CN110178792B - 一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法。该方法是通过杂交的方法获得具有原纤蛋白1(Fibrillin‑1，Fbn1)基因杂合点突变的低密度脂蛋白受体基因(LDLR)敲除小鼠。本发明首次将Fbn1C1039G+/‑点突变引入LDLR‑/‑小鼠基因组，结合了两种基因型的特点，方法简单易行，能形成具有大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、丰富的新生血管和斑块内出血、血管外向重构等特点的易损斑块，且能模型上观察到类似于人的斑块破裂等导致急性心脑血管事件的发生。其成模率高，可重复性好，为药物研究、器械耗材改进提供良好的动物基础，为探索动脉粥样硬化机制提供了良好平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种动脉模型的构建方法，特别涉及一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
目前，我国心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。冠心病是心血管疾病中最主要的疾病，动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是冠心病的最主要的病理过程，关于动脉粥样硬化的研究，成为近年心血管领域的研究热点。易损斑块破裂是不良心血管事件发生的首要原因，据报道，有3/4的急性心梗的发生是源于斑块破裂，但由于动物基因组和人类基因组的差异，以及斑块形成的病理生理过程不同，使目前动物模型易损斑块与人类易损斑块还有很大差异，因此，建立和人类动脉粥样硬化斑块相似的动物模型成为目前亟待解决的难题。
关于动脉粥样硬化的研究主要存在以下几种方式：1、高脂饮食诱导：由于动物与人基因组的不同，单纯饮食诱导动脉粥样的方式下，鼠、兔等动物不易产生动脉粥样硬化，仅猴子和猪等与人类基因组高度同源的动物能产生类似于人的斑块，但这类动物存在花费贵、喂养时间长、操作难度大等问题，成为研究的主要限制。2、血管损伤：通过损伤血管内皮的方式可缩短斑块形成时间，但其可重复性差，且无法模拟人类斑块形成的整个病理生理过程。3、基因敲除技术：目前基因敲除技术广泛用于动脉粥样硬化的研究中，小鼠由于繁殖速度快，喂养时间短，易操作等优势成为基因敲除技术应用最多的动物。目前广泛用于动脉粥样硬化的基因敲除鼠包括：ApoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠等，正常饮食状态下，ApoE-/-小鼠也能形成动脉粥样硬化斑块，但其动脉粥样硬化程度轻，而高脂饮食喂养的ApoE-/-和LDLR-/-鼠都能形成动脉粥样硬化斑块，但其斑块形成迅速，很难观察到人类易损斑块可见的外向重构。基于上述限制，有研究人员利用基因敲除技术构建了ApoE基因敲除犬(公开号为CN106987604)，该方法优点在于保留疾病原发症状，疾病表型持续时间长，但由于犬喂养时间长，繁殖慢等问题不利于普遍研究。而公开号为CN101480359A的专利申请所提供的利用液氮冻伤血管的方法建立的易损斑块模型，不利于研究易损斑块产生的机制和探索干预办法。
综上所述，目前关于动脉粥样易损斑块的研究中，缺乏一种符合人类易损斑块特点的动物模型和建模方法。因此，建立和人类动脉粥样硬化斑块相似的动物模型成为目前亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法，其是通过杂交的方法获得具有原纤蛋白1(Fibrillin-1，Fbn1)基因杂合点突变的低密度脂蛋白受体基因(LDLR)敲除小鼠。
其中，优选的，所述的原纤蛋白1(Fibrillin-1)基因杂合点突变是指Fbn1C1039G+/-。
其中，优选的，所述的构建方法包括以下步骤：
(1)将Fbn1基因杂合点突变鼠Fbn1C1039G+/-与低密度脂蛋白受体基因敲除(LDLR-/-)小鼠杂交，获得F1代鼠，F1代鼠的基因型为Fbn1C1039G+/+LDLR+/-或Fbn1C1039G+/-LDLR+/-；
(2)选择基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR+/-的F1代鼠与LDLR-/-小鼠杂交，获得F2代，F2代基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-、Fbn1C1039G+/-LDLR+/-、Fbn1C1039G+/+LDLR+/-或Fbn1C1039G+/+LDLR-/-；
(3)选择F2代鼠中基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-的小鼠经高脂喂养后，即为动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型。
其中，优选的，所述的高脂饲料的配方为：小鼠基础饲料中加入猪油10％w/w，奶粉4％w/w，胆固醇2％w/w，胆酸钠0.5％w/w。
进一步的，本发明还提出了由所述的构建方法所得到的动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型在动脉粥样硬化与易损斑块研究中的应用，其中，该研究是以非疾病的治疗为目的。
