CN117604034A - 一种制备人源化ttr小鼠的方法及其应用 - Google Patents

一种制备人源化ttr小鼠的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117604034A
CN117604034A CN202311569861.7A CN202311569861A CN117604034A CN 117604034 A CN117604034 A CN 117604034A CN 202311569861 A CN202311569861 A CN 202311569861A CN 117604034 A CN117604034 A CN 117604034A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
ttr
mouse
human
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311569861.7A
Other languages
English (en)
Inventor
牟星
徐婧语
潘书敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cyagen Biosciences Inc Suzhou
Original Assignee
Cyagen Biosciences Inc Suzhou
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cyagen Biosciences Inc Suzhou filed Critical Cyagen Biosciences Inc Suzhou
Priority to CN202311569861.7A priority Critical patent/CN117604034A/zh
Publication of CN117604034A publication Critical patent/CN117604034A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及基于同源重组技术的Ttr基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用，所述方法包括用人TTR核酸替换内源小鼠Ttr核酸序列，所述方法中TTR基因外显子、内含子及UTR序列均为人源基因，且由人7.2kb的启动子序列驱动表达，以形成编码人或人源化TTR蛋白质的经修饰的Ttr基因；所述人TTR包括从基因上游7.2kb至基因3’UTR；所述内源小鼠Ttr包括从基因上游7.2kb至3’UTR；本发明采用同源重组技术将小鼠Ttr基因全长替换为人TTR基因全长，在ES细胞中一步打靶实现，不存在脱靶的现象，获得的小鼠具备生殖传递能力，周期短且安全。

Description

一种制备人源化TTR小鼠的方法及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及基于同源重组技术的Ttr基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
遗传性转甲状腺素蛋白(hATTR)淀粉样变性是一种由转甲状腺素蛋白(TTR)基因突变引起的遗传性、致命性疾病。转甲状腺素蛋白(Transthyretin，TTR)也被称为维生素A结合蛋白，是一种重要血浆蛋白组成成分，广泛分布在多种细胞、血浆和组织液中。TTR作为一种载体蛋白，主要在肝脏和脑内脉络丛中合成，分泌到血液和脑脊液中，起着运载甲状腺素(主要是T4)和视黄醇(即维生素A)分布到全身各个组织和细胞中的作用。
TTR是一种具有高度稳定性的四聚体结构蛋白，但TTR四聚体在病理情况或非正常生理状态下(如应激、炎症反应时)可发生分解，降解为单体。TTR的单体会生成种类复杂多样的淀粉样纤维，从而导致细胞内淀粉样纤维非正常生理性集聚。而细胞内的淀粉样异常沉积会造成细胞本身新陈代谢异常以至整个组织功能上的改变和紊乱，从而引发相关的疾病，比如报道较多的，遗传性转甲状腺素淀粉样变性病。
hATTR淀粉样变性发病率和死亡率很高，影响了全球5万多人。由于该病可能造成神经和心脏损伤，因此，确诊后的患者中位生存期为4.7年，而心肌病患者的生存期大大缩短(3.4年)。
RNAi(RNA干扰)是一种基因沉默的自然细胞过程，也是目前生物学和药物开发中最有前途和发展最快的前沿领域之一，有可能改变遗传病和其他疾病患者的治疗方案。
动物模型的应用有助于推动hATTR相关的潜在治疗方法向临床试验进一步转化,很多研究旨在靶向特定RNA，阻止野生型和变异的转甲状腺素(TTR)蛋白的生成，用于治疗hATTR淀粉样变性的多发性神经病患者。
相应地，存在关于非人动物例如啮齿类动物例如鼠科动物例如小鼠或大鼠的需要，其中所述非人动物的Ttr基因是整体或部分替换为人TTR基因的，或分别用包含编码人或人源化TTR蛋白质的序列的人TTR基因替换(例如在内源非人基因座处)。
还存在关于包含TTR基因(例如人源化或人)的非人动物的需要，在所述非人动物中，TTR基因处于人调节元件(例如人源调节元件)的控制下。
还存在关于人源化非人动物的需要，所述人源化非人动物表达人或人源化TTR蛋白质，所述非人动物的Ttr基因是整体或部分替换为TTR基因的，所述TTR基因处于人调节元件(例如人源调节元件)的控制下。
