CN108374023B - 一种构建肾脏可诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种构建肾脏可诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型的方法，其包括在诱导的条件下特异性地在小鼠肾小管细胞内表达IL34基因的步骤。通过构建可诱导的肾小管高度表达IL34小鼠，从而成功构建了以固有巨噬细胞为主要浸润特点的肾脏小鼠模型，可以有效避免非选择性基因过表达和非选择性细胞浸润，减少对肾外重要器官和机体整体状态的影响，还能有效提高肾脏固有巨噬细胞浸润的特异性。此外，通过这一模型，结合生物信息学分析，还可以进一步探究肾脏固有巨噬细胞的功能，为寻找更具特异性的固有巨噬细胞生物学标记提供可靠路径，为靶向肾脏固有巨噬细胞的药物筛查提供可靠的体内研究模型。
Description
技术领域
本发明涉及小鼠疾病模型领域，尤其涉及一种构建肾脏可诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型的方法。
背景技术
巨噬细胞具有高度的异质性，在肾脏静息期，维持组织稳态、组织修复；在病理状态下，却促进肾脏纤维化。既往大多数研究，将巨噬细胞简单地划分为M1型(炎症性巨噬细胞)和M2型(修复性巨噬细胞)，忽视了巨噬细胞的表型、功能、内涵和对环境反应的复杂性，同时忽略了M1/M2的功能交叉现象，导致巨噬细胞在肾脏病中的作用模糊不清。因此，现在越来越多的研究者主张将组织内巨噬细胞按来源分为外周巨噬细胞和固有巨噬细胞(Tissue-resident macrophage)。外周巨噬细胞源于骨髓和外周淋巴组织的髓系细胞，炎症时由外周进入损伤部位，成为肾脏炎性巨噬细胞，以CD45+CD11b+F4/80+Ly6c+为特征；而肾脏固有巨噬细胞产生于胚胎期，成年后长期定植于肾脏，以CD45+CD11b+F4/80+Ly6c-为特征。然而，过去肾脏固有巨噬细胞的报道不多，对其功能也不甚了解，其主要原因是肾脏固有巨噬细胞的特征不明确。
目前尚缺乏肾脏特异性以固有巨噬细胞为主要浸润特点的小鼠。已有的针对IL34基因干预小鼠，主要是IL34基因全敲除小鼠，但该小鼠存在以下两个问题：
1)由于该小鼠不是肾脏特异性IL34敲除，更不是肾脏特异性IL34过表达小鼠，涉及到多器官、多系统的综合作用，存在各系统之间的相互作用，无法直观的对肾脏作用进行单因素分析；
2)该小鼠同时涉及到其他免疫器官、免疫细胞以及其他巨噬细胞亚型的综合作用，无法作为肾脏固有巨噬细胞的研究模型。
发明内容
在研究过程中，我们发现，当在肾小管细胞中组成型强表达IL34时会促使肾脏固有巨噬细胞浸润肾脏。
基于以上发现，本发明提供了一种构建肾脏可诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型的方法，其包括在诱导的条件下特异性地在小鼠肾小管细胞内表达IL34基因的步骤。
在一个优选实施方案中，所述在诱导的条件下特异性地在小鼠肾小管细胞内表达IL34基因的步骤通过使全能细胞中同时具有IL34条件表达框和肾小管组织特异性启动子驱动的在诱导条件下有活性的Cre重组酶表达框来实现，所述IL34条件表达框从5’到3’依次包括靶基因表达启动子、两端带有方向相同的loxp序列的转录阻碍片段和IL34基因编码框。
在一个优选实施方案中，所述肾小管组织特异性启动子为Cdh16基因启动子。
在一个优选实施方案中，所述在诱导条件下有活性的Cre重组酶为他莫昔芬可诱导的Cre重组酶。
在一个优选实施方案中，所述在诱导条件下有活性的Cre重组酶表达框插入于小鼠Cdh16基因第18个外显子与3’UTR之间。
在一个优选实施方案中，所述靶基因表达启动子为CAG启动子。
在一个优选实施方案中，所述IL34条件表达框插入于Rosa26基因位点处。
在一个优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：
S1：构建带有所述IL34条件表达框的LSL-IL34小鼠；
S2：构建带有所述肾小管组织特异性启动子驱动的在诱导条件下有活性的Cre重组酶表达框的KSP-iCreERT2小鼠；
S3：将所述LSL-IL34小鼠与所述KSP-iCreERT2小鼠杂交，得到的子代小鼠即为肾脏诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型。
在一个优选实施方案中，S1包括以下步骤：
S11：构建第一打靶载体，所述第一打靶载体除了包括所述IL34条件表达框外，还在两端设置有与Rosa26基因同源的片段；
