CN113136401A - 对小鼠进行基因改造以及构建皮炎小鼠模型的方法 - Google Patents

对小鼠进行基因改造以及构建皮炎小鼠模型的方法 Download PDF

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Abstract

公开一种对小鼠进行基因改造的方法，包括：在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件；以及在小鼠的基因组中引入能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。公开一种构建皮炎小鼠模型的方法。公开一种同源重组载体，其序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。公开一种能够过表达细胞因子基因的表达框，其反向互补序列如SEQ ID No.4。公开一种ES细胞打靶载体，序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。公开一种能够过表达细胞因子基因的表达框，反向互补序列如SEQ ID No.11。用该方法建立小鼠模型，可将小鼠发病起始时间缩短为饲喂DOX后1‑1.5周且发病率100％，持续饲喂DOX两周后即可诱导中至重度特应性皮炎的发生，发病快且症状强烈而典型。

Description

对小鼠进行基因改造以及构建皮炎小鼠模型的方法
技术领域
本申请涉及医药技术领域，尤其涉及对小鼠进行基因改造以及构建皮炎小鼠模型的方法。
背景技术
特应性皮炎是自身免疫疾病的一种，以炎症过程为核心，典型地伴随Th2型免疫应答，是最常见的炎性皮肤疾病之一；皮肤病变的形态学特征表现为一种慢性的、反复发作的炎症性皮肤病，主要症状为皮肤干燥、慢性湿疹样皮损和剧烈瘙痒，严重影响患者生活质量。近二十年来，全球发病率持续上升，已引起世界卫生组织的高度关注。该病可累计任何年龄人群，通常在5岁前起病，在儿童中的发病率为10-20％。2017年，我国1-7岁城市儿童特应性皮炎患病率已达12.94％，儿童患者约计2600万人，其中约60％的儿童患者可持续至成年。由于城镇化程度的不断提高，患病率与重症患者均呈大幅上涨趋势。随着对该病的日益重视，人们对该病发病机制的认识日益加深，新的治疗靶点不断被发现，新型治疗药物也相继问世，寻找稳定高效的药效学评价动物模型迫在眉睫。
目前用于药效测定的特应性皮炎小鼠模型数量不多，使用较多的是利用半抗原(如噁唑酮和氯化苦咪酸)及变应原(卵清蛋白、尘螨和卡泊三醇)诱导皮肤产生炎症反应，但这些方法均需大量人力每天进行擦涂，且操作方法没有标准化，组内的个体间差异比较大，很多表型没有对特应性皮炎与接触性皮炎做严格区分，相关信号通路不明确。本方法开发出两种转基因动物模型制备方法，在小鼠基因组特异位点Rosa26基因位点插入特应性皮炎发病相关基因IL-13。IL-13属Th2型细胞因子，是诱发特应性皮炎的关键效应因子，其高表达与特应性皮炎的严重程度呈正相关，阻断IL-13可改善特应性皮炎临床症状。Rosa26位点被认为是插入外源基因的安全位点，外源基因定点插入不会影响其他基因的表达。传统的转基因小鼠一般通过利用质粒进行受精卵原核注射的方式来制备，通常会得到多个品系(Founders)。不同品系由于质粒在染色体上的整合位点不同、拷贝数不同，不同品系之间不容易得到一致的结果。而且由于转基因小鼠传代后，转基因的拷贝数稀释以及基因沉默等原因，同一品系的表型在传代过程中也很容易丢失，造成实验结果不能重复。现在大部分实验室都是通过定点转基因的方式来制备转基因小鼠。其中用的最多的位点是Rosa26位点。优点是外源基因的重组位置确定；只有1个拷贝的插入；结合其它系统(如tet-on)可以使外源基因在特定组织及特定时间表达；与随机转基因相比，需要的小鼠量小。
现有技术中，基因位点随机插入的IL-13转基因(tet-off系统)动物模型(ZhengTao et al,2009)至少需要停止饲喂DOX 8周才有个体发病，且个体间发病时间差异很大，组间个体发病起始时间前后可相差两个月，个体间发病程度也参差不齐，因此并不适用于作为药效评价的动物模型。
发明内容
本申请通过皮肤组织特异过表达IL-13定点转基因方法对小鼠进行基因改造并构建小鼠模型，本申请的小鼠模型很好地重现了人特应性皮炎的临床症状(包括表型和病理)，且本申请的基因改造后的小鼠可以方便地通过饲喂Doxycyclin(DOX)饮用水(tet-on系统)诱导IL-13基因特异性地在皮肤组织中过表达，疾病发病症状完全可控，组间个体发病趋势基本一致。
具体来说，本申请涉及如下技术方案：
1.一种对小鼠进行基因改造的方法，其特征在于，其包括：
在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件；以及
在小鼠的基因组中引入能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
2.根据项1所述的方法，其特征在于，所述给定位点为Rosa26位点或H11位点，优选为Rosa26位点。
3.根据项1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞因子为：白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-33(IL-33)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-25(IL-25)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-17(IL-17)或白细胞介素-31(IL-31)，优选为IL-13、IL-4、IL-31、IL-33、IL-18或TSLP，更优选为IL-13。
4.根据项1～3中任一项所述的方法，其特征在于，能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件为能够在压力诱导下特异性地在表皮组织中表达细胞因子基因的表达组件；
优选地，能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件包括KRT5和rtTA/m2rtTA/tTA，更优选为rtTA/m2rtTA。
5.根据项1～4中任一项所述的方法，其特征在于，在给定位点引入是利用CRISPR/Cas9系统对小鼠的受精卵进行基因改造得以实现的。
6.根据项5所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统对小鼠的受精卵进行基因改造包括对小鼠的受精卵进行显微注射；
所述显微注射物质包括：Cas9mRNA、gRNA以及同源重组载体；
所述同源重组载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框；
所述能够过表达细胞因子基因的表达框包括：细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件。
7.根据项6所述的方法，其特征在于，其包括：
将显微注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，得到F0代小鼠，F0代小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠，F1代小鼠与含有能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件的小鼠交配后得到子代小鼠。
8.根据项6或7所述的方法，其特征在于，所述能够过表达细胞因子基因的表达框的反向互补序列如SEQ ID No.4所示。
9.根据项6～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述同源重组载体的序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。
10.根据项1～4中任一项所述的方法，其特征在于，在给定位点引入是利用ES细胞打靶技术对小鼠ES细胞进行基因改造得以实现的。
11.根据项10所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶技术对小鼠ES细胞进行基因改造包括：在小鼠的基因组的给定位点引入ES细胞打靶载体，获得阳性ES细胞克隆，将阳性ES细胞克隆注射到小鼠囊胚中，获得嵌合小鼠；
所述ES细胞打靶载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框、筛选标记基因；
能够过表达细胞因子基因的表达框包括：细胞因子基因、能够过表达细胞因子基因的表达组件、能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
12.根据项11所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将嵌合小鼠与野生型小鼠交配，获得杂合子小鼠。
13.根据项11所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将嵌合小鼠与能够去除筛选标记基因的小鼠交配，获得杂合子小鼠。
14.根据项12或13所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将获得的杂合子小鼠自交，获得纯合子小鼠。
15.根据项11～14中任一项所述的方法，其特征在于，所述能够过表达细胞因子基因的表达框的序列如SEQ ID No.11所示。
16.根据项11～15中任一项所述的方法，其特征在于，所述ES细胞打靶载体的序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。
17.一种构建皮炎小鼠模型的方法，其特征在于，其包括：
在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件；以及
在小鼠的基因组中引入能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
18.根据项17所述的方法，其特征在于，所述给定位点为Rosa26位点或H11位点，优选为Rosa26位点。
19.根据项17或18所述的方法，其特征在于，所述细胞因子为：白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-33(IL-33)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-25(IL-25)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-17(IL-17)或白细胞介素-31(IL-31)，优选为IL-13、IL-4、IL-31、IL-33、IL-18或TSLP，更优选为IL-13。
20.根据项17～19中任一项所述的方法，其特征在于，能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件为能够在压力诱导下特异地在表皮组织中表达细胞因子基因的表达组件；
优选地，能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件包括KRT5和rtTA/m2rtTA/tTA，更优选为rtTA/m2rtTA。
21.根据项17～20中任一项所述的方法，其特征在于，在给定位点引入是利用CRISPR/Cas9系统对小鼠的受精卵进行基因改造得以实现的。
22.根据项21所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统对小鼠的受精卵进行基因改造包括对小鼠的受精卵进行显微注射；
所述显微注射物质包括：Cas9mRNA、gRNA以及同源重组载体；
所述同源重组载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框；
所述能够过表达细胞因子基因的表达框包括：细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件。
23.根据项22所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
将显微注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，得到F0代小鼠，F0代小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠，F1代小鼠与含有能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件的小鼠交配后得到子代小鼠。
24.根据项22或23中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含细胞因子基因的基因片段的反向互补序列如SEQ ID No.4所示。
25.根据项22～24中任一项所述的方法，其特征在于，所述同源重组载体的序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。
26.根据项17～21中任一项所述的方法，其特征在于，在给定位点引入是利用ES细胞打靶技术对小鼠ES细胞进行基因改造得以实现的。
27.根据项26所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶技术对小鼠ES细胞进行基因改造包括：在小鼠的基因组的给定位点引入ES细胞打靶载体，获得阳性ES细胞克隆，将阳性ES细胞克隆注射到小鼠囊胚中，获得嵌合小鼠；
所述ES细胞打靶载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框、筛选标记基因；
能够过表达细胞因子基因的表达框包括：细胞因子基因、能够过表达细胞因子基因的表达组件、能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
28.根据项27所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将嵌合小鼠与野生型小鼠交配，获得杂合子小鼠。