还存在关于人源化非人动物的需要，所述人源化非人动物在眼中表达人或人源化TTR蛋白质，所述年龄匹配的非人动物表达功能TTR蛋白质。
已开发了几种TTR人源化小鼠模型。具体地，由Regeneron开发的TTR人源化动物所述内源Ttr基因座的从Ttr起始密码子至Ttr终止密码子的区域已被删除并且被包含相应的人TTR序列和人TTR 3’非翻译区域的人TTR序列取代，其中所述内源Ttr 5’非翻译区域没有被删除并且没有被相应的人TTR序列取代，其中所述内源Ttr启动子未被删除并且未被相应的人TTR序列取代，该品系模型无法将靶向序列设计在5’UTR及人源启动子序列中，导致应用受限。另一种由四川大学华西医院开发的Ttr人源化动物采用CAS9技术构建，这样可能导致潜在的脱靶风险，同样其5’UTR序列及启动子序列未被替换，在靶向5’UTR及启动子方向受限。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种制备人源化TTR小鼠的方法及其应用。
本发明包括以下技术方案：
一种制备人源化TTR小鼠的方法，用人TTR核酸替换内源小鼠Ttr核酸序列，所述方法中TTR基因外显子、内含子及UTR序列均为人源基因，且由人7.2kb的启动子序列驱动表达，以形成编码人或人源化TTR蛋白质的经修饰的Ttr基因；
所述人TTR包括从基因上游7.2kb至基因3’UTR；
所述内源小鼠Ttr包括从基因上游7.2kb至3’UTR。
进一步的，上述一种制备人源化TTR小鼠的方法，包括以下步骤：
(1)构建打靶载体，打靶载体包含5arm同源臂序列、人TTR基因组序列、抗体筛选元件及3arm同源臂，其中同源臂序列从C57BL/6小鼠的基因组中进行扩增获取，人TTR基因组序列从BAC:RP11-933I14中克隆获取；
(2)将构建好的质粒电转到C57BL/6品系的ES细胞中，通过药物筛选，挑取药物抗性的ES克隆，相关ES克隆进行培养、扩增后进行PCR分型鉴定及Southern鉴定，获得正确打靶的阳性ES细胞
(3)将阳性ES细胞注射入囊胚中，再将囊胚移植到代孕鼠内，通过20天左右的孕期，小鼠出生；
(4)剪取5-7d的幼鼠鼠爪，提取DNA，进行PCR分型鉴定确认小鼠基因型；
(5)待雄性Founder小鼠到8周龄与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生7天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞；
(6)待雄性F1小鼠到8周龄，雌性F1小鼠到6周龄，进行相互配种，F2小鼠出生7天后PCR鉴定，确认纯合子小鼠的出生；
(7)将纯合子小鼠通过眼眶采血，收集血清，分析血清中TTR蛋白含量。
进一步的，上述一种制备人源化TTR小鼠的方法，所述步骤(1)具体包括以下步骤：
设计4段同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列；
具体为：以野生型C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段；以人BAC:RP11-933I14为模板PCR扩增获得人DNA片段；Neo抗体筛选盒；
5’端同源臂：小鼠mm10数据库中定位为chr18:20,654,860-20,658,083,通过上游引物SEQ ID NO：1及下游引物SEQ ID NO：2增获得；
人源DNA片段I：人hg38数据库中定位为chr18:31,584,681-31,593,436；通过上游引物SEQ ID NO:3及下游引物SEQ ID NO:4扩增获得；
人源DNA片段II：人hg38数据库中定位为chr18:31,593,437-31,598,821；通过上游引物SEQ ID NO:5及下游引物SEQ ID NO:6扩增获得；
3’同源臂：小鼠mm10数据库中定位为chr18:20,674,322-20,679,412；通过上游引物SEQ ID NO:7及下游引物SEQ ID NO:8扩增获得；
通过INFUION连接将5’端同源臂片段、3’端同源臂片段、人源DNA片段和Neo抗体筛选盒连接至PUC57质粒上，最终获得打靶载体。
进一步的，上述一种制备人源化TTR小鼠的方法，步骤(2)包括以下具体步骤：
提取40ug获得的打靶载体质粒，将其通过电转到C57BL/6品系的ES细胞系中，于细胞电转24小时后更换含G418抗性药物的ES培养基；连续7天每天观察ES药筛情况，并每天更换新鲜的含抗性药物的ES培养基，在第8天挑选状态好，体积在中等偏大的单克隆团，再对克隆进行细胞培养，并进行后续基因型鉴定、Southern鉴定。
进一步的，上述一种制备人源化TTR小鼠的方法，所述步骤(2)还包括ES细胞基因型鉴定，包括以下具体步骤：分别使用5对引物对ES细胞基因组DNA进行PCR分析鉴定，引物位置：
F1(SEQ ID NO:9)位于5’同源臂外侧；
R1(SEQ ID NO:10)位于人源DNA片段I上；
F2(SEQ ID NO:11)位于Neo元件上；
R2(SEQ ID NO:12)位于人源DNA片段II上；
F3(SEQ ID NO:13)位于人源DNA片段II上；
R3(SEQ ID NO:14)位于3’同源臂上；
F4(SEQ ID NO:15)位于人源DNA片段I上；
R4(SEQ ID NO:16)位于Neo元件上；
F5(SEQ ID NO:17)位于5’同源臂上。