Fbn1C1039G+/-是原纤蛋白基因的杂合点突变，原纤蛋白1(Fibrillin-1)是合成微原纤维的重要成分。弹性蛋白是血管壁和动脉粥样硬化斑块细胞外基质的重要组成部分，弹性纤维的破坏可引起动脉硬化，血管弹性减低。微原纤维为弹性蛋白的沉积和交联提供支架。因此，Fbn1基因的突变，可通过影响弹性纤维的交联影响血管壁结构，又由于Fbn1基因双敲小鼠(基因型为Fbn1C1039G-/-)因严重基因缺陷常无法出生或出生后很快死亡，因此，本发明采用Fbn1基因杂合突变小鼠(基因型为Fbn1C1039G+/-)。而LDLR可识别LDL颗粒上脂蛋白B100，参与LDL的胞吞作用，也可以促进ApoB、ApoE的胞吞，LDLR-/-鼠在高脂喂养后能形成早期动脉粥样硬化斑块。故本发明首次将Fbn1C1039G+/-点突变引入LDLR-/-小鼠基因组，结合了两种基因敲除鼠的特点，成功构建出具有大坏死核、多炎症细胞、薄纤维帽、新生血管形成、外向重构等人类易损斑块特点的斑块(图3，图4)。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、按照本发明方法建立的小鼠模型，能形成具有大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、丰富的新生血管和斑块内出血、血管外向重构等特点的易损斑块，能更好的模拟人体易损斑块发生的病理生理过程，减少动物实验与人体实际的差距，为药物研究、器械耗材改进提供良好的动物基础，为探索动脉粥样硬化机制提供良好平台，利用这个平台，研究人员能更好地探究易损斑块的特点及其干预方式。
2、本发明方法简单易行，按照本发明方法建立的小鼠模型是以C57BL/6鼠为背景的基因敲除鼠，具有高重复性、易于繁殖等优点，为动脉粥样硬化易损斑块的研究提供了良好的动物基础。
附图说明
图1为动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型建立模式图；
图2为Fbn1基因点突变位点测序结果图；
其中：图2A为基因型Fbn1C1039G+/-杂合敲除鼠测序结果，如图所示，反向测序210-220bp段同一位点可见一双峰，对应核苷酸为A/C，图2B为野生型测序结果，相同位点核苷酸为单峰A；
图3为LDLR基因电泳验证结果图；
其中：LDLR-/-纯合小鼠(N1-N6)可扩增出单一的长度为350bp条带(引物LDLR-m和LDLR-c)，野生型鼠(W1)可扩增出单一的长度为167bp条带(引物LDLR-w和LDLR-c)，杂合型可同时扩增出350bp和167bp条带；
图4为模型小鼠与对照小鼠高脂喂养20周主动脉窦冰冻切片HE染色图；
其中：图4A为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-小鼠高脂喂养20周后HE染色图，血管外向重构，管腔面积增大；图4B为LDLR-/-小鼠高脂喂养20周后HE染色图，C:坏死核，P:斑块，L：血管腔。箭头所指为最薄纤维帽处(miniFCT)；图4C，图4D分别为图4A，图4B方框部分的放大图，图4C可见大量炎症细胞，图4D炎症细胞较图4C图少；
图5为模型小鼠斑块破裂继发血栓形成HE染色图；
其中：图5A为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-小鼠高脂喂养20周后主动脉窦HE染色图，可见斑块破裂血栓形成，m:血管中膜；图5B为图5A左方框部分的放大图，箭头所指处纤维帽破裂，继发血栓形成；图5C图为图5A右方框部分的放大图，星号所在位置可见丰富滋养血管形成；
图6为模型小鼠与对照组小鼠高脂24周后主动脉大体油红O染色图。
其中：图6A为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-小鼠主动脉，图6B为LDLR-/-小鼠主动脉。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建及鉴定
动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型建立模式图如图1所示。
1.将基因型为Fbn1杂合点突变的小鼠(基因型：Fbn1C1039G+/-，购买自美国Jackson实验室)与LDLR基因敲除小鼠(基因型：LDLR-/-，购买自北京华阜康生物科技有限公司)杂交获得F1鼠，基因型为Fbn1C1039G+/+LDLR+/-或C1039G+/-LDLR+/-。将F1代鼠取尾部组织提DNA。(DNA提取试剂盒为：血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒：天根DP304-02)。
2.鉴定F1代Fbn1基因型，将鼠尾DNA进行PCR扩增，PCR体系为：2xTaq PCR MasterMix:12.5μL，正反引物各10μM(1μL)，基因组DNA100ng，加ddH2O至25μL，反应条件：94℃3min、94℃30sec、55℃30sec、72℃1min、72℃5min，循环数为35，扩增产物长度为500bp，将扩增产物送测序，鉴定引物(5’-3’)为：
Fbn1-f：TTGTCCATGTGCTTTAAGTAGC
Fbn1-r：ACAGAGGTCAGGAGATATGC
鉴定结果见图2，杂合敲除鼠在210-220bp段同一位点可见一双峰，对应核苷酸为A/C，野生型在同一位点核苷酸为A。