29.根据项27所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将嵌合小鼠与能够去除筛选标记基因的小鼠交配，获得杂合子小鼠。
30.根据项28或29所述的方法，其特征在于，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将获得的杂合子小鼠自交，获得纯合子小鼠。
31.根据项27～30中任一项所述的方法，其特征在于，所述能够过表达细胞因子基因的表达框的序列如SEQ ID No.11所示。
32.根据项27～31中任一项所述的方法，其特征在于，所述ES细胞打靶载体的序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。
33.一种同源重组载体，其特征在于，其序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。
34.一种能够过表达细胞因子基因的表达框，其特征在于，其反向互补序列如SEQID No.4所示。
35.一种ES细胞打靶载体，其特征在于，其序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。
36.一种能够过表达细胞因子基因的表达框，其特征在于，其反向互补序列如SEQID No.11所示。
37.一种根据项1～32中任一项所述的方法产生的小鼠或其后代在制备动物模型中的用途。
38.一种根据项1～32中任一项所述的方法产生的小鼠或其后代或小鼠模型作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
39.根据项38所述的应用，其特征在于，所述小鼠或其后代或小鼠模型用于自身免疫性疾病，优选特异性皮炎的模型的应用。
发明的效果
相比于现有技术，利用本申请的方法对小鼠进行基因改造以及建立小鼠模型，在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因，以及在小鼠基因组中引入能够特异性过表达细胞因子基因的表达组件，可将小鼠发病起始时间缩短为饲喂DOX后1-1.5周且发病率100％，持续饲喂DOX两周后即可诱导中至重度特应性皮炎的发生，不但发病快且症状强烈而典型。本申请的方法更优选采用的tet-on系统，既方便操作又节约成本。鉴于快速的发病进程和典型的症状及易操作的特点，利用本申请的方法进行基因改造后的小鼠以及构建的小鼠模型适用于药效测定，疾病发病症状完全可控，组间个体发病趋势基本一致。
附图说明
图1为如实施例1所述的同源重组载体质粒构建序列。
图2如实施例2所述Tg(+)和Tg(-)组血清IL-13表达水平测定结果。
图3为如实施例2所述特应性皮炎小鼠模型表型。
图4如实施例2所述特应性皮炎模型表型临床评分。
图5为如实施例2所述特应性皮炎小鼠模型表皮水分缺失(TEWL)指标的测定情况。
图6为如实施例2所述特应性皮炎小鼠模型病理特征。
图7为如实施例2所述特应性皮炎模型组织学评分、炎细胞浸润评分和最厚表皮层厚度变化。
图8(a)～(c)为如实施例2所述阻断IL-13可恢复小鼠模型特应性皮炎表型。
图9为如实施例3所述ES细胞打靶载体质粒构建序列。
图10为如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠和野生小鼠模型表型。
图11为如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠和野生小鼠模型表型临床评分。
图12为如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠和野生小鼠模型病理特征。
图13为如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠和野生小鼠模型表型病理组织学评分。
图14为如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠和野生小鼠模型表型病理学炎细胞浸润评分。
图15为如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠和野生小鼠模型表型病理学最厚表皮层厚度测量。
图16为IL-13在如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠模型的表皮层高表达(箭头指示IL-13表达的区域，深色区域为免疫组化IL-13蛋白阳性信号)。
图17为如实施例3所述KI纯合小鼠、KI杂合小鼠和野生小鼠生存曲线分析。
具体实施方式
定义
如本文中使用的术语“启动子”包括与要转录的核酸序列(诸如编码期望分子的核酸序列)可操作连接的DNA序列。启动子一般位于要转录的核酸序列的上游，并且提供RNA聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。在特定的实施方案中，启动子一般位于转录的核酸序列的上游以生成期望的分子，并且提供RNA聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。
如本文中使用的术语“CRISPR/Cas9”是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。以CRISPR/Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。
在本文中使用的术语“白细胞介素”白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白细胞介素interleukin缩写为IL，功能关系免疫反应的表达和调节，这种调节有来源于淋巴细胞或巨噬细胞等的许多因子参与。来源于淋巴细胞的有淋巴细胞活素，来源于巨噬细胞的总称为monokine，其中的各个因子的生物活性各有不同(例如巨噬细胞活化，促进T细胞繁殖等)，因子自身的物理化学性质多不清楚。
在本文中使用的术语“白细胞介素-13”由TH2细胞产生，是诱发特应性皮炎的关键效应因子，其高表达与特应性皮炎的严重程度呈正相关，阻断IL-13可改善特应性皮炎临床症状。其基因位于第5号染色体上，与IL-4基因紧密连接。IL-13分子的氨基酸顺序与IL-4有20％～25％的同源性，在功能上也与IL-4有许多相似之处。IL-13可诱导单核细胞分化，增强其MHCⅡ类分子的表达；抑制lps诱导的单核因子分泌，控制炎症反应；诱导B细胞增殖及合成IgE类抗体，增强B细胞表面MHCⅡ类分子、CD23及CD72的表达；协同IL-2刺激NK细胞产生IFN，从而促进单核-巨噬细胞活化和TH1型细胞免疫反应。最近还发现，IL-13还具有抑制HIV-1在巨噬细胞内复制，诱导中性粒细胞中IL-1RA基因表达和蛋白质合成等多种功能。
在本文中使用的术语“白细胞介素-4”是II型辅助T细胞(Th2细胞)分泌的细胞因子。白细胞介素-4的生物作用，包括刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞。它也在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。白细胞介素-4诱导B细胞抗体类别转换向IgE，上调第二型主要组织兼容性复合体的产生。通过转基因方法在小鼠表皮组织中过表达IL-4会诱发特应性皮炎症状。
在本文中使用的术语“白细胞介素-22”属IL-10家族细胞因子，由多种细胞产生，组成性表达于胸腺和脑组织，可诱导急性期蛋白产生。通过转基因方法在小鼠表皮组织中过表达IL-22引起了类似特应性皮炎的症状,如激活Th2局部和系统性的免疫反应，上调TSLP和IL-33的表达，下调上皮组织分化相关基因，导致表皮组织屏障功能缺失，加重过敏原暴露导致的皮炎症状。
在本文中使用的术语“白细胞介素-33”，也称为DVS27或NF-HEV(来自高内皮细胞的核因子)，是IL-1家族的促炎蛋白和染色质相关细胞因子，与IL-1和IL-18具有高度的序列和结构相似性。IL-33蛋白在人扁桃体、派尔集合淋巴结和淋巴结中被高内皮微静脉内皮细胞高度而选择性地表达。IL-33蛋白具有转录调节特性，研究表明IL-33是一种具有双重功能的蛋白，可能同时充当细胞因子和细胞内核因子。作为一种2型细胞因子，IL-33蛋白在蠕虫感染和变态反应性疾病中也起着关键作用。在小鼠中皮下注射IL-33会导致皮层纤维化，嗜酸性粒细胞增多，IL-13表达升高。通过转基因方法在小鼠皮肤组织中过表达IL-33会导致Th2型免疫应答。
在本文中使用的术语“白细胞介素-18”，通过构建转基因小鼠在表皮组织中组成型过表达IL-18导致了自发的特应性皮炎样症状，该症状独立于IgE/stat6信号通路。
在本文中使用的术语“白细胞介素-25”主要由骨髓基质细胞分泌，Th2细胞和肥大细胞也可分泌，其可促进淋巴谱系的细胞增殖，但对髓系细胞无作用。受体为胸腺共享抗原-1(TSA-1)。体外实验表明IL-25可直接作用于角质层形成细胞促进表皮组织的屏障缺失。
在本文中使用的术语“白细胞介素-5”，小鼠的IL-5可促进抗原刺激的B细胞分化为抗体合成细胞，主要作用于进入细胞增殖后期的B细胞，并增加活化B细胞IL-2R的表达；可促进IgA合成；可协同ConA或IL-2诱导胸腺中杀伤性T细胞前体(CTPp)分化为CTL；也可趋化人嗜酸性粒细胞，延长成熟嗜酸性粒细胞的存活时间，刺激人和小鼠嗜酸性粒细胞的功能，诱导嗜酸性粒细胞的分化。在特应性皮炎患者的皮损组织中有高表达的IL-5，进而募集嗜酸性粒细胞加剧炎症反应。
在本文中使用的术语“白细胞介素-23”是造血细胞因子家族成员,它是由p19和p40两个亚基组成的活性复合体，IL-23受体由IL-12β1和IL-23R构成，IL-23的信号途径与白细胞介素-12(IL-12)有相同的Jak-Stat信号分子，IL-23的功能与IL-12也存在许多相同之处，但也有其独特的功能。IL-23可作用于活化的T细胞,记忆性T细胞和树突状细胞，产生γ干扰素(IFN-γ)和IL-12等细胞因子，在炎症性疾病，自身免疫性疾病的发病以及抗肿瘤和抗感染等方面发挥重要作用，有望成为新的免疫治疗因子。在CCR4基因型缺陷的小鼠中注射IL-23蛋白可诱导出特应性皮炎样症状。
在本文中使用的术语“白细胞介素-17”是一种主要由活化的T细胞产生的致炎细胞因子，可以促进T细胞的激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和化学增活素及细胞黏附分子1(CAM-1)，从而导致炎症的产生。IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。IL-17与受体结合后，可通过MAP激酶途径和核转录因子kB(nuclearfactor kB，NF-kB)途径发挥其生物学作用。Th17细胞能够分泌产生IL-17A、IL-17F、IL-6以及a肿瘤坏死因子(TNF-a)等，这些细胞因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞。Th17细胞产生的IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效地介导了组织的炎症反应。尤其在特应性皮炎的慢性期可见Th2/Th17混合炎症浸润。
在本文中使用的术语“白细胞介素-31”为gp130/IL-6家族成员，具有调节细胞增殖，调节造血，免疫调节等功能。研究发现，IL-31在自身免疫性疾病，变态反应性疾病等疾病中起重要作用。通过转基因方法在小鼠表皮细胞中过表达IL-31会导致瘙痒和皮层屏障受损。
在本文中使用的术语“胸腺基质淋巴细胞生成素”胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是1994年被发现的一种IL-7样细胞因子，该因子对树突状细胞(DC)活化和诱导淋巴细胞及其亚群的分化，成熟有着重要的调控作用。近年来TSLP倍受关注，大量研究证实其对Th2和调节性T细胞(Treg)的分化成熟具有重要影响，并参与支气管哮喘，过敏性皮炎，过敏性鼻炎等变态反应性疾病的发生发展。表皮细胞过表达TSLP的小鼠可以发展成为类特应性皮炎的症状，表现为Th2细胞因子和IgE抗体系统性高表达。
在本文中使用的术语“细胞因子”是指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。细胞因子(cytokine，CK)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。本申请的细胞因子可为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子等。肿瘤坏死因子超家族(TNFα)过表达能够引起皮肤组织海绵层水肿，诱导角质层生成细胞表达TSLP，和Th2细胞因子一起诱导类特应性皮炎症状，但Th2型细胞因子起主要作用。干扰素仅在疾病慢性期中起到部分作用。特应性皮炎患者皮肤组织中高表达的CCL17、CCL22趋化因子，会募集更多的Th2细胞参与到免疫反应，同时高表达的CCL26趋化因子和白介素IL-5会进一步募集嗜酸性粒细胞参与到免疫反应中。
在本文中使用的术语“ES细胞打靶”是指在小鼠胚胎干细胞(ES细胞)中进行DNA同源重组，将ES细胞重新注射到囊胚腔中，可以形成嵌合胚胎，并能在假孕小鼠体内发育，最终发育为嵌合体小鼠。这种嵌合小鼠的组织细胞(包括生殖细胞)可以分别来自囊胚的细胞和被注射的ES细胞。因此，通过嵌合小鼠和野生型小鼠的交配，ES细胞中的遗传信息就能够传递到后代的小鼠个体中。
在本文中使用的术语“杂合子”是指杂合子是指同源染色体同一位点上的两个等位基因不相同的基因型个体。杂合子间交配所生后代会出现性状的分离。
在本文中使用的术语“纯合子”又称纯合体，同型结合体，其是指二倍体中同源染色体上相同位点等位基因相同的基因型个体。
在本文中使用的术语“位点”是指基因在染色体上占有的特定位置。
在本文中使用的术语“TRE”为四环素响应元件的缩写，通常是19个核苷酸的四环素操纵子(tetO)序列的7个重复。
在本文中使用的术语“CMV”为巨细胞病毒启动子的缩写，是启动真核基因表达的强力启动子，常参与构建高效真核表达载体，并广泛应用于基因治疗产品和DNA疫苗的制备。