进一步的，上述一种制备人源化TTR小鼠的方法，所述步骤(2)还包括还包括Southern鉴定，包括以下具体步骤：
应用Southern blot方法对PCR确认为阳性的克隆进行确认；
选用MfeI酶消化基因组，转膜，杂交；
探针位于5’同源臂外侧片段上；探针合成引物分别为：P1-F(SEQ ID NO:18)，P1-R(SEQ ID NO:19)；
P1-F(SEQ ID NO:18)：5'-TGTGGCTGGTGACTGGAGGAAAGT-3'；
P1-R(SEQ ID NO:19)：5'-AACCTAGTCAGGGAGAAGCAAACCTGG-3'；
制备成功的基因工程细胞经探针杂交分别产生：
5’Probe:5.60kb-MT，而野生型的C56BL/6小鼠基因组只有7.47kb的条带，不会有杂交条带产生；
选用ScaI酶消化基因组，转膜，杂交；探针分别位于3’同源臂外侧片段上；探针合成引物分别为：P2-F(SEQ ID NO:20)，P2-R(SEQ ID NO:21)；
P2-F(SEQ ID NO:20)：5'-CTGACTTGGCATGGTTAAGATGTGGT-3'；
P2-R(SEQ ID NO:21)：5'-TAGGAAGGCTCTGTGGGAAGACTCATA-3'；
制备成功的基因工程细胞经探针杂交分别产生：
3’Probe:15.89kb-MT,而野生型的C56BL/6小鼠基因组只有12.97kb的条带，不会有杂交条带产生。
进一步的，上述一种制备人源化TTR小鼠的方法，步骤(3)包括以下具体步骤：
取白化C57BL/6小鼠的囊胚，将阳性细胞注射至囊胚中，再将囊胚移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到C57BL/6背景的首建鼠，即Founder鼠，为F0代；将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。
进一步的，上述一种制备人源化TTR小鼠的方法，所述步骤(5)包括以下具体步骤：
将F0小鼠与野生型小鼠配种得到F1代小鼠，对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析；
分别使用2对引物对小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置F6(SEQ ID NO:22)及R6(SEQ ID NO:23)位于人的基因组上；F7(SEQ ID NO:24)及R7(SEQ ID NO:25)位于鼠的基因组上，对F1代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析；
F6(SEQ ID NO:22)：5’-GAGCAATATGTTGGAAACAAGAACC-3’；
R6(SEQ ID NO:23)：5’-TGTCTGTGAAGAGGTGAGATTGAA-3’；
F7(SEQ ID NO:24):5’-GAGCAATATGTTGGAAACAAGAACC-3’；
R7(SEQ ID NO:25):5’-TTGCTCTGGGTAGTGAGGACTTAG-3’；
F6R6引物产物长度应为284bp，在野生型小鼠中无法检测到；F7R7引物产物长度应为227bp，而在纯合小鼠中无法检测到。
进一步的，本发明还公开了上述方法在制备治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性疾病的药物中的用途。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果:
(1)本发明采用同源重组技术将小鼠Ttr基因全长替换为人TTR基因全长，在ES细胞中一步打靶实现，不存在脱靶的现象，获得的小鼠具备生殖传递能力，周期短且安全。
(2)本发明获得的小鼠不再表达小鼠Ttr内源基因，在人源TTR的调控元件下驱动人TTR全长序列的转录调控，所述TTR全长序列包含5’UTR至3’UTR的所有基因组序列，使得治疗评价中的各类序列可完全靶向人的TTR启动子序列及TTR基因组全长序列，不存在人鼠嵌合的RNA序列。
(3)hTTR7577/7577小鼠(克隆B-F10)具有约55μg/mL循环hTTR，带有小鼠TTR信号序列(hTTR7655/7655,hTTR7655/7656,和hTTR7656/7656)的人源化TTR小鼠不具有提高的分泌的TTR水平；而本发明中雄鼠具用约83μg/mL循环hTTR，雌鼠具用约128μg/mL循环hTTR，该模型具有提高的分泌TTR水平。
附图说明
图1为载体图谱示意图；
图2为ES细胞基因型鉴定的PCR反应体系；
图3为ES细胞基因型鉴定的PCR鉴定结果；
图4为ES细胞Southern blot检测结果，从左至右依次为WT，1B5,1C3,1E3,1E4,1H1,1H2；
图5为F1代基因型鉴定的PCR鉴定结果；
图6为Fn代基因型鉴定的PCR鉴定结果；
图7为实施例5中血清中TTR含量的比较图(野生型对照小鼠和人源化TTR小鼠)。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
构建载体
设计4段同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：以野生型C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段；以人BAC:RP11-933I14为模板PCR扩增获得人DNA片段；Neo抗体筛选盒。
