載體基因轉殖地感染，並在24小時內開始表現該等內含子介子及RGFP。在感染後24小時分離並收集正向基因轉殖的mirPS細胞，使用FACS流式細胞計數儀經anti-RGFP單株抗體(Clontech，CA)來分類細胞。

實施例4 北方點墨分析法

在1%甲醛-洋菜膠上分餾所有RNAs(20μg)並轉移至尼龍膜(nylon membrane，Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。合成LNA-DNA探針(Sigma-Genosys，MO)可補足位於在該等RGFP五端外顯子之間或在所設計之pre-miRNA/shRNA介子處側面的75-bp接面序列，或補足一標的基因轉錄分子，該等合成之LNA-DNA探針係用Prime-It II工具(Stratagene，La Jolla，CA)在[³²P]-dATP出現下以隨機引子延伸來標示([³²P]-dATP>3000Ci/mM，Amersham International，Arlington Heights，IL)，並以10bp-cutoff Micro Bio-Spin層析管柱(Bio-Rad，Hercules，CA)來純化。雜合係在50%的新鮮去離子甲醯胺(freshly deionized formamide，pH 7.0)、5倍Denhardt溶液、0.5% SDS、4倍SSPE及250mg/mL的變性鮭魚精子DNA片段(18小時，42℃)的混合物中進行。在自動放射照相術(autoradiography)之前將膜在2倍SSC、0.1%的SDS(15分鐘，25℃)中連續清洗兩次，並在0.2倍SSC、0.1%的SDS(45分鐘，37℃)中清洗一次。圖4B及6B中顯示該等結果。

實施例5 SDS-PAGE及西方點墨分析法

對於標的蛋白質之免疫點墨法(immunoblotting)(圖8C及9B)，在移除培養基之後以冰冷PBS淋洗約~70%滿盤之分離細胞，然後溶解一CelLytic-M溶解/萃取試劑(lysis/extraction reagent，Sigma-Aldrich，MO)，其補充成分為蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)、Leupeptin、TLCK、TAME及PMSF。該等細胞係在室溫下於一震動器(shaker)上培育15分鐘，之後將其刮到微量離心管(microtube)內，然後在12,000 xg下離心5分鐘以將該細胞碎片製成粒狀。收集包含蛋白質之細胞溶解產物並在-70℃下儲存備用。以SOFTmax套裝軟體在一E-max微量盤測讀儀(microplate reader，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上測量蛋白質定量。在還原(reducing，+50mM DTT)及非還原(non-reducing，無DTT)的條件下，將每30μg之細胞溶解產物加入SDS-PAGE樣本緩衝液中，並在裝載到6%-8%之聚丙烯醯胺凝膠上之 前沸騰3分鐘；分子量係藉由與標準蛋白質(Bio-Rad，Hercules，CA)的比較來測定。根據該等標準操作程序來實行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法。以PAGE分解之蛋白質在一硝化纖維素膜上電漬，並在室溫下於Odyssey阻斷試劑(Odyssey blocking reagent)(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NB)中培育2小時。然後，吾人在該試劑中施加一原生抗體並在4℃下培育該混合物。原生抗體使用包括：Oct3/4(1：500，Santa Cruz)、SSEA-3(1：500，Santa Cruz)、SSEA-4(1：500，Santa Cruz)、Sox2(1：500，Santa Cruz)、Nanog(1：500，Santa Cruz)、Klf4(1：200，Santa Cruz)、β-actin(1：2000，Chemicon，Temecula，CA)、及RGFP(1：1000，Clontech)。經過一夜後，以TBS-T淋洗該膜三次，然後在室溫下暴露在羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG)中達1小時，該羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 680反應性染料(1：2,000；Invitrogen-Molecular Probes)結合形成二級抗體。在三次額外的TBS-T淋洗後，使用Li-Cor Odyssey紅外線成像器(Infrared Imager)及Odyssey軟體第10版來管理該免疫點墨法之螢光掃描及影像分析。