S12：将S11中构建的所述第二打靶载体转入小鼠受精卵中，通过CRISPR/Cas9系统插入到Rosa26基因位点处，得到LSL-IL34小鼠受精卵；
S13：将所述LSL-IL34小鼠受精卵培养成LSL-IL34小鼠。
在一个优选实施方案中，S2包括以下步骤：
S21：构建第二打靶载体，所述第二打靶载体带有在诱导条件下有活性的Cre重组酶编码框iCreERT2，以及连接在所述编码框iCreERT2的5’端的P2A序列，此外，所述第二打靶载体的两端还设置有小鼠Cdh16基因的同源片段使其能插入到小鼠Cdh16基因第18个外显子与3’UTR之间；
S22：将S21中构建的所述第二打靶载体转入小鼠受精卵中，通过CRISPR/Cas9系统插入到Rosa26基因位点处，得到KSP-iCreERT2小鼠受精卵；
S13：将所述KSP-iCreERT2小鼠受精卵培养成KSP-iCreERT2小鼠。
本发明的有益效果是：通过构建可诱导的肾小管高度表达IL34小鼠，从而成功构建了以固有巨噬细胞为主要浸润特点的肾脏小鼠模型，可以有效避免非选择性基因过表达和非选择性细胞浸润，减少对肾外重要器官和机体整体状态的影响，还能有效提高肾脏固有巨噬细胞浸润的特异性。此外，通过这一模型，结合生物信息学分析，还可以进一步探究肾脏固有巨噬细胞的功能，为寻找更具特异性的固有巨噬细胞生物学标记提供可靠路径，为靶向肾脏固有巨噬细胞的药物筛查提供可靠的体内研究模型。
附图说明
图1为小鼠模型构建示意图
图2为第一打靶载体示意图；
图3为第二打靶载体示意图；
图4为小鼠模型中肾脏组织中巨噬细胞标记及巨噬细胞趋化因子的荧光染色照片；
图5为小鼠肾脏组织流式细胞学分析图。
图6为图5的统计图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
小鼠模型的构建过程如图1所示，包括以下步骤：
S1：构建带有所述IL34条件表达框的LSL-IL34小鼠；
S2：构建带有所述肾小管组织特异性启动子驱动的在诱导条件下有活性的Cre重组酶表达框的KSP-iCreERT2小鼠；
S3：将所述LSL-IL34小鼠与所述KSP-iCreERT2小鼠杂交，得到的子代小鼠即为肾脏诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型。
1.打靶载体的构建
第一打靶载体示意图如图2示，从5’到3’依次为CAG启动子、loxP序列、STOP序列、loxP序列、IL34编码框(Gene id 76527，GenBank)、IRES、EGFP、WPRE和PA。
其中，CAG启动子为组成型强启动子，驱动下游序列的转录；
Loxp序列是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向，在本案中，两个Loxp序列方向相同。当两个Loxp位点位于同一染色体上且方向一致时，Cre重组酶会特异性的将两个Loxp位点间的序列(即stop序列)切除，启动目的基因IL34的表达；
STOP序列为转录终止序列，具有3个拷贝的SV40多聚A序列，将启动子与IL34编码框隔开，使得当STOP存在时，IL34无法被转录，EGFP是绿色荧光标记，以利于后期的实验观察；
WPRE和PA是翻译调控序列，有助于IL34的翻译。
loxp-Stop-loxp的设置使得当细胞中含有Cre重组酶时，STOP会被切除，从而使CAG启动子得以驱动IL34编码框的表达。在第一载体的两端还设置有与Rosa26基因同源的片段(sgRNA序列)。
第二打靶载体示意图如图3示，从5’到3’依次为P2A序列和iCreERT2编码框，此外，在第二打靶载体的两端还设置有1-2kb的同源片段使其能够插入到小鼠Cdh16基因(Geneid 12556，GenBank)的第18个外显子与3’UTR之间。P2A是一类自剪切序列，在翻译到它的时候会断开，把同一条mRNA表达出的蛋白前后分开产生两个蛋白，实现小鼠原有的Cdh16基因的启动子同时驱动Cdh16和iCreERT2的表达。iCreERT2为tamoxifen诱导的Cre重组酶(tamoxifen-inducible improved Cre recombinase)。该酶在环境中含有他莫昔芬的情况下具有重组酶活性。
2.将打靶载体导入分别小鼠的受精卵，培育成LSL-IL34小鼠和KSP-iCreERT2小鼠
将两个Cas9/sgRNA打靶载体分别显微注射到不同的小鼠受精卵中，得到两类F0代小鼠。通过选择F0代鼠尾基因型鉴定结果中阳性小鼠与野生型交配获得具有稳定基因型的F1代。进一步对F1代基因型进行Southern鉴定，分别得到具有稳定基因型LSL-IL34小鼠和KSP-iCreERT2小鼠。
3.LSL-IL34小鼠与KSP-iCreERT2小鼠杂交