5’端同源臂(3224bp)：小鼠mm10数据库中定位为chr18:20,654,860-20,658,083,通过上游引物(SEQ ID NO:1)及下游引物(SEQ ID NO:2)扩增获得。
人源DNA片段I(8756bp)：人hg38数据库中定位为chr18:31,584,681-31,593,436；通过上游引物(SEQ ID NO:3)及下游引物(SEQ ID NO:4)扩增获得。
人源DNA片段II(8756bp)：人hg38数据库中定位为chr18:31,593,437-31,598,821；通过上游引物(SEQ ID NO:5)及下游引物(SEQ ID NO:6)扩增获得。
3’同源臂(5091bp)：小鼠mm10数据库中定位为chr18:20,674,322-20,679,412；通过上游引物(SEQ ID NO:7)及下游引物(SEQ ID NO:8)扩增获得。
通过INFUION连接将5’端同源臂片段、3’端同源臂片段、人源DNA片段和Neo抗体筛选盒连接至PUC57质粒上，最终获得打靶载体,载体图谱见图1。
序列如下：
SEQ ID NO:1：5’-taggcgatgagatctagctgtcgcgacaggtaagtgggcaatcctttcagg-3’
SEQ ID NO:2：5’-TAAAGTTAACTACTTAAGTGCCGCGGGTTTAAACCCAGGCGCGCCCTCAGGAGTTAGTCTGGAAGTCTCTTTCA-3’
SEQ ID NO:3:5’-cttccagactaactcctgagggaattccacacactgctcctt-3’
SEQ ID NO:4:5’-TAACTACTTAAGTGCCGCGGTTGGTGTTACCCAGGGACACCAGGGAAT-3’SEQID NO:5:5’-ttagtagcgtcgcacgtgaaatcgatagctaagtgtccttgtcttaga-3’
SEQ ID NO:6:5’-TATAAGCAGCCACAGTTAGTTGCCTTTCACAGGAATGTTTTATTGTC-3’
SEQ ID NO:7:5’-actaactgtggctgcttatatcatgt-3’
SEQ ID NO:8:5’-AAAAGCTGGTACGCGGCCGCTGTGGTGCTCCCTGTACCTCAGT-3’。
实施例2
ES细胞电转
提取40ug实施例一获得的打靶载体质粒，将其通过电转到C57BL/6品系的ES细胞系中，于细胞电转24小时后更换含G418抗性药物的ES培养基。连续7天每天观察ES药筛情况，并每天更换新鲜的含抗性药物的ES培养基。在第8天挑选状态好，体积在中等偏大的单克隆团，再对克隆进行细胞培养，并进行后续基因型鉴定、Southern鉴定。
实施例3
显微注射及胚胎移植
取白化C57BL/6小鼠的囊胚，将实施例二获得的阳性细胞注射至囊胚中，再将囊胚移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到C57BL/6背景的首建鼠(即Founder鼠，为F0代)。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。
实施例4
基因改造人源化细胞及小鼠的鉴定
1、ES细胞基因型鉴定及Southern鉴定
分别使用5对引物对实施例2得到的ES细胞基因组DNA进行PCR分析鉴定：引物位置F1(SEQ ID NO:9)位于5’同源臂外侧，R1(SEQ ID NO:10)位于人源DNA片段I上；F2(SEQ IDNO:11)位于Neo元件上，R2(SEQ ID NO:12)位于人源DNA片段II上；F3(SEQ ID NO:13)位于人源DNA片段II上,R3(SEQ ID NO:14)位于3’同源臂上；F4(SEQ ID NO:15)位于人源DNA片段I上,R4(SEQ ID NO:16)位于Neo元件上；F5(SEQ ID NO:17)位于5’同源臂上。
F1(SEQ ID NO:9)：5’-GCCTGTGTAAGATCGCACAGATAA-3’
R1(SEQ ID NO:10)：5’-TGTCTGTGAAGAGGTGAGATTGAA-3’
F2(SEQ ID NO:11):5’-GCACCATTGTCCACTTGTCCC-3’
R2(SEQ ID NO:12):5’-TTAGCTATCGATTTCACGTGCGAC-3’
F3(SEQ ID NO:13)：5’-CTGTCGTCACCAATCCCAAGGA-3’
R3(SEQ ID NO:14)：5’-ATGGCCCTCAAATGAGTAAAGTGC-3’
F4(SEQ ID NO:15):5’-GTAACACCAACCGCGGCAC-3’
R4(SEQ ID NO:16):5’-TGGCTTCTGAGGCGGAAAGA-3’
F5(SEQ ID NO:17):5’-GAGCAATATGTTGGAAACAAGAACC-3’
PCR反应体系(25μL)如图2所示：
F1-R1引物产物长度应为3416bp，F2-R2引物产物长度应为262bp,F3-R3引物产物长度应为772bp,F4-R4引物产物长度应为198bp，F5-R1引物产物长度应为284bp。
在获得的96个克隆中共有27个克隆经鉴定为阳性克隆，PCR鉴定结果见图3。
进一步的，应用Southern blot方法对PCR确认为阳性的6个克隆(1B5,1C3,1E3,1E4,1H1和1H2)进行确认。