在本文中使用的术语“KRT5”为角蛋白5启动子的缩写，该基因编码的蛋白质是角蛋白基因家族的成员，该基因主要在毛囊基质和复层鳞状上皮基底层的角质细胞里表达。
在本文中使用的术语“rtTA”为反义Tet转录活化因子的缩写，其为Tet-on调控系统的调节蛋白，rtTA是由rTetR与VP16的转录活化区域融合而成。rTetR由TetR中的4个氨基酸发生突变而衍生而来的。rTetR的表型与TetR相反，在无Tet或DOX时，rtTA不能结合TRE，导致基因表达关闭；而在有Tet或DOX存在时，rtTA会结合在TRE上，导致基因表达开放。
为了提高利用小鼠模型进行药效测定的效率和准确性，需要建立发病症状可控、发病快且症状强烈而典型的小鼠模型。本申请提供一种对小鼠进行基因改造的方法，其特征在于，其包括：
在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件；以及
在小鼠的基因组中引入能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
在本申请一个具体实施方式中，所述给定位点为稳定位点，在稳定位点放置DNA序列非常安全稳定，所述稳定位点为Rosa26位点或H11位点，优选为Rosa26位点。
Rosa26位点在科学界被称为Gt(ROSA)26Sor，是一个位于小鼠6号染色体上由三个外显子构成的非编码基因，因为该区域极易进行基因插入操作，且由于其尚未发现功能性表达蛋白，加之容易进行同源重组，插入该区域的蛋白可以很好的进行表达，不会影响其他内源性基因的表达和功能发挥，在所有细胞类型和发育阶段均有广泛表达。
H11位点(也叫Hipp11)位于小鼠第11号染色体，是Eif4enif1与Drg1这两个基因之间的一个位点，由Simon Hippenmeyer于2010年发现并命名。由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。同时H11位点所在的Eif4enif1与Drg1这两个基因的侧翼序列区域具有广泛的空间和时间EST(expression sequence tag)表达模式，能够使整合在此的外源基因受指定启动子的驱动而稳定表达。该位点的纯合敲入小鼠可正常发育和繁殖。
在本申请一个具体实施方式中，所述细胞因子为：白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-33(IL-33)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-25(IL-25)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-17(IL-17)或白细胞介素-31(IL-31)，优选为IL-13、IL-4、IL-31、IL-33、IL-18或TSLP，更优选为IL-13。
在本申请一个具体实施方式中，能够过表达细胞因子基因的表达组件包括TRE和CMV。
在本申请一个具体实施方式中，能够过表达细胞因子基因的表达组件包括TRE、CMV和SV40-pA。
在本申请一个具体实施方式中，能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件为能够在压力诱导下特异性地在表皮组织中表达细胞因子基因的表达组件，能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件包括KRT5和rtTA/m2rtTA/tTA，由于采用tet-on系统更经济方便，因此更优选为rtTA/m2rtTA。
在本申请一个具体实施方式中，在给定位点引入是利用CRISPR/Cas9系统对小鼠的受精卵进行基因改造得以实现的。进行基因改造的受精卵可以是对体外受精得到的，也可以是体内受精得到的。利用CRISPR/Cas9系统对小鼠的受精卵进行基因改造包括对小鼠的受精卵进行显微注射；所述显微注射物质包括：Cas9mRNA、gRNA以及同源重组载体；所述同源重组载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框；所述能够过表达细胞因子基因的表达框包括：细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件。
在本申请一个具体实施方式中，对非人动物细胞的受精卵进行基因改造是通过对受精卵的细胞核或细胞质进行注射来完成的。
在本申请一个具体实施方式中，所述方法包括将显微注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，得到F0代小鼠，由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠，因此再将F0代小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠，F1代小鼠与含有能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件的小鼠交配后得到子代小鼠。
在本申请一个具体实施方式中，所述能够过表达细胞因子基因的表达框的反向互补序列如SEQ ID No.4所示。所述同源重组载体的序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。所述同源重组载体还可以包括本领域技术人员所熟知的其它序列。
在本申请一个具体实施方式中，对小鼠进行基因改造的方法，其包括：构建同源重组载体，同源重组载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框，能够过表达细胞因子基因的表达框包括：IL-13基因和TRE-CMV表达组件。同源重组载体通过一对同源重组臂定点整合入野生小鼠基因组Rosa26位点，并在TRE和CMV融合启动子的驱动下过量表达IL-13基因，该表达载体通过受精卵显微注射到F0代小鼠，鉴定后进一步与野生型小鼠交配从而得到F1代小鼠。F1代小鼠与含有KRT5-rtTA皮肤组织特异性表达组件的小鼠品系交配，子代小鼠可通过饲喂DOX，特异性驱动IL-13基因在皮肤组织中表达。
在上述具体实施方式中，同源重组载体中的IL-13cDNA可替换为其它特应性皮炎相关效应因子基因，因此该载体具有通用性。由该载体构建出的其它炎症因子F1代小鼠均可与Tg(KRT5-rtTA)交配，从而得到子代中皮肤组织中特异过表达的一系列炎症因子小鼠模型，该策略具有灵活性与通用性。
在本申请一个具体实施方式中，在给定位点引入是利用ES细胞打靶技术对小鼠ES细胞进行基因改造得以实现的。
在本申请一个具体实施方式中，利用ES细胞打靶技术对小鼠ES细胞进行基因改造包括：在小鼠的基因组的给定位点引入ES细胞打靶载体，获得阳性ES细胞克隆，将阳性ES细胞克隆注射到小鼠囊胚中，获得嵌合小鼠；
所述ES细胞打靶载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框、筛选标记基因；
能够过表达细胞因子基因的表达框包括：细胞因子基因、能够过表达细胞因子基因的表达组件、能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
在本申请一个具体实施方式中，能够过表达细胞因子基因的表达组件包括TRE和CMV，够特异性地表达细胞因子基因的表达组件包括KRT5和rtTA/m2rtTA。
在本申请一个具体实施方式中，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将嵌合小鼠与野生型小鼠交配，获得杂合子小鼠。
在本申请一个具体实施方式中，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将嵌合小鼠与能够去除筛选标记基因的小鼠交配，获得杂合子小鼠，筛选标记基因包括正筛选标记基因和负筛选标记基因。
在本申请一个具体实施方式中，利用ES细胞打靶对小鼠ES细胞进行基因改造还包括：将获得的杂合子小鼠自交，获得纯合子小鼠。
在本申请一个具体实施方式中，所述能够过表达细胞因子基因的表达框的序列如SEQ ID No.11所示，所述ES细胞打靶载体的序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。
在本申请一个具体实施方式中，对小鼠进行基因改造的方法，其包括：构建ES细胞打靶载体，所述ES细胞打靶载体包括：3’同源臂、5’同源臂、能够过表达细胞因子基因的表达框、正、负筛选标记基因；能够过表达细胞因子基因的表达框包括：IL-13、TRE-CMV表达组件、KRT5-M2rtTA表达组件。将所述ES细胞打靶载体定点整合进入小鼠基因组Rosa26位点，该具体实施方式一次性构建长片段表达载体，由此载体构建的转基因小鼠F1代自交后，即可通过饲喂DOX诱导IL-13基因的表达，该实施方式省去了保种两种小鼠品系及交配的工作量。
本申请还提供一种构建皮炎小鼠模型的方法，其特征在于，其包括：
在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件；以及
在小鼠的基因组中引入能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
在本申请一个具体实施方式中，所述给定位点为Rosa26位点或H11位点，优选为Rosa26位点。
在本申请一个具体实施方式中，所述细胞因子为：白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-33(IL-33)、白细胞介素-25(IL-25)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-17(IL-17)或白细胞介素-31(IL-31)，优选为IL-13、IL-4、IL-31、IL-33、IL-18或TSLP，更优选为IL-13。
在本申请一个具体实施方式中，能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件为能够在压力诱导下特异地在表皮组织中表达细胞因子基因的表达组件。
本申请还提供一种同源重组载体，其序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。
本申请还提供一种能够过表达细胞因子基因的表达框，其特征在于，其反向互补序列如SEQ ID No.4所示。
本申请还提供一种ES细胞打靶载体，其序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。所述ES细胞打靶载体还可以包括本领域技术人员所熟知的其它序列。
本申请还提供一种能够过表达细胞因子基因的表达框，其反向互补序列如SEQ IDNo.11所示。
本申请模型构建方法可将发病起始时间缩短为饲喂DOX后1-1.5周且发病率100％，持续饲喂DOX两周后即可诱导中至重度特应性皮炎的发生，不但发病快且症状强烈而典型。相比以往小鼠模型采用的tet-off系统(Zheng Tao et al,2009)，即需永久饲喂DOX才可令小鼠保持健康不发病，从成本考虑并不是最经济的方法，也不方便操作；本发明方法采用的tet-on系统则经济方便。鉴于快速的发病进程和典型的症状及易操作的特点，本方法构建出的小鼠模型适用于药效测定。
实施例
实施例1 Rosa26-(2xIns-TRE-CMV-IL-13-SV40-pA-2xIns)品系的构建
1.1 构建同源重组载体
构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含3.3kb 5’同源臂、2xIns-TRE-CMV-IL-13-SV40-pA-2xIns和3.3kb 3’同源臂。同源重组载体质粒如图1所示，同源重组载体的核酸包括序列如SEQ ID No.1所示的序列。采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，将构建的同源重组载体片段整合入小鼠基因组位点Rosa26。
其中，Rosa26插入位点(nRosa-test-r2)反向互补序列如SEQ ID No.3所示；5’同源臂的序列如SEQ ID No.2所示；两段绝缘子2xIns反向互补序列如SEQ ID No.5所示；SV40polyA反向互补序列如SEQ ID No.6所示；IL-13基因编码序列的反向互补序列如SEQ IDNo.7所示；TRE-CMV融合启动子反向互补序列如SEQ ID No.8所示；3’同源臂序列如SEQ IDNo.9所示；能够过表达细胞因子基因的表达框(2xIns-TRE-CMV-IL13-SV40-pA-2xIns片段)的反向互补序列如SEQ ID No.4所示。
1.2 小鼠受精卵的显微注射
通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA(5’GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG3’)；将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。
1.3 F0代小鼠的获得和基因型鉴定
将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，20天左右出生的小鼠为F0代小鼠。通过PCR扩增及测序对其进行基因型鉴定。经PCR鉴定，双臂同源重组阳性的F0代小鼠为2、3、17、18、20、22、29、32、34、36号，经测序确认均为阳性。
5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定引物信息如表1所示：
表1
引物 序列5'-->3' 引物类型
I GCCGGGCCTCGTCGTCT 正向
II TTTTTGGGGGTGATGGTGGTC 反向
5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应体系如表2所示：
表2
反应组分 体积(μl)
双蒸水 13.2
PCR缓冲液 2
2.5mM dNTP 2
引物I(10pmol/μl) 0.5
引物II(10pmol/μl) 0.5
DNA聚合酶 0.8
基因组DNA 1
5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应条件如表3所示：