實施例6 斑馬魚中之內含子RNA介導基因靜默

在轉染期間，Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)品種之斑馬魚幼蟲係在含10ml之0.2倍不含血清RPMI 1640培養液的一魚缸中養育。藉由將60μl之FuGene微脂體轉染試劑(Roche Biochemicals，Indianapolis，IN)小心地溶解在1ml之1倍不含血清的RPMI 1640培養液中製備一轉染預混物。接著，如實施例1-2所示，將具一anti-EGFP pre-miRNA介子之該等SpRNAi-RGFP載體(20μg)與該預混溶液混合，然後置於冰上30分鐘再直接施加在該魚缸內的該Tg(actin-GAL4：UAS-gfp)魚幼蟲上。在12小時之間隔中給予全部三種劑量(共60μg)。在首次轉染60小時後收集樣本。圖1B顯示該結果。

實施例7 流式細胞計數儀測驗

在所需之實驗後，將細胞胰蛋白酶水解、形成粒狀，並於-20℃下將其再懸浮於1ml之PBS中(含預冷的70%甲醇)中，固定該等細胞1小時。將該等細胞形成粒狀並以1ml之PBS清洗一次。將該等細胞再次形成粒狀並於37℃下再懸浮於1ml之PBS溶液(含1mg/ml碘化丙啶(propidium iodide)、0.5mg/ml核醣核酸苷(RNase))中達30分鐘。然後，在BD FACSCalibur流式細胞計數儀(San Jose，CA)上分析約15,000個細胞。藉由繪製脈衝寬度對脈衝面積的圖並圈選該等單一細胞來排除細胞雙元體。使用套裝軟體Flowjo以「Watson Pragmatic」演算法來分析所收集之資料。如圖5A所示，該流式細胞計數儀圖表之第一(左)及第二(右)波峰表示在整個受測試之細胞群體中休眠G0/G1及有絲分裂M期之細胞群體的含量。

實施例8 DNA去甲基化測驗

來自約兩百萬株細胞之基因體DNA係以一DNA分離工具(DNA isolation kit，Roche)來分離，並分成兩個小劑量。該DNA小劑量之一(2μg)以一CCGG切割限制酶HpaII來解消，然後以1%之洋菜膠電泳法來評估，以判定泛基因體的去甲基化(圖7A)。在二亞硫酸鹽修飾之前及之後，另一小劑量(2μg)係用於PCR選殖該Oct3/4啟動子之整個9,400鹼基對(bp)五端調節區域(NT_007592核苷酸21992184-22001688)。二亞硫酸鹽修飾係以一CpGenome DNA修飾工具(Chemicon，CA)來實行。對DNA作二亞硫酸鹽處理以將所有未甲基化之胞嘧啶轉換成尿嘧啶，而已甲基化之胞嘧啶則仍維持為胞嘧啶。例如：將未甲基化之ACGT位(而非已甲基化之ACGT)改變成AUGT位。在二亞硫酸鹽修飾之前及之後已設計並測試了專對標的Oct3/4五端啟動子區域的PCR引子，包括：兩前向引子5’-GAGGAGTTGA GGGTACTGTG-3’(SEQ.ID.NO.44)(經二亞硫酸鹽修飾後之DNA)與5’-GAGGAGCTGA GGGCACTGTG-3’(SEQ.ID.NO.45)(未修飾之DNA)以及一反向引子5’-GTAGAAGTGC CTCTGCCTTC C-3’ (SEQ.ID.NO.46)。在PCR選殖方面，不論是已作二亞硫酸鹽處理或未作處理之該等基因體DNA(50ng)，首先在1倍PCR緩衝液中與該等引子(共150pmole)混合，再加熱至94℃持續4分鐘，然後立即於冰上冷卻。其後，進行25個如下之PCR循環：在92℃下進行1分鐘，在55℃下進行1分鐘，然後在70℃下進行5分鐘，其係使用一長模板PCR延伸工具(Roche)。以一PCR純化工具(PCR purification kit，Qiagen)收集所得之產物，且以多種ACGT切割限制酶的均量混合物(每一種5U)來解消2μg之DNA，該等限制酶包含：AclI(AACGTT)、BmgBI(CACGTC)、PmlI(CACGTG)、SnaBI(TACGTA)及HpyCH4IV(ACGT)。然後，使用3%洋菜膠電泳法來評估該等已解消之片段(圖7B)。