选用MfeI酶消化基因组，转膜，杂交。探针位于5’同源臂外侧片段上。探针合成引物分别为：P1-F(SEQ ID NO:18)，P1-R(SEQ ID NO:19)。
P1-F(SEQ ID NO:18)：5'-TGTGGCTGGTGACTGGAGGAAAGT-3'
P1-R(SEQ ID NO:19)：5'-AACCTAGTCAGGGAGAAGCAAACCTGG-3'
制备成功的基因工程细胞经探针杂交分别产生：
5’Probe:5.60kb-MT(with MfeI digestion)，而野生型的C56BL/6小鼠基因组只有7.47kb的条带，不会有杂交条带产生。
选用ScaI酶消化基因组，转膜，杂交。探针分别位于3’同源臂外侧片段上。探针合成引物分别为：P2-F(SEQ ID NO:20)，P2-R(SEQ ID NO:21)。
P2-F(SEQ ID NO:20)：5'-CTGACTTGGCATGGTTAAGATGTGGT-3'
P2-R(SEQ ID NO:21)：5'-TAGGAAGGCTCTGTGGGAAGACTCATA-3'
制备成功的基因工程细胞经探针杂交分别产生：
3’Probe:15.89kb-MT(with ScaI digestion),而野生型的C56BL/6小鼠基因组只有12.97kb的条带，不会有杂交条带产生
实验结果显示杂交条带大小均与预期相符，证实6个克隆均为阳性克隆且不存在随机插入，编号分别为:1B5、1C3、1E3、1E4、1H1和1H2。Southern blot检测结果见图4。
3、F0代小鼠嵌合率分析
实施例4获得的F0小鼠从毛色观测嵌合率，出生小鼠均为雄鼠，嵌合率如下表1所示。
表1：F0代小鼠嵌合率分析
F0小鼠编号 黑色占比
1 100％
2 100％
3 100％
4 100％
5 100％
6 100％
7 100％
嵌合率为100％，，说明阳性ES细胞发育成阳性小鼠。
4、F1代基因型鉴定
将F0小鼠与野生型小鼠配种得到F1代小鼠，对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。分别使用2对引物对小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置F6(SEQ ID NO:22)及R6(SEQ ID NO:23)位于人的基因组上；F7(SEQ ID NO:24)及R7(SEQ ID NO:25)位于鼠的基因组上，对F1代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析。
F6(SEQ ID NO:22)：5’-GAGCAATATGTTGGAAACAAGAACC-3’
R6(SEQ ID NO:23)：5’-TGTCTGTGAAGAGGTGAGATTGAA-3’
F7(SEQ ID NO:24):5’-GAGCAATATGTTGGAAACAAGAACC-3’
R7(SEQ ID NO:25):5’-TTGCTCTGGGTAGTGAGGACTTAG-3’
F6R6引物产物长度应为284bp，在野生型小鼠中无法检测到；F7R7引物产物长度应为227bp，而在纯合小鼠中无法检测到。
在出生的23只小鼠中共有12只小鼠经鉴定为杂合子小鼠，PCR鉴定结果见图5。
5、Fn代基因型鉴定
将F1鉴定为阳性的小鼠相互交配得到Fn代小鼠。对Fn代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。使用与F1小鼠鉴定相同的引物对Fn代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析。
在获得的9只Fn代小鼠中共有5只小鼠经鉴定为纯合小鼠，106、109、110、112、114鉴定为纯合小鼠，113鉴定为杂合小鼠，而107、108、111鉴定为阴性小鼠；PCR鉴定结果见图6。
实施例5
基因改造小鼠的表征
取实施例4得到的Fn代纯合小鼠检测TTR蛋白表达。
通过小鼠眼框采血，将血液收集至促凝管中，然后离心收集上清，即得到小鼠血清。然后采用ELISA试剂盒(货号：ab216665)检测血清中TTR含量，检测结果如图7所示，在野生型对照小鼠中检测不到人源TTR蛋白，而在人源化TTR小鼠中检测到人源TTR蛋白表达。
综上所述，(1)本发明采用同源重组技术将小鼠Ttr基因全长替换为人TTR基因全长，在ES细胞中一步打靶实现，不存在脱靶的现象，获得的小鼠具备生殖传递能力，周期短且安全。(2)本发明获得的小鼠不再表达小鼠Ttr内源基因，在人源TTR的调控元件下驱动人TTR全长序列的转录调控，所述TTR全长序列包含5’UTR至3’UTR的所有基因组序列，使得治疗评价中的各类序列可完全靶向人的TTR启动子序列及TTR基因组全长序列，不存在人鼠嵌合的RNA序列。(3)hTTR7577/7577小鼠(克隆B-F10)具有约55μg/mL循环hTTR，带有小鼠TTR信号序列(hTTR7655/7655,hTTR7655/7656,和hTTR7656/7656)的人源化TTR小鼠不具有提高的分泌的TTR水平；而本发明中雄鼠具用约83μg/mL循环hTTR，雌鼠具用约128μg/mL循环hTTR，该模型具有提高的分泌TTR水平。
上述仅仅是本发明有限的几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，用人TTR核酸替换内源小鼠Ttr核酸序列，所述方法中TTR基因外显子、内含子及UTR序列均为人源基因，且由人7.2kb的启动子序列驱动表达，以形成编码人或人源化TTR蛋白质的经修饰的Ttr基因；