将LSL-IL34小鼠与KSP-iCreERT2小鼠杂交，得到的子代小鼠在其他组织或器官中基因表达无异常，但是在肾小管中，由于Cre重组酶的表达，打靶载体中的Stop序列被切除，活化了IL34的表达。使得杂交子代小鼠特异性地在肾小管中高表达IL34。
4.杂交子代小鼠的症状
得到的杂交子代小鼠在正常状态下与对照组无明显差异。但是，当对小鼠施用他莫昔芬后，可诱导肾脏固有巨噬细胞浸润肾小管。
对施用了他莫昔芬的杂交子代小鼠的肾脏组织进行免疫荧光检测，观察肾脏巨噬细胞标记F4/80和巨噬细胞趋化因子(MCP-1)的表达情况。结果如图4示，可诱导性高表达IL34肾小管管周明显巨噬细胞浸润，同时这种肾小管与MCP-1无共表达，说明浸润的巨噬细胞并非炎症性巨噬细胞。
通过流式细胞学验证固有巨噬细胞(CD45+CD11b+F4/80+Ly6c-)浸润情况。结果显示，流式细胞学验证构建的KSP-iCre-IL34小鼠肾脏组织巨噬细胞(CD45+CD11b+F4/80+)浸润增多，且以固有巨噬细胞(CD45+CD11b+F4/80+Ly6c-)浸润为主，而炎症巨噬细胞(CD45+CD11b+F4/80+Ly6c+)与对照组相比无改变(见图5和6)。可见肾脏组织以固有巨噬细胞浸润为主。
以上结果证明该小鼠模型构建成功。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种构建肾脏可诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型的方法，其特征在于，包括在诱导的条件下特异性地在小鼠肾小管细胞内表达IL34基因的步骤；
所述在诱导的条件下特异性地在小鼠肾小管细胞内表达IL34基因的步骤通过使全能细胞中同时具有IL34条件表达框和肾小管组织特异性启动子驱动的在诱导条件下有活性的Cre重组酶表达框来实现，所述IL34条件表达框从5’到3’依次包括靶基因表达启动子、两端带有方向相同的loxp序列的转录阻碍片段和IL34基因编码框；
所述肾小管组织特异性启动子为Cdh16基因启动子；
所述在诱导条件下有活性的Cre重组酶为他莫昔芬可诱导的Cre重组酶，所述在诱导条件下有活性的Cre重组酶表达框插入于小鼠Cdh16基因第18个外显子与3’UTR之间；
所述靶基因表达启动子为CAG启动子；
所述IL34条件表达框插入于Rosa26基因位点处；
所述方法包括以下步骤：
S1：构建带有所述IL34条件表达框的LSL-IL34小鼠；
S2：构建带有所述肾小管组织特异性启动子驱动的在诱导条件下有活性的Cre重组酶表达框的KSP-iCreERT2小鼠；
S3：将所述LSL-IL34小鼠与所述KSP-iCreERT2小鼠杂交，得到的子代小鼠即为肾脏诱导性固有巨噬细胞浸润小鼠模型；
步骤S1包括以下步骤：
S11：构建第一打靶载体，所述第一打靶载体除了包括所述IL34条件表达框外，还在两端设置有与Rosa26基因同源的片段；
S12：将步骤S11中构建的所述第一打靶载体转入小鼠受精卵中，通过CRISPR/Cas9系统插入到Rosa26基因位点处，得到LSL-IL34小鼠受精卵；
S13：将所述LSL-IL34小鼠受精卵培养成LSL-IL34小鼠；
步骤S2包括以下步骤：
S21：构建第二打靶载体，所述第二打靶载体带有在诱导条件下有活性的Cre重组酶编码框iCreERT2，以及连接在所述编码框iCreERT2的5’端的P2A序列，此外，所述第二打靶载体的两端还设置有小鼠Cdh16基因的同源片段使其能插入到小鼠Cdh16基因第18个外显子与3’UTR之间；
S22：将步骤S21中构建的所述第二打靶载体转入小鼠受精卵中，通过CRISPR/Cas9系统插入到Rosa26基因位点处，得到KSP-iCreERT2小鼠受精卵；
S23 ：将所述KSP-iCreERT2小鼠受精卵培养成KSP-iCreERT2小鼠。
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| IL-34和CSF-1在狼疮肾炎小鼠肾脏的表达及意义;廖文慧等;《华中科技大学学报（医学版）》;20150430;第44卷(第2期);摘要 * |
| 他莫昔芬诱导的Cre重组酶在hGfapCreERT2转基因鼠小脑中的表达研究;郭志宝等;《中国组织化学与细胞化学杂志》;20120630;第21卷(第3期);第232页右栏第2-3段 * |
| 廖文慧等.IL-34和CSF-1在狼疮肾炎小鼠肾脏的表达及意义.《华中科技大学学报（医学版）》.2015,第44卷(第2期),摘要. * |
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