在二亞硫酸鹽DNA定序分析(圖7C)方面，吾人進一步使用定量PCR(qPCR)擴增一467-bp標的區域，其係在Oct3/4轉錄起始位(NT_007592核苷酸21996577-21997043)之側翼。所用之引子係一前向引子5’-GAGGCTGGAG TAGAAGGATT GCTTTGG-3’(SEQ.ID.NO.47)及一反向引子5’-CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC-3’(SEQ.ID.NO.48)。將以上選殖之9,400-bp Oct3/4五端啟動子區域(50ng)與該等qPCR引子(總共100pmole)混合在1倍PCR緩衝液中，加熱至94℃持續2分鐘，然後立即於冰上冷卻。其後，進行20個如下之PCR循環：在94℃下進行30秒，在68℃下進行1分鐘，其係使用一高準確度PCR延伸工具(high-fidelity PCR extension kit，Roche)。具一正確467-bp長度之擴增後DNA產物進一步地以3%洋菜膠電泳法來分餾，再以一膠體萃取工具(Qiagen)純化，然後用於DNA定序。該等DNA甲基化位之一詳細圖譜係藉由比較在該已作二亞硫酸鹽修飾之DNA序列中之未改變的胞嘧啶、與在該未作二亞硫酸鹽修飾之DNA序列中之未改變的胞嘧啶來產生。

實施例9 微型核醣核酸(miRNA)微陣列分析

在70%滿盤下，使用mirVana^TM miRNA分離工具(miRNA isolation kit，Ambion)自每一細胞培養物中分離小RNAs。使用1%甲醛-洋菜膠電泳及光譜儀測量(Bio-Rad)來評估該等分離之小RNAs的純度及數量，然後立刻以乾冰冷涷並送往LC Sciences(San Diego，CA)進行miRNA微陣列分析。每一微陣列晶片分別與標示為Cy3或Cy5之一單一樣本雜合，或是與標示為Cy3與Cy5之一對樣本雜合。進行背景相減及正規化(normalization)。在一雙重樣本測驗方面，執行一p值計算並產生超過3倍之分化表現轉錄分子的一列表。在圖6A之Cy3及Cy5強度影像(藍背景)中，當訊號強度自第1級增加至第65,535級時，對應之色彩由藍色轉變成綠色、黃色，再到紅色。訊息強度在23,000級之上被視為基因表現中的正向呼叫。在Cy5/Cy3比之影像(黑背景)中，當Cy3高於Cy5級時，色彩為綠色；當Cy3級等於Cy5級時，色彩為黃色；及當Cy5級高於Cy3級時，色彩為紅色。

實施例10 整體細胞基因表現型式之泛基因體微陣列分析

包含超過54,000個寡核苷酸探針之人類基因體GeneChip U133A&B與plus 2.0陣列(Affymetrix，Santa Clara，CA)係用來偵測在mirPS細胞中之泛基因體47,000個人類基因轉錄體的表現型式，如圖8A及9A所示。每一樣本係在第三份複本中測試，並重覆相同實驗四次。來自每一受測樣本之全部RNA係使用RNeasy離心管柱(spin columns，Qiagen)來分離。為製備用於微陣列雜合之標定的探針，使用Superscript選擇系統(Invitrogen)將該等萃取之全部RNA(2μg)轉換成雙股cDNA，其具有一合成之oligo(dT)₂₄-T7啟動引子5'-GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA GGGAGGCGG-(dT)₂₄-3'(SEQ.ID.NO.49)。將所得之cDNAs以苯酚/氯仿萃取來純化，以乙醇沈澱析出，並在0.5μg/μl之濃度下再懸浮於以焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理之二次水(ddH₂O)中。然後，進行體外轉錄，其包含：1μg之dsDNAs、7.5mM未標定ATP與GTP、5mM未標定UTP與CTP、及2mM生物素標定CTP與UTP(biotin-11-CTP、biotin-16-UTP，Enzo Diagnostics)，以及20U之T₇ RNA聚合酶。反應在37℃下進行4小時，然後將所得之cRNAs以RNeasy離心管柱(Qiagen)純化。在一1%之洋菜膠上分離一部分之cRNA樣本以檢查長度範圍，然後藉由在94℃下於pH 8.0的40mM三醋酸鹽(Tris-acetate)、100mM KOAc/30mM MgOAc中加熱35分鐘，將10μg之cRNAs隨機分餾成50個鹼基的一平均長度。在200μl之AFFY緩衝液(Affymetrix)中於40℃下持續地混合16小時以完成雜合。在雜合之後，以200μl之6倍SSPE-T緩衝液(1倍之0.25M氯化鈉/15mM磷酸鈉，pH 7.6/1mM EDTA/0.005%氚核)淋洗陣列三次，然後以200μl之6倍SSPE-T在50℃下清洗1小時。該等陣列另外再以0.5倍之SSPE-T淋洗兩次，並以0.5倍之SSPE-T在50℃下清洗15分鐘。然後，以2μg/ml之卵白素-藻紅蛋白(streptavidin-phycoerythrin，Invitrogen-Molecular Probes)及1mg/ml之醯化BSA(Sigma)在6倍之SSPE-T(pH 7.6)中完成染色測驗。該等陣列係以一共焦掃描器(confocal scanner，Molecular Dynamics)在7.5μm下讀取。