所述人TTR包括从基因上游7.2kb至基因3’UTR；
所述内源小鼠Ttr包括从基因上游7.2kb至3’UTR。
2.一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建打靶载体，打靶载体包含5arm同源臂序列、人TTR基因组序列、抗体筛选元件及3arm同源臂，其中同源臂序列从C57BL/6小鼠的基因组中进行扩增获取，人TTR基因组序列从BAC:RP11-933I14中克隆获取；
（2）将构建好的质粒电转到C57BL/6品系的ES细胞中，通过药物筛选，挑取药物抗性的ES克隆，相关ES克隆进行培养、扩增后进行PCR分型鉴定及Southern鉴定，获得正确打靶的阳性ES细胞
（3）将阳性ES细胞注射入囊胚中，再将囊胚移植到代孕鼠内，通过20天左右的孕期，小鼠出生；
（4）剪取5-7d的幼鼠鼠爪，提取DNA，进行PCR分型鉴定确认小鼠基因型；
（5）待雄性Founder小鼠到8周龄与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生7天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞；
（6）待雄性F1小鼠到8周龄，雌性F1小鼠到6周龄，进行相互配种，F2 小鼠出生7天后PCR鉴定，确认纯合子小鼠的出生；
（7）将纯合子小鼠通过眼眶采血，收集血清，分析血清中TTR蛋白含量。
3.根据权利要求1所述的一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括以下步骤：
设计4段同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列；
具体为：以野生型C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段；以人BAC:RP11-933I14为模板PCR扩增获得人DNA片段；Neo抗体筛选盒；
5’端同源臂：小鼠mm10数据库中定位为chr18:20,654,860-20,658,083,通过上游引物SEQ ID NO：1及下游引物SEQ ID NO：2增获得；
人源DNA片段I：人hg38数据库中定位为chr18:31,584,681-31,593,436; 通过上游引物SEQ ID NO:3及下游引物SEQ ID NO:4扩增获得；
人源DNA片段II：人hg38数据库中定位为chr18:31,593,437-31,598,821； 通过上游引物SEQ ID NO:5及下游引物SEQ ID NO:6扩增获得；
3’同源臂：小鼠mm10数据库中定位为chr18:20,674,322-20,679,412；通过上游引物SEQ ID NO:7及下游引物SEQ ID NO:8扩增获得；
通过INFUION连接将5’端同源臂片段、3’端同源臂片段、人源DNA片段和Neo抗体筛选盒连接至PUC57质粒上，最终获得打靶载体。
4.根据权利要求1所述的一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，步骤（2）包括以下具体步骤：
提取40ug获得的打靶载体质粒，将其通过电转到C57BL/6品系的ES细胞系中，于细胞电转24小时后更换含G418抗性药物的ES培养基；连续7天每天观察ES药筛情况，并每天更换新鲜的含抗性药物的ES培养基，在第8天挑选状态好，体积在中等偏大的单克隆团，再对克隆进行细胞培养，并进行后续基因型鉴定、Southern鉴定。
5.根据权利要求1所述的一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，所述步骤（2）还包括ES细胞基因型鉴定，包括以下具体步骤：分别使用5对引物对ES细胞基因组DNA进行PCR分析鉴定，引物位置：
F1(SEQ ID NO:9)位于5’同源臂外侧；
R1(SEQ ID NO:10)位于人源DNA片段I上；
F2(SEQ ID NO:11)位于Neo元件上；
R2(SEQ ID NO:12)位于人源DNA片段II上；
F3(SEQ ID NO:13)位于人源DNA片段II上；
R3(SEQ ID NO:14)位于3’同源臂上；
F4(SEQ ID NO:15)位于人源DNA片段I上；
R4(SEQ ID NO:16)位于Neo元件上；
F5(SEQ ID NO:17)位于5’同源臂上。
6.根据权利要求1所述的一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，所述步骤（2）还包括还包括Southern鉴定，包括以下具体步骤：
应用Southern blot方法对PCR确认为阳性的克隆进行确认；
选用MfeI酶消化基因组，转膜，杂交；
探针位于5’同源臂外侧片段上；探针合成引物分别为：P1-F(SEQ ID NO:18)，P1-R(SEQID NO:19)；
P1-F(SEQ ID NO:18)：5'-TGTGGCTGGTGACTGGAGGAAAGT-3'；
P1-R(SEQ ID NO:19)：5'-AACCTAGTCAGGGAGAAGCAAACCTGG-3'；
制备成功的基因工程细胞经探针杂交分别产生：
5’Probe: 5.60 kb-MT，而野生型的C56BL/6小鼠基因组只有7.47 kb的条带，不会有杂交条带产生；