3.选择F1代中基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-的雄鼠与基因型为LDLR-/-的雌鼠杂交，获得F2代，F2代鼠基因型可能为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-、Fbn1C1039G+/-LDLR+/-、Fbn1C1039G+/+LDLR+/-或Fbn1C1039G+/+LDLR-/-，提取F2代鼠尾部DNA，分别鉴定Fbn1和LDLR基因型。
4.鉴定LDLR基因型：将鼠尾DNA进行PCR扩增，PCR体系为：2xTaq PCR Master Mix:12.5μL，引物(LDLR-c共用引物、LDLR-m突变引物、LDLR-w野生型引物)各10μM(1μL)，基因组DNA100ng，加ddH2O至25μL，反应条件：94℃3min、94℃30sec、55℃30sec、72℃1min、72℃5min，循环数为35，鉴定引物(5’-3’)为：
LDLR-c:CCATATGCATCCCCAGTCTT
LDLR-w:GCGATGGATACACTCACTGC
LDLR-m:AATCCATCTTGTTCAATGGCCGATC
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定结果如图3，LDLR-/-纯合小鼠可扩增出单一的长度为350bp条带(N1-N6)，正常野生型鼠可扩增出单一的长度为167bp条带(W1)，杂合型可同时扩增出350bp和167bp条带。
5.选上述F2代鼠中基因型为Fbn1C1039G+/-LDLR-/-的小鼠为理想的易损斑块模型。将模型组小鼠Fbn1C1039G+/-LDLR-/-和对照组LDLR-/-小鼠经高脂饲料喂养(western-type diet,WD)后，取其心脏，4％多聚甲醛固定24小时，梯度蔗糖脱水，OCT包埋后冰冻切片，HE染色，并用ImageJ数据进行分析，统计斑块面积，结果见表1、图4、图5。(高脂饲料配方：小鼠基础饲料中加入猪油10％w/w，奶粉4％w/w，胆固醇2％w/w，胆酸钠0.5％w/w。)
表1
注：每组6只鼠，结果表示为平均数±SEM，***表示模型组vs对照组，p<0.001,**表示模型组vs对照组，p<0.01，
表示模型组WD24w vs模型组WD12w，p<0.001,
表示模型组WD24wvs模型组WD12w，p<0.01.¤表示对照组WD24w vs对照组WD12w，p>0.05，§表示对照组WD24wvs对照组WD12w，p<0.001.
随着高脂时间延长Fbn1C1039G+/-LDLR-/-组小鼠逐渐出现血管外向重构，管腔面积增大，坏死核心变大，纤维帽变薄，具体见表1；且模型组可见大量炎症细胞，而对照组炎症细胞较模型组少，见图4；高脂喂养至20周时，模型组即可出现斑块破裂继发血栓形成，见图5，延长高脂时间至24周发生斑块破裂者增多。
6.主动脉大体油红O染色，取材后4％多聚甲醛固定24小时，剪开血管，PBS洗3次，每次5min，油红O染色15min，75％酒精洗至正常组织变白，固定拍照，大体染色可见，模型组小鼠形成动脉粥样硬化程度较对照组更重，见图6。
结论：通过本发明方法建立的小鼠模型能形成具有大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、丰富的新生血管和斑块内出血、血管外向重构等特点的易损斑块，为探索动脉粥样硬化机制提供良好平台，利用这个平台，研究人员能更好地探究易损斑块的特点及其干预方式。
Claims (3)
1.一种动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型的构建方法，其特征在于，通过杂交的方法获得具有原纤蛋白1（Fibrillin-1，Fbn1）基因杂合点突变的低密度脂蛋白受体基因（LDLR）敲除小鼠，所述的原纤蛋白1（Fibrillin-1）基因杂合点突变是指Fbn1 C1039G+/-;
所述的构建方法，包括以下步骤：
（1）将Fbn1基因杂合点突变鼠Fbn1C1039G+/-与低密度脂蛋白受体基因敲除（LDLR-/-）小鼠杂交，获得F1代鼠，F1代鼠的基因型为Fbn1C1039G+/+ LDLR+/-或Fbn1C1039G+/- LDLR+/-；
（2）选择基因型为Fbn1C1039G+/- LDLR+/-的F1代鼠与LDLR-/-小鼠杂交，获得F2代，F2代基因型为Fbn1C1039G+/- LDLR-/-、Fbn1C1039G+/- LDLR+/-、Fbn1C1039G+/+ LDLR+/-或Fbn1C1039G+/+LDLR-/-；
（3）选择F2代鼠中基因型为Fbn1C1039G+/- LDLR-/-的小鼠经高脂饲料喂养后，即为动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的高脂饲料的配方为：小鼠基础饲料中加入猪油10%w/w，奶粉4% w/w，胆固醇2% w/w，胆酸钠0.5% w/w。
3.由权利要求1或2所述的构建方法所得到的动脉粥样硬化易损斑块小鼠模型在动脉粥样硬化与易损斑块研究中的应用，其特征在于，该研究是以非疾病的治疗为目的。
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