為識別該背景之變化，吾人使用相同之樣本來複製該等微陣列測試，並選擇兩百株基因(圖8A之白點)以作進一步之比較，其略為在該等測試之一側呈現。使用完美相配探針及失配探針之間的總平均差將該等樣本訊號正規化。之後，使用Affymetrix Microarray Suite 5.0版、Expression Console^TM 1.1.1版(Affymetrix)及Genesprings(Silicon Genetics)軟體來分析整個泛基因體基因表現型式之變化(圖8A之綠點)。超過一倍(one-fold)之基因表現率的變化被視為陽性分化基因(positive differential genes)。在基因叢集測驗中，使用一外掛程式Genetrix(Epicenter Software)與Affymetrix軟體配合。以在每一微陣列中之內部管家基因控制平均正規化該樣本之訊號。在正規化之後，當訊號強度由第1級增加至第65,535級時，該對應之色彩由綠色轉變成黑色，再到紅色。在第23,000級(紅色)之上的訊息強度視為一正向呼叫，其中一北方墨點分析可偵測為陽性。

實施例11 細胞分化及免疫偵測測驗

在不進行任何處理下，除了不含哺乳細胞之mirPS培養基的處理以外，將該等mirPS衍生類胚胎體異種移植至一六週大雌性假性懷孕免疫功能不足之SCID-beige小鼠的子宮或腹腔中可形成類畸胎瘤之囊腫(圖10)。該免疫功能不足之裸鼠係用來提供模擬移植治療的一體內環境。製造該假性懷孕小鼠的方法為：在腹膜內注射1IU之人類停經後促性腺激素(human menopausal gonadotrophin，HMG)兩天，然後再注射人類絨毛膜性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)一天。在體外分子引導幹細胞分化成生殖細胞系譜系方面，mirPS細胞在37℃及5% CO₂下保持在DMEM/F12(1：1；高葡萄糖)培養液中之聚鳥胺酸/基膜素覆蓋皿(polyornithine/laminin-coated)上12小時，該培養液的補充成分為10%炭吸附FBS、4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉、5ng/ml活化素及50ng/ml之二氫睪固酮(dihydrotestosterone，DHT)。之後，胰蛋白酶水解該等細胞，以1倍PBS清洗，並收集在四個小劑量之冷凍Matrige(每一個劑量100μl)及一個小劑量之100μl的1倍PBS中。之後，吾人隨即將該等細胞轉殖到六週大之免疫功能不足SCID-beige裸鼠的後肢肌肉、腹膜、子宮、皮下頸部皮膚(含Matrigel)及尾靜脈(含PBS)中。在實驗處理期間以二乙醚(diethyl ether)麻醉該小鼠。一週後，僅在子宮區域發現類精原細胞。在纖維母細胞分化方面，吾人在異體移植之前按照以上所示之相同程序，但使用標準不含酚紅之DMEM培養液進行6小時，該培養液的補充成分為10% FBS、4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉、5ng/ml Noggin蛋白及100ng/ml轉形生長因子-β 1(TGF-β 1)。一週後在子宮中發現纖維母細胞。在軟骨細胞分化方面，吾人如先前般實行相同程序，但使用標準RPMI 1640培養液進行6小時，該培養液的補充成分為10% FBS、4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉及100ng/ml骨成形蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)。僅在肝臟區域發現軟骨細胞。