选用ScaI酶消化基因组，转膜，杂交；探针分别位于3’同源臂外侧片段上；探针合成引物分别为：P2-F(SEQ ID NO:20)，P2-R(SEQ ID NO:21)；
P2-F(SEQ ID NO:20)：5'-CTGACTTGGCATGGTTAAGATGTGGT-3'；
P2-R(SEQ ID NO:21)：5'-TAGGAAGGCTCTGTGGGAAGACTCATA-3'；
制备成功的基因工程细胞经探针杂交分别产生：
3’Probe: 15.89 kb-MT,而野生型的C56BL/6小鼠基因组只有12.97 kb的条带，不会有杂交条带产生。
7.根据权利要求1所述的一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，步骤（3）包括以下具体步骤：
取白化C57BL/6小鼠的囊胚，将阳性细胞注射至囊胚中，再将囊胚移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到C57BL/6背景的首建鼠，即Founder鼠，为F0代；将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。
8.根据权利要求1所述的一种制备人源化TTR小鼠的方法，其特征在于，所述步骤（5）包括以下具体步骤：
将F0小鼠与野生型小鼠配种得到F1代小鼠，对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析；
分别使用2对引物对小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置F6(SEQ ID NO:22)及R6(SEQ ID NO:23)位于人的基因组上；F7(SEQ ID NO:24)及R7(SEQ ID NO:25)位于鼠的基因组上，对F1代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析；
F6(SEQ ID NO:22)：5’- GAGCAATATGTTGGAAACAAGAACC-3’；
R6(SEQ ID NO:23)：5’- TGTCTGTGAAGAGGTGAGATTGAA-3’；
F7(SEQ ID NO:24): 5’- GAGCAATATGTTGGAAACAAGAACC-3’；
R7(SEQ ID NO:25): 5’- TTGCTCTGGGTAGTGAGGACTTAG-3’；
F6R6引物产物长度应为284bp，在野生型小鼠中无法检测到；F7R7引物产物长度应为227bp，而在纯合小鼠中无法检测到。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备人源化TTR小鼠的方法在制备治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性疾病的药物中的用途。
CN202311569861.7A 2023-11-23 2023-11-23 一种制备人源化ttr小鼠的方法及其应用 Pending CN117604034A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311569861.7A CN117604034A (zh) 2023-11-23 2023-11-23 一种制备人源化ttr小鼠的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311569861.7A CN117604034A (zh) 2023-11-23 2023-11-23 一种制备人源化ttr小鼠的方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117604034A true CN117604034A (zh) 2024-02-27

Family

ID=89943545

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311569861.7A Pending CN117604034A (zh) 2023-11-23 2023-11-23 一种制备人源化ttr小鼠的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117604034A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111163633A (zh) * 2017-09-29 2020-05-15 瑞泽恩制药公司 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法
CN113853433A (zh) * 2019-05-27 2021-12-28 转基因股份有限公司 外显子人源化小鼠
CN114958852A (zh) * 2022-06-09 2022-08-30 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
CN116676338A (zh) * 2023-07-10 2023-09-01 四川大学华西医院 一种遗传型转甲状腺素蛋白淀粉样变疾病模型的构建方法及应用