表3
Figure BDA0002903610350000171
Figure BDA0002903610350000181
3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定引物信息如表4所示：
表4
引物 序列5'-->3' 引物类型
III TAGTGGGGGCCTTGCGGTTAC 正向
IV TCTTTAGGAGCCATTCAGTGTTCA 反向
3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应体系如表5所示：
表5
反应组分 体积(μl)
双蒸水 13.2
PCR缓冲液 2
2.5mM dNTP 2
引物III(10pmol/μl) 0.5
引物IV(10pmol/μl) 0.5
DNA聚合酶 0.8
基因组DNA 1
总计 20
3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定反应条件如表6所示：
表6
Figure BDA0002903610350000182
Figure BDA0002903610350000191
由于受精卵早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，需要进行传代以获得可稳定遗传的F1代小鼠。
1.4 F1代小鼠获得及基因型鉴定
F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代小鼠，通过PCR鉴定及测序对其进行基因型鉴定。PCR鉴定阳性小鼠为：3、6、9、25、30、37号；经测序确认均为阳性。
F1代阳性小鼠PCR鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。其中，5’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应；3’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应。
实施例2 双阳性特应性皮炎小鼠模型的建立与症状分析
2.1 双阳性特应性皮炎小鼠模型建立
实施例1的F1代阳性小鼠与转基因小鼠品系Tg(KRT5-rtTA)(购自JAX)交配，子代小鼠于6周前完成双阳性Tg(+)鉴定。R26-(2xIns-TRE-CMV-IL-13-SV40-pA-2xIns)基因型阳性鉴定方法如下表7中所示，Tg(KRT5-rtTA)阳性PCR鉴定方法可参考JAX网站。选取7只出生年龄相近的Tg(+)小鼠，作为实验组；9只同胞小鼠Tg(-)，作为对照组。对双阳小鼠Tg(+)和非双阳小鼠Tg(-)从6周大开始同时施喂DOX水，DOX(SIGMA,D9891)用饮用水配至终浓度1mg/mL。通过饲喂DOXTg(+)组可持续表达IL-13，用CBA(Cytometry Beads Assay)法测定血清中IL-13表达水平，双阳小鼠Tg(+)血清中IL-13含量显著高于Tg(-)组(如图2示)，模型显示IL-13的过表达引起了强烈的中至重度特应性皮炎症状。
表7
Figure BDA0002903610350000192
Figure BDA0002903610350000201
基因型判断：小鼠基因组使用引物对(P1，P2)，(P3，P4)分别扩增，野生型只有(P1，P2)扩增出994bp条带，(P3，P4)无条带；杂合子(P1，P2)扩增出994bp条带，(P3，P4)也扩增出小条带457bp。
2.2 小鼠模型症状表型与病理特征与人特应性皮炎症状高度契合
于DOX刺激一周后，即在第二周时Tg(+)7只小鼠全部出现湿疹症状，如抓挠，丘疹，红斑和皮损；于第三、四周出现疾病加重，异常皮肤面积变大，由背部蔓延到腹部和头部包括唇周、耳周、脸颊且头顶触感有明显的粗糙和硬化。皮肤苔藓化，动物状态异常，体重下降，活动减少，体表温度下降，严重的出现动物死亡，表型如图3示，而对照Tg(-)组全部正常。
对小鼠的背部皮肤表型分析分别从红斑、皮肤厚度和结痂三个指标加和进行临床评分，IL-13表达组Tg(+)与未表达组Tg(-)，临床评分无论在雄性组还是雌性组均有显著性差异(图4)。
表皮间水分缺失(Trans-epidermal water loss，TEWL)是衡量特应性皮炎的指标之一，与IL-13未表达组Tg(-)相比，无论雄性鼠还是雌性鼠TEWL数值在IL-13表达组Tg(+)显著性增加(图5)。
对小鼠的背部皮肤组织学切片(图6)分别从结痂、皮层亢进、表皮缺损和溃疡形成四个指标加和进行组织学评分，IL-13表达组Tg(+)与未表达组Tg(-)具有显著性差异；炎细胞浸润评分呈显著增加；量化后的表皮厚度在IL-13表达组显著增加(图7)。
相较其他特应性皮炎模型(Zheng Tao et al,2009)，该模型症状出现时间可由先前的饲喂DOX8周缩短至1-1.5周，发病进展迅速，持续饲喂DOX 4周即可引起严重的死亡症状，因此大大节约了药效评价的周期。并症状可控，即可通过选取不同的DOX喂养时间决定对不同程度的特应性皮炎症状给药，方便进行药效测定。
2.3 阻断IL-13能够逆转特应性皮炎模型的表型
对6只Tg(+)雄鼠持续施喂DOX1.5-2周，诱导IL-13持续表达，6只小鼠全部发病，临床评分介于4-8分间，相对施喂DOX前，水分缺失(TWEL)数值均大幅上升；且伴随体重的明显下降。随后撤离DOX，阻断IL-13的过表达，6只小鼠于撤离DOX 3周后，临床评分、TWEL和体重均明显恢复(图8)；于撤离DOX 6周后，临床评分降低显著，除一只小鼠外其余小鼠均恢复至0-1分，TWEL值降至施喂DOX前水平，体重均明显增加。
实施例3 Rosa26-(2xIns-TRE-CMV-IL-13-SV40-pA-2xIns-pKRT5-M2rtTA-SV40-pA-2xIns)小鼠品系的构建和表型症状分析
3.1 Rosa26-(2xIns-TRE-CMV-IL-13-SV40-pA-2xIns-pKRT5-M2rtTA-SV40-pA-2xIns)小鼠品系的构建
利用同源重组原理，采用ES细胞打靶的方式，在Rosa26基因位点定点插入2xIns-TRE-CMV-IL-13-SV40-pA-2xIns-pK5-M2rtTA-SV40-pA-2xIns表达框。简要过程如下：首先构建ES细胞打靶载体，该载体包含3.3kb 5’同源臂、2xIns-TRE-CMV-IL-13-Ins-KRT5-M2rtTA-2xIns、PGK-Neo-polyA、3.3kb 3’同源臂和MC1-TK-polyA负筛选标记，载体质粒构建详见图9，ES细胞打靶载体序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。该载体经线性化后，电转转染JM8A3 ES细胞。经长片段PCR鉴定，共获得5个正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞克隆经扩增后，注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠。高比例嵌合小鼠与Flp小鼠交配获得6只阳性F1代去Neo杂合子小鼠。
其中，5’同源臂的序列如SEQ ID No.2所示；两段绝缘子2xIns反向互补序列如SEQID No.5所示；SV40 polyA反向互补序列如SEQ ID No.6所示；IL-13基因编码序列的反向互补序列如SEQ ID No.7所示；TRE-pCMV融合启动子反向互补序列如SEQ ID No.8所示；3’同源臂序列如SEQ ID No.18所示；M2rtTA反向互补序列的序列如SEQ ID No.12所示；KRT5启动子反向互补序列的序列如SEQ ID No.13所示；FRT序列如下SEQ ID No.14所示；PGK启动子的序列如SEQ ID No.15所示；Neo基因的序列如SEQ ID No.16所示；bGHpolyA的序列如SEQ ID No.17所示；能够过表达细胞因子基因的表达框(2xIns-TRE-CMV-IL13-SV40-pA-2xIns-pK5-M2rtTA-SV40-pA-2xIns片段反向互补序列如片段)的反向互补序列如SEQ IDNo.11所示。
经胚胎干细胞打靶，共获得抗性ES细胞克隆144个。对抗性ES细胞克隆基因组DNA抽提后，通过长片段PCR的方式对同源重组阳性克隆进行筛选。PCR获得的阳性克隆经测序确认，共获得5个正确同源重组的阳性ES细胞克隆。
同源重组阳性克隆PCR鉴定方案为：5’臂同源重组阳性克隆应扩增出3.4kb片段，阴性克隆应扩增出6.8kb片段；3’臂同源重组阳性克隆应扩增出6.3kb片段，阴性克隆应无产物。
ES细胞5’同源臂鉴定引物信息如下表8所示：
表8
引物 序列5'-->3' 引物类型
I GCCGGGCCTCGTCGTCT 正向
II TTTTTGGGGGTGATGGTGGTC 反向
ES细胞5’同源臂鉴定反应体系如下表9所示：
表9
反应组分 体积(μl)
双蒸水 13.2
PCR缓冲液 2
2.5mM dNTP 2
引物I(10pmol/μl) 0.5
引物II(10pmol/μl) 0.5
DNA聚合酶 0.8
基因组DNA 1
总计 20
ES细胞5’同源臂鉴定反应条件如下表10所示：
表10
步骤# 温度(℃) 时间 说明
1 94 3min -
2 98 15sec -
3 61 15sec -
4 68 3min 重复步骤2-4，循环35次
5 68 5min -
6 12 - 保持
ES细胞3’同源臂鉴定引物信息如下表11所示：
表11
Figure BDA0002903610350000231
Figure BDA0002903610350000241
ES细胞3’同源臂鉴定反应体系如下表12所示：
表12
反应组分 体积(μl)
双蒸水 13.2
PCR缓冲液 2
2.5mM dNTP 2
引物III(10pmol/μl) 0.5
引物IV(10pmol/μl) 0.5
DNA聚合酶 0.8
基因组DNA 1
总计 20
ES细胞3’同源臂鉴定反应条件如下表12所示：
表12
步骤# 温度(℃) 时间 说明
1 94 3min -
2 98 15sec -
3 61 15sec -
4 68 3min 重复步骤2-4，循环35次
5 68 5min -
6 12 - 保持
同源重组阳性ES细胞克隆，经扩增后，注射到C57BL/6J小鼠囊胚中，通过胚胎移植，获得高嵌合雄鼠。高嵌合小鼠与Flp小鼠交配，繁育获得F1代小鼠，通过PCR鉴定及测序对其进行基因型鉴定。PCR鉴定阳性小鼠为：76、81、92、93、94、95号；经测序确认均为阳性。
同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案为：5’臂同源重组阳性小鼠应扩增出3.4kb片段，野生型小鼠应扩增出6.8kb片段；3’臂同源重组阳性小鼠应扩增出6.9kb片段，野生型小鼠无片段。
F1代小鼠5’同源臂鉴定引物信息如下表13所示：
表13
引物 序列5'-->3' 引物类型
I GCCGGGCCTCGTCGTCT 正向
II TTTTTGGGGGTGATGGTGGTC 反向
F1代小鼠5’同源臂鉴定反应体系如下表14所示：
表14
反应组分 体积(μl)
双蒸水 13.2
PCR缓冲液 2
2.5mM dNTP 2
引物I(10pmol/μl) 0.5
引物II(10pmol/μl) 0.5
DNA聚合酶 0.8
基因组DNA 1
总计 20
F1代小鼠5’同源臂鉴定反应条件如下表15所示：
表15
步骤# 温度(℃) 时间 说明
1 94 3min -
2 98 15sec -
3 61 15sec -
4 68 3min 重复步骤2-4，循环35次
5 68 5min -
6 12 - 保持
F1代小鼠3’同源臂鉴定引物信息如下表16所示：
表16
引物 序列5'-->3' 引物类型
III TAGTGGGGGCCTTGCGGTTAC 正向
IV TTTCACTTAGTTTGTTTGGATGGT 反向
F1代小鼠3’同源臂鉴定反应体系如下表17所示：
表17
反应组分 体积(μl)
双蒸水 13.2
PCR缓冲液 2
2.5mM dNTP 2
引物III(10pmol/μl) 0.5
引物IV(10pmol/μl) 0.5
DNA聚合酶 0.8
基因组DNA 1
总计 20
F1代小鼠3’同源臂鉴定反应条件如下表18所示：
表18
步骤# 温度(℃) 时间 说明
1 94 3min -
2 98 15sec -
3 61 15sec -
4 68 4min 重复步骤2-4，循环35次
5 68 5min -
6 12 - 保持
F1代阳性小鼠PCR鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。其中，5’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应；3’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应。
获得的去Neo小鼠(IL-13KI/+:Flp+)通过与野生型小鼠交配，获得分离掉Flp基因型的knockin(KI)小鼠(该小鼠简写为：IL-13KI/+)；将获得的去Neo且去Flp的KI阳性杂合子小鼠(IL-13KI/+)自交，获得KI纯合(该小鼠简写为：IL-13KI/KI)和KI杂合小鼠(IL-13KI/+)；获得的去Neo且去Flp的KI阳性杂合子小鼠(IL-13KI/+)与野生型小鼠外交，进一步获得KI杂合小鼠(IL-13KI/+)。纯合子和杂合子均可作为实验组，同胞野生型小鼠作为对照组。
3.2 小鼠模型症状表型分析
以WT(野生)基因型的雄性和雌性小鼠作为正常对照组，HE(杂合)和HO(纯合)基因型的雄性和雌性小鼠分别作为实验组进行表型分析。组别信息如下：Group 1-WT_Femal(8只)，Group 2-WT_Male(8只)，Group3-HE_Female(8只)，Group 4-HE_Male(8只)，Group 5-HO_Female和Group6-HO_Male，其中Group 1-WT_Femal，Group 2-WT_Male，Group 3-HE_Female和Group 4-HE_Male每组8只小鼠，Group 5-HO_Female有5只小鼠，Group6-HO_Male有3只小鼠。各组小鼠6周龄时同时饲喂DOX水(SIGMA，D9891，终浓度1mg/mL)，从DOX水饲喂第三天开始，纯合组与杂合组出现湿疹症状，如抓挠，丘疹，红斑和皮损；至第7天病情加重，实验组所有小鼠全部发病，异常皮肤面积变大，腹部和头部包括唇周、耳周、脸颊且头顶触感有明显的粗糙和硬化，其中纯合组病情急速发展，Group 6-HO_Male组部分小鼠出现死亡；至第10天病情迅速恶化皮肤苔藓化严重，动物状态异常，体重下降，继续出现动物死亡，而对照Tg(-)组全部正常，表型如图10所示。分别从红斑、皮肤厚度和结痂三个指标加和进行临床评分，IL-13基因型杂合组和纯合组分别相比野生型组，杂合组相比纯合组，临床评分无论在雄性组还是雌性组均有显著性差异。对喂养DOX水(记为day0)直至day10的总评分通过Two-way ANOVA分析发现，在雄性小鼠中，Group 4-HE_Male和Group6-HO_Male分别对比Group 2-WT_Male，Group 4-HE_Male对比Group6-HO_Male；在雌性小鼠中，Group 3-HE_Female和Group 5-HO_Female分别对比Group 1-WT_Femal，Group 3-HE_Female对比Group5-HO_Female，均有显著的统计学差异(图11)。
对小鼠的背部皮肤组织切片进行HE染色(图12)和组织学分析包括组织学评分、炎细胞浸润评分和表皮层厚度测量。分别从结痂(0-4分)、皮层亢进(0-4分)、表皮缺损(0-4分)和溃疡形成(0-4分)四个指标加和(共16分)进行组织学评分，在雄性小鼠中，HE_Male和HO_Male分别对比WT_Male，在雌性小鼠中，HE_Female和HO_Female分别对比Group WT_Femal，均有显著的统计学差异(图13)；炎细胞浸润评分,在雄性小鼠中，HE_Male和HO_Male分别对比WT_Male，在雌性小鼠中，HE_Female和HO_Female分别对比Group WT_Femal，均有显著的统计学差异(图14)；量化后的表皮厚度，在雄性小鼠中，HE_Male和HO_Male分别对比WT_Male，在雌性小鼠中，HE_Female和HO_Female分别对比Group WT_Femal，均有显著的统计学差异(图15)。
通过免疫组化分析，IL-13在Rosa26-(2XIns-TRE-CMV-IL-13-SV40-pA-2XIns-pK5-M2rtTA-SV40-pA-2XIns)杂合子与纯合子小鼠的表皮层高表达(图16)。
通过从day0到day10之间检测小鼠生存状况，对生存曲线使用Log-rank(Mantel-Cox)test分析，在雄性小鼠中，Group 4-HE_Male和Group 6-HO_Male分别对比Group 2-WT_Male，在雌性小鼠中，Group 3-HE_Female和Group5-HO_Female分别对比Group 1-WT_Femal，均有显著的统计学差异，且Group4-HE_Male和Group 6-HO_Male单独对比，Group 3-HE_Female和Group5-HO_Female单独对比，也均有显著的统计学差异(图17)。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳福沃药业有限公司
<120> 对小鼠进行基因改造以及构建皮炎小鼠模型的方法
<130> PD01233
<150> 202010053779.9
<151> 2020-01-17
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized sequence
<400> 1
gccagcgggg gcggcgagga ggcgctccca ggttccggcc ctcccctcgg ccccgcgccg 60
cagagtctgg ccgcgcgccc ctgcgcaacg tggcaggaag cgcgcgctgg gggcggggac 120
gggcagtagg gctgagcggc tgcggggcgg gtgcaagcac gtttccgact tgagttgcct 180
caagaggggc gtgctgagcc agacctccat cgcgcactcc ggggagtgga gggaaggagc 240
gagggctcag ttgggctgtt ttggaggcag gaagcacttg ctctcccaaa gtcgctctga 300
gttgttatca gtaagggagc tgcagtggag taggcgggga gaaggccgca cccttctccg 360
gaggggggag gggagtgttg caataccttt ctgggagttc tctgctgcct cctggcttct 420
gaggaccgcc ctgggcctgg gagaatccct tccccctctt ccctcgtgat ctgcaactcc 480
agtctttcta gaagatgggc gggagtcttc tgggcaggct taaaggctaa cctggtgtgt 540
gggcgttgtc ctgcagggga attgaacagg tgtaaaattg gagggacaag acttcccaca 600
gattttcggt tttgtcggga agttttttaa taggggcaaa taaggaaaat gggaggatag 660
gtagtcatct ggggttttat gcagcaaaac tacaggttat tattgcttgt gatccgcctc 720
ggagtatttt ccatcgaggt agattaaaga catgctcacc cgagttttat actctcctgc 780
ttgagatcct tactacagta tgaaattaca gtgtcgcgag ttagactatg taagcagaat 840
tttaatcatt tttaaagagc ccagtacttc atatccattt ctcccgctcc ttctgcagcc 900
ttatcaaaag gtattttaga acactcattt tagccccatt ttcatttatt atactggctt 960
atccaacccc tagacagagc attggcattt tccctttcct gatcttagaa gtctgatgac 1020
tcatgaaacc agacagatta gttacataca ccacaaatcg aggctgtagc tggggcctca 1080
acactgcagt tcttttataa ctccttagta cactttttgt tgatcctttg ccttgatcct 1140
taattttcag tgtctatcac ctctcccgtc aggtggtgtt ccacatttgg gcctattctc 1200
agtccaggga gttttacaac aatagatgta ttgagaatcc aacctaaagc ttaactttcc 1260
actcccatga atgcctctct cctttttctc catttataaa ctgagctatt aaccattaat 1320
ggtttccagg tggatgtctc ctcccccaat attacctgat gtatcttaca tattgccagg 1380
ctgatatttt aagacattaa aaggtatatt tcattattga gccacatggt attgattact 1440
gcttactaaa attttgtcat tgtacacatc tgtaaaaggt ggttcctttt ggaatgcaaa 1500
gttcaggtgt ttgttgtctt tcctgaccta aggtcttgtg agcttgtatt ttttctattt 1560
aagcagtgct ttctcttgga ctggcttgac tcatggcatt ctacacgtta ttgctggtct 1620
aaatgtgatt ttgccaagct tcttcaggac ctataatttt gcttgacttg tagccaaaca 1680
caagtaaaat gattaagcaa caaatgtatt tgtgaagctt ggtttttagg ttgttgtgtt 1740
gtgtgtgctt gtgctctata ataatactat ccaggggctg gagaggtggc tcggagttca 1800
agagcacaga ctgctcttcc agaagtcctg agttcaattc ccagcaacca catggtggct 1860
cacaaccatc tgtaatggga tctgatgccc tcttctggtg tgtctgaaga ccacaagtgt 1920
attcacatta aataaataaa tcctccttct tcttcttttt ttttttttta aagagaatac 1980
tgtctccagt agaatttact gaagtaatga aatactttgt gtttgttcca atatggtagc 2040
caataatcaa attactcttt aagcactgga aatgttacca aggaactaat ttttatttga 2100
agtgtaactg tggacagagg agccataact gcagacttgt gggatacaga agaccaatgc 2160
agactttaat gtcttttctc ttacactaag caataaagaa ataaaaattg aacttctagt 2220
atcctatttg tttaaactgc tagctttact taacttttgt gcttcatcta tacaaagctg 2280
aaagctaagt ctgcagccat tactaaacat gaaagcaagt aatgataatt ttggatttca 2340
aaaatgtagg gccagagttt agccagccag tggtggtgct tgcctttatg cctttaatcc 2400
cagcactctg gaggcagaga caggcagatc tctgagtttg agcccagcct ggtctacaca 2460
tcaagttcta tctaggatag ccaggaatac acacagaaac cctgttgggg aggggggctc 2520
tgagatttca taaaattata attgaagcat tccctaatga gccactatgg atgtggctaa 2580
atccgtctac ctttctgatg agatttgggt attatttttt ctgtctctgc tgttggttgg 2640
gtcttttgac actgtgggct ttctttaaag cctccttcct gccatgtggt ctcttgtttg 2700
ctactaactt cccatggctt aaatggcatg gctttttgcc ttctaagggc agctgctgag 2760
atttgcagcc tgatttccag ggtggggttg ggaaatcttt caaacactaa aattgtcctt 2820
taattttttt tttaaaaaat gggttatata ataaacctca taaaatagtt atgaggagtg 2880
aggtggacta atattaaatg agtccctccc ctataaaaga gctattaagg ctttttgtct 2940
tatacttaac ttttttttta aatgtggtat ctttagaacc aagggtctta gagttttagt 3000
atacagaaac tgttgcatcg cttaatcaga ttttctagtt tcaaatccag agaatccaaa 3060
ttcttcacag ccaaagtcaa attaagaatt tctgactttt aatgttaatt tgcttactgt 3120
gaatataaaa atgatagctt ttcctgaggc agggtctcac tatgtatctc tgcctgatct 3180
gcaacaagat atgtagacta aagttctgcc tgcttttgtc tcctgaatac taaggttaaa 3240
atgtagtaat acttttggaa cttgcaggtc agattctttt ataggggaca cactaaggga 3300
gaccaccatc acccccaaaa actcgaaatt cgatatcaag cttagggaca gccccccccc 3360
aaagccccca gggatgtaat tacgtccctc ccccgctagg gggcagcagc gagccgcccg 3420
gggctccgct ccggtccggc gctccccccg catccccgag ccggcagcgt gcggggacag 3480
cccgggcacg gggaaggtgg cacgggatcg ctttcctctg aacgcttctc gctgctcttt 3540
gagcctgcag acacctgggg ggatacgggg aaaaagcttt aggctgaaag agagatttag 3600
aatgacagaa tcatagaacg gcctgggttg caaaggagca cagtgctcat ccagatccaa 3660
ccccctgcta tgtgcagggt catcaaccag cagcccaggc tgcccagagc cacatccagc 3720
ctggccttga atgcctgcag ggatggggca tccacagcct ccttgggcaa cctgttcagt 3780
gcgtcaccac cctctggggg aaaaactgcc tcctcatatc caacccaaac ctcccctgtc 3840
tcagtgtaaa gccattcccc cttgtcctat caagggggag tttgctgtga cattgttggt 3900
ctggggtgac acatgtttgc caattcagtg catcacggag aggcagatct tggggataag 3960
gaagtgcagg acagcatgga cgtgggacat gcaggtgttg agggctctgg gacactctcc 4020
aagtcacagc gttcagaaca gccttaagga taagaagata ggatagaagg acaaagagca 4080
agttaaaacc cagcatggag aggagcacaa aaaggccaca gacactgctg gtccctgtgt 4140
ctgagcctgc atgtttgatg gtgtctggat gcaagcagaa ggggtggaag agcttgcctg 4200
gagagataca gctgggtcag taggactggg acaggcagct ggagaattgc catgtagatg 4260
ttcatacaat cgtcaaatca tgaaggctgg aaaagccctc caagatcccc aagaccaacc 4320
ccaacccacc caccgtgccc actggccatg tccctcagtg ccacatcccc acagttcttc 4380
atcacctcca gggacggtga cccccccacc tccgtgggca gctgtgccac tgcagcaccg 4440
ctctttggag aaggtaaatc ttgctaaatc cagcccgacc ctcccctggc acaacgtaag 4500
gccattatct ctcatccaac tccaggacgg agtcagtgag gatggggcga tcccttaagc 4560
atgctctaac aggcctggct ttttttttta aaaagtaggt tgcggtgata ataattcaag 4620
ttttcatcac ttgaaacaca ttttaccaac tatcacccaa gcctcgacgg gacagccccc 4680
ccccaaagcc cccagggatg taattacgtc cctcccccgc tagggggcag cagcgagccg 4740
cccggggctc cgctccggtc cggcgctccc cccgcatccc cgagccggca gcgtgcgggg 4800
acagcccggg cacggggaag gtggcacggg atcgctttcc tctgaacgct tctcgctgct 4860
ctttgagcct gcagacacct ggggggatac ggggaaaaag ctttaggctg aaagagagat 4920
ttagaatgac agaatcatag aacggcctgg gttgcaaagg agcacagtgc tcatccagat 4980
ccaaccccct gctatgtgca gggtcatcaa ccagcagccc aggctgccca gagccacatc 5040
cagcctggcc ttgaatgcct gcagggatgg ggcatccaca gcctccttgg gcaacctgtt 5100
cagtgcgtca ccaccctctg ggggaaaaac tgcctcctca tatccaaccc aaacctcccc 5160
tgtctcagtg taaagccatt cccccttgtc ctatcaaggg ggagtttgct gtgacattgt 5220
tggtctgggg tgacacatgt ttgccaattc agtgcatcac ggagaggcag atcttgggga 5280
taaggaagtg caggacagca tggacgtggg acatgcaggt gttgagggct ctgggacact 5340
ctccaagtca cagcgttcag aacagcctta aggataagaa gataggatag aaggacaaag 5400
agcaagttaa aacccagcat ggagaggagc acaaaaaggc cacagacact gctggtccct 5460
gtgtctgagc ctgcatgttt gatggtgtct ggatgcaagc agaaggggtg gaagagcttg 5520
cctggagaga tacagctggg tcagtaggac tgggacaggc agctggagaa ttgccatgta 5580
gatgttcata caatcgtcaa atcatgaagg ctggaaaagc cctccaagat ccccaagacc 5640
aaccccaacc cacccaccgt gcccactggc catgtccctc agtgccacat ccccacagtt 5700
cttcatcacc tccagggacg gtgacccccc cacctccgtg ggcagctgtg ccactgcagc 5760
accgctcttt ggagaaggta aatcttgcta aatccagccc gaccctcccc tggcacaacg 5820
taaggccatt atctctcatc caactccagg acggagtcag tgaggatggg gctcccatag 5880
agcccaccgc atttggtacc ttgctagctg agctctgata tcttctcgat aagatacatt 5940
gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt 6000
tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac 6060
aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag 6120
taaaacctct acaaatgtgg tatggctgat tatgatcagt tatctagatt tagaaggggc 6180
cgtggcgaaa cagttgcttt gtgtagctga gcagttttgt tataaagtgg gctacttcga 6240
ttttggtatc ggggaggctg gagaccgtag tgggggcctt gcggttacag aggccatgca 6300
atatcctctg ggtcctgtag atggcattgc aattggagat gttggtcagg gaatccaggg 6360
ctacacagaa cccgccagcg gccaggtcca cactccatac catgctgccg ttgcacaggg 6420
gagtctggtc ttgtgtgatg ttgctcagct cctcaataag ctccttaagg gtcagaggga 6480
gagacacaga tcttggcacc ggccctgggg cggcgagacc accaaggcaa gcaagagcca 6540
ggactgcagt cacccagagc gccatggtgg cgaattctcc aggcgatctg acggttcact 6600
aaacgagctc tgcttatata ggcctcccac cgtacacgcc tacctcgaca tacgttctct 6660
atcactgata gggagtaaac tcgacatacg ttctctatca ctgataggga taaactcgac 6720
atacgttctc tatcactgat agggagtaaa ctcgacatac gttctctatc actgataggg 6780
agtaaactcg acatacgttc tctatcactg atagggagta aactcgacat cgttctctat 6840
cactgatagg gagtaaactc gacatacgtt ctctatcact gatagggagt aaactcgaag 6900
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgatcg agttgaattc ccaagctttc 6960
tggatctctg ctgtactagg ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt 7020
ccctcccccg ctagggggca gcagcgagcc gcccggggct ccgctccggt ccggcgctcc 7080
ccccgcatcc ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg 7140
gatcgctttc ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagcc tgcagacacc tggggggata 7200
cggggaaaaa gctttaggct gaaagagaga tttagaatga cagaatcata gaacggcctg 7260
ggttgcaaag gagcacagtg ctcatccaga tccaaccccc tgctatgtgc agggtcatca 7320
accagcagcc caggctgccc agagccacat ccagcctggc cttgaatgcc tgcagggatg 7380
gggcatccac agcctccttg ggcaacctgt tcagtgcgtc accaccctct gggggaaaaa 7440
ctgcctcctc atatccaacc caaacctccc ctgtctcagt gtaaagccat tcccccttgt 7500
cctatcaagg gggagtttgc tgtgacattg ttggtctggg gtgacacatg tttgccaatt 7560
cagtgcatca cggagaggca gatcttgggg ataaggaagt gcaggacagc atggacgtgg 7620
gacatgcagg tgttgagggc tctgggacac tctccaagtc acagcgttca gaacagcctt 7680
aaggataaga agataggata gaaggacaaa gagcaagtta aaacccagca tggagaggag 7740
cacaaaaagg ccacagacac tgctggtccc tgtgtctgag cctgcatgtt tgatggtgtc 7800
tggatgcaag cagaaggggt ggaagagctt gcctggagag atacagctgg gtcagtagga 7860
ctgggacagg cagctggaga attgccatgt agatgttcat acaatcgtca aatcatgaag 7920
gctggaaaag ccctccaaga tccccaagac caaccccaac ccacccaccg tgcccactgg 7980
ccatgtccct cagtgccaca tccccacagt tcttcatcac ctccagggac ggtgaccccc 8040
ccacctccgt gggcagctgt gccactgcag caccgctctt tggagaaggt aaatcttgct 8100
aaatccagcc cgaccctccc ctggcacaac gtaaggccat tatctctcat ccaactccag 8160
gacggagtca gtgaggatgg ggcactaggg gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg 8220
taattacgtc cctcccccgc tagggggcag cagcgagccg cccggggctc cgctccggtc 8280
cggcgctccc cccgcatccc cgagccggca gcgtgcgggg acagcccggg cacggggaag 8340
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ggggggatac ggggaaaaag ctttaggctg aaagagagat ttagaatgac agaatcatag 8460
aacggcctgg gttgcaaagg agcacagtgc tcatccagat ccaaccccct gctatgtgca 8520
gggtcatcaa ccagcagccc aggctgccca gagccacatc cagcctggcc ttgaatgcct 8580
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ggggaaaaac tgcctcctca tatccaaccc aaacctcccc tgtctcagtg taaagccatt 8700
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caactccagg acggagtcag tgaggatggg gcctagtcag agaaatgttc tgtcgaggct 9420
tgggtgatag ttggtaaaat gtgtttcaag tgatgaaaac ttgaattatt atcaccgcaa 9480
cctacttttt aaaaaaaaaa gccaggcctg ttagagcatg cttaagggat ccctaggact 9540
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aaggcagaca accaagaaac tacagttaag gttacctgtc tttaaaccat ctgcatatac 9660
acagggatat taaaatattc caaataatat ttcattcaag ttttccccca tcaaattggg 9720
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ttgtgaaatt gttttcaagt gatagttaaa gcccatgaga tacagaacaa agctgctatt 9840
tcgaggtctc ttggtttata ctcagaagca cttctttggg tttccctgca ctatcctgat 9900
catgtgctag gcctacctta ggctgattgt tgttcaaata aacttaagtt tcctgtcagg 9960
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ttaatgtgaa agttaggtct ttgtgggttt gatttttaat tttcaaaacc tgagctaaat 10080
aagtcatttt tacatgtctt acatttggtg gaattgtata attgtggttt gcaggcaaga 10140
ctctctgacc tagtaaccct acctatagag cactttgctg ggtcacaagt ctaggagtca 10200
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ccatattttt tttccttttt tttttttttt ttggtttttc gagacagggt ttctctgtat 10560
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tgttgttgag ccactgagaa tggtctcaga acataacttc ttaaggaacc ttcccagatt 11100
gccctcaaca ctgcaccaca tttggtcctg cttgaacatt gccatggctc ttaaagtctt 11160
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aggacagtgc ttgtttaagg ctatatttct gctgtctgag cagcaacagg tcttcgagat 11280
caacatgatg ttcataatcc caagatgttg ccatttatgt tctcagaagc aagcagaggc 11340
atgatggtca gtgacagtaa tgtcactgtg ttaaatgttg ctatgcagtt tggatttttc 11400
taatgtagtg taggtagaac atatgtgttc tgtatgaatt aaactcttaa gttacacctt 11460
gtataatcca tgcaatgtgt tatgcaatta ccattttaag tattgtagct ttctttgtat 11520
gtgaggataa aggtgtttgt cataaaatgt tttgaacatt tccccaaagt tccaaattat 11580
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cttaattatt caattaacac cgtttgtgtt ataatatata taaaactgac atgtagaagt 11700
gtttgtccag aacatttctt aaatgtatac tgtctttaga gagtttaata tagcatgtct 11760
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<210> 2
<211> 3300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized sequence
<400> 2
gccagcgggg gcggcgagga ggcgctccca ggttccggcc ctcccctcgg ccccgcgccg 60
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gttgttatca gtaagggagc tgcagtggag taggcgggga gaaggccgca cccttctccg 360
gaggggggag gggagtgttg caataccttt ctgggagttc tctgctgcct cctggcttct 420
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ggtttccagg tggatgtctc ctcccccaat attacctgat gtatcttaca tattgccagg 1380
ctgatatttt aagacattaa aaggtatatt tcattattga gccacatggt attgattact 1440
gcttactaaa attttgtcat tgtacacatc tgtaaaaggt ggttcctttt ggaatgcaaa 1500
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aaatgtgatt ttgccaagct tcttcaggac ctataatttt gcttgacttg tagccaaaca 1680
caagtaaaat gattaagcaa caaatgtatt tgtgaagctt ggtttttagg ttgttgtgtt 1740
gtgtgtgctt gtgctctata ataatactat ccaggggctg gagaggtggc tcggagttca 1800
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atccgtctac ctttctgatg agatttgggt attatttttt ctgtctctgc tgttggttgg 2640
gtcttttgac actgtgggct ttctttaaag cctccttcct gccatgtggt ctcttgtttg 2700
ctactaactt cccatggctt aaatggcatg gctttttgcc ttctaagggc agctgctgag 2760
atttgcagcc tgatttccag ggtggggttg ggaaatcttt caaacactaa aattgtcctt 2820
taattttttt tttaaaaaat gggttatata ataaacctca taaaatagtt atgaggagtg 2880
aggtggacta atattaaatg agtccctccc ctataaaaga gctattaagg ctttttgtct 2940
tatacttaac ttttttttta aatgtggtat ctttagaacc aagggtctta gagttttagt 3000
atacagaaac tgttgcatcg cttaatcaga ttttctagtt tcaaatccag agaatccaaa 3060
ttcttcacag ccaaagtcaa attaagaatt tctgactttt aatgttaatt tgcttactgt 3120
gaatataaaa atgatagctt ttcctgaggc agggtctcac tatgtatctc tgcctgatct 3180
gcaacaagat atgtagacta aagttctgcc tgcttttgtc tcctgaatac taaggttaaa 3240
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized sequence
<400> 3
gaccaccatc acccccaaaa a 21
<210> 4
<211> 6048
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized sequence
<400> 4
gggacagccc ccccccaaag cccccaggga tgtaattacg tccctccccc gctagggggc 60
agcagcgagc cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc cccgagccgg 120
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cttctcgctg ctctttgagc ctgcagacac ctggggggat acggggaaaa agctttaggc 240
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caagggcatc ggctgggagc atgtctaagt caaaatcgtc aagggcgtcg gccggcccgc 6300
cgctttcgca ctttagctgt ttctccaggc cacatatgat tagttccagg ccgaaaagga 6360
aggcaggttc ggctccctgc cggtcgaaca gctcaattgc ttgtctcaga agtgggggca 6420
tagaatcggt ggtaggtgtc tctctttcct cttttgctac ttgatgctcc tgttcctcca 6480
atacgcagcc cagtgtaaag tggcccacgg cggacagagc gtacagtgcg ttctccaggg 6540
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ttgggcgggt gccgagatgc actttagccc cgtcgcgatg tgagaggaga gcacagcgga 6660
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gggtatgatg cctgtccagc atctcgattg gcagggcatc gagcagggcc cgcttgttct 6780
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tcaggccttc gataccgact ccattgagta attccagagc gccgtttatg actttgctct 6900
tgtccagtct agacatggtg gcaatggctg gttcctagtg gagtaagagt agcgggaact 6960
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acacacctgc gcagcggtgt ggggtgcaaa cgctgtcttc ctggcaggct ctgctcagct 7200
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caagggggca tttggccaag atcctgaaag atccttccag gaccaggaat gtcatcaaac 7380
attgcagcac attgcacact atccatgaac agggggcaga gcgagtcccc cactggcagt 7440
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gaattgaatt gacagatgta aggtcatctc ccttccctat gtcattgtgg aaggccttcc 10080
cctaccccat cctgagtcca agggtcctct ccacccactt ctgtccctgg cttcccatcc 10140
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gcatcaatga gtctaaaatt gcaaagaagg gcttttacca ttttcttggc ctttgctttg 11520
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ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 15060
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aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 20220
acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 20280
tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctcgactag agcttgcgga acccttcgaa 20340
gttcctattc tctagaaagt ataggaactt catcagtcag gtacataatg gatccagatc 20400
cctaggactt gctgagcaca caagagtagt tacttggcag gctcctggtg agagcatatt 20460
tcaaaaaaca aggcagacaa ccaagaaact acagttaagg ttacctgtct ttaaaccatc 20520
tgcatataca cagggatatt aaaatattcc aaataatatt tcattcaagt tttcccccat 20580
caaattggga catggatttc tccggtgaat aggcagagtt ggaaactaaa caaatgttgg 20640
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cctgtcaggt gatgtcatat gatttcatat atcaaggcaa aacatgttat atatgttaaa 20880
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tgtatatctc aaataatgct ggcctttttt aaaaagccct tgttctttat caccctgttt 21300
tctacataat ttttgttcaa agaaatactt gtttggatct ccttttgaca acaatagcat 21360
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tctctgtata gccctggctg tcctggaact cactttgtag accaggctgg cctcgaactc 21480
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ggctaagttg gatattttgt tatataacta taaccaatac taactccact gggtggattt 21600
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ctctaacaga ggctgttggt actagtggca cttaagcaac ttcctacgga tatactagca 21720
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cttgaggaca ggacagtgct tgtttaaggc tatatttctg ctgtctgagc agcaacaggt 22140
cttcgagatc aacatgatgt tcataatccc aagatgttgc catttatgtt ctcagaagca 22200
agcagaggca tgatggtcag tgacagtaat gtcactgtgt taaatgttgc tatgcagttt 22260
ggatttttct aatgtagtgt aggtagaaca tatgtgttct gtatgaatta aactcttaag 22320
ttacaccttg tataatccat gcaatgtgtt atgcaattac cattttaagt attgtagctt 22380
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tttaaaatgc ttaattattc aattaacacc gtttgtgtta taatatatat aaaactgaca 22560
tgtagaagtg tttgtccaga acatttctta aatgtatact gtctttagag agtttaatat 22620
agcatgtctt ttgcaacata ctaacttttg tgttggtgcg agcaatattg tgtagtcatt 22680
ttgaaaggag tcatttcaat gagtgtcaga ttgttttgaa tgttattgaa cattttaaat 22740
gcagacttgt tcgtgtttta gaaagcaaaa ctgtcagaag ctttgaacta gaaattaaaa 22800
agctgaagta tttcagaagg gaaataagct acttgctgta ttagttgaag gaaagtgtaa 22860
tagcttagaa aatttaaaac catatagttg tcattgctga atatctggca gatgaaaaga 22920
aatactcagt ggttcttttg agcaatataa cagcttgtta tattaaaaat tttccccaca 22980
gatataaact ctaatctata actcataaat gttacaaatg gatgaagctt acaaatgtgg 23040
cttgacttgt cactgtgctt gttttagtta tgtgaaagtt tggcaataaa cctatgtcct 23100
aaatagtcaa actgtggaat gactttttaa tctattggtt tgtctagaac agttatgttg 23160
ccatttgccc taatggtgaa agaaaaagtg gggagtgcct tggcactgtt catttgtggt 23220
gtgaaccaaa gaggggggca tgcacttaca cttcaaacat ccttttgaaa gactgacaag 23280
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ggctggcttg ttatgctgac aagtgtgatt aaattcaaac tttgaggtaa gttggaggaa 23400
cttgtacatt gttaggagtg tgacaatttg gactcttaat gatttggtca tacaaaatga 23460
acctagacca acttctggaa gatgtatata ataactccat gttacattga tttcacctga 23520
ctaatactta tcccttatca attaaataca gaagatgcca gccatctggg ccttttaacc 23580
cagaaa 23586
<210> 11
<211> 15035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthesized sequence
<400> 11
gggacagccc ccccccaaag cccccaggga tgtaattacg tccctccccc gctagggggc 60
agcagcgagc cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc cccgagccgg 120
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gctcatccag atccaacccc ctgctatgtg cagggtcatc aaccagcagc ccaggctgcc 360
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cttgggcaac ctgttcagtg cgtcaccacc ctctggggga aaaactgcct cctcatatcc 10800
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agaaatccgc ctgcctctgc ctcctgagtg ccgggattaa aggcgtgcac caccacgcct 1140
ggctaagttg gatattttgt tatataacta taaccaatac taactccact gggtggattt 1200
ttaattcagt cagtagtctt aagtggtctt tattggccct tcattaaaat ctactgttca 1260
ctctaacaga ggctgttggt actagtggca cttaagcaac ttcctacgga tatactagca 1320
gattaagggt cagggataga aactagtcta gcgttttgta tacctaccag ctttatacta 1380
ccttgttctg atagaaatat ttcaggacat ctagagtgta ctataaggtt gatggtaagc 1440
ttataaggaa cttgaaagtg gagtaactac tccatttctc tgaggggaga attaaaattt 1500
ttgaccaagt gttgttgagc cactgagaat ggtctcagaa cataacttct taaggaacct 1560
tcccagattg ccctcaacac tgcaccacat ttggtcctgc ttgaacattg ccatggctct 1620
taaagtctta attaagaata ttaattgtgt aattattgtt tttcctcctt tagatcattc 1680
cttgaggaca ggacagtgct tgtttaaggc tatatttctg ctgtctgagc agcaacaggt 1740
cttcgagatc aacatgatgt tcataatccc aagatgttgc catttatgtt ctcagaagca 1800
agcagaggca tgatggtcag tgacagtaat gtcactgtgt taaatgttgc tatgcagttt 1860
ggatttttct aatgtagtgt aggtagaaca tatgtgttct gtatgaatta aactcttaag 1920
ttacaccttg tataatccat gcaatgtgtt atgcaattac cattttaagt attgtagctt 1980
tctttgtatg tgaggataaa ggtgtttgtc ataaaatgtt ttgaacattt ccccaaagtt 2040
ccaaattata aaaccacaac gttagaactt atttatgaac aatggttgta gtttcatgct 2100
tttaaaatgc ttaattattc aattaacacc gtttgtgtta taatatatat aaaactgaca 2160
tgtagaagtg tttgtccaga acatttctta aatgtatact gtctttagag agtttaatat 2220
agcatgtctt ttgcaacata ctaacttttg tgttggtgcg agcaatattg tgtagtcatt 2280
ttgaaaggag tcatttcaat gagtgtcaga ttgttttgaa tgttattgaa cattttaaat 2340
gcagacttgt tcgtgtttta gaaagcaaaa ctgtcagaag ctttgaacta gaaattaaaa 2400
agctgaagta tttcagaagg gaaataagct acttgctgta ttagttgaag gaaagtgtaa 2460
tagcttagaa aatttaaaac catatagttg tcattgctga atatctggca gatgaaaaga 2520
aatactcagt ggttcttttg agcaatataa cagcttgtta tattaaaaat tttccccaca 2580
gatataaact ctaatctata actcataaat gttacaaatg gatgaagctt acaaatgtgg 2640
cttgacttgt cactgtgctt gttttagtta tgtgaaagtt tggcaataaa cctatgtcct 2700
aaatagtcaa actgtggaat gactttttaa tctattggtt tgtctagaac agttatgttg 2760
ccatttgccc taatggtgaa agaaaaagtg gggagtgcct tggcactgtt catttgtggt 2820
gtgaaccaaa gaggggggca tgcacttaca cttcaaacat ccttttgaaa gactgacaag 2880
tttgggtctt cacagttgga attgggcatc ccttttgtca gggagggagg gagggaggga 2940
ggctggcttg ttatgctgac aagtgtgatt aaattcaaac tttgaggtaa gttggaggaa 3000
cttgtacatt gttaggagtg tgacaatttg gactcttaat gatttggtca tacaaaatga 3060
acctagacca acttctggaa gatgtatata ataactccat gttacattga tttcacctga 3120
ctaatactta tcccttatca attaaataca gaagatgcca gccatctggg ccttttaacc 3180
cagaaa 3186

Claims (10)

1.一种对小鼠进行基因改造的方法，其特征在于，其包括：
在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件；以及
在小鼠的基因组中引入能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述给定位点为Rosa26位点或H11位点，优选为Rosa26位点。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞因子为：白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-22(IL-22)、白细胞介素-33(IL-33)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-25(IL-25)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-17(IL-17)或白细胞介素-31(IL-31)，优选为IL-13、IL-4、IL-31、IL-33、IL-18或TSLP，更优选为IL-13。
4.一种构建皮炎小鼠模型的方法，其特征在于，其包括：
在小鼠的基因组的给定位点引入细胞因子基因和能够过表达细胞因子基因的表达组件；以及
在小鼠的基因组中引入能够特异性地表达细胞因子基因的表达组件。
5.一种同源重组载体，其特征在于，其序列包括如SEQ ID No.1所示的序列。
6.一种能够过表达细胞因子基因的表达框，其特征在于，其反向互补序列如SEQ IDNo.4所示。
7.一种ES细胞打靶载体，其特征在于，其序列包括如SEQ ID No.10所示的序列。
8.一种能够过表达细胞因子基因的表达框，其特征在于，其反向互补序列如SEQ IDNo.11所示。
9.一种根据权利要求1～3中任一项所述的方法产生的小鼠或其后代在制备动物模型中的用途。
10.一种根据权利要求1～3中任一项所述的方法产生的小鼠或其后代或小鼠模型作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
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