在特定組織標記之免疫偵測方面，該等組織樣本係在4℃下於4%三聚甲醛(paraformaldehyde)中固定一整夜。在將該等樣品嵌入石蠟中之前，先將該等樣品相繼地以1倍PBS、甲醇、異丙醇及四氫萘(tetrahydronaphthalene)清洗。然後在一微切片機(microtome)上以7-10μm之厚度切割該等嵌入之樣本並固定在乾淨的TESPA塗布玻片上。然後，以二甲苯(xylene)去除該等玻片之蠟並使用封片膠(mounting media；Richard Allan Scientific，Kalamazoo，MI)固定在蓋玻片下，再以蘇木精(hematoxylin)及曙紅(eosin)(H&E，Sigma)染色以供形態觀察之用。免疫組織化學(IHC)染色工具係購自Imgenex(San Diego，CA)。根據製造商的建議實行抗體稀釋及免疫染色法之程序。所用之原生抗體包括：Tuj1(1：500，Abcam Inc.，Cambridge，MA)、ABCA2(1：100，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、Dazla(1：100，Abcam)、EE2(1：100，Santa Cruz)、atlastin1(1：200，Santa Cruz)、COL1A1(1：500，Santa Cruz)、COL2A1(1：500，Santa Cruz)、tropoelastin(1：200，Abcam)，及RGFP(1：500，Clontech)。以螢光染色標定之羊抗兔(goat anti-rabbit)或馬抗小鼠(horse anti-mouse)的抗體係用來作為二級抗體(1：2,000，Invitrogen-Molecular Probes)。在具全場掃描之一100倍顯微鏡下觀察到陽性結果，並以一Metamorph影像處理程式(Nikon 80i及TE2000顯微鏡定量分析系統)在200倍或400倍之放大倍率下測量以作定量分析。

實施例12 細胞遷移測驗

在一96孔培養盤中，吾人在每一孔中將一PC3及一mirPS-PC3細胞放置在一起，然後記錄其移動及交互作用。該等細胞皆在37℃及5% CO₂下於RPMI 1640培養液中生長，該培養液的補充成分為10%炭吸附FBS、4mM L-麩醯胺、1mM丙酮酸鈉、5ng/ml活化素、5ng/ml Noggin蛋白、3ng/ml bFGF及0.5μM GSK-3抑制劑XV。在一TE2000倒立式顯微鏡系統(invert microscopic system，Nikon)下使用一成對之MO-188NE 3D液壓式精密微操縱器(hydraulic fine micromanipulators)來個別地分離並收集該等細胞，該微操縱器具有一細胞固持器(cell holder)。整個微操縱器及顯微鏡系統皆放置在一防震桌上。每15秒記錄該等相片(放大倍率400x及600x)，持續6小時。藉由追蹤在該等相片中之細胞移動及該細胞之形態判定該細胞遷移。如圖7D所示，轉移性癌症PC3細胞呈現如ATCC所述之一快速梭形移動，其中該mirPS-PC3細胞保持在該放置位置中，其顯現一圓形休眠之表現型。

實施例13 統計分析

該等結果以平均值±標準差(mean±SE)表示。資料之統計分析係以單因子變異數分析(one-way ANOVA)來計算。當主要效應明顯時，使用Dunnett事後測試法(Dunnett's post-hoc test)來識別與控制組有明顯差異之群。在兩組處理群之間進行比對時，使用雙尾student t測試(two-tailed student t test)。對於包含超過兩組處理群之實驗，則依照一事後多範圍測試(post-hoc multiple range test)實行變異數分析(ANOVA)。機率值p<0.05被認定為具有統計上的意義。所有p值係由雙尾測試(two-tailed test)來決定。

【生物材料寄存】

國內生物材料【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

質體mir-302s pre-miRNA：財團法人食品工業發展研究所、2009年4月27日、BCRC-940569

國外生物材料【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

<110> Lin,Shi-Lung 林希龍 Wu,David TS 吳堂熙

<120> 使用重組核酸組成物引發基因靜默效應而抑制標的細胞生長的方法Method of Inhibiting Targeted Cell through Gene Silencing Effect by Using Recombinant Nucleic Acid Composition

<150> 12/149725

<151> 2008-05-07

<150> 61/191327

<151> 2008-09-08

<150> 61/193438

<151> 2008-11-28

<150> PCT/US09/30432

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<160> 53

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人造序列

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<212> DNA

<213> 人造序列

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<212> RNA

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<212> DNA

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<221> misc_feature

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<223> n is a,c,g,or t

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<212> RNA

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<212> RNA

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 藉由從海葵(Heteractis crispa)衍生來之HcRed1彩色蛋白質基因(chromoprotein gene)於第69個胺基酸插入天門冬胺酸(aspartate(Asp))而生成之突變紅色螢光蛋白基因

<400> 22

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<223> 化學合成寡核苷酸

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<212> DNA

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<220>

<223> primer

<400> 44

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> primer

<400> 45

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> primer

<400> 46

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> primer

<400> 47

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> primer

<400> 48

<210> 49

<211> 63

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> primer

<400> 49

<210> 50

<211> 69

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> intron

<400> 50

<210> 51

<211> 73

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> intron

<400> 51

<210> 52

<211> 68

<212> RNA

<213> 人造序列

<220>

<223> intron

<400> 52

<210> 53

<211> 62

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> intron

<400> 53

Claims (24)

1. 一種使用一重組核酸組成物來引發一基因靜默效應而抑制一標的細胞生長的方法，包含下列步驟：(a)提供該重組核酸組成物，其被傳送、被轉錄及被處理成至少一基因靜默效應子，以干擾複數個mir-302標的之細胞週期檢查點基因及致癌基因；以及(b)以該重組核酸組成物處理一含有該標的細胞的細胞基質並抑制mir-302標的之細胞週期檢查點基因及相關致癌基因。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該標的細胞選自一哺乳動物細胞、一人類細胞、一腫瘤細胞、一癌症細胞、及其組合。
3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該腫瘤細胞為一源自畸胎瘤的細胞。
4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該癌症細胞包含一乳腺癌細胞、一前列腺癌細胞、一黑色素癌細胞，或其組合。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物包含一表現勝任載體。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物包含一藥物可誘發之基因表現啟動子。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該藥物可誘發之基因表現啟動子受到一四環黴素衍生物或同等物的控制。
8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物包含一病毒啟動子。
9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該病毒啟動子受一第二型RNA聚合酶或其同等物所驅動。
10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該病毒啟動子為一CMV啟動子。
11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞基質表現複數個mir-302標的之細胞週期檢查點基因。
12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中處理該細胞基質係在mir-302抑制mir-302標的之細胞週期檢查點基因的條件下進行。
13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物包含一五端供體剪接位、一內含子插入位、一分支點基序、一多嘧啶段以及一三端受體剪接位。
14. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該內含子插入位包含與mir-302分享超過91%同源性之該基因靜默效應子。
15. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物進一步包含複數個外顯子。
16. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因靜默效應子包含一序列，該序列與一SEQ.ID.NO.1序列或一SEQ.ID.NO.2序列同源。
17. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因靜默效應子與一SEQ.ID.NO.3序列同源或互補，或兩者皆是。
18. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因靜默效應子之序列包含一選自由一SEQ.ID.NO.9序列、一SEQ.ID.NO.10序列、一SEQ.ID.NO.11序列、一SEQ.ID.NO.12序列以及一SEQ.ID.NO.13序列所組成之群組的序列。
19. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因靜默效應子之序列包含一選自由一SEQ.ID.NO.50序列、一SEQ.ID.NO.51序列、一SEQ.ID.NO.52序列以及一SEQ.ID.NO.53序列所組成之群組的序列。
20. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物經由一基因傳送方法被傳送至該細胞基質中。
21. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該mir-302標的之細胞週期檢查點基因與致癌基因係選自CDK2、cyclin D1、cyclin D2或其組合。
22. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因靜默效應包含細胞週期減弱、細胞遷移率減弱、G1期檢查點停滯、腫瘤抑制、抗腫瘤細胞生長以及癌細胞凋亡之其中一項。
23. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該基因靜默效應起因於微型核醣核酸所引介誘導的轉譯抑制作用及RNA干擾。
24. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該重組核酸組成物是由一基因 工程方法產生。