CN116716345A (zh) * 2023-05-10 2023-09-08 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种用于制备人源化rho和或rho突变体小鼠的方法及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111163633A (zh) * 2017-09-29 2020-05-15 瑞泽恩制药公司 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法
CN113853433A (zh) * 2019-05-27 2021-12-28 转基因股份有限公司 外显子人源化小鼠
US20220340926A1 (en) * 2019-05-27 2022-10-27 Transgenic Inc. Exon-humanized mouse
CN114958852A (zh) * 2022-06-09 2022-08-30 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种Ifnar1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及其应用
CN116716345A (zh) * 2023-05-10 2023-09-08 赛业（苏州）生物科技有限公司 一种用于制备人源化rho和或rho突变体小鼠的方法及其应用
CN116676338A (zh) * 2023-07-10 2023-09-01 四川大学华西医院 一种遗传型转甲状腺素蛋白淀粉样变疾病模型的构建方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
赛业生物: "模型推荐｜HUGO-GT™全基因组人源化小鼠加速眼科、神经、代谢等基因治疗药物研发", 《赛业生物》, 24 August 2023 (2023-08-24), pages 1 - 8 *
集萃药康: "新品上市｜人源化小鼠助力罕见病ATTR研究", 《集萃药康》, 19 April 2022 (2022-04-19), pages 1 - 6 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018177351A1 (zh) 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
CN106047930A (zh) 一种PS1基因条件性敲除flox大鼠的制备方法
CN104593418A (zh) 一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法
CN110951787A (zh) 一种免疫缺陷小鼠、其制备方法及应用
CN110771573B (zh) PirB基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法
CN112011538B (zh) 一种Mutyh基因条件性敲除小鼠模型的构建方法
CN110438160B (zh) 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用
CN116676338A (zh) 一种遗传型转甲状腺素蛋白淀粉样变疾病模型的构建方法及应用
CN112899311A (zh) 一种rs1-ko小鼠模型的构建方法及其应用
CN113699152A (zh) Slc35e2b基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN116716345A (zh) 一种用于制备人源化rho和或rho突变体小鼠的方法及其应用
CN114457114B (zh) 一种Fars2基因条件性敲除动物模型的构建方法
CN108374023B (zh) 一种构建肾脏可诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型的方法
CN117604034A (zh) 一种制备人源化ttr小鼠的方法及其应用
WO2024103631A1 (zh) Notch2nlc基因ggc重复扩增突变转基因小鼠及其构建方法和应用
CN117363660A (zh) 一种构建sma小鼠模型的方法
CN115029382B (zh) 一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的基因修饰小鼠的制备方法
CN112522312B (zh) Wkh大鼠模型构建方法
US20060265772A1 (en) Histamine hyperproductive animal
CN112877357B (zh) Abcg4基因在构建肥胖程度呈双向变化动物模型中的用途
CN116144658B (zh) 用于构建神经退行性动物模型的sgRNA及其应用
CN114410691B (zh) Slc35e1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN114868705B (zh) 一种视网膜色素变性小鼠模型的构建方法
CN111808859B (zh) WAS基因的gRNA及其应用
CN114747541B (zh) 一种psgl-1人源化非人类动物模型的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination